Tài liệu Phân lập một số hợp chất taxoid từ lá thông đỏ lá dài (taxus wallichiana zucc.) trồng ở lâm đồng, định hướng thiết lập chất đối chiếu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỨA HOÀNG OANH PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TAXOID TỪ LÁ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI (TAXUS WALLICHIANA ZUCC.) TRỒNG Ở LÂM ĐỒNG, ĐỊNH HƯỚNG THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỨA HOÀNG OANH PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TAXOID TỪ LÁ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI (TAXUS WALLICHIANA ZUCC.) TRỒNG Ở LÂM ĐỒNG, ĐỊNH HƯỚNG THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC MÃ SỐ: 62720410 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN PHƯƠNG DUNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Người cam đoan Hứa Hoàng Oanh i MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................... i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ................................................ iii DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vii DANH MỤC SƠ ĐỒ ............................................................................................. x MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI ..................................................... 3 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG THÔNG ĐỎ .................................... 12 1.3. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA THÔNG ĐỎ ............................................... 19 1.4. TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT TAXOID TỪ THÔNG ĐỎ ............................. 21 CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 33 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..................................................................... 33 2.2. DUNG MÔI, HÓA CHẤT .......................................................................... 33 2.3. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ.................................................................. 33 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 46 3.1. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP TAXOID TRONG LÁ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI 46 3.2. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ................................................................ 69 3.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC TAXOID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ......................... 87 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 103 ii 4.1. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG TAXOID TRONG LÁ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI......................... 103 4.2. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU .............................................................. 117 4.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HỢP CHẤT TAXOID .............................................................................................. 118 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI ................................................................................ 124 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 125 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 127 DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 132 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 1 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 1 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt tắt (M)Hz (Mega)Hertz ACN CĐC COSY Acetonitrile Chất đối chiếu Correlated Spectroscopy cs d cộng sự doublet Đỉnh đôi dd doublets of doublet Đỉnh đôi kép DCM Dichloromethan Distortionless Enhancement by DEPT EtOAc EtOH HMBC HPLC HSQC (Phổ) tương quan 1H – 1H Polarization Transfer Ethyl acetate Ethanol Heteronuclear Multiple Bond Correlation High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng Chromatography Heteronuclear Single Quantum cao Correlation IR Infrared Hồng ngoại J L Coupling constant Liter Hằng số ghép Lít m MeOH Multiplet Methanol Đỉnh đa Medium Pressure Liquid Sắc ký lỏng áp suất trung Chromatography Mass Spectroscopy bình Khối phổ MPLC MS iv Ký hiệu, chữ viết Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt tắt NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân PDA Photo diode array Dãy diod quang PFP Pentafluorophenyl PE Petrolium ether Pđ PTN SKC Phân đoạn Phòng thí nghiệm Sắc ký cột SKĐ SKLM Sắc ký đồ Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử Tw1 Taxus wallichiana 1 Tw2 Taxus wallichiana 2 UV-Vis Ultraviolet Visible Ultra Performance Liquid Chromatography UPLC 10-DAB 10-deacetylbaccatin 10-DAT 10-deacetyltaxol Ether dầu hỏa Phân đoạn 1 của cao thông đỏ qua sắc ký cột Phân đoạn 2 của cao thông đỏ qua sắc ký cột Tử ngoại – Khả kiến Sắc ký lỏng siêu hiệu năng v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các hợp chất diterpen phân lập từ Taxus wallichiana................................. 15 Bảng 1.2. Các hợp chất trong tinh dầu ở lá Taxus wallichiana Zucc........................... 18 Bảng 1.3. Các phương pháp chiết xuất taxoid và các dung môi được sử dụng ............. 23 Bảng 1.4. Các phương pháp phân tích định lượng các hợp chất taxoid ....................... 32 Bảng 2.1. Ký hiệu, thời gian và địa điểm thu hái các mẫu khảo sát ............................ 33 Bảng 3.1. Kết quả định tính thành phần hóa học trên các dịch chiết .......................... 46 Bảng 3.2. Kết quả phân lập các phân đoạn giàu taxoid bằng sắc ký cột cổ điển ........ 49 Bảng 3.3. Điều kiện sắc ký HPLC trong đánh giá độ tinh khiết và tinh sạch các hợp chất (1) và (2) ................................................................................................................. 51 Bảng 3.4. Điều kiện sắc ký trong phân lập và đánh giá độ tinh khiết hợp chất (3)..... 52 Bảng 3.5. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất (1) và taxinin B.. 55 Bảng 3.6. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất (2) và taxuspin F .. 58 Bảng 3.7. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và C-NMR của hợp chất (3) và 10-deacetyl 13 taxinin B ......................................................................................................................... 62 Bảng 3.8. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất (4) với taxuspin D 65 Bảng 3.9. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất (5) với taxchinin B.. 68 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ tinh khiết các hợp chất bằng kỹ thuật HPLC........... 71 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của phương pháp HPLC ........... 71 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát tính tuyến tính ................................................................ 74 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng (n = 9)................................................................ 77 Bảng 3.14. Dữ liệu phổ UV-Vis, MS và điểm chảy, năng suất quay cực của các chất phân tích ........................................................................................................................ 79 Bảng 3.15. Dữ liệu phổ IR của các chất phân tích ........................................................ 79 Bảng 3.16. Khảo sát độ lặp lại của taxinin B ................................................................ 80 Bảng 3.17. Khảo sát độ lặp lại của taxuspin F.............................................................. 81 Bảng 3.18. Khảo sát độ lặp lại của 10-deacetyl taxinin B ............................................ 81 vi Bảng 3.19. Khảo sát độ lặp lại của taxuspin D ............................................................. 82 Bảng 3.20. Kết quả kiểm tra độ đồng nhất lô của các nguyên liệu chất đối chiếu ...... 83 Bảng 3.21. Kết quả đánh giá bằng phân tích thống kê ANOVA một yếu tố ............... 83 Bảng 3.22. Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích thống kê ANOVA một yếu tố 84 Bảng 3.23. Xác định giá trị ấn định của taxinin B........................................................ 85 Bảng 3.24. Xác định giá trị ấn định của taxuspin F ..................................................... 85 Bảng 3.25. Xác định giá trị ấn định của 10-deacetyl taxinin B .................................... 86 Bảng 3.26. Xác định giá trị ấn định của taxuspin D ..................................................... 86 Bảng 3.27. Chương trình rửa giải gradient định lượng đồng thời các taxoid ............. 92 Bảng 3.28. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 99 Bảng 3.29. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống (%RSD) ................................ 99 Bảng 3.30. Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian (n = 6) ............... 100 Bảng 3.31. Kết quả khảo sát độ đúng (n = 9).............................................................. 100 Bảng 3.32. Hàm lượng taxoid trong mẫu thử TW ..................................................... 101 Bảng 4.1. So sánh hệ số di chuyển Rf của 2 pic trong phân đoạn Tw1-3 khảo sát với 3 hệ dung môi khai triển SKLM .................................................................................... 108 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Thông đỏ lá dài mọc tự nhiên ......................................................................... 4 Hình 1.2. Thông đỏ lá dài được trồng ............................................................................. 4 Hình 1.3. Vi phẫu lá của Taxus caespitosa var. latifolia ................................................. 6 Hình 1.4. Các dạng hạt của Taxus sp. ............................................................................. 7 Hình 1.5. Lá và hạt của Taxus contorta var. contorta ................................................... 10 Hình 1.6. Dạng lá Taxus contorta var. mucronata có lá uốn cong, từ Bhutan ............. 10 Hình 1.7. Taxus chinensis với các hạt có đầu nhọn, từ Quý Châu, Trung Quốc......... 10 Hình 1.8. Cành của Taxus chinensis trên núi Nga Mi, Tứ Xuyên, Trung Quốc ................. 11 Hình 1.9. Cành của Taxus wallichiana từ Khasia, Ấn Độ ................................................... 11 Hình 1.10. Lá của T. wallichiana var. yunnanensis, từ Vân Nam, Trung Quốc .......... 11 Hình 1.11. Lá của T. wallichiana var. wallichiana Đông Himalaya ............................. 11 Hình 1.12. Khung taxoid căn bản ................................................................................. 13 Hình 1.13. Khung 6/8/6 của hợp chất taxoid trong Thông đỏ ...................................... 14 Hình 1.14. Cấu trúc các hợp chất taxoid có nitơ ở mạch nhánh C13 .......................... 14 Hình 1.15. 10,15-epoxy-11(151)-abeo-10-deacetylbaccatin III ................................. 16 Hình 1.16. Wallifoliol .................................................................................................... 16 Hình 3.1. Sắc ký đồ các phân đoạn phân lập hợp chất sau khi triển khai cao MeOH 100% đã xử lý qua cột cổ điển Silica-gel ...................................................................... 51 Hình 3.2. Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (1) .......................................... 56 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất (1) ................................................................ 56 Hình 3.4. Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (2) .......................................... 59 Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất (2) ................................................................ 59 Hình 3.6. Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (3) .......................................... 61 Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất (3) ................................................................ 61 viii Hình 3.8. Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (4) .......................................... 64 Hình 3.9. Cấu trúc của hợp chất (4) ............................................................................. 64 Hình 3.10. Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (5). ....................................... 67 Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất (5). ............................................................. 69 Hình 3.12. Sắc ký đồ SKLM kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất (1) ......................... 70 Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu trắng .................................................................................... 72 Hình 3.14. Sắc kí đồ HPLC của taxinin B (λ = 280 nm) ............................................... 72 Hình 3.15. Sắc kí đồ HPLC của taxuspin F (λ = 280 nm) ............................................ 73 Hình 3.16. Sắc kí đồ HPLC của 10-deacetyl taxinin B (λ = 280 nm) .......................... 73 Hình 3.17. Sắc kí đồ HPLC của taxuspin D (λ = 280 nm) ............................................ 74 Hình 3.18. Sắc kí đồ HPLC của taxinin B .................................................................... 75 Hình 3.19. Sắc kí đồ HPLC 3D kiểm tra độ tinh khiết của taxinin B .......................... 75 Hình 3.20. Độ tinh khiết sắc ký taxuspin F ................................................................... 75 Hình 3.21. Sắc kí đồ HPLC 3D kiểm tra độ tinh khiết của taxuspin F........................ 76 Hình 3.22. Sắc kí đồ HPLC của 10-deacetyl taxinin B ................................................. 76 Hình 3.23. Sắc kí đồ HPLC 3D kiểm tra độ tinh khiết 10-deacetyl taxinin B ............. 76 Hình 3.24. Sắc kí đồ HPLC của taxuspin D.................................................................. 77 Hình 3.25. Sắc kí đồ HPLC 3D kiểm tra độ tinh khiết của taxuspin D ....................... 77 Hình 3.26. Phổ hấp thu UV của taxuspin F .................................................................. 87 Hình 3.27. Phổ hấp thu UV của paclitaxel.................................................................... 87 Hình 3.28. Phổ hấp thu UV của 10-deacetyl taxinin B ................................................. 88 Hình 3.29. Phổ hấp thu UV của taxuspin D.................................................................. 88 Hình 3.30. Phổ hấp thu UV của taxinin B .................................................................... 88 Hình 3.31. Sắc ký đồ khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid bằng HPLC ở bước sóng 280 nm ........................................................................................... 89 Hình 3.32. Sắc ký đồ khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid bằng HPLC ở bước sóng 227 nm ........................................................................................... 89 ix Hình 3.33. Sắc ký đồ HPLC khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid với hệ pha động ACN – H2O (70 : 30) (λ = 227 nm) .......................................... 90 Hình 3.34. Sắc ký đồ HPLC khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid với hệ pha động ACN – H2O (60 : 40) (λ = 227 nm) .......................................... 91 Hình 3.35. Sắc ký đồ HPLC khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid với hệ pha động ACN – H2O triển khai gradient như bảng 3.27...................... 92 Hình 3.36. Sắc ký đồ HPLC khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid ở tốc độ dòng 0,8 ml/phút (λ = 227 nm) ............................................................. 93 Hình 3.37. Sắc ký đồ HPLC khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid ở tốc độ dòng 1,2 ml/phút (λ = 227 nm) ............................................................. 93 Hình 3.38. Sắc ký đồ HPLC khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid ở tốc độ dòng 1 ml/phút (λ = 227 nm) ................................................................ 94 Hình 3.39. Sắc ký đồ taxuspin F (λ = 280 nm) .............................................................. 95 Hình 3.40. Sắc ký đồ paclitaxel (λ = 227 nm)............................................................... 95 Hình 3.41. Sắc ký đồ 10-deacetyl taxinin B (λ = 280 nm) ............................................. 95 Hình 3.42. Sắc ký đồ taxuspin D (λ = 280 nm).............................................................. 96 Hình 3.43. Sắc ký đồ taxinin B (λ = 280 nm) ................................................................ 96 Hình 3.44. Sắc ký đồ mẫu trắng (λ = 280 nm) .............................................................. 97 Hình 3.45. Sắc ký đồ mẫu chuẩn (λ = 227 nm) ............................................................. 97 Hình 3.46. Sắc ký đồ mẫu chuẩn (λ = 280 nm) ............................................................. 98 Hình 3.47. Sắc ký đồ mẫu thử (λ = 227 nm) ................................................................. 98 Hình 3.48. Sắc ký đồ mẫu thử TW .............................................................................. 101 Hình 4.1. SKĐ khảo sát tốc độ dòng ở 40 ml/phút và 50 ml/phút.............................. 109 Hình 4.2. Sắc ký đồ HPLC độ tinh khiết của hợp chất (1) trước khi tinh chế ......... 110 Hình 4.3. Sắc ký đồ HPLC mẫu chuẩn ở bước sóng 227 nm ..................................... 120 Hình 4.4. Sắc ký đồ HPLC mẫu chuẩn ở bước sóng 280 nm ..................................... 121 Hình 5.1. Cấu trúc hóa học của các hợp chất taxoid được phân lập ........................ 126 x DANH MỤC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1. Các nội dung và phương pháp nghiên cứu .................................................. 35 Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết xuất các taxoid thô từ lá Thông đỏ lá dài .......................... 48 Sơ đồ 3.2. Quy trình chiết tách và phân lập các hợp chất taxoid (1), (2) và (3) .......... 50 Sơ đồ 3.3. Quy trình chiết tách và phân lập hợp chất taxoid (4) và (5) ....................... 53 1 MỞ ĐẦU Theo các nhà khoa học, các loài Thông đỏ (Taxus sp.) có chứa taxoid là nhóm hợp chất chính yếu gồm cả paclitaxel, 10-deacetyl baccatin III (10-DAB, tiền chất tổng hợp paclitaxel) để sản xuất Taxol® và các dẫn xuất taxoid khác. Hiện nay, taxol được sử dụng là nguyên liệu chính để điều chế thuốc chữa trị ung thư như: Ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi, v.v..[91]. Các nhà khoa học ở Mỹ và một số nước châu Âu đã thành công trong việc chiết xuất taxol và các taxoid từ vỏ cây; công nghệ này làm cây nhanh lão hóa và gây cạn kiệt nguồn cung cấp. Người ta phải đốn 6 - 8 cây Thông đỏ 100 năm tuổi mới có đủ lượng taxol phân lập từ vỏ cây để điều trị cho một bệnh nhân ung thư [97]. Do có giá trị kinh tế cao nên Thông đỏ bị lạm dụng khai thác, đặc biệt là ở vùng Himalaya và Trung Quốc, nguồn dược liệu thiên nhiên này trở nên khan hiếm và bị đe dọa tuyệt chủng [2]. Năm 2011, sách đỏ của IUCN đã công bố Taxus wallichiana là loài có nguy cơ tuyệt chủng [50], [97]. Do đó, để có đủ lượng taxol cho sản xuất thuốc, ngoài việc tổng hợp trực tiếp taxol thì các nhà khoa học đã quan tâm chú ý nhiều hơn đến bán tổng hợp taxol từ các taxoid khác được phân lập từ Thông đỏ. Ngoài nguồn nguyên liệu từ vỏ, người ta còn thu được lượng 10-DAB ở cành và lá Thông đỏ nhiều hơn so với ở vỏ cây [97]. Ở Việt Nam, Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) là loài chỉ mới gặp ở Lâm Đồng với số cây còn lại ước tính chỉ trên 250 cây [7]. Năm 2007, trong sách đỏ Việt Nam, Thông đỏ được xếp vào cấp VU – loài sẽ nguy cấp; còn trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP của Chính phủ thì Thông đỏ được xếp vào nhóm IA – nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại [2]. Do đó, để khai thác nguồn nguyên liệu quý mà không ảnh hưởng đến vùng phân bố tự nhiên của loài Thông đỏ này, Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt trồng Thông đỏ bước đầu cung cấp nguyên liệu phục vụ cho chiết tách taxol và các hợp chất taxoid trong sản xuất thuốc điều trị ung thư [5]. Bên cạnh đó, các nhà khoa học Việt Nam đã tiến hành một vài nghiên cứu về chiết xuất, phân lập và xác 2 định cấu trúc các hoạt chất sinh học từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng [6], [8]. Tuy nhiên, Thông đỏ lá dài vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ về thành phần các hợp chất taxoid để có cơ sở xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguồn nguyên liệu taxol của Việt Nam. Vì thế, đề tài: “Phân lập một số hợp chất taxoid từ lá Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng ở Lâm Đồng, định hướng thiết lập chất đối chiếu” được thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất taxoid từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng. 2. Thiết lập một số chất đối chiếu được phân lập từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng phục vụ công tác kiểm nghiệm. 3. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời taxol và một số taxoid phân lập được từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI Tên gọi Tên khoa học: Taxus wallichiana Zucc [1], [2], [3]. Tên nước ngoài: Himalayan yew (Anh), Xu mi hong dou shan (Trung Quốc). Tên Việt Nam: Thông đỏ lá dài, Thông đỏ nam, Thông đỏ Hymalaya, sam hạt đỏ lá dài, vân nam hồng đậu sam [1], [2], [3]. Trong hệ thống phân loại thực vật quốc tế, thông đỏ lá dài thuộc [1], [2], [3]: Ngành: Thông (Pinophyta) Lớp: Thông (Pinopsida) Bộ: Thủy tùng (Taxales) Họ: Thủy tùng hay Thông đỏ (Taxaceae) Chi: Taxus Loài: Taxus wallichiana Zucc. Mô tả thực vật Cây gỗ to cao đến 20 m, đường kính thân 40 – 50 cm. Thân có vỏ màu hồng xám, phân nhiều cành mảnh, khi non màu lục. Lá mọc so le, hầu như không cuống, thường xếp thành 2 dãy như một lá kép, hình dải rất hẹp, dáng cong, dài 2,5 – 4 cm, rộng 2 – 3 mm, gốc thuôn, đầu nhọn, mặt trên lõm như lòng thuyền, mặt dưới có hai dãy lỗ khí. Cụm hoa đơn tính, khác gốc. Nón đực hình chùy mọc đơn độc ở nách lá, kèm theo ở gốc là những lá bắc lợp. Nón cái gồm những nhánh ngắn, có vảy dạng gai lợp, xếp thành 4 dãy đứng; mọc đơn độc trên đỉnh cành ngắn tại một bên trục hoa. Hạt hình trứng dài, nằm trong một vỏ hạt giả hình đấu khi chín mọng màu đỏ tươi, có cạnh, dài khoảng 6 – 7 mm [1], [2], [3]. 4 Phân bố, sinh thái Ở Việt Nam chi Taxus có 2 loài là Taxus chinensis thường gọi là “Thông đỏ lá ngắn” và Taxus wallichiana Zucc. gọi là “Thông đỏ lá dài” [1], [2]. Hình 1.1. Thông đỏ lá dài mọc tự nhiên Hình 1.2. Thông đỏ lá dài được trồng ở Lâm Đồng ở Lâm Đồng Nguồn: Hình 1.1 và 1.2 theo tác giả Trần Công Luận [6] Thông đỏ lá dài: Phân bố ở Nepan (vùng núi Hymalaya), phía bắc Myanmar, Đông Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Philippin và Việt Nam. Ở Việt Nam, loài này cũng chỉ thấy ở một số vùng núi cao thuộc tỉnh Khánh Hòa, Lâm Đồng (Đà Lạt, Đơn Dương), Hà Giang (Thái An – Quản Bạ), độ cao phân bố từ 1400 – 1600 m hoặc hơn [1], [2]. Thông đỏ thường ra lá non vào mùa xuân – hè, nón đực xuất hiện sớm hơn nón cái từ cuối mùa đông, nhưng đến giữa mùa xuân năm sau cả nón đực và nón cái mới nở. Thông đỏ sinh trưởng chậm, tái sinh tự nhiên từ hạt khó. Tuy vậy, nếu trên đỉnh núi có vài cây to, vẫn có thể thấy những cây con mọc từ hạt. Vài năm gần đây, một số cơ sở nghiên cứu ở Hà Nội và Đà Lạt đã thí nghiệm thành công việc nhân giống Thông đỏ bằng cành [6]. Các loài Thông đỏ trên thế giới Trên thế giới, theo Spjut chi Taxus có 24 loài (species) và 55 thứ (varieties) được phân loại thành ba nhóm, hai nhóm trong số đó có nguồn gốc từ Bắc Mỹ: (1) Nhóm Baccata, đại diện là Thông đỏ Canada (Taxus canadensis) và nhiều giống được trồng có liên quan: T. baccata, T. biternata, T. caespitosa, T. cuspidata, T. 5 recurvata và T. umbraculifera và (2) Nhóm Wallichiana, đại diện là Thông đỏ Florida bản địa (Taxus continosa var . floridana), Thông đỏ Mesoamerican (T. continosa var. continosa) và Thông đỏ Thái Bình Dương (T. brevifolia), bao gồm hai thứ (var. polychaeta, var. reptaneta) [94]. Nhóm Wallichiana được coi là tổ tiên của các nhóm khác bởi cấu tạo lá có các tế bào biểu bì góc nhìn thấy ở mặt cắt ngang lá (phần T), và có các nhú (papillose) đồng nhất trên bề mặt được bao quanh bởi một biên hẹp của các tế bào trơn nhẵn, thường là 4 tế bào. Trong vi phẫu mặt cắt ngang lá (phần T) ở Hình 1.3.a và Hình 1.3.b là một phần biểu bì mặt dưới của lá từ mép trái đến gân giữa của Taxus caespitosa var. latifolia, phóng to tương ứng ×100 và ×250, phía trên cho thấy các tế bào biểu bì hình elip. Quan sát được một vùng biên của tám (8) hình thang nhẵn với các ô có chiều rộng gần như hình chữ nhật, không có (0) vùng chuyển tiếp của các tế bào nhú (papillose); tiếp theo là một dải 14 hàng lỗ khí, gân giữa có 15-18 tế bào theo chiều rộng, không có nhú và một phần của dải lỗ khí thứ hai (1 hàng lỗ khí). Các tế bào màu cam là các tế bào phụ bao quanh lỗ mở (“nhẫn Florin”). Lỗ khí cũng được bao quanh bởi các tế bào bảo vệ chìm không thể nhìn thấy. Các tế bào xung quanh nhú được gọi là các tế bào phụ. Chi Taxus được xác định bởi các dải nhú - lỗ khí chỉ có ở mặt dưới lá. Nhóm Wallichiana bao gồm 2 phân nhóm là Chinensis và Wallichiana; được tìm thấy ở cả châu Á và Bắc Mỹ, phân nhóm Wallichiana được nhận biết nhờ các tế bào biểu bì lá có hình tứ giác và hình chữ nhật cao thấy trong mặt cắt ngang (phần T), có xu hướng vuông góc với bề mặt của lỗ khí; và các nhánh cây màu đỏ tía. Ở phân nhóm Chinensis, xuất hiện chủ yếu ở khu vực từ miền trung Trung Quốc đến Indonesia, các tế bào biểu bì hình elip hoặc hình chữ nhật rộng, xu hướng song song với bề mặt của lỗ khí (các lỗ khí vuông góc với bề mặt nhưng thường được định hướng kéo dài ra theo chiều dọc về phía mép lá và thường thẳng hàng theo hàng ngang cũng như các hàng dọc) và các nhánh cây màu xanh lá đến màu vàng cam. 6 (a) (b) Hình 1.3. Vi phẫu lá của Taxus caespitosa var. latifolia Nguồn: Hình 1.3.a. được vẽ bởi Karen Parker; Hình 1.3.b. do Spjut vẽ [94]. Nhóm Baccata có thể có nguồn gốc từ nhóm Wallichiana do mất dần lỗ khí và các nhú, khác biệt bởi các tế bào biểu bì hình elip nhỏ hơn (trong phần T), và các nhú kém phát triển trên gân chính ở giữa lá. Nhóm thứ ba (3) là nhóm Sumatrana, dường như tiến hóa hơn nhờ các tế bào biểu bì biệt hóa vùng mép lá, thường xuất hiện màu đỏ bóng trong các mẫu vật khô. Vùng mép lá có chiều rộng thay đổi từ 8 – 36 dãy tế bào, trong đó gần một nửa số tế bào gần dải lỗ khí nhất có thể phát triển thành nhú, nhưng thường không quá 12 dãy tế bào. Bằng chứng sinh học cổ xưa khác của Taxaceae ở Bắc Mỹ là hạt. Manchester (1994) [67] đã mô tả T. masonii, Torreya clarnensis và một chi mới của Taxaceae, Diploporus, từ hạt ở thế Thủy Tân (Eocene) ở Oregon. Sự khác biệt của T. masonii với các loài còn tồn tại có liên quan dựa trên sự đối xứng hai bên của hạt, bề mặt cắt ngang hình thấu kính, mặc dù hạt của T. chinensis và T. recurvata (Thông đỏ Anh quốc) cho thấy xu hướng đối xứng hai bên cùng với sự phát triển của bề mặt dạng lăng trụ (xem Hình 1.4). Thông đỏ châu Âu (T. baccata) và Thông đỏ Canada (T. canadensis) thường có hạt hình khối trụ với bề mặt nhẵn bóng, đuôi nhọn ở đỉnh, trong khi các hạt trong các loài Thông đỏ khác ở châu Âu - Địa Trung Hải có hình 7 nón, hoặc xẻ thùy và không có đỉnh nhọn - có hình dạng giống như quả ớt chuông (ví dụ, T. baccata từ Iran). Khu vực từ Tây Tứ Xuyên (Trung Quốc) với đại diện T. chinensis, đến Đông Nam nước Nga với đại diện bởi T. umbraculifera var. microcarpa, các hạt trở nên nhỏ hơn và hình nón càng ngày càng hẹp về phía đỉnh. Khác với hạt có hình trứng có 3-4 cạnh của T. kingstonii Spjut ở Đông Himalaya (Hình 1.4), hoặc hạt có 3-4 thùy của T. biternata ở vùng ôn đới ở phía Đông Á hoặc các hạt hình cầu khác nhau ở Nhóm T. sumatrana (xem Hình 1.4 với T. celebica, T. mairei var. speciosa (Florin) Spjut ở Đông Nam Trung Quốc). Hạt hình nón tương đối nhỏ hơn là một đặc điểm phân loại để nhận biết T. umbraculifera var. microcarpa và T. caespitosa. minor subpyramidalis mairei contorta baccata glauca linearis kingstonii celebica mairei mairei chinensis umbraculifera microcarpa caespitosa Hình 1.4. Các dạng hạt của Taxus sp. Chú thích ảnh: Hàng trên cùng từ trái sang phải: (1) T. canadensis var. minor từ Maine (Ovis, Island, Mỹ, True 164); (2) T. contorta từ Tây Bắc Himalaya, Chumba (Pengelly); (3) T. baccata var. baccata từ Ma rốc (Haut 938); (4) var. glauca, từ Armenia