Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng cố định đạm của vi kh...

Tài liệu Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng cố định đạm của vi khuẩn azotobacter – thử nghiệm trên cây trồng

.PDF
103
780
134

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC **** ĐỖ HOÀNH QUÂN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH TĂNG TRƯỞNG, CỐ ĐỊNH ĐẠM CỦA VI KHUẨN AZOTOBACTER – THỬ NGHIỆM TRÊN CÂY TRỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ NGÀNH: 60.42.30 HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. PHẠM THỊ ÁNH HỒNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2011 Lời cảm ơn Trong khoảng thời gian hơn một năm làm luận văn tốt nghiệp, ngoài những nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía các thầy cô trong Khoa Sinh học, các thầy cô trong bộ môn Sinh hóa và quý công ty TNHH Gia Tường, giờ đây tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp với rất nhiều cảm xúc khác nhau. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến: Quý thầy cô trong Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh hóa đã nhiệt tình giảng dậy, truyền đạt cho em kiến thức, kinh nghiệm nghiên cứu khoa học, là chìa khóa giúp em trong việc hoàn thành đề tài nghiên cứu tốt nghiệp. PGS. TS. Phạm Thị Ánh Hồng, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và định hướng cho em trong suốt thời gian em thực hiện đề tài tốt nghiêp. ThS. Nguyễn Như Nhứt, Trưởng chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường – Bình Dương, người luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Cảm ơn các anh chị và các bạn trong Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi sớm hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Con xin tỏ lòng thành kính, biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ và gia đình luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để con được học hành và là điểm tựa vững chắc cho con vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 7 năm 2011 Đỗ Hoành Quân i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A. Azotobacter IAA Indol acetic acid ATP Adenosin triphosphate ADP Adenosin diphosphate rH2 Lưu lượng khí hydrogen pO2 Áp suất khí oxygen PCR Polymerase chain reaction OD Optical density CFU Colony froming units TB Giá trị trung bình SD Độ lệch chuẩn thực nghiệm. ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Các con đường cung cấp đạm cho đất trong chu trình chuyển hóa nitơ .......... 4 Bảng 1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số loài thuộc chi Azotobacter ................. 11 Bảng 3.3. Giá trị pH của các mẫu đất ............................................................................ 44 Bảng 3.4. Đặc điểm và hình dạng khuẩn lạc của các chủng phân lập được ..................... 45 Bảng 3.5. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của 20 chủng phân lập ........... 51 Bảng 3.6. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của 20 chủng Azotobacter phân lập trên môi trường Ashby .................................................................... 52 Bảng 3.7. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau ................................................................ 59 Bảng 3.8. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 cố định được trên các môi trường nuôi cấy khác nhau .................................... 61 Bảng 3.9. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau ................................................................ 62 Bảng 3.10. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 cố định được khi nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau .................................... 63 Bảng 3.11. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trên các loại đường với các nồng độ khác nhau .............................................. 65 Bảng 3.12. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trên các loại đường với các nồng độ khác nhau .......................... 68 Bảng 3.13. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trên môi trường cố bổ sung ion Mn2+ và ion Cu2+ ở các nồng độ khác nhau ................. 70 Bảng 3.14. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trên môi trường cố bổ sung ion Mn2+ và ion Cu2+ ở các nồng độ khác nhau ................................................................................ 71 Bảng 3.15. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy ở tốc độ lắc khác nhau ...................................................................... 74 Bảng 3.16. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy ở tốc độ lắc khác nhau ................................................................ 75 iii Bảng 3.17. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trong môi trường có các nguồn đạm khác nhau ....................................... 77 Bảng 3.18. Hàm lượng nitơ cố định được (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trong môi trường có các nguồn đạm khác nhau. ......................... 79 Bảng 3.19. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau ................................................................... 81 Bảng 3.20. Hàm lượng nitơ tổng cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau .............................................................. 82 Bảng 3.21. Hàm lượng nitơ cố định được và sự tồn tại của các chủng Azotobacter trong đất sau 45 ngày ....................................................... 84 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của hỗn hợp hai chủng Az 03 và Az 07 lên sự phát triển của cây cải xanh ................................................................... 85 iv DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ Biểu đồ 3.1. Hàm lượng nitơ tổng của 20 chủng Azotobacter cố định được trên môi trường Ashby ......................................................... 53 Biểu đồ 3.2. Khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 và Az 07 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau .................................................... 60 Biểu đồ 3.3. Khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 và Az 07 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau ................................................... 61 Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của pH lên khả năng tăng trưởng của hai chủng Az 03 và Az 07 ................................................................... 63 Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của pH lên khả năng cố định nitơ của hai chủng Az 03 và Az 07 .................................................................. 64 Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 ............................................................ 66 Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 07 ............................................................ 66 Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 ................................................................... 68 Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 07 ................................................................... 69 Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của ion Mn2+ và ion Cu2+ ở các nồng độ khác nhau lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 .............................................. 70 Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng của ion Mn2+ và ion Cu2+ ở các nồng độ khác nhau lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 07 .............................................. 71 Đồ thị 3.9. Ảnh hưởng của ion Mn2+ và ion Cu2+ ở các nồng độ khác nhau lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 ............................................... 72 Đồ thị 3.10. Ảnh hưởng của ion Mn2+ và ion Cu2+ ở các nồng độ khác nhau lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 07 ............................................... 72 v Đồ thị 3.11. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 và Az 07 ........................................................................ 74 Đồ thị 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 và Az 07 ........................................................................ 75 Đồ thị 3.13. Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 .................................................................... 77 Đồ thị 3.14. Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 07 .................................................................... 78 Đồ thị 3.15. Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 ................................................................... 79 Đồ thị 3.16. Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 07 ................................................................... 80 Đồ thị 3.17. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 và Az 07 ........................................................................ 81 Đồ thị 3.18. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 và Az 07 ................................................................. 83 vi Mở đầu MỞ ĐẦU  Đặt vấn đề Trong khí quyển, nitơ chiếm gần 80% thể tích, tuy nhiên chúng tồn tại ở dạng khí N2 với liên kết cộng hóa trị rất bền vững (N≡N), thực vật không thể sử dụng trực tiếp được. Để sử dụng được nguồn đạm dồi dào này thì cần phải phá vỡ liên kết bền vững trong phân tử N2, tạo ra các loại đạm mà cây trồng có thể hấp thu được. Trong công nghiệp sản xuất phân bón hóa học, để phá vỡ liên kết này người ta thực hiện các phản ứng hóa học dưới điều kiện nhiệt độ, áp suất rất cao và có sự tham gia của nhiều chất xúc tác, do dó, việc sản xuất phân bón bằng phương pháp này sẽ gây tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và tác động xấu đến sức khỏe của con người. Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học trong nông nghiệp, thì việc nghiên cứu và tìm ra cách chuyển hóa để biến nguồn đạm dồi dào từ trong khí quyển vào trong đất mà không tác động đến môi trường và sức khỏe con người đã được nghiên cứu. Một trong những hướng quan trọng và hiệu quả là việc sử dụng vi sinh vật có khả năng cố định đạm nhờ hệ enzyme nitrogenase. Azotobacter là giống vi sinh vật cố định đạm tự do có khả năng làm giàu nguồn đạm trong đất - nguồn đạm cây trồng sử dụng được. Chúng có khả năng này là nhờ quá trình cố định nitơ sinh học, quá trình khử N2 trong không khí thành NH3 dưới tác dụng của enzyme nitrogenase. Ngoài ra chúng còn kích thích hấp thu các chất dinh dưỡng khoáng của thực vật (NO3-, PO43-, K+, Fe2+), sản sinh ra các chất có khả năng điều hòa sinh trưởng ở thực vật (indole 3-acetic acid, indole- lactic acid…). Loài vi sinh vật trên phân bố rộng rãi trong đất và nước nhưng sự phân bố trên không đồng đều và số lượng hiện diện quá ít không đem lại hiệu quả cao. Do đó, việc phân lập, tuyển chọn chủng giống có hoạt tính cố định đạm cao để bổ sung vào đất trồng trọt là một trong những khâu quan trọng nhằm nâng cao năng suất cây trồng. Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng, cố định đạm của vi khuẩn Azoterbacter – Thử nghiệm trên cây trồng”. -1- Mở đầu  Mục tiêu của nghiên cứu: Tuyển chọn được chủng Azotobacter có hoạt tính cố định đạm cao từ các chủng phân lập, nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng và cố định đạm của các chủng chọn lọc, từ đó ứng dụng trong lĩnh vực trồng trọt.  Nội dung thực hiện: - Phân lập chủng Azotobacter từ các mẫu đất ở Hà Nội, Lâm Đồng, Đông Nai, Long An, Tiền Giang, Bến Tre. - Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chủng phân lập. - Tuyển chọn chủng có hoạt tính cố định đạm cao. - Định danh đến loài các chủng chọn lọc bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA. - Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng tăng trưởng và cố định nitơ của chủng chọn lọc. - Thử nghiệm hiệu quả của các chủng chọn lọc trên cây cải xanh (Brassica Juncea). -2- PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan tài liệu 1.1. Đai cương về nitơ 1.1.1. Nguồn nitơ trong tự nhiên Nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu đối với động vật, thực vật và ngay cả với các loài vi sinh vật. Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, riêng trong không khí, nitơ chiếm 78,16% thể tích. Người ta ước tính rằng, trong bầu khí quyển bao trùm lên một hecta đất đai chứa tới 8 triệu tấn nitơ. Lượng nitơ này có thể cung cấp cho cây trồng tới hàng chục triệu năm (nếu như cây trồng có khả năng đồng hóa được nó). Trong cơ thể các loài sinh vật trên trái đất cũng có khoảng 0.4 x 109 tấn nitơ. Trong các trầm tích chứa 4 x 1015 tỷ tấn nitơ [36]. Hợp chất đạm mà thực vật hút từ đất, một phần như gốc rễ được trả lại đất, phần còn lại được động vật và thực vật dị dưỡng tiêu thụ, lại biến thành các chất bài tiết và xác trả lại đất. Những chất hữu cơ này dưới tác dụng của nhiều loại vi sinh vật, nấm bị khử thành đạm ở dạng hữu hiệu [6]. Trên thực tế trong tuần hoàn này đạm bị mất đi khá nhiều. Phần lớn phân người và gia súc theo nước chảy ra biển do tưới, do mưa mà số lượng lớn đạm trong đất bị rửa trôi, cuối cùng chảy vào biển. Số đạm này, một phần được trả lại bằng phân bón có nguồn gốc từ sản phẩm của biển, nhưng phần rất lớn là ở dạng mà thực vật hầu như không thể sử dụng được [6]. Nitơ trong không khí tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử N2, dạng nguyên tử kép (N2) được khóa chặt với nhau thông qua liên kết cộng hóa trị bền vững (N≡N). Mặc dù rất cần nguyên tố này, nhưng cây chỉ có thể hấp thụ được nitơ ở dạng NO3- và NH4+. Để sử dụng được nguồn nitơ lớn từ không khí có 2 con đường chính là hóa học và sinh học [6].  Hóa học: Kể từ năm 1920, biện pháp công nghiệp Haber-Bosch đã giúp con người phá vỡ liên kết ba này. Biện pháp này đòi hỏi phải thực hiện ở nhiệt độ rất cao (450 - 500oC), áp suất lớn gấp 400 lần áp suất khí quyển và Fe3+ là chất xúc tác [40]. Các hợp chất nitơ được tổng hợp hóa học trên cung cấp cho cây trồng một nguồn nitơ lớn và ổn định. Tuy nhiên, bên cạnh việc sử dụng phân đạm được tổng hợp hóa học cho nông nghiệp có thể làm tăng năng suất cây trồng thì cũng đem lại những tác hại vô cùng to lớn, vì trung bình chỉ có 40-50% lượng đạm bón được cây hấp thu, phần còn lại gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí… từ đó gây hại, thậm chí là tiêu diệt các vi sinh -3- Tổng quan tài liệu vật có lợi. Các hợp chất chứa nitơ của phân bón hóa học gây hại rất lớn đối với cá, động vật thân mềm và con người. Một ví dụ cụ thể ở những người sống ở nông thôn và sử dụng giếng nước chứa nitrat cao thì thường có hiện tượng oxy kết hợp với hemoglobin (gọi là hiện tượng Methemoglobinemia) điều này gây hại đến tế bào máu. Ngoài ra, việc lạm dụng phân đạm tổng hợp hóa học còn gây tác hại cho đất (như đất bị bạc màu, chua, chai…) hay ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm (như việc tồn dư các hợp chất chứa đạm như NO3-, NH4+) [6].  Sinh học: Nhờ các vi sinh vật có thể tiết ra enzyme nitrogenase để thực hiện được một quá trình sinh học đặc biệt - quá trình cố định nitơ. Nhóm vi sinh vật có khả năng thực hiện quá trình này được gọi là các vi sinh vật cố định nitơ. Việc sử dụng phân bón vi sinh chứa các vi sinh vật trên vẫn đảm bảo cho năng suất cây trồng đồng thời hạn chế sử dụng phân bón hóa học làm cho sản phẩm sạch và an toàn hơn, lượng nitrat giảm đáng kể, đất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả năng cải tạo đất do hệ sinh vật có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi xốp hơn, cây dễ hút chất dinh dưỡng hơn. Ngoài ra, còn có các con đường tạo nitơ khác như do sấm chớp hay cháy [8]. Bảng 1.1. Các con đường cung cấp đạm cho đất trong chu trình chuyển hóa nitơ [6]. Hàm lượng nitơ cố định Cách cố định nitơ (1012 g/năm) Không phải con đường sinh học 80 (Non-biologital) Công nghiệp (Industrial) 50 Sự cháy (Combustion) 20 Chớp hay sét (Lightning) 10 Con đường sinh học (Biologital) 175 Đất nông nghiệp 90 Đất rừng và không phải nông nghiệp 50 Biển 35 -4- Tổng quan tài liệu 1.1.2. Vai trò của nitơ đối với thực vật Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein, diệp lục, ATP… Hàm lượng nitơ trong thành phần các chất khô của thực vật dao động từ 1-3%. Tuy hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng trong đời sống sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất của cây trồng [3]. Sự thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém, chlorophylle không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm a b Hình 1.1. Cây lúa, không bón đạm (a); có bổ sung đạm (b). Thừa nitơ cũng sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và hình thành hoạt động quang hợp nên năng suất giảm [3, 10]. năng suất của cây trồng. Cây sinh trưởng mạnh thân lá tăng nhanh nên cây rất yếu, dễ đổ, giảm năng suất nghiêm trọng và có khi không có thu hoạch [3, 9]. 1.1.3. Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên 1.1.3.1. Quá trình khoáng hóa Quá trình khoáng hóa là quá trình phân hủy xác hữu cơ dưới tác động của quần thể vi sinh vật thành các chất khoáng hòa tan hay các chất khí và tỏa nhiệt, tùy thuộc vào điều kiện khoáng hóa mà cho các sản phẩm khác nhau. Giai đoạn này có sự tham gia của các chủng vi sinh vật nitrat hóa như Nitrosomonas và Nitrobacter - những vi khuẩn tham gia vào quá trình oxy hóa những hợp chất chứa nitơ thành nitrat (NO3-), một dạng thích hợp để cho cây trồng hấp thu [38]. Hợp chất hữu cơ NH4+ Vi khuẩn amon hóa Vi khuẩn nitrat hóa Nitrosomonas NO2- Nitrobacter -5- NH4+ NO2- NO3- Tổng quan tài liệu 1.1.3.2. Quá trình phản nitrat hóa Là quá trình phân hủy chuyển hóa hợp chất nitrat trong điều kiện yếm khí dưới tác dụng của vi sinh vật tạo thành nitơ [38]. NO3- Vi khuẩn phản nitrat hóa N2 1.1.3.3. Quá trình cố định nitơ phân tử Quá trình này được thực hiện do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium sống cộng sinh ở rễ cây họ Đậu hay Azotobacter sống tự do... sẽ biến đổi N2 trong không khí thành NH3, từ NH3 sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất. Để quá trình này xảy ra thì phải có lực khử mạnh, ATP và thực hiện ở điều kiện kỵ khí (do chỉ trong điều kiện này enzyme nitrogenase mới hoạt động) [38]. N2 + H2 Không khí Nitrogenase NH3 Vi khuẩn cố định đạm H2O Hình 1.2. Chu trình nitơ trong tự nhiên [37] -6- NH4+ Tổng quan tài liệu 1.2. Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ 1.2.1. Phân loại Vi khuẩn cố định nitơ được phân ra thành ba nhóm nhỏ: nhóm vi khuẩn sống cộng sinh, nhóm vi khuẩn sống tự do và nhóm vi khuẩn tương tác với thực vật ký chủ. Tuy nhiên, sự phân biệt giữa ba nhóm này, đặc biệt là giữa nhóm vi khuẩn cố định đạm sống tự do và nhóm vi khuẩn cố định đạm tương tác với thực vật thì vẫn chưa được mô tả một cách rõ ràng và một số vi khuẩn được xếp vào nhiều nhóm [6,10]. * Vi khuẩn sống cộng sinh: là những vi khuẩn sống tương tác với thực vật ký chủ theo kiểu hai bên cùng có lợi. Khi đó, vi khuẩn cộng sinh sẽ tiến hành trao đổi chất dinh dưỡng với thực vật và làm thay đổi cấu trúc mô thực vật ở nơi vi khuẩn định cư, điển hình là hiện tượng tạo nốt sần ở rễ của những cây họ Đậu. Hiện tượng cộng sinh giữa vi khuẩn và cây họ Đậu được xem là tương tác gần giữa vi khuẩn và thực vật, trong đó, vi khuẩn được gọi là sinh vật cộng sinh. Hầu hết các vi khuẩn cố định nitơ là vi khuẩn gram âm , có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ Đậu, hay là những thành viên xạ khuẩn thuộc chi Frankia – là vi khuẩn gram dương có khả năng hình thành nốt sần trên cây thân gỗ, cây hai lá mầm và cây bụi. Ban đầu, những vi khuẩn cộng sinh với cây họ đậu được phân loại thành chi Rhizobium, do đó, những vi khuẩn này thường được nói đến như là những vi khuẩn nốt rễ (rhizobia). Ngày nay, những vi sinh vật cộng sinh ở cây họ Đậu được phân thành nhiều chi, trong đó, hầu hết các loài thuộc chi Rhizobium, Sinorhizobium (Ensifer), Mesorhizobium và Bradyrhizobium [6,10]. * Vi khuẩn cố định nitơ tự do: là những vi khuẩn cố định nitơ tương tác với thực vật mà không xâm nhập vào cơ thể của chúng theo hướng cộng sinh chuyên biệt. Trong số này quan trọng nhất là các loài thuộc chi Azotobacter, Pseudomonas và Clostridium [6,10]. * Vi khuẩn cố định nitơ tương tác: là những vi sinh vật tham gia vào quá trình trao đổi chất dinh dưỡng với thực vật nhưng không làm thay đổi cấu trúc của rễ thực vật. Để phân biệt được vi sinh cố định nitơ cộng sinh hay tương tác với thực vật ký chủ thì chủ yếu dựa vào mức độ tương tác. Sự cố định nitơ tương tác được hiểu là quá trình cố định nitơ bởi những vi sinh vật sống tự do nhưng lại chịu ảnh hưởng trực tiếp bởi cây trồng. Theo Klucas (1991), trong mối quan hệ tương tác, cả cây trồng và vi khuẩn cố định nitơ -7- Tổng quan tài liệu đều có lợi nhưng mối quan hệ này thường diễn ra ngẫu nhiên nhiều hơn là sự cộng tác bắt buộc. Sự cố định nitơ tương tác là một quá trình sinh thái trung gian giữa cố định nitơ cộng sinh và nitơ tự do. Và vi khuẩn cố định nitơ tương tác bao gồm những vi khuẩn sống tự do trong vùng lân cận rễ cây thực vật đến những vi sinh vật sống nội sinh trong mô tế bào thực vật. Để quá trình cố định nitơ của vi sinh vật tương tác có thể diễn ra cần những yêu cầu sau đây [10]: + Thực vật ký chủ + Chất nền thực vật + Môi trường thích hợp để enzyme nitrogenase hoạt động. + Quá trình chuyển nitơ được cố định từ vi khuẩn sang cây trồng. Một số vi khuẩn tham gia vào quá trình cố định nitơ tương tác điển hình như: Azospirillum, Burkholderia, Enterobacter, Gluconoacetobacter, Herbasspirillum và Klebsiella [10]. 1.2.2. Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ Vai trò quan trọng nhất của những vi khuẩn cố định nitơ đó là khả năng cố định nitơ cung cấp đạm cho cây trồng. Bên cạnh đó, các vi khuẩn cố định nitơ còn được biết đến với nhiều vai trò khác có ích cho cây trồng như: - Kích thích sinh trưởng ở thực vật bằng cách tạo ra các enzyme như ACC deaminase (1-aminocyclopropane-1-carbonxylate deaminase), hay tạo ra các hormone thực vật như auxin, cytokinin và gibberellin. Đặc biệt các chủng Azotobacter kích thích sự nẩy mầm của hạt và giúp phát triển hệ rễ của cây trồng [18, 22]. - Giảm tác động có hại của mầm bệnh bằng cách cạnh tranh về dinh dưỡng, cạnh tranh về nơi cư trú hay tạo ra các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân chống lại bệnh sự xâm nhập của kẻ thù hay cảm ứng hệ thống phòng vệ của cây ký chủ [18,20, 22]. - Ngoài ra, chúng còn giúp cây trồng hấp thu hiệu quả các ion như sắt, kẽm và các nguyên tô vi lượng khác [24]. -8- Tổng quan tài liệu 1.3. Vi khuẩn Azotobacter 1.3.1. Đặc điểm phân loại Theo khóa phân loại Bergey (2005), Azotobacter được chia thành 7 loài: A. chroococcum, A. beijerinckii, A. vinelandii, A. salinestris, A. paspali, A. nigricans, A. armeniacus. - A. chrococcum (Beijerinck, 1901): tế bào hình que thẳng đến hình elíp, kích thước đường kính 1,6 x 2,5 m và 3-5 m chiều rộng, tạo nang xác, có khả năng di động được, có tiên mao. Khuẩn lạc khi già có màu nâu đen, sắc tố không khuếch tán vào môi trường. Có khả năng đồng hóa mannitol, tinh bột, glucose…. Khuẩn lạc mờ đục, lồi, hầu hết các chủng đều nhầy, trơn và bóng [14, 23]. - A. beijerinskii (Lipman, 1904): tế bào có kích thước 2,4 x 5,0 m, có khả năng tạo nang xác, không có lông roi, không di động được. Khi già có màu vàng hoặc màu nâu sáng. Sắc tố không khuếch tán vào môi trường. Có khả năng đồng hóa mannitol, không đồng hóa tinh bột nhưng đồng hóa được benzoat natri [14, 23]. - A. vinelandii (Lipman, 1903): tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 µm, có khả năng tạo nang xác, có tiên mao, có khả năng di động. Loài này sinh sắc tố màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố này khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa mannitol và Sodium benzoat [14, 23]. - A. salinestris (Page và Shivprasad, 1991) tế bào có hình cầu que (cocobacilli), kích thước 2 x 3-4 m khi tế bào còn non, khi già có hình cầu với bán kính từ 3-5 m, nhiều dạng và thường tìm thấy dạng kết đôi hoặc dạng chuỗi (6-8 tế bào), tạo nang xác. Tế bào di động bởi chu mao (Peritrichous flagella) dài 9-10 m. Tế bào già thì không di động, có khả năng tăng trưởng tốt ở dãy nhiệt độ 30-360C. Nhiệt độ cố định nitơ tốt nhất là 350C, tế bào phát triển trong khoảng pH 6.2 – 8.0 và tối ưu ở pH 7.2. Khả năng sử dụng nguồn carbon bao gồm fructose, galactose, glucose, sucrose, mannitol, melibiose, 0.25% sodium benzoate và tinh bột. Nguồn nitrate và amomonium được sử dụng như nguồn nitơ. Sắc tố màu nâu nhạt đến nâu đen được tạo thành bởi hầu hết các chủng khi chúng phát triển trên môi trường vô đạm và thông khí tốt [14, 23]. -9- Tổng quan tài liệu - A. paspali (Dobereiner, 1966): đặc điểm hình thái giống với các chủng loài Azotobacter khác, nhưng tế bào dài hơn, kích thước tế bào thường 5 – 10 µm, có thể dài tới 60 µm. Tế bào di động bởi chu mao (peritrichous flagella). Khuẩn lạc thường mờ đục với đường mép liên nhau hoặc lượn sóng, thường không nồi và bề mặt nhám. Có thể sử dụng ammonium nhưng không sử dụng được glutamate như là nguồn nitơ duy nhất cho sự tăng trưởng. Theo Thompson và Skerman (1979),Nguồn carbon sử dụng được bao gồm maltose, trihalose, raffinose, mannitol [14, 23]. - A. nigricans (Krasil’ nikov, 1949): Tế bào hình que đầu tròn, không di động và không có tiêm mao. Khuẩn lạc thường trơn, nhưng có thể thay đổi do lượng polysaccharide ngoại bào. Hầu hết tế bào mờ đục nhưng có thể trong mờ. Sắc tố được tạo ra thường có màu đỏ tím. Tăng trưởng yếu hoặc không tăng trưởng ở 370C. Ammonium và nitrate được sử dụng như là nguồn nitơ thích hợp. Loài này mang gen nif và vnf nhưng không có anf, có khả năng tổng hợp nitrogenase-1 và nitrogenase-2 [14, 23]. - A. armeniacus (Thompson và Skerman, 1981): đặc điểm hình thái của loài này giống hầu hết các chủng khác. Tế bào di động bằng chu mao, khuẩn lạc mờ đục, rất nhầy và bề mặt nhám nhiều hơn các chủng khác. Sắc tố tan trong nước màu nâu đen đến đỏ tím [14, 23]. (a) (b) (c) Hình 1.3. Tế bào sinh dưỡng các chủng Azotobacter [14] A. chrococcum (a), A. nigricans (b), A. paspali (c) 1.3.2. Tổng quan về Azotobacter Azotobacter thuộc chi vi khuẩn gốc rễ sống tự do, không sinh bào tử nhưng tạo bào xác (cyst) giúp chúng chống chịu được với điều kiện khô hạn và bất lợi. Chúng được tìm - 10 - Tổng quan tài liệu thấy trong đất trung tính đến kiềm, trong môi trường nước và trên một số thực vật. Azotobacter được quan tâm nhiều do chúng có khả năng cố định nitơ phân tử từ không khí thành ammonia. Quá trình cố định này được thực hiện nhờ hệ nitrogenase [17]. Chủng đầu tiên thuộc chi Azotobacter được phân lập từ đất là chủng Azotobacter chrococcum ở Holland vào năm 1901. Kể từ đó các loài vi khuẩn này đã được nghiên cứu bởi nhiều tác giả. A. chrococcum và A. algilis được nghiên cứu bởi Beijerinck (1901). Trong nhiều năm tiếp theo thì các loài thuộc nhóm vi khuẩn Azotobacter khác đã được tìm thấy trong đất và xung quanh vùng rễ như A. vinelandii (Lipman, 1903), A. beijernckii (Lipman, 1904), A. nigricans (Krassilnikov, 19490), A. paspali (Dobereiner, 1966); A. armenicus (Thompson và Skerman, 1981), A. salinestris (Page và Shivprasad, 1991). Các loài vi khuẩn cố định nitơ này rất quan trọng trong ngành nông nghiệp và môi trường [23] vinelandii A. salinestris A. paspali A. nigricans A. A. beijerinckii Đặc điểm A. A. chroococcum Tên loài armeniacus Bảng 1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số loài thuộc chi Azotobacter [14] Sắc tố tan trong nước Vàng xanh - - - - + - + Xanh - - - - - - d Nâu đen - - - d - + - Nâu đen đến đỏ tím - + - + - - - Đỏ tím - + - d + - d + - + + - + + D-Glucuronate - - + - - + - D-Galacturonate - + + - - nd - Glutarate - d - - - nd + Glycolate - - - - - nd + Phenol - - d - - nd + Rhamnose - - - - - - + Caproate + - - - - nd + Caprylate - + - - - nd + meso-Inositol - + + - - nd + Malonate + - - d - nd + Khử nitrate thành nitite Nguồn carbon - 11 - Tổng quan tài liệu Propan-1-ol - - d d - nd + Trehalose + + d + - nd - Tinh bột thủy phân + + d d - nd - Di động + + - - + + + Chu mao (Petitrichous flagella) + + - - + + + 5.0-5.5 - - d d - - - 6.0 - - + d d d + 6.5-9.5 + + + + + + + 10 + d + + + - + nif + d + + + d + vnf + nd + + + d + anf - nd - - + nd + 90C - - d d - - - 0 14 C d - + d + - + 180C + d + + + - + 0 32 C + + + + + d + 0 d d - - + + + Sản xuất polysaccharide ngoại bào + d d + - d d Peroxidase d d d d - + + Urease + + + + + + + Oxidase + d + + + nd + Thiosulfate d - d d + nd + Cysteine - - - - d nd d + + + + + + + Sucrose + d + + + + + Propionate + d + - - nd + β-Phenylpropionate d - - - - nd + n-Butyrate + + + d - nd + Glutarate - d - - - nd + DL-β-Hydroxybutyrate d + + d - nd d Benzoate d - + - - + + nd - Sự cố định nitơ xẩy ra ở pH Các gen cố định nitơ Phát triển ở nhiệt độ: 37 C Tạo H2S từ: Sử dụng như nguồn carbon duy nhất Fuctose, glucose, acetate, pyruvate, fumarate, malate, succinate, α-oxoglutarate, lactate, DL-gluconate, hoặc methylcarbinol. Trehalose d + d + - Melibiose + + + d - + + Maltose + + d d - nd + - 12 -
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan

Tài liệu vừa đăng