Phân lập, tuyển chọn, và tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho chủng Acetobacter Xylnum H6, Chế tạo màng sinh học

  • Số trang: 65 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 106 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt Tr­êng ®¹i häc s­ ph¹m hµ néi 2 Khoa sinh - ktnn ---------L« thÞ b¶o kh¸nh Ph©n lËp, tuyÓn chän vµ tèi ­u hãa m«i tr­êng dinh d­ìng cho chñng vi khuÈn acetobacter xylinum h6, chÕ t¹o mµng sinh häc Khãa luËn tèt nghiÖp ®¹i häc Chuyªn ngµnh: Vi sinh vËt Hµ néi – 2008 L« ThÞ B¶o Kh¸nh 1 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt MỤC LỤC Lời cảm ơn Bản cam đoan Mục lục 1 Danh mục bảng và hình 3 Đặt vấn đề 5 Nội dung 7 Chương 1. Tổng quan tài liệu 7 1.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter ........................... 7 1.2. Phân loại Acetobacter................................................................. 8 1.2.1.Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn......................................... 8 1.2.2. Lược sử phân loại Acetobacter................................................. 9 1.3. Đặc điểm chung của Acetobacter................................................. 11 1.3.1. Đặc điểm khuẩn lạc Acetobacter.............................................. 13 1.3.2. Đặc điểm màng vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng 13 1.3.3. Nhu cầu dinh dưỡng của chủng Acetobacter........................... 14 1.3.4. Con đường chuyển hoá Cacbon............................................... 14 1.3.5. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn Acetobacter....................... 15 1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men axetic.............................. 18 1.5. Các yếu tố điều kiện và môi trường ảnh hưởng............................ 19 1.6. Màng sinh học (Bacterial cellulose, Biocellulose – BC)............ 20 Chương 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 22 2.1. Đối tượng – hoá chất................................................................ 22 2.1.1. Đối tượng................................................................................. 22 2.1.2. Thiết bị - hoá chất.................................................................... 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu.............................................................. 24 L« ThÞ B¶o Kh¸nh 2 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt 2.2.1. Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter ................................... 24 2.2.2. Tuyển chọn Acetobacetr cho màng ........................................ 25 2.2.3. Tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter thuần khiết......................... 25 2.2.4. Phân biệt vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram................ 26 2.2.5. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp axit.................... 27 2.2.6. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn....................... 28 2.2.7. Phương pháp tuyển chọn các chủng...................................... 28 2.2.8. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn ................... 29 2.2.9. Phương pháp quy hoạch hoá toán học thực nghiệm.............. 29 2.2.10. Phương pháp tạo vết thương ở thỏ....................................... 33 Chương 3. Kết quả và thảo luận 35 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter.................. 35 3.2. Nghiên cứu một số đặc tính hình thái..................................... 39 3.2.1. Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum......... 39 3.2.2. Khảo sát khả năng tạo axit axetic của vi khuẩn ................ 39 3.2.3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng ............... 42 3.2.4. Khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn A.xylinum........... 43 3.3. Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển A. xylinum H6 ....... 47 3.4. Tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho chủng vi khuẩn H6 ........ 51 3.4.1. Thiết lập mô hình toán học................................................... 52 3.4.2. Tối ưu hoá........................................................................... 56 3.5. Bước đầu dùng màng BC trị bỏng ở thỏ.................................... 58 Chương 4. Kết luận và kiến nghị 62 4.1. Kết luận.................................................................................... 62 4.2. Kiến nghị................................................................................. 62 Tài liệu tham khảo 63 L« ThÞ B¶o Kh¸nh 3 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH Bảng: Bảng 1.1. Những đặc điểm phân biệt, so sánh Acetobacter……………….. 12 Bảng 2.1. Thành phần môi trường…………………………………………...23 Bảng 2.2. Cách sử lý màng………………………………………………......34 Bảng 3.1. Quan sát thời gian dặc điểm màng tạo thành……………………..37 Bảng 3.2. Hàm lượng axit axetic của một số chủng…………………………40 Bảng 3.3. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A. xylinum……………... 42 Bảng 3.4. Khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn A. xylinum………… 43 Bảng 3.5. Khảo sát khả năng tạo màng của H6……………………………...45 Bảng 3.6. Tương quan giữa nồng độ pha loãng………………………....... ..48 Bảng 3.7. Thời gian nuôi cấy và hàm lượng tế bào………………………… 49 Bảng 3.8. Các yếu tố và mức khảo sát………………………………………53 Bảng 3.9. Ma trận thực nhiệm……………………………………………….54 Bảng 3.10. Kiểm tra sự thích ứng của mô hình……………………………...56 Bảng 3.11. Tối ưu hoá môi trường………………………………………......57 Bảng 3.12. Diện tích vết thương còn lại trong thực tế………………………59 Hình: Hình 1.1. Cơ chế của quá trình oxy hoá rươụ etylic ………………………...19 Hình 3.1. Mẫu khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter nhóm 1……………………38 Hình 3.2. Mẫu khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter nhóm 3……………………38 Hình 3.3. Tế bào chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum..................................39 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn hàm lượng axit axetic ……………………… ... 40 Hình 3.5. Vòng phân giải CaCO3 của vi khuẩn Acetobacter xylinum............41 Hình 3.6. Màng mỏng, dịch nuôi cấy đục…………………………………...45 Hình 3.7. Màng mỏng, dịch nuôi cấy trong……………………………… L« ThÞ B¶o Kh¸nh 4 45 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt Hình 3.8. Màng BC dày…………………………………………………… 46 Hình 3.9. Màng BC của chủng H6...................................................................46 Hình 3.10. Đồ thị tương quan giữa số lượng tế bào của chủng H6 .................49 Hình 3.11. Đồ thị sinh trưởng phát triển của chủng H6…………………….. 50 H ình 3.12. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ lành vết thương...........................................59 Hình 3.13. Vết thương sử dụng màng trị bỏng………………………………60 Hình 3.14.Vết thương sử dụng màng BC tẩm dầu mù u sau 9 ngày………...60 Hình 3.15. Vết thương sử dụng màng BC tẩm dầu mù u sau 15 ngày………61 Hình 3.16. Vết thương không dùng màng BC, bôi dầu mù u sau 15 ngày…..61 L« ThÞ B¶o Kh¸nh 5 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, đối với các quốc gia trên thế giới công nghệ sinh học (CNSH) không còn là một nghành mới mẻ mà nó đã trở thành một nghành kinh tế chủ đạo trong sự phát triển khoa học kĩ thuật và công nghệ. Là một bộ phận của CNSH, công nghệ vi sinh đã và đang ngày càng phát triển mạnh mẽ và ngày càng có những ứng dụng thiết thực vào cuộc sống. Bằng việc ứng dụng các quá trình lên men vi sinh vật đã tạo ra chế phẩm giúp chúng ta tận dụng và tiết kiệm chi phí trong việc giải quyết nhiều vấn đề ví dụ như trong nông nghiệp, công nghiệp, bảo vệ môi trường... Một trong các chủng vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghệ lên men vi sinh là vi khuẩn Acetobacter (còn gọi là vi khuẩn giấm). Vi khuẩn Acetobacter xylinum khi nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh sẽ hình thành một lớp một lớp màng trên bề mặt thoáng của dung dịch, màng này có bản chất là cellulose kết hợp với tế bào vi khuẩn Acetobacter xylium. Công thức cellulose do vi khuẩn sản xuất ra cũng giống như cellulose của tế bào thực vật nhưng nó có một số tính chất ưu việt hơn: độ dẻo dai, độ bền cơ học, khả năng polymer hoá cao… Nhờ vào một số đặc tính lý hoá vượt trội mà màng BC ngày nay được coi như một nguồn polymer sinh học mới, một nguồn nguyên liệu có tiềm năng. Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra thêm một số tính năng đặc biệt của màng như : bám chắc vào bề mặt khi nước bốc hơi lại có thể di chuyyển qua, ngăn cản được sự xâm nhập của vi khuẩn… [7], [8]. Nhờ đó mà màng BC được ứng dụng trong rất nhiều các lĩnh vực khác nhau: công nghệ thực phẩm làm thạch dừa là đồ ăn tráng miệng khá phổ biến, trong công nghệ sản xuất giấy chất lượng cao, trong y học làm màng thay thế cho da tạm thời ở các bệnh nhân bỏng, một loại màng siêu thấm, trong khoa học vật liệu mới L« ThÞ B¶o Kh¸nh 6 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt với việc sản xuất micro chất lượng cao, tác dụng trong bảo vệ môi trường do sản xuất ra EM (Effective Micorgamisms)... [11]. Ở Việt Nam việc nghiên cứu, sử dụng màng BC mới chỉ được quan tâm trong thời gian gần đây và mới thu được những kết quả bước đầu (dùng màng đắp lên vết thương hở, dùng màng đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ) [7], [8]. Việc nghiên cứu ra một môi trường dinh dưỡng tối ưu nhất cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển, chế tạo màng sinh học trên quy mô công nghiệp vẫn đang là hướng nghiên cứu được nhiều tác giả quan tâm. Với mong muốn được tìm hiểu rõ hơn, tìm ra môi trường dinh dưỡng tối ưu cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum và những ứng dụng hữu ích của màng BC trên cơ sở kế thừa những kết quả thu được của các tác giả đã nghiên cứu trước mà tôi quyết định chọn đề tài: “ Phân lập, tuyển chọn và tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho chủng Acetobacter xylinum H6, chế tạo màng sinh học’’. L« ThÞ B¶o Kh¸nh 7 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter ( vi khuẩn giấm) Giấm là một sản phẩm rất quen thuộc có từ lâu đời mà cho đến ngày nay vẫn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và đời sống hàng ngày. Từ xa xưa con người đã biết làm giấm dựa vào kinh nghiệm thực tế của mình mà họ chưa hiểu gì về cơ sở khoa học, càng không giải thích là bằng cách nào rượu loãng có thể biến thành giấm ăn. Cho đến đầu thế kỉ XIX, khi khoa học kĩ thuật phát triển, đặc biệt với sự ra đời của kính hiển vi, thế giới vi sinh vật dần được khám phá. Con người cũng giải thích được cơ chế của quá trình lên men tạo giấm (Vinnnegar) nhờ một nhóm vi sinh vật mà ngày nay các nhà khoa học gọi chúng là vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn axetic, vi khuẩn giấm [4], [5]. Năm 1822, Person tiến hành những nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn Acetobacter từ lớp màng thu được trên bề mặt các bình sản xuất giấm. Ông khẳng định đó là một loại vi sinh vật, gọi là Mycoderma aceti [7]. Đến năm 1837, Kiitzing tiếp tục tìm hiểu sau khi loại bỏ hết các vi sinh vật trong chum làm giấm và thấy rằng giấm không được tạo thành. Ông đã đưa ra nhận xét: quá trình lên men giấm nhất thiết phải có vi sinh vật nếu không sẽ không diễn ra sự chuyển hoá rượu thành giấm. Cũng trong năm 1837, Hansen (người Đan Mạch) đã tách được từ màng giấm hai loại vi khuẩn thuần khiết là: Mycoderma aceti và Mycoderma pastuerianum. Từ năm 1862 đến năm 1868, Pasteur với sự trợ giúp đắc lực của kính hiển vi đã chứng minh được sự đúng đắn trong nhận xét của Kiitzing, Hansen và khẳng định bản chất của quá trình lên men giấm. Ông tiếp tục tiến hành L« ThÞ B¶o Kh¸nh 8 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt nghiên cứu lớp màng nhầy xuất hiện trên bề mặt bia, rượu vang và đưa đến kết luận: màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn mà ông gọi tên là Mycoderma aceti. Cùng với những nghiên cứu trên về vi khuẩn Acetobacter, các nghiên cứu tiếp theo cũng như những nghiên cứu sau này đều nhằm mục đích tìm hiểu rõ thêm và tìm cách cải thiện quá trình lên men giấm. Từng bước nghiên cứu những ứng dụng mới của vi khuẩn Acetobacter bằng cách phân lập các chủng vi khuẩn thuần khiết, nghiên cứu các đặc điểm cấu tạo, sinh lý, sinh hoá của chúng để tìm ra những chủng tốt nhất cho từng ứng dụng dựa trên cơ sở là các tiêu chuẩn phân loại đã được đưa ra. 1.2. Phân loại Acetobacter 1.2.1. Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn Acetobacter Để phân loại vi khuẩn Acetobacter có mốt số tiêu chuẩn phân loại : + Đặc điểm phân lập: là nơi cư trú có liên quan đến điều kiện môi trường sống. + Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả năng di động, vỏ nhầy, màu sắc khi tế bào nhuộm Gram… + Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái, đặc điểm, đặc tính (trơn, xù xì…), tính chất (đục, trong…), màu sắc…của vết mọc (khuẩn lạc) trên môi trường thạch. Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng cần lưu ý đến sự biến đổi của môi trường sau một thời gian nuôi cấy (môi trường đục hay trong, có mùi thơm hay không mùi, có màu vàng nâu hay vàng nhạt). + Đặc điểm sinh hoá (theo khoá phân loại của Pasteur, 1950) - Khả năng tạo catalase - Khả năng tổng hợp các xeto từ các rượu bậc cao như: glyxerol, manitol, sorbitol. - Khả năng oxi hoá axetat thành CO2 và H2O. L« ThÞ B¶o Kh¸nh 9 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt - Khả năng oxi hoá glucozơ thành axit gluconic. - Khả năng sử dụng muối amon làm nguồn nitơ trong môi trường Hoyer và sử dụng rượu etylic làm nguồn cacbon. - Khả năng tạo sắc tố nâu. - Khả năng tổng hợp cellulose. Ngoài các tiêu chuẩn trên, hiện nay khi phân loại Acetobacter, các tác giả còn sử dụng sinh học phân tử để giải trình tự rARN 16S. 1.2.2. Lược sử phân loại Acetobacter Ngay từ thế kỷ XIX, các tác giả đã tiến hành phân lập Acetobacter thành các chủng thuần khiết và tiến hành phân loại chúng. Trong đó, khóa phân loại của Beijerinck (1899) đã thu hút được sự quan tâm của nhiều tác giả. Ông đã chia vi khuẩn axetic thành 4 nhóm cơ bản. Năm 1916 kế tiếp nghiên cứu của Beijerinck, Janke đã phân loại vi khuẩn axetic thành 4 nhóm dựa trên 2 dấu hiệu sau: - Một là: khả năng sử dụng đạm amoni để thực hiện quá trình sinh trưởng và phát triển của mình. - Hai là: có hay không giai đoạn di động trong quá trình phát triển. Dựa vào nơi sống đặc trưng của vi khuẩn axetic mà năm 1926, Heneberg đã chia chúng thành 4 nhóm khác nhau: - Nhóm 1: vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa hublon độc với chúng. - Nhóm 2: vi khuẩn có khả năng phát triển trên bia. - Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang. - Nhóm 4: vi khuẩn để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh. Năm 1934, theo các nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ, vi khuẩn axetic có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của C và N từ đó vi khuẩn axetic có tên là vi khuẩn Acetobacter. L« ThÞ B¶o Kh¸nh 10 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt Đến năm 1936, các tác giả Kenyver, Wanneil, Staniel cùng đề xuất ý kiến ghép vi khuẩn Acetobacter vào họ Pseudomonas do chúng co hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động. Năm 1948, Vanghn tiếp tục nghiên cứu và công bố kết quả thu được khi quan sát sự di động của nhiều loại vi khuẩn: Acetobacter aceti, Acetobacter oxydans, Acetobacter zancens, Acetobacter melanoginum, Acetobacter pasteurianum. Ông kết luận những loài trên đều thuộc một loại có đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn Acetobacter trong họ Pseudomonadacae. Cùng năm 1948, Krassilhicov cũng như các tác giả Mỹ nghiên cứu về xạ khuẩn và vi khuẩn đều thống nhất xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ Pseudomonadacae. Năm 1914, Bergeys đã đưa ra khoá phân loại. Trong đó ông phân Acetobacter thành 2 loại: Loại 1: có khả năng oxi hoá axit axetic thành CO2 và H2O bao gồm: a/ Sử dụng muối amoni làm nguồn N duy nhất (dung dịch Hoyer) đại diện là vi khuẩn Acetobacter aceti. b/ Không sử dụng muối amoni làm nguồn N duy nhất + Trên môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy chứa cellulose, đại diện là : Acetobacter xylinum. + Trên môi trường dịch thể không tạo màng nhầy chứa cellulose, đại diện là: Acetobacter pasteurianum, Acetobacter kneiziiganus, Acetobacter rancens Loại 2: không có khả năng oxi hoá axit axetic. a/ Tạo sắc tố nâu trên môi trường glucozơ. - Sắc tố nâu tối tới đen nhạt đại diện là: Acetobacter melanogenus. - Sắc tố hồng, đại diện là: Acetobacter rasens. L« ThÞ B¶o Kh¸nh 11 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt b/ Không tạo sắc tố - Nhiệt độ thích hợp nhất là 30 - 350C: Acetobacter suboxydans. - Nhiệt độ thích hợp nhất là 18 - 210C: Acetobacter oxydans. Khoá phân loại của Frateur được nhiều người ủng hộ với 4 nhóm vi khuẩn axetic là: Acetobacter subosydans Acetobacter mezoxydans Acetobacter oxydans Acetobacter peroxydans Cho đến nay, khoá phân loại của Bergey và nhiều tác giả khác xếp vi khuẩn Acetobacter và vi khuẩn Glucobacter thuộc vào một họ riêng tên là: Acetobacteriaceae. Sau này rất nhiều nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu và vẫn còn nhiều tranh luận khác nhau về sự phân loại đồng nhất vi khuẩn Acetobacter nhưng tất cả các nghiên cứu trên đều tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, đồng thời đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc ứng dụng vi khuẩn Acetobacter vào đời sống thực tiễn. 1.3. Đặc điểm chủng của Acetobacter [4], [6], [7], [8] Vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men axit axetic. Dựa vào đặc điểm và tiêu chuẩn phân loại học mà xếp chúng thuộc 2 giống: - Acetobacter có chu mao hoặc không có chu mao. - Gluconobacter đơn mao. Bergey (1989), Lapent et al (1990) thì Acetobacter và Gluconobacter là 2 giống vi khuẩn quan trọng nhất của họ Acetobacteriaceae. Hai giống này giống rất phổ biến trong tự nhiên như trên bề mặt lá, hoa quả…Chúng đều có khả năng tạo axetic từ rượu etylic. Ở tế bào Gluconobacter không có chu trình L« ThÞ B¶o Kh¸nh 12 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt Tricacboxylic (ATC) nên không thể diễn ra quá trình oxi hoá axetat song lại có một chu trình khác thay thế (chu trình Glyoxylat). Ngược lại, ở tế bào Acetobacter xảy ra các quá trình trên. Khi so sánh hai giống trên với những vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas thấy chúng có những điểm tương đồng. Cũng có một số điểm mà hai giống trên khác Pseudomonas như: chịu được nồng độ axit cao hơn, khả năng chuyển hoá pepton yếu hơn, không sinh sắc tố, ít di động hơn. Một số loài vi khuẩn axetic khi phát triển trên môi trường nghèo chất dinh dưỡng hay thời gian nuôi cấy lâu ngày (môi trường già) hình thái dễ bị biến đổi (tế bào phình to, kéo dài hoặc phân nhánh) [1]. Khi tiếp tục nghiên cứu hai giống với các vi khuẩn thuộc Pseudomonas để xếp chúng thành các nhóm độc lập và thu được một số kết quả. Bảng 1.1. Những đặc điểm phân biệt, so sánh Acetobacter, Gluconobacter với Pseudomonas Đặc điểm so sánh Gluconobacte 1. Vị trí tiên mao + 2. Phát triển ở pH = 4.5 + 3.Oxi hóa etanol ở pH= 4.5 + 4. Oxi hóa axit axetic 5. Oxi hóa lactat 6. Glucozơ  gluconate + 7.Sử dụng tinh bột, lactozơ 8. Sử dụng gelatin 9. Sắc tố huỳnh quang Ghi chú: Dấu (+): có Dấu (-): không Acetobacter Chu mao +/+ + + + +/ - Pseudomonas Tiên mao ở cực + + +/ +/ +/ +/ Dấu (+/-): có hoặc không Vi khuẩn Acetobacter là những trực khuẩn hình que hay hình elip, đứng độc lập hay xếp thành chuỗi, kích thước khoảng 0,6 – 0,8 m, có hoặc không có tiên mao, sống và phát triển trong điều kiện hiếu khí bắt buộc hoá dị dưỡng hữu cơ, không sinh bào tử, bắt màu Gram âm, thích hợp với pH = 5,4 – 6,8, L« ThÞ B¶o Kh¸nh 13 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt nhiệt độ 25 – 300C, có khả năng oxi hoá rượu etylic thành axit axetic, khả năng oxi hoá hoàn toàn các hợp chất hữu cơ (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeton hoặc các axit hữu cơ tương ứng. 1.3.1. Đặc điểm khuẩn lạc Acetobacter Khi nghiên cứu về khuẩn lạc của vi khuẩn axetic trên môi trường đặc, người ta thấy rằng: khuẩn lạc đều đặn, đường kính khuẩn lạc trung bình 3mm riêng 1 số loài như: Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum có khuẩn lạc nhỏ hơn đường kính d = 1mm, bề mặt trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên dày và sẫm màu hơn xung quanh. Nhưng một số loài khác thì khuẩn lạc có đường kính nhỏ hơn (d = 4 -5 mm), bề mặt trơn nhẵn không màu, mỏng như hạt sương nhỏ, có thể dùng que nuôi cấy tách ra khỏi môi trường dễ dàng. Tuy nhiên cũng có những khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường, khó có thể gạt ra bằng que nuôi cấy. 1.3.2. Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng Ở môi trường lỏng vi khuẩn Acetobacter có sự hình thành màng trên mặt thoáng, màng tạo thành có độ dày mỏng khác nhau và đặc điểm của các loại màng cũng khác nhau. Có loại màng dày như sứa, nhẵn và trơn bóng, khi lắc nhẹ sẽ chìm xuống đáy bình và có thể tiếp tục hình thành 1 lớp màng mới. Có loại màng mỏng như tờ giấy celophen, dai, nhẵn, khi lắc cũng chìm xuống đáy bình và hình thành nên 1 lớp màng mới, dịch nuôi cấy trong và có mùi thơm dễ chịu. Khi nghiên cứu màng này thấy có nhiều sợi cellulose giống như sợi bông, chắc khoẻ được đan kết với nhau bởi chính các vi khuẩn Acetobacter tạo nên độ dẻo dai, độ đàn hồi tốt và tính chắc khoẻ của màng. Có những màng lại rất mỏng, dễ vỡ, không nhẵn mà nhăn nheo, bám theo thành bình, dịch nuôi cấy thường có màu vàng nâu, không trong va không có mùi thơm dễ chịu. L« ThÞ B¶o Kh¸nh 14 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt Từ những quan sát về đặc điểm của khuẩn lạc và đặc điểm của các loại màng được hình thành nó cũng góp phần sơ bộ về định dạng các loại màng của vi khuẩn Acetobacter. 1.3.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter [1] Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter là rất phong phú. Nguồn C, N và các chất kích thích sinh trưởng cung cấp cho quá trình này là hết sức đa dạng: nguồn C có thể cung cấp từ các hợp chất đường: glucozơ, saccarozơ, rượu etylic và axit hữu cơ. Muối amon làm nguồn cung cấp N, muối photphat làm nguồn P . Ngoài ra, các chất sinh trưởng như: các axit amin (Izoloxin, alanin, prolin, valin), axit nicotinic, axit pantoneic, axit folic, biotin nicotinamid… đều có vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Acetobacter. Một số loài vi khuẩn có khả năng tự tổng hợp polysaccarit phân tử lớn như cellulose, dextran… (Acetobacter xylium, Acetobacter aceti, Acetobacter kiitzingianum…). Điển hình là vi khuẩn Acetobacter xylinum có thể tổng hợp được những sợi cellulose giống như những sợi bông. 1.3.4.Con đường chuyển hoá cacbon Nghiên cứu về khả năng chuyển hóa C các tác giả đã đi đến kết luận: vi khuẩn axetic có thể oxi hóa các bon theo những con đường sau: + Con đường thứ nhất: không có sự photphoril hóa cơ chất và sự tham gia của các enzym đặc hiệu. + Con đường thứ hai: oxy hóa cơ chất đã được photphoril hóa trong con đường pentozophotphat. + Con đường thứ ba: Entner – Doudoroff (ED). + Con đường thứ tư: chu trình Krebs hoặc Glyoxinat L« ThÞ B¶o Kh¸nh 15 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt 1.3.5. Đặc điểm một số loài vi khuẩn Acetobacter 1.3.5.1. Acetobacter aceti Trực khuẩn ngắn, kích thước 0,4 – 0,8 x 1 – 1,2 m, không di động được, thường xếp thành chuỗi dài, bắt màu Gram âm, màu vàng với thuốc nhuộm iot. Khuẩn lạc to, sáng trên gelatin với dịch lên men chứa 10 % đường saccarozơ tạo thành màng nhầy, nhẵn. Chúng có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ rượu cao (11 %) và có thể tích luỹ đến 6 % axit axetic trong môi trường. Chúng thường phát triển trên môi trường bia với nhiệt độ thích hợp là 300C. 1.3.5.2. Acetobacter xylinum Trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2 m, tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, không di động được, thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, các tế bào được bao bởi chất nhầy tạo váng nhăn và dày khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iốt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của cellulose), chúng có thể tích luỹ 4,5 % axit axetic trong môi trường. Khi nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum trên môi trường lỏng sẽ hình thành trên bề mặt lớp màng , màng là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose. Trong tế bào xảy ra quá trình trao đổi chất nói chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình trao đổi oxy và các chất dinh dưỡng [9]. Vi khuẩn Acetobacter xylinum thường sống chung với nấm men trong “nấm chè” còn gọi là “thuỷ hoài sâm”, “hải bảo”, hay “vị bảo” – một loại nước chua có vị thơm dùng để pha nước giải khát trong gia đình, trên bề mặt có một váng vi sinh vật được nuôi cấy bằng nước chè đường. 1.3.5.3. Acetobacter pasteurianum Có hình dạng tương tự như Acetobacter aceti nhưng váng vi khuẩn có dạng khô và nhăn nheo, bắt màu xanh của thuốc nhuộm iốt, tế bào xếp dời L« ThÞ B¶o Kh¸nh 16 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt nhau thành chuỗi, đôi khi bắt gặp tế bào có dạng hình chuỳ phồng lên, di động không thuờng xuyên. Khuẩn lạc trên gelatin nhỏ, tròn. Nhiệt độ thích hợp để phát triển là 300C. 1.3.5.4. Acetobacter acetosum Trực khuẩn có kích thước 0,4 – 0,8 x 1 m. Các tế bào xếp riêng rẽ thành từng chuỗi, không di động được. Nhiệt độ thích hợp nhất cho chúng phát triển là 300C – 360C. 1.3.5.5. Acetobacter kiitzingianum Có màng nhày, nhẵn ở mép và được nâng cao lên thành bình. Tế bào dạng trực khuẩn, ngắn, to, thô, không di động. Khuẩn lạc trên Gelatin với dịch lên men nhớt, nhỏ, tạo thành màng xếp nếp trên môi trường ẩm. Thích hợp phát triển ở 300C. 1.3.5.6. Acetobacter shiitzenbacchii Trực khuẩn khá dài, kích thước khoảng 0,3 – 0,4 x 1,0 – 3,6 m, thường xếp đôi hoặc đứng riêng rẽ, có thể tạo váng nhầy và không bền vững. Có khả năng tích luỹ trong môi trường đến 11,5 % axit axetic, do đó thường được sử dụng để chưyển hoá rượu thành giấm theo phương pháp Đức (phương pháp nhanh). 1.3.5.7. Acetobacter lindreni Trực khuẩn xếp riêng rẽ tạo chuỗi, thỉnh thoảng có tế bào phồng to hình cầu, không di động. Khuẩn lạc trên gelatin với dịch lên men tròn, nhỏ, màu vàng, trên môi trường lỏng tạo váng màu nâu, nhớt. Thích hợp phát triển ở 250C. 1.3.5.8. Acetobacter orleanense Trực khuẩn dài trung bình, không di động, gặp điều kiện nhiệt độ cao có thể sinh ra tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to.Tạo váng vi khuẩn rất dày trên môi trường lỏng. Có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu cao L« ThÞ B¶o Kh¸nh 17 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt (10 % - 12%) và tích luỹ đến 9,5% axit axetic. Thường được dùng để chuyển hoá rượu vang thành giấm theo phương pháp Pháp (phương pháp chậm hay phương pháp Orleans). Thích hợp phát triển ở 250C – 300C. 1.3.5.9. Acetobacter suboxydans Có dạng hình que ngắn, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi ngắn, không có khả năng di động, tạo thành những váng mỏng, dễ vỡ. Có khả năng chuyển hoá glucozơ thành axit gluconic, oxy hoá rượu sobit thành socboza - dùng để sản xuất axit ascorbic – vitamin C. Loại vi khuẩn này muốn phát triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng: axit para aminobenzoic, axit pantoneic, axit nicotinic. 1.3.5.10. Acetobacter hoshigakii Trực khuẩn có kích thước 0,7 – 0,9 x 1,5 – 1,8 m, thường xếp riêng rẽ, không di động. Khuẩn lạc trên thạch với chất chiết rút từ đậu nành nhỏ, tròn, dạng hạt xám sau đó chuyển thành màu nâu. Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên men tròn, màu trắng sữa, về sau phần giữa khuẩn lạc hoá nâu, phía ngoài màu vàng nhạt. Có khả năng tạo thành axit gluconic. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là từ 300C – 350C. 1.3.5.11. Acetobacter ascendens Trực khuẩn không di động, các khuẩn lạc trên glucozơ, genlatin khô trắng với vành sáng chói. Trên môi trường lỏng tạo thành màng nhầy chắc, nâng lên theo thành bình. Thích hợp phát triển ở 250C. 1.3.5.12. Acetobacter oxydans Trực khuẩn có kích thước 0,8 – 1,2 x 2,4 – 2,7 m, các tế bào rời nhau hoặc xếp thành chuỗi. Quan sát trong chuỗi thấy có tế bào phồng to lên, di động. Khuẩn lạc trên gelatin tròn sau trở thành dạng không cân đối với sự phân nhánh đặc trưng. Nhiệt độ thích hợp từ 180C – 210C. L« ThÞ B¶o Kh¸nh 18 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt 1.3.5.13. Acetobacter plancatum Trực khuẩn có kích thước 0,4 – 0.6 x 1,4 – 1,6 m, không di động. Khuẩn lạc rượu vang trên gelatin tròn trịa, hơi nhô lên, sáng, ẩm ướt, nhớt. Nhiệt độ thích hợp từ 250C – 300C [4]. Hầu hết các loài Acetobacter thường phát triển tốt nhất ở 250C – 300C, đều có khả năng sử dụng muối phophat, đa số đòi hỏi cung cấp thêm vitamin, chúng có khả năng oxy hoá rượu thành axit và trong quá trình sinh trưởng, phát triển chúng tạo ra một lớp màng dày có bản chất cellulose trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Với những nghiên cứu hiện nay cho thấy lớp màng này có thể được ứng dụng vào rất nhiều nghành quan trọng có ý nghĩa thực tiễn trong cuộc sống. Đồng thời khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn trên rất khác nhau vì vậy cần phải tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt nhất và phù hợp với mục đích sử dụng của từng loại màng. 1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men axetic Quá trình lên men axetic là quá trình oxi hoá rượu etylic thành axit axetic trong môi trường khác nhau dưới tác dụng của Acetobacter. Sự chuyển hoá rượu etylic thành axit axetic bao gồm 2 giai đoạn: + Giai đoạn 1: rượu chuyển hoá thành axetaldehyt + Giai đoạn 2: axetaldehyt chuyển hoá thành axit axetic Quá trình lên men này được mô tả cụ thể như sau: L« ThÞ B¶o Kh¸nh 19 Líp K30b- Sinh Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn nghµnh vi sinh vËt Hình 1.1. Cơ chế quá trình oxy hoá rượu etylic thành axit axetic 1.5. Các yếu tố điều kiện và môi trường ảnh hưởng đến lên men axetic [4] Ebner và Hromatka (1949 – 1953) cho rằng: axit axetic được tạo thành bởi chính tế bào sinh sản. Dưới tác dụng của vi khuẩn Acetobacter mà nhờ quá trình lên men rượu etylic tạo thành axit axetic. Bởi vậy các yếu tố như: thành phần môi trường, nhiệt độ, chế độ thông khí…đều ảnh hưởng đến quá trình lên men. L« ThÞ B¶o Kh¸nh 20 Líp K30b- Sinh
- Xem thêm -