Tài liệu Phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ---------------- NGUYỄN THỊ THẮM PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG CHUYỂN HÓA BÃ MÍA THÀNH MÙN HỮU CƠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp em đã nhận đƣợc sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của Nhà trƣờng, Thầy cô và các bạn. Trƣớc hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới cô giáo, PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã định hƣớng ý tƣởng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn, sửa luận văn để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo trong Khoa Sinh-KTNN, Trƣờng ĐH Sƣ Phạm Hà Nội 2 đã giảng dạy, tạo điều kiện cho chúng em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Vi sinh vật, Khoa Sinh-KTNN, Trƣờng ĐH Sƣ Phạm Hà Nội 2 đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất giúp em học tập và làm việc trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và ngƣời thân đã động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập để em có đƣợc kết quả này. Trong quá trình thực hiện đề tài, do bƣớc đầu làm quen với nghiên cứu khoa học nên không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc sự đóng góp ý kiến từ phía thầy cô và các bạn sinh viên. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Thắm LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng mình. Các số liệu, các kết quả thu đƣợc trong khóa luận là trung thực, chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Thắm MỤC LỤC MỞ ĐẦU............................................................................................................................. 1 1. Lí do chọn đề tài ..................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu............................................................................... 2 3. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu..................................................... 2 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................... 2 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................. 3 4.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................. 3 4.2. Ý nghĩa thực tiễn.................................................................................. 3 5. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................. 3 6. Tính mới................................................................................................. 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 5 1.1. Đặc điểm và phân loại nấm mốc ........................................................... 5 1.1.1. Nấm bất toàn (Deuteromycetes) ......................................................... 5 1.1.2. Bào tử trần (conidia) ......................................................................... 7 1.2. Sơ lƣợc về chi Penicillium .................................................................... 8 1.3. Sơ lƣợc về chi Aspergillus .................................................................... 9 1.3.1. Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới ..................... 9 1.3.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus ..................................................... 9 1.4. Cellulose và Cellulase .........................................................................11 1.4.1. Cellulose ..........................................................................................11 1.4.2. Cellulase ..........................................................................................12 1.5. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới và Việt Nam ..................................13 1.5.1. Trên Thế giới ...................................................................................13 1.5.2. Ở Việt Nam......................................................................................14 1.6. Định hƣớng ứng dụng..........................................................................15 1.6.1. Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ giàu cellulose .........................15 1.6.2. Ứng dụng trong ủ phân hữu cơ bón cho cây trồng..............................15 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............17 2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu .......................................................17 2.1.1. Vi sinh vật .......................................................................................17 2.1.2. Hóa chất – Thiết bị ...........................................................................17 2.2. Môi trƣờng phân lập và nuôi cấy..........................................................17 2.2.1. Môi trƣờng phân lập nấm mốc ..........................................................17 2.2.2. Môi trƣờng bảo quản và giữ giống ....................................................18 2.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy thử hoạt tính enzyme ........................................18 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .....................................................................18 2.3.1. Phƣơng pháp ủ và lấy mẫu ................................................................18 2.3.2. Phƣơng pháp phân lập nấm mốc........................................................19 2.3.3. Phƣơng pháp nuôi cấy và bảo quản chủng giống ................................19 2.3.4. Phƣơng pháp quan sát hình thái nấm mốc ..........................................19 2.3.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính cellulase của nấm mốc .....................20 2.3.6. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả .............................................21 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................22 3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme cellulase từ bã mía ủ...........................................................................22 3.1.1. Phân lập các chủng nấm mốc trong bã mía ủ......................................22 3.1.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc phân lập .......23 3.1.3. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao .........26 3.2. Nghiên cứu định loại sơ bộ 2 chủng nấm mốc M4 và M6 .......................29 3.2.1. Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc M6 .............................................29 3.2.2. Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc M4 .............................................30 3.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung bột đậu tƣơng đến khả năng sinh enzyme cellulase của 2 chủng nấm mốc Penicillium M4 và chủng Penicillium M6 .............................................32 3.4. Ứng dụng bã mía ủ có bổ sung bột đậu tƣơng chuyển hóa thành mùn hữu cơ và trồng rau sạch.....................................................................35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................41 PHỤ LỤC ..........................................................................................................................45 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả các chủng nấm mốc thu đƣợc sau 5 lần phân lập .............22 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc đã phân lập ..............24 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa 1% CMC ....27 Bảng 3.4. Đánh giá hoạt tính cellulase của các chủng nấm mốc đã phân lập .............................................................................................27 Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulase của 2 chủng Penicillium M4, Penicillium M6 với các tỷ lệ bột đậu tƣơng khác nhau...................33 Bảng 3.6. Kết quả thử nghiệm trồng rau mầm củ cải xanh trên bã mía ủ và đất đối chứng .........................................................................36 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Các dạng Hyphomycetes............................................................... 6 Hình 1.2. Giá sinh bào tử Coelomycetes ....................................................... 6 Hình 1.3. Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt ...................................... 7 Hình 1.4. Một số hình dạng bào tử trần ........................................................ 8 Hình 1.5. Chi Penicillium (Các thành phần của chổi )................................... 9 Hình 1.6. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus: a. 1 lớp b. 2 lớp - c. phiến - d. tia, e. tể .....................................................10 Hình 1.7. Cấu trúc lập thể của cellulose ......................................................11 Hình 1.8. Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase .................13 Hình 3.1. Khuẩn lạc một số chủng nấm mốc trên môi trƣờng Czapeckdox ............................................................................................23 Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của hai chủng nấm mốc đã tuyển chọn............28 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Penicillium M4 trên KHV (x1000) ......................................................................................30 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Penicillium M4 trên KHV (x1000) .....................................................................................32 Hình 3.5. Môi trƣờng thử hoạt tính có bổ sung bột đậu tƣơng ......................33 Hình 3.6. Hoạt tính cellulase của 2 chủng Penicillium M6 và Penicillium M4 trong môi trƣờng bổ sung bột đậu tƣơng.................................35 Hình 3.7. Hình ảnh rau củ cải trồng trên các môi trƣờng đất khác nhau ........37 Hình 3.8. Chiều cao của cây trồng trên bã mía ủ (CT1)................................37 Hình 3.9. Hình ảnh rau củ cải trồng trên các môi trƣờng đất khác nhau ........38 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 1. CMC : Cacboxyl methyl cellulose 2. dd : Dung dịch 3. KHV : Kính hiển vi 4. KL : Khuẩn lạc 5. NM : Nấm mốc 6. VK : Vi khuẩn 7. VSV : Vi sinh vật 8. XK : Xạ khuẩn MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Hiện nay, vấn đề môi trƣờng đang đƣợc hầu hết các quốc gia trên thế giới đặc biệt quan tâm. Ô nhiễm môi trƣờng đang ngày càng trở lên trầm trọng, kéo theo thiên tai biến động ảnh hƣởng tới môi trƣờng sinh thái. Một trong những nguồn thải gây ô nhiễm mỗi trƣờng là các chất thải, phế phẩm khó đƣợc phân hủy trong môi trƣờng tự nhiên, bã mía là một trong số đó. Mía là loại cây lấy đƣờng quan trọng của ngành công nghiệp đƣờng với tổng diện tích hàng triệu hec-ta và sản lƣợng mía thu hoạch mỗi năm lên tới 1,83 tỷ tấn. Lƣợng bã mía thải ra ƣớc tính chiếm 25-30% lƣợng mía đem ép, nguồn bã mía nếu không đƣợc xử lý sẽ đem lại một nguy cơ lớn về lƣợng phế phẩm gây ô nhiễm môi trƣờng. Trên thế giới, nhiều công trình khoa học đã đề cập đến công nghệ xử lý mùn cƣa, trấu, rơm và một số nguyên liệu khác thành phân hữu cơ. Ở Việt Nam trong những năm gần đây, vấn đề về xử lý bã mía, rơm rạ sau thu hoạch đã nhận đƣợc nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu khoa học. Trong đó có nhiều công trình khoa học nghiên cứu và ứng dụng công nghệ xử lý phế phụ phẩm nhƣ: xử lý rơm rạ bằng chế phẩm Trichoderma với nhiều loại đất canh tác khác nhau của Trần Thị Ngọc Sơn, Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long (2013), đã sản xuất thành công chế phẩm sinh học Trichoderma có khả năng xử lý rơm rạ trực tiếp ngoài đồng làm giảm tỷ lệ C/N trong rơm rạ và gia tăng hàm lƣợng NPK, gia tăng năng suất lúa c ng nhƣ tăng hiệu quả kinh tế trồng lúa và cải thiện độ phì nhiêu đất. Hay của Nguyễn Thị Dung (2013), nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp tốt nhất là vỏ trấu và xác định đƣợc điều kiện tối ƣu về khả năng lên men rắn của chủng nấm mốc M4V, ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi. Nghiên cứu gần đây của Phạm 1 Thị Thanh Nhàn (2014), đã nghiên cứu đƣợc 03 chủng vi khuẩn, 02 chủng xạ khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose tốt nhất, đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào và thử nghiệm khả năng phân giải rơm rạ thực tế, có thể ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học chuyển hóa rơm rạ thành phân hữu cơ [13]... Tuy nhiên chƣa có nhiều công trình nghiên cứu đầy đủ về vi sinh vật tham gia chuyển hóa phế phẩm nông nghiệp, đặc biệt là chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ. Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn phế phẩm giàu cellulose đã và đang đƣợc triển khai rộng rãi. Quá trình phân giải này hầu hết là do sự chuyển hóa nhờ vi sinh vật, trong đó nấm mốc là một trong những đối tƣợng đƣợc các nhà khoa học quan tâm bởi lƣợng enzyme ngoại bào sinh ra tƣơng đối lớn, có thể ứng dụng để phân giải nguồn rác thải giàu cellulose nhƣ rác thải sinh hoạt, phế phẩm nông nghiệp. Do vậy, nghiên cứu các chủng nấm mốc có hoạt tính cellulase nhằm xử lý bã mía là hƣớng nghiên cứu cần thiết. Chính vì vậy tôi quyết định thực hiện đề tài:“Phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ”. 2. Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn đƣợc các chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme phân giải cellulose từ khối ủ bã mía; xác định hàm lƣợng bột đậu tƣơng bổ sung thích hợp vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm nâng cao hoạt tính enzyme cellulase của chủng nấm mốc tuyển chọn và ứng dụng chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ, thử nghiệm trồng rau sạch. 3. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu Một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose trong khối ủ bã mía thu đƣợc tại Phƣờng Xuân Hòa, Thị xã Phúc Yên, Tỉnh Vĩnh Phúc. 2 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Phƣơng pháp ủ và lấy mẫu 3.2.2. Phƣơng pháp phân lập nấm mốc 3.2.3. Phƣơng pháp nuôi cấy và bảo quản chủng giống 3.2.4. Phƣơng pháp quan sát hình thái nấm mốc 3.2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính cellulase của nấm mốc 3.2.6. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học Tìm hiểu sự đa dạng của các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose trên các phế phụ phẩm nông nghiệp, qua đó tuyển chọn và định loại sơ bộ một số chủng nấm mốc có hoạt tính enzyme cellulase tốt từ bã mía. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Tìm ra hƣớng đi mới tốt hơn cho phế phẩm bã mía, đồng thời ứng dụng trong quá trình phân giải bã mía và rác thải có cấu trúc cellulose thành mùn hữu cơ, khắc phục ô nhiễm môi trƣờng. 5. Nhiệm vụ nghiên cứu 5.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme cellulase trong bã mía ủ 5.2. Nghiên cứu định loại sơ bộ 2 chủng nấm mốc M4 và M6 5.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung bột đậu tƣơng đến khả năng sinh enzyme cellulase của 2 chủng nấm mốc Penicillium M4 và chủng Penicillium M6 5.4. Ứng dụng bã mía ủ có bổ sung bột đậu tƣơng chuyển hóa thành mùn hữu cơ và trồng rau sạch 3 6. Tính mới Từ nguồn cơ chất bã mía ủ đã tuyển chọn và định loại sơ bộ 2 chủng nấm mốc M4 và M6 có hoạt tính cellulase cao với đƣờng kính vòng phân giải của chủng Penicillium M6 là D = 22mm, chủng Penicillium M4 là D = 21mm. Sử dụng bột đậu tƣơng bổ sung với hàm lƣợng thích hợp vào môi trƣờng nuôi cấy để nâng cao hoạt tính cellulase của 2 chủng đã tuyển chọn: ở chủng Penicillium M6 là 0,7g/100ml, D = 29mm; ở chủng Penicillium M4 là 0,35g/100ml, D = 22,5mm. Ứng dụng bổ sung bột đậu tƣơng vào bã mía nhằm chuyển hóa nhanh thành mùn hữu cơ và ứng dụng trồng rau sạch, giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng. 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm và phân loại nấm mốc Phần lớn nấm mốc thuộc nhóm phân loại Deuteromycetes, một số là dạng sinh sản vô tính của các nhóm nấm túi (Ascomycetes) hoặc nhóm nấm đảm (Basidiomycetes). Deuteromycetes bao gồm khoảng 2400 chi trong đó có 1700 chi thuộc nhóm nấm Hyphomycetes và 700 chi thuộc nhóm Ceolomycetes. Theo E. Kiffer, M. Morelet (2000), trong số các chi nấm thuộc tổ chi Phialoconidiae (lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Deuteromycetes) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài, tiếp theo là chi Aspergillus có khoảng 185 loài. 1.1.1. Nấm bất toàn (Deuteromycetes) Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính của nấm túi hoặc nấm đảm. Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes (1953). Lớp nấm bất toàn đƣợc chia thành 3 nhóm: Nhóm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá (giá sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá). Nhóm Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá bào tử trần ở trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata. Nhóm Agonomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần. Ở đây giới thiệu 2 khoá phân loại đến chi của lớp nấm bất toàn. 1.1.1.1. Hyphomycetes (moniliaales- nấm bông, 1700 chi, 11000 loài) Các dạng hệ sợi nấm mang các bào tử trên sợi riêng rẽ hoặc trên cụm sợi nấm (nhƣ các đệm nấm, các bó giá), nhƣng không ở trong các conidiomata (fruit body) riêng biệt. 5 Hình 1.1. Các dạng Hyphomycetes 1.1.1.2. Coelomycetes (nấm xoang, 700 chi, 9000 spp) riêng rẽ Bào tử trần sinh ra trong các túi giá, đĩa giá, túi giá dạng cốc, đệm giá. Hình 1.2. Giá sinh bào tử Coelomycetes 1.1.1.3. Agonomycetes (mycelia sterilia - nấm bất thụ) Agonomycetes không có khả năng sinh sản bằng bào tử. Một số tạo thành cấu trúc gọi là sclerotina, các bào tử áo (Chlamydospore) hoặc các tế bào dày (tế bào Hulle). Nói chung đây là nhóm không có các đặc điểm đặc trƣng để phân loại (Erick H.C. Mckenzie, 2004; Michael J. Carlie, Sarah C. Watkinson, Graham, 1994). Năm 1995, Hughes đã đƣa ra khóa phân loại có tính liên kết và tổng quát hơn về nhóm Hyphomycetes. Ông chia nhóm này thành 8 tổ chi dựa vào đặc điểm của giá bào tử trần (conidiophores) và bào tử trần (conidia). Năm 1968, Baron lại đƣa ra một 6 khóa phân loại khác hoàn chỉnh hơn mà ngày này nhiều nhà nấm học vẫn sử dụng (H.L. Barneet & Barry B. Hunter, 1973), trong đó các đặc điểm của conidia, các kiểu tạo thành conidia từ các tế bào sinh ra nó, sự tiến hóa của các tế bào conidia và các tế bào sinh ra nó... là những đặc điểm quan trọng để phân loại (Erick H.C. Mckenzie, 2004; E. Kifer & N Morelet, Robert K. Noyd, 2000). Cuống sinh bào tử trần: Một sợi nấm phân nhánh hoặc đơn giản (một sợi nấm sinh sản) mang hoặc gồm có các tế bào sinh bào tử trần mà từ đó các bào tử trần đƣợc sinh ra. Đôi khi đƣợc dùng khi mô tả những cấu trúc biến đổi đối với các tế bào sinh bào tử trần. Có nhiều dạng: dạng có hoặc không có vách ngăn đơn giản không phân nhánh (H1.3c), dạng cuống sinh bào tử trần kéo dài cùng với việc sinh bào tử trần (H1.3d), dạng cuống có vách ngăn, phát triển đơn độc hoặc phân nhánh (H1.3e). Hình 1.3. Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt 1.1.2. Bào tử trần (conidia) Có nhiều hình dạng khác nhau: Hình dạng đơn giản. Ví dụ: Cầu, gần cầu, elip, hình quả thận (H.1.4a). Bào tử sợi, tỷ lệ chiều dài và rộng của bào tử = 15:1(H1.4b). Bào tử vách lƣới, bào tử đƣợc chia nhỏ ra bởi các vách ngăn chéo nhau (H1.4c). Bào tử xoắn ốc trục bào tử uốn cong hơn 1800 (H1.4d ). Bào tử dạng chữ thập, bào tử có nhiều trục, có mấu, có lông mềm chiếm 1/4 chiều dài của bào tử (H1.4e). 7 Hình 1.4. Một số hình dạng bào tử trần 1.2. Sơ lƣợc về chi Penicillium Theo E. Kiffer, M. Morelet (2000), trong số các chi nấm thuộc tổ chi Phialoconidiae (lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Deuteromycotina) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài, chúng phân bố khắp nơi trên trái đất, cƣ trú ở trên rất nhiều các ổ sinh thái. Theo Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2001) [5] chi Penicillium đặc trƣng bởi các đặc điểm: Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đôi khi màu sẫm. Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi có màu vàng, đỏ, tím hoặc trắng. Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc có màu sắc khác nhau, môi trƣờng thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu sắc do có mặt các sắc tố hòa tan tƣơng ứng. Bộ máy mang bào tử trần hoặc chỉ gồm giá bào tử trần với một vòng thể bình ở đỉnh giá, hoặc gồm giá bào tử trần với hai đến nhiều cuống thể bình ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình đó có các thể bình. Giá bào tử trần có thể phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất, sát mặt môi trƣờng thạch nuôi cấy (các sợi nền), khi đó thƣờng có chiều dài đều nhau và khẩn lạc có dạng mặt nhung (velutinate). Bào tử trần c ng nhƣ giá bào tử trần, các nhánh, các cuống thể bình, các thể bình tùy từng loại có mặt ngoài nhẵn, ráp, có gai hoặc sần sùi, gồ ghề. 8 Hình 1.5. Chi Penicillium (các thành phần của chổi) 1.3. Sơ lƣợc về chi Aspergillus 1.3.1. Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới Chi Aspergillus do Micheli mô tả lần đầu tiên năm 1729, sau đó năm 1809, Link đã mô tả loài Aspergillus glaucus và loài nấm túi Eurotiumherbariorum đƣợc phát hiện trên cùng một tiêu bản mẫu cây khô. Fries (1832) đã công nhận chi nấm này của Micheli De Bary (1850) phát hiện ra rằng, giai đoạn bào tử trần của Eurotium herbariorum chính là Aspergillus glaucus. Nhƣ vậy, theo Luật pháp Quốc tế và danh pháp thực vật, chi Aspergillus chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries. Hệ thống phân loại chi Aspergillus của Raper và Fennell (1965) gồm 132 loài (đã đƣợc chấp nhận) và đƣợc xếp vào 18 nhóm loài, đến nay vẫn ổn định và đƣợc sử dụng rộng rãi, về cơ bản không sửa đổi, mặc dù cho đến nay một số loài mới thuộc chi nấm này đã đƣợc công bố với số loài hiện biết là 185 loài Aspergillus. 1.3.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus Hệ sợi nấm gồm các sợi có vách ngăn phân cách, không màu, màu nhạt, hoặc một số trƣờng hợp trở nên nâu hay màu sẫm khác ở vùng nhất định của khuẩn lạc. Sinh sản vô tính bằng bào tử trần (conidia). C ng nhƣ các loại nấm bất toàn khác, hình thái cơ quan sinh bào tử trần là một đặc điểm chủ yếu, đặc trƣng dùng trong phân loại chi nấm này. 9 Các đặc điểm cơ quan sinh bào tử trần: cơ quan sinh bào tử trần phát triển tử một tế bào đặc biệt gọi là tế bào chân có đƣờng kính lớn hơn, màng dày hơn các tế bào lân cận của sợi nấm. Từ tế bào chân phát triển thành giá bào tử trần. Giá bào tử trần có thể có vách ngăn, bề mặt nhẵn hoặc không nhẵn, trong suốt hoặc có màu, dài hay ngắn tùy thuộc vào loài. Phần ngọn của giá bào tử phình rộng tạo thành bọng đỉnh giá (versicle). Bọng đỉnh giá có thể có nhiều hình thái khác nhau, đây là một đặc điểm đặc trƣng để phân loại Aspergillus với các loại nấm Hyphomycetes khác, đặc biệt với các chi Penicillium. Bọng đỉnh giá có thể có hình cầu, hình bán cầu, hình chùy, hình quả bầu, hình bàn chang. Từ bọng đỉnh giá sinh ra các tế bào sinh bào tử trần gọi là thể bình (phialide). Nếu các thể bình sinh ra trực tiếp từ bọng đỉnh giá thì gọi là dạng đơn tầng (uniseriate). Nếu các thể bình đƣợc sinh ra qua một lớp tế bào gốc xuất phát từ bọng đỉnh giá (lớp cuống thể bình, metulae) thì gọi là dạng lƣỡng tầng (biseriate). Philade hoặc metulae mọc trên bọng đỉnh giá c ng là đặc điểm đặc trƣng để phân biệt Aspergillus với các chi có quan hệ gần g i với nó. Từ thể bình sinh ra các bào tử trần (conidia). Bào tử trần không có vách ngăn, khác nhau về hình dạng, kích thƣớc, màu sắc ở các loài khác nhau. Hình 1.6. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus: a. 1 lớp b. 2 lớp - c. phiến - d. tia, e. tể 10 1.4. Cellulose và Cellulase 1.4.1. Cellulose Cellulose là loại polysaccharide cấu trúc của thực vật, chúng tạo nên thành tế bào, giúp cho các mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi. Cellulose là thành phần chủ yếu trong thân, lá của thực vật (trong gỗ chứa khoảng 95% cellulose, sợi bông vải 97 - 98%, sợi đay 75%, thân cây họ Cói và họ Lúa 30 - 40%)... Trong đó, bã mía chứa trung bình 49% là nƣớc, 48% là xơ (45-55% cellulose) và 2,5% là chất hoà tan (đƣờng). Cellulose có màu trắng, không mùi. Cellulose không tan trong nƣớc (ngay cả khi đun nóng) và các dung môi hữu cơ thông thƣờng nhƣng tan trong một số dung dịch axit vô cơ mạnh (HCl, HNO 3) và một số dung dịch muối (ZnCl2, PbCl2),... Cellulose là hợp chất cao phân tử đƣợc cấu tạo bởi hàng nghìn đến hàng chục nghìn gốc β-D-Glucose liên kết với nhau bằng các liên kết β-1,4glycoside nên có cấu trúc mạch thẳng, rất bền và khó bị phân hủy. Cellulose có công thức cấu tạo là (C 6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000. Trong đó có các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang. Hình 1.7. Cấu trúc lập thể của cellulose Các phân tử cellulose kết hợp với nhau tạo thành micel tức là bó sợi có chiều dài 50 - 100Å. Các micel lại tạo thành bó microfibril với đƣờng kính khoảng 250Å nhờ nhiều liên kết hydro tạo sợi bền chắc. Toàn bộ cấu trúc này đƣợc bao bọc bởi lignin và hemicelluloses. 11