Tài liệu Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học hydrocacbon thơm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM --------------------------------- LÊ TIẾN MẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái nguyên - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM --------------------------------- LÊ TIẾN MẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. NGHIÊM NGỌC MINH Thái nguyên - 2008 Lêi c¶m ¬n! Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS. Nghiêm Ngọc Minh đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt là KS. Đàm Thúy Hằng, Thạc Sỹ Nguyễn Bá Hữu những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để hoàn thành bản luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô và các bạn đồng nghiệp Khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Sư Phạm - Đại Học Thái Nguyên. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó! Hà nội, tháng 9 năm 2008 Học viên Lê Tiến Mạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả Lê Tiến Mạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................1 DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................2 DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................3 MỞ ĐẦU .......................................................................................... CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................8 1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân .............8 1.1.1. Tính chất hóa lý ..................................................................8 1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hƣởng của nó tới môi trƣờng sống .............................................................................................10 1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH ..........................................................13 1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam ...........13 1.2.2. Nguồn gốc phát sinh ............................................................14 1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH ................................................15 1.3.1 Phƣơng pháp hóa lý ..............................................................16 1.3.2. Phƣơng pháp phân hủy sinh học ...........................................16 1.4. Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật ..................................19 1.4.1. Vi sinh vật phân hủy PAH ...................................................19 1.4.2. Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV ...........................................21 1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân .................................................................25 1.6. Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật ........................................29 1.6.1. Phƣơng pháp phân loại truyền thống ...................................29 1.6.2. Phƣơng pháp phân loại bằng sinh học phân tử .....................30 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................33 2.1. Nguyên liệu và hóa chất .............................................................. 33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.1.1. Nguyên liệu.........................................................................33 2.1.2. Hóa chất .............................................................................33 2.2. Môi trƣờng nuôi cấy....................................................................33 2.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu ...................................................34 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................34 2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nƣớc nhiễm dầu ......................34 2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn .............................................................................35 2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn......................36 2.4.4. Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3-dioxygenase............................................................................36 2.4.4.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo phƣơng pháp của Sambrook, Russell ........................................36 2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phƣơng pháp PCR ........................37 2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng ..................................38 2.4.4.4. Phƣơng pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động ........................................................................................40 2.4.4.5. Phƣơng pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại ...........41 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................42 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH .................................................................42 3.2. Đặc điểm hình thái và tế bào của chủng vi khuẩn BQN31 .............44 3.3. Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khuẩn BQN31 .............................................................................................45 3.4. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 .............................................................................................49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.4.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR .......................................................49 3.4.2. Tách dòng gen mã hóa 16S rRNA từ chủng BQN31 ............50 3.4.3 Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc thích hợp ......................................................................................52 3.4.4. Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn BQN31 .............54 3.5. Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từ chủng BQN31 .............................................................................................57 IV. KẾT LUẬN ........................................................................................62 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (cặp bazơ) USEPA United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ môi trường Hoa Kỳ) LB Luria-Bertani PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) POP Persistent Organic Pollutant DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid VSV Vi sinh vật X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside μl Microlit μm Micromet PAH Polycyclic aromatic hydrocacbon (hydrocarbon thơm đa nhân) ppm đơn vị một phần triệu (mg/l) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp 2 Khoa Sinh - KTNN DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH ......................................... 9 Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH ................. 20 Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật ................................. 30 Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập được trên mô i trường khoáng có bổ sung các hợp chất PAH .................................................................... 42 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn ............................... 44 Bảng 3.3: phổ UV đo khả năng phân hủy các PAH của chủng BQN31..................................................................................................... 46 Bảng 3.4: Khả năng sử dụng các PAH khác nhau của chủng BQN31 .......... 46 Bảng 3.5: Độ tương đồng của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế .............................................. 56 Bảng 3.6: Độ tương đồng của đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3 dioxygenase của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế ................................................................... 60 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp 3 Khoa Sinh - KTNN DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocacbon thơm đa nhân (PAH) ...................................................................................................... 8 Hình 1.2: Các con đường phân hủy PAH ở vi sinh vật ............................... 21 Hình 1.3: Ba con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn và nấm .................................................................................................... 22 Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng BQN30, BQN31, BQN32, BQN33.......................................................................... 43 Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31............................... 45 Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31 .............................................. 45 Hình 3.4: DNA tổng số của chủng BQN31 ............................................... 50 Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31........................................................................................... 50 Hình 3.6: Kết quả biến nạp chủng BQN31 ................................................ 51 Hình 3.7: Sản phẩm điện di kiểm tra DNA plasmid của các dòng được lựa chọn ........................................................................................... 52 Hình 3.8: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 13 ............................... 53 Hình 3.9: Sản phẩm làm sạch DNA plasmid dòng số 13 của chủng vi khuẩn BQN31....................................................................................... 53 Hình 3.10: Trình tự đầy đủ đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 ........... 54 Hình 3.11: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện. Thước đo thể hiện hai nucleotide khác nhau trên 1.000 nucleotide so sánh..................................................................................... 55 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp 4 Khoa Sinh - KTNN Hình 3.12: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza từ DNA tổng số chủng BQN31 và cặp mồi C23OF và C23OR ................................................................................................ 58 Hình 3.13: Trình tự nucleotide và trình tự axít amin suy diễn đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng Sphingomonas sp. BQN31 ........................................................................ 58 Hình 3.14: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng Sphingomonas sp. BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện. Thước đo thể hiện một nucleotide khác nhau trên 100 nucleotide so sánh ................................ 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp 5 Khoa Sinh - KTNN MỞ ĐẦU Trong thời đại ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về nguyên liệu và nhiên liệu của con người ngày càng tăng, đã kéo theo sự mở rộng các ngành công nghiệp khai thác, chế biến như : công nghiệp dầu mỏ, khai thác chế biến than, công nghiệp sản xuất sơn, sản xuất các hóa chất tẩy rửa... Quảng Ninh là một tỉnh nằm trong vùng kinh tế trọng điểm Bắc Bộ, có tốc độ tăng trưởng kinh tế cao so với bình quân chung của cả nước. Trong những năm gần đây, các ngành công nghiệp và dịch vụ chiếm một tỷ trọng lớn, khoảng trên 80% GDP của tỉnh. Các ngành công nghiệp khai thác và chế biến than, xi măng, đóng tàu, nhiệt điện, sản xuất vật liệu xây dựng đang có tốc độ phát triển nhanh. Quảng Ninh là một trong những điểm trung chuyển xăng dầu lớn nhất cả nước. Hoạt động vận tải đường bộ, đường thủy; các hoạt động du lịch, vận tải khách du lịch….diễn ra hết sức sôi động. Các hoạt động trên đã tạo ra một bộ mặt kinh tế rất đa dạng của Quảng Ninh. Tuy nhiên, các hoạt động đó cũng đã gây ra những hậu quả không nhỏ về môi trường, đặc biệt là các hoạt động vận chuyển và khai thác than, chế biến và sử dụng vật liệu nổ, các hoạt động vận tải, trung chuyển xăng dầu… ở Quảng Ninh. PAH là một nhóm các hợp chất hữu cơ có hai hay nhiều vòng thơm. Chúng có mặt khắp nơi trong môi trường (đất, không khí, các nguồn nước và các lớp trầm tích) và là một trong các thành phần có trong các sản phẩm của dầu mỏ [16]. Một số PAH có khả năng gây ung thư tiềm tàng, gây đột biến và là chất gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Tổ chức bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã xếp PAH vào nhóm những chất ô nhiễm điển hình và tiến hành kiểm soát sự có mặt của PAH trong các hệ sinh thái dưới nước cũng như trên cạn [16], [50]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp 6 Khoa Sinh - KTNN Trong nước thải tại nhiều cơ sở sản xuất công nghiệp ở Quảng Ninh, ngoài một số hợp chất hữu cơ, vô cơ (NH4 NO3) thì sự có mặt của dầu và một số các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) đang là vấn đề lớn đặt ra đòi hỏi các cấp chính quyền địa phương cần phải quan tâm xử lý triệt để. Hiện nay để khắc phục hậu quả này có nhiều phương pháp có thể áp dụng như sử dụng hóa chất, hấp phụ, lắng đọng… Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi chi phí lớn và vẫn có thể gây ra ô nhiễm thứ cấp. Qua thử nghiệm thực tế, phương pháp xử lý bằng công nghệ sinh học đã và đang khẳng định tính ưu việt của nó. Đó là giá thành rẻ, có thể tiến hành thuận lợi trong điều kiện tự nhiên, độ an toàn rất cao và thân thiện với môi trường. Do vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu về điều tra về phân bố, cấu trúc các tập đoàn vi sinh vật, khả năng phân hủy PAH của các chủng đơn cũng như các tập đoàn vi sinh vật. Các gen tham gia quá trình phân hủy sinh học PAH cũng được quan trắc trong quá trình xử lý, của các tập đoàn VSV bản địa và trong các nghiên cứu phân hủy PAH ở điều kiện phòng thí nghiệm. Catechol là một trong các sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm, do vậy các gen mã hóa các enzym chuyển hóa catechol được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Chính vì những yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã lựa chọn nghiên cứu và thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học hydrocarbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp 7 Khoa Sinh - KTNN Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập và tuyển chọn ra được một số chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ hợp chất hydrocacbon thơm. Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: 1. Phân lập và tuyển chọn một số loại vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH. 2. Nghiên cứu, đánh giá khả năng phân hủy sinh học PAH của một số chủng vi khuẩn đã được phân lập. 3. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái tế bào của một đại diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH. 4. Phân loại định tên đại diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH dựa trên việc xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp 8 Khoa Sinh - KTNN CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân 1.1.1 Tính chất hóa lý Các PAH có mặt khắp nơi trong môi trường, những hợp chất này có 26 vòng benzen kết hợp với nhau. Trọng lượng phân tử vào khoảng 128 – 278 g/mol (Hình 1.1). Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) PAH là những chất kỵ nước. Khả năng gây ô nhiễm môi trường tùy thuộc khả năng hòa tan của chúng trong môi trường nước [16], [48]. Đặc điểm về khả năng hòa tan và áp suất hơi của PAH là nhân tố chính ảnh hưởng đến khả năng phân tán của chúng trong khí quyển, thủy quyển và sinh quyển. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 9 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số lượng vòng benzen trong cấu trúc hóa học của các PAH quyết định khả năng hòa tan của các PAH trong nước. PAH giảm khả năng hòa tan trong nước hay tăng tính kỵ nước khi số lượng vòng benzen tăng [54]. Khả năng hòa tan của các PAH rất biến động, từ những chất khó hòa tan nhất là benzo(b)perylen có chỉ số hòa tan là 0,003 mg/l cho đến chất dễ hòa tan nhất là naphthalen có chỉ số hòa tan tới 31 mg/l. Nếu khả năng hòa tan trong nước của PAH thấp, hay hệ số hấp phụ cao sẽ dẫn đến các PAH có xu hướng bị hấp phụ trong cặn bùn, đất đá và trầm tích, do đó ảnh hưởng rất nhiều tới khả năng chúng bị phân hủy sinh học bởi vi sinh vật [10]. Ngược lại, khả năng hòa tan trong nước của PAH cao thì khả năng bị phân hủy bởi vi sinh vật cũng cao. Điều đó cho thấy khả năng hòa tan trong nước của các PAH có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng trong quá trình phân hủy sinh học PAH. Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH [31] Loại PAH Nhiệt độ Số nóng chảy vòng (o C) thơm Nhiệt độ sôi (o C) Độ tan trong nước (mg/l) LogKp d Áp suất hơi ở 20o C (torr) Phenanthrene 3 101 340 1,29 4,45 6,8x10-4 Anthracene 3 216 340 0,07 4,46 2,0x10-4 Fluoranthene 4 111 250 0,26 5,33 6,0x10-6 Benzo[a]anthracene 4 158 400 0,24 5,61 5,0x10-9 Pyrene 4 149 360 0,14 5,32 6,8x10-7 Chrysene 4 255 488 0,02 5,61 6,3x10-7 Benzo[a]pyrene (BaP) 5 179 496 0,0038 6,04 5,0x10-7 Dibenzo[a]anthracene 5 262 524 0,0005 5,97 1,0x10-10 Benzo[g,h,i]perylen 6 222 -- 0,0003 7,23 1,0x10-10 * Kp d= [octanol]/ [nước] Trong các tính chất vật lý của PAH, hệ số Kp d phản ánh khả năng hấp phụ lên bề mặt vật liệu rắn. Nếu hệ số Kp d cao, các PAH có xu hướng tăng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp 10 Khoa Sinh - KTNN khả năng hấp phụ lên bề mặt các vật liệu rắn, đồng nghĩa với sự giảm khả năng phân hủy sinh học. Áp suất hơi và nhiệt độ sôi của các PAH cũng có vai trò quan trọng trong quá trình xử lý loại bỏ PAH khỏi các vùng bị ô nhiễm do nó ảnh hưởng đến khả năng hóa hơi của mỗi PAH. Khi áp suất hơi tăng, khả năng bay hơi của các PAH cũng tăng, mà sự bay hơi cũng là một con đường để loại bỏ PAH khỏi nguồn ô nhiễm. Khả năng bay hơi của các PAH cũng phụ thuộc vào kích thước và khối lượng phân tử. Naphthalene có kích thước nhỏ nhất nên có khả năng bay hơi đến 89%, trong khi đó benzo[a]pyrene (BaP) là hợp chất có kích thước lớn, chỉ có khả năng bay hơi 1%. Phenanthrene là đồng phân của anthracene có độ bay hơi thấp hơn do cấu trúc phân tử chứa các vòng thơm không thẳng hàng như trong cấu trúc của anthracene (Hình 1.1 và Bảng 1.1). PAH còn bị phân hủy dưới ánh sáng tử ngoại từ bức xạ mặt trời. Trong khí quyển, PAH có thể phản ứng với những chất ô nhiễm như nitrogen oxid, sulfur oxid tạo thành các dạng dione, nitro và dinitro PAH và sulfonic acid. 1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hưởng của nó tới môi trường sống Tính độc của PAH đã được người ta biết đến từ những năm 30 của thế kỷ XX, khi Hieger và Cook cùng những cộng sự khác nghiên cứu và thấy tinh thể benzo(a)pyrene màu vàng gây khối u ở động vật thí nghiệm [17]. Với con người, PAH có thể là tác nhân gây đột biến và dẫn đến ung thư [16], [31], [11], [27]. Ở quy mô phòng thí nghiệm, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, quá trình gây ung thư bởi PAH là một quá trình phức tạp, đa giai đoạn và phụ thuộc vào nhiều yếu tố : kích thước phân tử PAH, độ phân cực trong phân tử, hóa học lập thể và các phản ứng xảy ra trong quá trình trao đổi chất, các nguyên tố mang điện tích mà có ảnh hưởng đến sự gắn kết của các sản phẩm trao đổi chất với các đại phân tử là DNA, RNA. Một số nghiên cứu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp 11 Khoa Sinh - KTNN khác đã đưa ra kết luận: các PAH có khối lượng phân tử nhỏ, cấu tạo phân tử chỉ có một, hai, ba vòng thơm là rất độc, trong khi các PAH có khối lượng phân tử lớn lại có thể gây độc ở mức độ gen, hoặc gây ra đột biến, bởi chúng có khả năng gắn vào các phân tử DNA, RNA, hoặc protein, gây nên những biến đổi ở mức phân tử [16], [42]. Naphthalene là một chất ô nhiễm thuộc nhóm PAH gây ảnh hưởng tới một loạt các cơ quan như phổi, thận và kìm hãm quá trình hô hấp. Nhiễm độc naphthalene ở người dẫn tới bệnh thiếu máu và viêm thận. Ngoài ra, sự thay đổi về da và mắt ở những người bị phơi nhiễm naphthalen cũng đã được công nhận. Phenanthrene được biết như chất cảm quang với da người, chất gây dị ứng với động vật, đột biến tới hệ thống vi khuẩn trong các điều kiện đặc biệt. Chất này gây yếu các nhiễm sắc thể tương đồng và kìm hãm sự nối liền các kẽ hở gian bào. Ngoài ra, các PAH khác như acenaphthalene, fluoranthene, fluorene đều gây độc cho động và thực vật. Độc tính của benzo(a)pyrene, benzo(a)anthracene, benzo(b)fluoranthrene, benzo(k)fluoranthrene, dibenzen (a,h)anthracene và indenol(1,2,3-c,d)pyrene đã được nghiên cứu chứng minh gây ung thư cho người. Trong tự nhiên hiếm khi bắt gặp các PAH đơn lẻ mà chỉ gặp chúng ở dạng hỗn hợp nhiều PAH, do đó độc tính của chúng càng được tăng cường [53]. PAH thâm nhập gián tiếp vào cơ thể con người thông qua chuỗi thức ăn, đường hô hấp hoặc qua sự tiếp xúc trực tiếp với nguồn ô nhiễm, gây ung thư, đột biến gen. Rất nhiều PAH có chứa “vùng bay” và vùng tương tự nó “vùng K”. Cả hai vùng này đều cho phép trao đổi chất, tạo ra dạng liên kết “epoxit-vùng bay” và “epoxit- vùng K” có khả năng hoạt động cao và một số chúng là nguyên nhân gây ra ung thư [53]. Khi xâm nhập vào cơ thể, PAH nhanh chóng xâm nhập vào các mô mỡ và tiếp tục di chuyển đến những cơ quan khác. Tùy từng loại PAH với liều Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp 12 Khoa Sinh - KTNN lượng và thời gian tác động mà mức độ ảnh hưởng đến cơ thể khác nhau. Chẳng hạn, với naphthalene, nếu tiếp xúc trong thời gian ngắn, nồng độ thấp, nó có thể gây dị ứng, viêm tấy da, mắt. Khi xâm nhập vào hệ tiêu hóa, naphthalene sẽ gây bệnh thiếu máu do chúng phá vỡ các tế bào hồng cầu. Nếu tiếp xúc với naphthalene trong thời gian dài với nồng độ lớn hơn 10 ppm sẽ dẫn tới các bệnh kinh niên, gây ung thư da phổi và có thể làm giảm khả năng thụ thai ở phụ nữ và có thể làm nguy hiểm tới sự phát triển của thai nhi [31]. Trong số các PAH, người ta đặc biệt chú ý đến benzo[a]pyrene vì tính độc hại của nó. Benzo[a]pyrene (BaP) là một thành phần có trong khói thuốc lá, và là một trong những nguyên nhân dẫn đến ung thư phổi [16], [31]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh BaP có thể chuyển hóa thành các loại oxid với sự xúc tác của phức hệ cytochrome P450, mà những oxid này có thể phản ứng với các DNA gây đột biến. BaP cũng được xác định là nguyên nhân gây ung thư cho con người và động vật [16], [31], [55]. Một vài nghiên cứu trên đối tượng động, thực vật cho thấy, động vật nếu tiếp xúc với naphthalene ở nồng độ cao, thì chỉ trong thời gian ngắn cũng có thể gây mờ mắt, gây độc ở mức độ vừa phải. Hiệu ứng mạnh hơn, naphthalene có thể gây chậm phát triển, thậm chí gây chết với động thực vật. Nghiên cứu ngưỡng độc của naphthalene đối với loài cá vược, người ta đã xác định LC50 là 240 g/l (LC50 là liều gây chết 50% mẫu sinh vật thí nghiệm). Bằng việc thử nghiệm với một nhóm chuột cho sử dụng anthracene với lượng 1,8 µg/l, người ta thấy rằng, sau 2 tuần gây nhiễm, tỷ lệ chuột xuất hiện khối u là 40% [31]. Sự tồn tại của các hợp chất PAH trong môi trường vùng bờ biển có thể đe dọa tới sức khỏe con người và môi trường biển thông qua các tác động trực tiếp hoặc qua các chuỗi thức ăn trong chu trình vật chất [61]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp 13 Khoa Sinh - KTNN Do tính độc hại như vậy, cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã xếp PAH vào danh sách một trong những chất ô nhiễm điển hình và đã tiến hành kiểm định sự có mặt của PAH trong hệ sinh thái dưới nước cũng như trên cạn [16], [53]. 1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH 1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam Các hydrocarbon thơm đa nhân đã được tìm thấy ở nhiều môi trường sinh thái khác nhau, kể cả môi trường không khí. Trong môi trường nước, PAH phân bố rộng rãi. Người ta ước tính, hàng năm có khoảng 2,3x105 tấn các hợp chất này đã xâm nhập vào các hệ sinh thái dưới nước. Đặc biệt, với hệ sinh thái bị ô nhiễm PAH vùng ven bờ biển thường có nguồn gốc từ phế thải và công nghiệp hóa dầu, công nghiệp khai thác và vận chuyển dầu mỏ, nước thải công nghiệp và sinh hoạt, cháy rừng và cháy đồng cỏ [61]. Người ta đã định lượng được nồng độ BaP trong nước uống là 0,0002 đến 0,024 g/l. Trong 90 mẫu nước kiểm tra ở Mỹ cho thấy nồng độ của 6 PAH từ 0,001 đến 0,01 g/l, 1% mẫu nước kiểm tra cho thấy nồng độ trung bình lớn hơn 0,1 g/l [31]. Nhiều công trình nghiên cứu còn cho thấy, sự có mặt của PAH trong các mẫu trầm tích với nồng độ đáng kể. Một số nơi có mức độ ô nhiễm PAH rất cao: nồng độ các hợp chất PAH ở vịnh Boston (Mỹ) có thể lên tới 100.000 ng/g. Nguyên nhân chủ yếu là do trong môi trường biển hầu hết các hợp chất PAH hòa tan kém trong nước đã dẫn đến việc chúng được tích lũy trong các lớp trầm tích [31]. Trong không khí cũng chứa một lượng đáng kể PAH. Đã có hơn 500 PAH và các hợp chất liên quan được phát hiện trong không khí, đặc biệt là BaP chiếm tỷ lệ cao nhất. Vào những năm 1970, ở Mỹ, nồng độ BaP trong không khí trung bình là 1- 5 ng/m3. Trong 30 năm trở lại đây, nồng độ BaP có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn