Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn bacillus subtilis từ bã bùn bia

  • Số trang: 60 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 64 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ BÃ BÙN BIA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS. TS. TRẦN NHÂN DŨNG SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN MINH THÙY MSSV: 3084035 LỚP: CNSHTT K34 Cần Thơ, Tháng 5/2013 Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp em đã nhận được rất nhiều sự hỗ trợ quý báu. Xin chân thành cảm ơn đến gia đình ba mẹ và anh chị đã hỗ trợ về mọi mặt cho em trong thời gian làm đề tài. Xin chân thành cảm ơn Thầy Trần Nhân Dũng đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em hoàn thành luận văn này Xin chân thành cảm ơn Cô Bùi Thị Minh Diệu, Thầy cố vấn Nguyễn Hữu Hiệp và tất cả các thầy cô đã giúp đỡ và chỉ dạy tận tình cho em trong suốt quá trình học Đại Học. Xin chân thành cảm ơn các anh, chị, các cán bộ của Phòng thí nghiệm vi sinh vật, Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Phòng thí nghiệm Hóa sinh thực phầm đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ em trong thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Sinh học tiên tiến khóa 34, các em khóa dưới và đội văn nghệ của viện đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ em trong thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn đến tất cả sự hỗ trợ và giúp đỡ quý báu. Sinh viên Nguyễn Minh Thùy Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. Trần Nhân Dũng SINH VIÊN THỰC HIỆN Nguyễn Minh Thùy DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Vi khuẩn Bacillus subtilis là dòng vi khuẩn có nhiều ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực như y học, chế biến thực phẩm, chăn nuôi thú y, nuôi trồng thủy sản và đặc biệt là xử lý ô nhiễm môi trường, giúp phân hủy các chất cặn bã, bùn đáy ... Đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn Bacillus subtilis từ bã bùn bia và nước thải” cho kết quả phân lập được 21 dòng vi khuẩn, trong đó 9 dòng phân lập từ bã bùn bia (Bs1, Bs2, Bs3, Bs4, Bs5, Bs6, Bs7, Bs8, Bs9) và 12 dòng phân lập từ nước thải của hố bùn bia (BN1, BN2, BN3, BN4, BN5, BN6, BN7, BN8, BN9, BN10, BN11, BN12) Trong số 21 dòng vi khuẩn đã phân lập được, có 16 dòng đạt yêu cầu khi nhuộm Gram (Gram dương). Sau khi kiểm tra các hoạt tính sinh hóa như Catalase, Amylase, Methyl Red, Protease và nhuộm bào tử có 8 dòng vi khuẩn (Bs1, Bs2, Bs4, BN1, BN2, BN5, BN9, BN12) đạt yêu cầu có bào tử và có khả năng tạo các enzyme trên và phản ứng (+) với thuốc thử Methyl Red. Tất cả kết quả được mang so sánh với vi khuẩn Bacillus subtilis (phòng sinh hóa thực phẩm là đối chứng dương). Tám dòng vi khuẩn này được thực hiện phản ứng PCR (Polymerase chain reaction) với cặp mồi 16S-9F và 16S-1525R. Phổ điện di cho kết quả 8 dòng vi khuẩn phân lập được và cả dòng Bacillus subtilis đối chúng dương đều cho kết quả ở 1500bp. Dựa trên kết quả về đặc điểm hình thái, nhuộm Gram và các phản ứng sinh hóa các dòng vi khuẩn trên được giải trình tự cho kết quả: 2 dòng mang kí hiệu Bs4 và BN5 là Bacillus subtilis (99% và 98% ), cho thấy Bacillus subtilis có mặt ở cả 2 mẫu bã bùn bia và nước thải. Các dòng còn lại có 2 dòng mang kí hiệu Bs2, BN9, cũng đồng thời ở cả mẫu bã bùn bia và nước thải, là vi khuẩn Bacillus megaterium, đây cũng là một dòng vi khuẩn có triển vọng trong ứng dụng về vi sinh môi trường. Từ khóa: Bacillus subtilis, bã bùn bia, nước thải,16S-9F, 16S-1525r Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ..................................................................................................... i PHẦN KÝ DUYỆT ........................................................................................... iii TÓM LƯỢC...................................................................................................... iv MỤC LỤC .......................................................................................................... v DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................ vii DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................... viii TỪ VIẾT TẮT .................................................................................................. ix CHƯƠNG 1.GIỚI THIỆU ................................................................................ 1 CHƯƠNG 2.LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................ 3 2.1 Sơ lược về bã bùn bia ........................................................................ 3 2.2 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................. 3 2.3 Phân loại vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................... 4 2.4 Nghiên cứu về Bacillus subtilis trong và ngoài nước..................... ...5 2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .................................... 6 2.6 Điện di Agarose gel ............................................................................. 7 2.7 Khuếch đại 16S – 23S rRNA cho nghiên cứu phả hệ loài ................. 8 2.8 Giải trình tự vi khuẩn ........................................................................ 10 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ ................................................................................................................... 11 3.1. Phương tiện nghiên cứu .................................................................... 11 3.1.1 Dụng cụ, thiết bị .................................................................... 11 3.1.2 Nguyên vật liệu ..................................................................... 11 3.1.3 Hóa chất và môi trường ........................................................ 11 (a) Môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis ................................................... 11 (b) Môi trường kiểm tra đặc tính sinh hóa .................................................. 11 3.1.4 Địa điểm thí nghiệm ............................................................. 12 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT 3.2 Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 13 3.2.1 Phương pháp thu mẫu .......................................................... 13 3.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis ............... 13 3.2.3 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................................................................... 13 3.2.4 Đo kích thước tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis ................... 13 3.2.5 Nhuộm Gram vi khuẩn Bacillus subtilis .............................. 16 3.2.6 Nhuộm bào tử Bacillus subtilis ............................................. 15 3.2.7 Các phản ứng sinh hóa để xác định vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................................................................................... 16 (a).Kiểm tra Catalase ................................................................................. 16 (b). Kiểm tra Methyl Red ............................................................................ 16 (c).Hoạt tính ezyme protease ...................................................................... 16 (d).Hoạt tính enzyme amylase .................................................................... 16 3.2.8 Trích DNA của các dòng vi khuẩn đã khảo sát ................... 17 3.2.9 Nhận diện các dòng vi khuẩn đã khảo sát bằng kỹ thuật PCR ................................................................................................................... 17 3.2.10 Điện di gel agarose sản phẩm PCR và chụp hình gel ........ 18 3.2.11 Giải trình tự dòng vi khuẩn phân lập được ....................... 19 CHƯƠNG 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 21 4.1.1 Phân lập vi khuẩn...........................................................................20 4.1.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập được ....................................................................................................................20 4.1.3 Hình dạng và khả năng chuyển động của tế bào vi khuẩn ...........23 4.1.4 Kích thước và nhuộm Gram các tế bào vi khuẩn .........................23 4.1.5 Khả năng tạo Catalase của vi khuẩn .............................................25 4.1.6 Kiểm tra hoạt tính Amylase của vi khuẩn .....................................26 4.1.7 Kiểm tra hoạt tính tạo Protease của vi khuẩn ..............................27 4.1.8 Khả năng phản ứng với Methyl Red .............................................28 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT 4.1.9 Nhuộm bào tử các tế bào vi khuẩn ................................................29 4.1.10 Sản phẩm PCR với cặp mồi 16S-9F và 16S-1525r ......................32 4.2 Giải trình tự .......................................................................................32 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..............................................45 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 22 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................... 2 Hình 2. Quy trình sản xuất bia ........................................................................ 3 Hỉnh 3. Cấy ria trên môi trường dinh dưỡng và trữ mẫu ròng ......................... 20 Hình 4. Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn đã phân lập .................................. 21 Hình 5. Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn ............................................................ 23 Hình 6. Bọt khí tạo thành do enzyme Catalase phản ứng với H2O2 ................ 25 Hình 7. Enzyme Amylase phân hủy tinh bột làm mất màu iod ....................... 26 Hình 8. Cấu trúc amylose của tinh bột ........................................................... 27 Hình 9. Vòng halo tạo thành trên môi trường sữa ........................................... 27 Hình 10. Biểu đồ đường kính vùng sáng của các dòng vi khuẩn..................... 28 Hình 11. Vi khuẩn làm đổi màu Methyl Red .................................................. 28 Hình 12. Bào tử của tế bào vi khuẩn .............................................................. 29 Hình 13. Sản phẩm PCR với cặp mồi (16S-9F và 16S-1525r) (Jang-Seu ki et al.,2009) ................................................................................ 32 Hình 14. Kết quả giải trình tự dòng Bs4 ......................................................... 33 Hình 15. Kết quả giải trình tự dòng BN5 ....................................................... 34 Hình 16. Kết quả giải trình tự dòng Bs1 ......................................................... 35 Hình 17. Kết quả giải trình tự dòng Bs2 ......................................................... 36 Hình 18. Kết quả giải trình tự dòng BN9 ....................................................... 37 Hình 19. Kết quả giải trình tự dòng BN12...................................................... 38 Hình 20. Tế bào vi khuẩn Bacillus Megaterium ............................................. 40 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập được ............................22 Bảng 2: Đặc điển tế bào vi khuẩn các dòng đã phân lập được ..............................24 Bảng 3: Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa ....................................................30 Bảng 4: Đặc tính sinh hóa những dòng chọn thực hiện phản ứng PCR .................31 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT B. Bacillus DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EtBr Ethibrium Bromide EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid ITS Internal Transcribed Spacer LB Luribernate MR Methyl Red PCR Polymerase Chain Reaction rADN ribosomal Acid Deoxyribonucleic rARN ribosomal Acid Ribonucleic TSA Tryptic Soy Agar TSA Tryp tic soy agar Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Đặt vấn đề: Vi khuẩn thuộc giống Bacillus có tiềm năng lớn về các enzyme ngoại bào. Nhiều trong số các enzyme ngoại bào là những enzyme thủy phân các phân tử hữu cơ lớn. Chính vì thế vi khuẩn này có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp thực phẩm, dược phẩm thuộc da và đặc biệt là trong xử lý chất thải giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Năm 1977 Priest đã nghiên cứu và chứng minh một chủng vi khuẩn Gram dương, tạo bào tử là vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp và sản xuất ra protease, esterase, và một số loại exoenzyme (enzyme ngoại bào) … Các phẩm chất về công nghệ sinh học, cùng với khả năng tạo bào tử và nảy mầm đã làm Bacillus (đặc biệt là Bacillus subtilis) trở thành hệ thống di truyền tiêu biểu cho các vi khuẩn Gram dương. (Lê Thị Lan, 1997; Priest, 1993). Bia là một sản phẩm nước uống ngày càng được ưa chuộng và rất thông dụng vào các dịp lễ Tết ở Việt Nam. Trong quy trình sản xuất bia bã bùn bia được thải ra là một môi trường nhiều dinh dưỡng cho các loại vi sinh vật phát triển. Mỗi ngày, khoảng 2 tấn bùn bia được thải ra từ một nhà máy sản xuất bia ở Bạc Liêu mà chưa có hướng giải quyết, gây nên ô nhiễm môi trường. Chính vì những đặc tính sinh học về enzyme ngoại bào nói trên của vi khuẩn Bacillus subtilis về thủy phân các phân tử hữu cơ lớn. Bã bùn bia là một môi trường giàu dinh dưỡng và chất hữu cơ nên đề tài quyết định chọn phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ trong bã bùn bia và nước thải của hố bùn bia trong quá trình sản xuất bia. Đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn Bacillus subtilis từ bã bùn bia” được thực hiện với mục tiêu phân lập, nhận diện các đặc tính hình thái sinh hóa và bằng phương pháp sinh học phân tử dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, qua đó tuyển chọn dòng có khả năng tổng hợp enzyme protease, amylase, catalase có hoạt tính cao. Với mục đích tận dụng bã bùn bia làm phân bón vi sinh cho cây và giúp giảm ô nhiễm môi trường. Mục tiêu đề tài: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ bã bùn bia và nước thải trong quá trình sản xuất. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về bã bùn bia Hình 1. Quy trình sản xuất bia (http://my.opera.com/gianghugo/blog/show.dml/38236692) Bã bùn bia là chất thải đọng lại khi trong quy trình sản xuất bia của nhà máy bia bao gồm cả cặn ở lần lắng và lọc trong quy trình sản xuất hay nói cách khác là chất thải sau cùng nhất của toàn bộ quá trình sản xuất. Sau khi sản xuất bia, nước thải chảy xuống hố xử lý nước thải, phần còn lắng lại là bã bùn bia. Vì lượng sản xuất bia rất lớn nên hố chất thải giải phóng ra hai tấn bã bùn bia một ngày. Nên phân biệt bã bùn bia với bã malt và bã cháo nấu bia là hai phế từ giai đoạn đầu. 2.2 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT Bacillus subtilis được Ferdinand Cohn- một cộng sự của Robert Koch mô tả và đặt tên năm 1872. Đó là một loại vi khuẩn Gram dương, có khả năng mọc được khi có sự hiện diện của oxi và có thể tạo thành dạng đặc biệt khi tế bào ở trạng thái nghỉ ngơi được gọi là nội bào tử (endospore). Bacillus subtilis là vi khuẩn đại diện cho loài Bacillus của họ Bacillaceae (Kenneth Todar, 2009). Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, có khả năng tạo bào tử (Perez et al., 2000). Sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis nhằm giúp chúng chống chịu được với điều kiện khắc nghiệt của môi trường như nhiệt độ, nồng độ muối, và giúp chúng có thể tồn tại một thời gian dài. (Panuwan Chantawannakula et al., 2002). Vi khuẩn Bacillus subtilis có hình dạng que dài và thẳng, kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10 µm, trong tự nhiên Bacillus subtilis thường tồn tại ở trạng thái bắt cặp hoặc tạo thành chuỗi dài chuỗi dài, với đầu tròn hoặc vuông. Thường là vi khuẩn Gram dương và có thể di chuyển nhờ vào những roi bao xung quanh. Bào tử có hình oval hoặc đôi lúc hình tròn hoặc hình trụ có khả năng chống chịu cao với nhiều điều kiện khác nhau, không nhiều hơn một bào tử cho mỗi tế bào (John G.Holt et al., 1994). Hầu hết chúng đều có tiêm mao, vách tế bào được cấu tạo bởi peptidoglycan chứa meso-diaminopimelic. Chúng có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease, amylase và enzyme Catalase. Phát triển ở nhiệt độ từ 35 đến 45°C và pH thích hợp là 4,5 (Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy Dương, 2003 ; Leser et al., 2007 ; Slepecky và Hemphill, 2006). Các vi khuẩn thuộc giống Bacillus đều có khả năng sinh nội bào tử hiếu khí, chúng được phân lập dễ dàng từ các nguồn như bùn, đất, không khí. Khi xử lý mẫu đất ở nhiệt độ (thường là 80°C/10-30 phút), các tế bào dinh dưỡng bị nhiệt độ phá hủy trong khi nhiều bào tử trong mẫu vẫn còn sống. Cấy trải các mẫu đã được xử lý với nhiệt trên môi trường thạch và để ở điều kiện hiếu khí sẽ thu được các khuẩn lạc đa số thuộc giống Bacillus subtilis (Nguyễn Đình Bảng et al.,1992 ; Slepecky và Hemphill, 2006) Các vi khuẩn giống Bacillus subtilis thường mọc tốt trên môi trường có nguồn carbon duy nhất là đường, acid hữu cơ, rượu, … với nguồn nitơ duy nhất là ammonium; ngoài ra có một số dạng phân lập cần vitamin để tăng trưởng. Chúng có thể sử dụng các enzyme thủy giải ngoại bào do quá trình phân giải polysaccharide, acid nucleic và lipid làm nguồn carbon và chất cho điện tử. Nhiều trực khuẩn thuộc loại này còn có khả năng sản xuất kháng sinh như: gramicidine, bacitracin, circulin, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT polymyxin, tyrocidine. Hầu hết việc tạo kháng sinh đều có liên quan đến quá trình bào tử hóa và kháng sinh được giải phóng ở giai đoạn tế bào bước vào pha tăng trưởng ổn định sau khi chuyển sang bào tử hóa (Nguyễn Lân Dũng et al., 1978). Bacillus subtilis có ích cho sự sinh trưởng của thực vật bằng việc giúp đỡ thực vật ngăn ngừa bệnh tật. Bacillus subtilis được sử dụng để kiểm soát một vài bệnh do nấm thường gặp ở ngũ cốc, trái cây và rau củ, do Bacillus subtilis tiết ra các kháng sinh chống nấm của vi khuẩn. Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn không gây bệnh có sức sống cao, dễ nuôi cấy và có khả năng đối kháng với một số các loài vi sinh vật khác để phục hồi thế cân bằng sinh thái của hệ vi khuẩn đường ruột. Đặc biệt là khả năng hình thành bào tử rất cao. Môi trường sống chủ yếu của Bacillus subtilis là đất, bùn, nước. Ngoài Bacillus subtilis các nhà nghiên cứu còn tìm thấy các chủng khác thuộc giống Bacillus cũng có tác dụng tương tự khi sử dụng chúng như một probiotic trong việc phục hồi hệ vi sinh vật đường ruột, trong điều trị các chứng rối loạn tiêu hóa do tiêu chảy (Green et al., 1999). Bacillus subtilis còn có vai trò quan trọng trong phân hủy chất hữu cơ lắng đọng ở đáy ao (thức ăn thừa, phân, bùn đáy) tác động làm giảm đáng kể lớp bùn và nhớt ở trong ao. Kết quả, cải thiện được chất lượng nước, giảm lớp bùn đáy, giảm tỷ lệ mắc bệnh, tăng số lượng vi sinh vật phù du, giảm mùi hôi và sau cùng tăng sản lượng nuôi. Chuyển đổi các chất thải hữu cơ thành các chất dinh dưỡng vô cơ tạo quần thể vi sinh vật có lợi và được sử dụng như thức ăn, loại bỏ chất hôi thối ở đáy ao (Cutting và Vander Horn, 1990). 2.3.Phân loại vi khuẩn Bacillus subtilis: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis (http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis, 3/2/2013) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT (http://www.astrobio.net/images/galleryimages_images/Gallery_Image_7589.jpg) Hình 2. Vi khuẩn Bacillus subtilis 2.4 Nghiên cứu về Bacillus subtilis trong và ngoài nước Từ rất lâu vô tình con người đã biết sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis như một tác nhân kháng khuẩn, những người nông dân từ xa xưa, họ dùng nước ngâm rơm rạ cho trâu bò uống để chữa bệnh viêm ruột. Chính sự có mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis là nguyên nhân chữa được bệnh, nhưng người nông dân vẫn chưa nhận ra được sự hiện diện của chủng vi khuẩn này. Mãi đến năm 1949 – 1950 Henry, Albot et al., đã phân lập thành công Bacillus subtilis thuần khiết. Từ đó chúng mới được dùng để điều trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh hoặc do loạn khuẩn gây ra với tên gọi là “Subtilistherapy” (liệu pháp điều trị bằng Bacillus subtilis). Bacillus subtilis có khả năng tiết nhiều enzyme quan trọng: trong tế bào có trên 2000 loại protein khác nhau và chủ yếu là enzyme (Nguyễn Lân Dũng et al., 1978). Bacillus subtilis có hệ thống enzyme tương đối hoàn chỉnh. Nổi bật là các enzyme thủy phân glucid, lipid, protid, enzyme cellulose biến đổi các chất xơ thành các loại đường dễ tiêu. Bacillus subtilis còn được đánh giá là một trong những vi khuẩn đầu Bảng sử dụng sản xuất acid amin quan trọng bằng công nghệ sinh học như: lusin, valin, tyrozin, prolin,… (Hoàng Thủy Long, 1991). Ngoài ra, Bacillus subtilis còn có khả năng sinh tổng hợp một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn Gram âm, Gram dương và nấm gây bệnh. Người ta đã ứng dụng chúng để tái Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT tạo sự cân bằng trong ruột. Bacillus subtilis còn có khả năng đồng hóa một số vitamin như B2 (riboflavin), đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của cơ thể động-thực vật, có mặt trong tất cả các tế bào, tham gia vào các quá trình dinh dưỡng và hô hấp của sinh vật (Hoàng Thủy Nguyên et al., 1974; Lương Đức Phẩm và Hồ Sướng, 1978) Công nghệ vi sinh còn ứng dụng để sản xuất men tiêu hóa cho con người. Hầu hết, các men tiêu hóa hiện nay cho con người trên thị trường đều có chứa vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus subtilis như: Biosubtilic, Antibio, Biofidin, Biobaby,… (Nguyễn Khắc Thái Sơn, 2007). Vi khuẩn Bacillus subtilis hiện đang được dùng trong chăn nuôi thủy sản, các loài trên cạn và trong tiêu thụ của con người như vi khuẩn đường miệng và phòng bệnh bằng vi khuẩn trong rối loạn tiêu hóa. Loài Bacillus subtilis Gram dương, hoại sinh, không mầm bệnh, hình thành bào tử. Bình thường được tìm thấy trong không khí, bụi, cát, nước, đất và trầm tích. Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là nhóm vi khuẩn thuộc môi trường và đi vào ruột qua thức ăn (Gatesoupe, 1999; Green et al., 1999; Moriarty, 1999). 2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật PCR là phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase được Kary Mullis phát minh năm 1985 và tiếp tục được các nghiên cứu sau đó bổ sung và hoàn thiện cho kỹ thuật quan trọng này. Nhờ sự xúc tác của enzyme DNA polymerase chịu nhiệt, các đoạn DNA mới đã được tổng hợp từ DNA khuôn trong môi trường có các dNTP (deoxyribonucleotid) và cặp mồi (primer) đặc hiệu. PCR cho phép sao chép nhanh một số lượng lớn không hạn chế nguyên bản của một đoạn DNA trong khoảng thời gian ngắn nhất. Phản ứng PCR là một chuỗi bao gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm có ba giai đoạn: + Giai đoạn biến tính (denaturation): thường nhiệt độ trong khoảng từ 94 - 96◦C trong khoảng thời gian từ 30 giây – 1 phút (tùy theo vật liệu). + Giai đoạn bắt cặp (annealing): nhiệt độ trong khoảng 50 - 56◦C, thường nhiệt độ 55°C và kéo dài từ 30 giây. + Giai đoạn kéo dài nhờ vào Taq polymerase (extension): nhiệt độ tăng lên 72°C, đây là nhiệt độ tối ưu cho nhiều DNA polymerase chịu nhiệt và thời gian kéo dài từ 1 phút trở lên tùy theo độ dài của DNA cần khuếch đại. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT Chu kỳ gồm ba giai đoạn này sẽ được lặp lại nhiều lần trong khoảng từ 25 – 40 chu kỳ (tùy vào ứng dụng chuyên biệt). Cuối cùng được kết thúc bằng giai đoạn “extension” ở 72°C trong vòng 5 phút, sau đó dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc 4°C (Tùy thuộc vào loại máy Thermal cycler được sử dụng). Sản phẩm PCR sẽ được điện di trên agarose gel để quan sát tính chất đa hình của các mẫu DNA, phân tích chuỗi trình tự di truyền thông qua sản phẩm của PCR và phân tích các sản hẩm trong kỹ thuật cloning (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). 2.6 Điện di Agarose gel: Điện di agarose gel là phương pháp thông dụng, dùng để tách rời các đoạn acid nucleic có kích thước từ 200 bp đến 50 kb. Agarose được chiết xuất từ một loài rong biển. Agarose gel có cấu trúc trùng hợp (polymer) thẳng. Hiện nay, người ta chế ra nhiều loại agarose đặc biệt để phân tích DNA và RNA như agarose tan ở nhiệt độ thấp: low melting agarose, metapho agarose,… Chuẩn bị gel agarose: đun chảy agarose trong dung dịch đệm thích hợp cho đến khi có màu trắng trong vào khuông có cài sẵn răng lược và để nguội. Khi đặc lại agarose sẽ tạo nên mạng lưới mà kích thước của nó lệ thuộc vào tỷ lệ agarose và nồng độ dung dịch đệm. Khi nằm trong gel agarose có điện trường pH >7, các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra, khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của máy điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp. Kích thước DNA: Phân tử DNA có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm (gần) hơn so với phân tử DNA có kích thước nhỏ. Nồng độ agarose: Tùy kích thước của DNA muốn phân tích mà chúng ta chọn nồng độ agarose gel thích hợp (nồng độ càng cao thì kích thước DNA càng nhỏ). Cấu trúc của DNA: Với cùng một kích thước, tùy cấu trúc (siêu xoắn, vòng hoặc thẳng) mà tốc độ di chuyển của DNA khác nhau. Điều nay cũng lệ thuộc dung dịch đệm và lượng ethium bromide. Ở điều kiện này cấu trúc siêu xoắn đi nhanh hơn cấu trúc thẳng, ở điều kiện khác thì ngược lại. Cường độ dòng điện: Độ phân ly của gel agarose giảm khi cường độ dòng điện tăng cao. Cường độ dòng điện không được lớn hơn 5 volt/cm (tính từ khoảng cách 2 điện cực). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT Chiều của điện trường: Các phân tử DNA lớn hơn 50 – 100 kb sẽ di chuyển cùng vận tốc nếu chiều điện trường không đổi, các trường hợp này chúng ta phải sử dụng pulsed-field gel electrophoresis. Thành phần các base và nhiệt độ: Trường hợp nồng độ agarose gel thấp hơn 5% phải chạy điện di ở 4°C, nếu không thành phần của base sẽ ảnh hưởng đến sự chuyển động của các đoạn DNA. Dung dịch đệm điện di: Dung dịch đệm ảnh hưởng đến DNA trong gel. Trường hợp nồng độ dung dịch đệm quá cao gel sẽ bị chảy và DNA bị biến tính. Dung dịch TAE thông dụng hơn cả, vì rẻ hơn, tuy nhiên TAE làm các điện cực mau hỏng hơn vì anod bị kiềm hóa và cathod bị acid hóa. (Trần Nhân Dũng et al., 2000) 2.7 Khuếch đại 16S – 23S rRNA cho nghiên cứu phả hệ loài: Vị trí gen mã hóa rRNA, được quan tâm như đơn vị di truyền cho tiến hóa lớn, từ khi được tìm thấy có ở cả sinh vật sơ hạch và chân hạch. Thật vậy, có sự ổn định phù hợp bên dưới vị trí gen mã hóa rRNA và được sử dụng như cơ quan với nhiều chức năng trong mối quan hệ tiến hóa (Cedergren et al., 1988). Ứng dụng trình tự rRNA như một công cụ dùng để phân loại được ứng dụng và chứng minh trên vi khuẩn, phân tích trình tự 16S rRNA đã giúp định nghĩa lại toàn bộ mối quan hệ phả hệ giống loài trước đây dựa vào sự trao đổi chất của tế bào (Fox et al., 1980; Lane et al., 1985; Woese, 1987; Woes và Fox, 1977). Ở sinh vật sơ hạch, nhiều vị trí gen mã hóa rRNA chứa tất cả ba loại rRNA, các gen 16S, 23S, 5S. Trong đó, 16S có khoảng 1500 nucleotid, 23S có khoảng 2900 nucleotid và 5S chứa khoảng 120 nucleotid. Chỉ có 16S và 23S được nghiên cứu nhiều hơn, còn 5S kích thước quá ngắn nên không được nghiên cứu (Lê Đình Lương, 2001). Các gen 16S, 23S, 5S được tách riêng bởi các vùng không gian (spacer regions), mà các vùng này có sự khác nhau lớn về chiều dài và trình tự cấp độ giống và loài. Đa dạng này là một phần trong sự khác nhau về số lượng và kiểu chuỗi tRNA được tìm thấy bên trong các vùng không gian tế bào (Brosius et al., 1981; Loughney et al., 1982). Vùng 16S-23S ITS là siêu biến, những nghiên cứu cho thấy bên trong vùng không có những vùng chức năng, những cấu trúc bậc 2 và những vị trí diễn ra các quá trình rất đặc hiệu. Trái lại, vùng mã hóa 16S – rRNA được bảo tồn nhiều hơn, nó cũng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT được sử dụng để nghiên cứu đa dạng của những loài sinh vật sơ hạch và ở mức độ loài phụ (Goebel et al., 1987) . Các nghiên cứu gần đây sử dụng phương pháp phân tích trình tự 16S rRNA để nghiên cứu mối quan hệ giống loài của Bacillus cũng như của vi sinh vật trong tự nhiên. Chuỗi 16S có tính ổn định cao và chứa vùng khác nhau nhiều hơn, có lợi cho nghiên cứu sự khác nhau của giống và loài (Goebel et al., 1987) Các cách phân loại trước đây đã cho rằng những loài thuộc giống Bacillus không thể có quan hệ gần với những loài không hình thành bào tử, hoặc là giống Bacillus có quan hệ gần gũi với các giống khác như Planococcus, Staphylococcus … Nhưng khi nghiên cứu trình tự 16S rRNA đã chỉ ra rằng Bacillus subtilis và những loài hình thành bào tử hình elip như: B. cereus, B. megaterium, B. pumilus hình thành một nhóm, trong khi những loài có bào tử hình tròn như: B. globisporus, B. aminovorans, B. aphaericus không hình thành một nhóm mà từng loài lại có quan hệ gần gũi với những loài không hình thành bào tử. Phân tích trình tự 16S rRNA đã phân loại Bacillus thành ba nhóm chính, trong đó B. subtilis thuộc nhóm I (Xu và Côté, 2003; Slepecky và Hemphill, 2006) Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc vào loại các nhóm vi sinh vật dị dưỡng hoại sinh, dùng để làm sạch môi trường nhờ vào khả năng tạo ra các enzyme (protease, amylase, cellulase, kitinase) phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học. Một số sản phẩm có sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis bao gồm Biofish, Bacterzeo, Zeolbacill, Bacizyme, Bio.Brime có sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis và hệ enzyme mà chúng tạo ra để phân hủy thức ăn dư thừa và chất mùn để xử lý ao nuôi. Không những được sử dụng trong xử lý môi trường ao nuôi tôm, mà Bacillus subtilis còn được sử dụng để xử lý nguồn đất bị ô nhiễm đặc biệt là ô nhiễm dầu. Nwaogu et al. (2008) đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để phân hủy dầu dielsel trong đất bị ô nhiễm. Ngoài ra chủng vi khuẩn này còn được ứng dụng trong lĩnh vực chăn nuôi để sản xuất thuốc bổ sung men vi sinh đường ruột cho gia súc và thủy sản như: AiT-Bac, Zym-Probiotic, Bacillus plus, Baci Yeast, Swell-05, Lactomix, Enzymebiosub,… (Bộ thủy sản, 2007). 2.8 Giải trình tự vi khuẩn: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013 Trường ĐHCT Phương pháp Dideoxy hay còn gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi (chaindetermination method) là một phương pháp xác định trình tự DNA được Frederick Sanger phát triển vào năm 1975. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng chuỗi deoxynucleotide không có nhóm OH ở vị trí 3’ do vậy trong quá trình kéo dài chuỗi polinucleotide enzyme polymerase gắn chúng vào chuỗi polinucleotide thì quá trình tổng hợp bị dừng lại. Kết quả tạo ra các đoạn DNA có kích thước hơn kém nhau một nucleotide, trên cơ sở xác định được trình tự nucleotide (1) Biến tính ADN sợi kép thành ADN 2 sợi đơn. (2) Mồi tiếp hợp với ADN sợi đơn. (3) Phản ứng tổng hợp chuỗi polinucleotit gồm: ADN sợi khuôn, primer, ADN polimerase và dNTP. Sự gắn dNTP mất nhóm OH ở vị trí 3’ vào chuỗi polinucleotit làm quá trình tổng hợp bị dừng lại. (4) Điện di trên gel poliacrylamid sẽ xác định được trình tự của đoạn DNA. 2.8.1 Các phương pháp cải biến từ phương pháp của Sanger *Xác định trình tự bằng máy tự động: - Trong kĩ thuật này, không dùng các đồng vị phóng xạ, thay vào đó là các hóa chất có khả năng phát huỳnh quang (fluochrome). -Mỗi loại Dideoxynucleotide được đánh dấu bằng fluochrome có màu khác nhau. - Tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại Dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu. - Điện di kết quả được đọc nhờ hệ thống vi tính. - Kết hợp phương pháp PCR và sử dụng các Dideoxy nucleotide. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
- Xem thêm -