Tài liệu Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây diếp cá (houttuynia cordata t.) ở tỉnh cà mau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.) Ở TỈNH CÀ MAU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN VÕ CHÍ MẢI MSSV: 3113728 Lớp: Vi Sinh Vật Học K37 Cần Thơ, Tháng 7/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.) Ở TỈNH CÀ MAU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN VÕ CHÍ MẢI MSSV: 3113728 Lớp: Vi Sinh Vật Học K37 Cần Thơ, Tháng 7/2014 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (Ký tên) (Ký tên) PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp Võ Chí Mải PHÊ DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký tên) Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Bốn năm học tập và nghiên cứu ở trường Đại học Cần Thơ, đây không phải là thời gian quá dài trong cuộc đời nhưng nó là khoảng thời gian tôi không bao giờ quên trong tâm trí của tôi. Đến nay tôi đã hoàn thành Luận văn tốt nghiệp Đại học, chuyên ngành Vi Sinh Vật Học. Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi luôn được sự hỗ trợ và động viên từ gia đình, quý Thầy Cô và bạn bè giúp tôi vượt qua những khó khăn, hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Cha mẹ và gia đình của tôi, họ luôn là nguồn động viên, an ủi khi tôi gặp khó khăn. Phó Giáo sư - Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, Thầy hướng dẫn đề tài, đã tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm học tập và nghiên cứu khoa học. Quý thầy cô của Viện NC & PT Công nghệ sinh học, đã truyền đạt những kiến thức bổ ích cho việc hoàn thành luận văn và tìm kiếm việc làm sau này. Cán bộ quản lí phòng thí nghiệm vi sinh vật, các anh chị cao học K19, các em sinh viên K38, tập thể lớp Vi sinh vật K37 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi để hoàn thành luận văn thật tốt đẹp. Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe đến cha mẹ, người thân, quý Thầy Cô và tất cả bạn bè của tôi. Xin chân thành cảm ơn! Cần thơ, ngày 17, tháng 11, năm 2014 Võ Chí Mải Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT TÓM TẮT Diếp cá là cây trồng phổ biến ở Việt Nam, chúng dùng như một loại rau hàng ngày trong cuộc sống, một số nghiên cứu cho thấy cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn và được ứng dụng để điều trị một số bệnh thông thường. Tuy nhiên việc nghiên cứu tập đoàn vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá chưa được nghiên cứu nhiều, vì vậy đề tài phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá đã thực hiện. Từ mẫu cây Diếp cá được trồng tại Cà Mau, đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn trên môi trường PDA đặc. Đa số các dòng vi khuẩn này có dạng hình que, gram âm và có khả năng chuyển động, ngoài ra chúng còn có các đặc tính cố định đạm, tổng hợp IAA và hòa tan lân. Kết quả khảo sát khả năng cố định ammonium và tổng hợp IAA của vi khuẩn cho thấy các dòng vi khuẩn này có thể tổng hợp được một lượng ammonium cao nhất ở ngày 2 sau khi chủng và giảm ở ngày 4 và 6 .Trong đó, dòng L1-DD1 có khả năng tổng hợp lượng ammonium cao nhất (2,62 µg/mL). Nồng độ IAA được sinh ra nhiều nhất ở ngày thứ 4 và giảm ở ngày thứ 6 là 4,49 µg/mL (do dòng L2-DD2 tổng hợp). Tám dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan, dòng R3-CM có khả năng hòa tan lân lớn nhất lên đến 182,31% ở ngày thứ 6. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn trên 2 chủng vi khuẩn Escherichia coli và Aeromonas hydrophila cho thấy có 5 dòng có hoạt tính kháng Escherichia coli, 4 dòng có tính kháng Aeromonas hydrophila và 2 dòng có khả năng kháng được Escherichia coli và Aeromonas hydrophila là dòngL1-DD1 và R1DD2. Ba dòng vi khuẩn được nhận diện ở cấp độ loài bằng phương pháp giải trình tự 16S-rRNA. Dòng L1-DD1 được nhận diện là Bacillus megaterium strain ATCC 14581 (ở mức độ là 98%). Dòng R1-DD2 được nhận diện là Bacillus amyloliquefaciens subsp. Plantarum strain FZB42 có độ tương đồng là 93% với và dòng T6-DD1 được nhận diện là Bacillus aerius strain 24K có độ tương đồng 94%. Từ khóa: Bacillus megaterium, Bacillus amyloliquefaciens subsp. Plantarum, Bacillus aerius, cây Diếp cá, kháng khuẩn, tổng hợp amonium - IAA, vi khuẩn nội sinh. Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT ..........................................................................................ii LỜI CẢM TẠ ..................................................................................................iii TÓM TẮT........................................................................................................ iv MỤC LỤC ........................................................................................................ v DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................... ix DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................ x CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................xii CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU.............................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu đề tài .................................................................................... 2 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................ 3 2.1 Tổng quan về Cà Mau ........................................................................... 3 2.1.1 Vị trí địa lý..................................................................................... 3 2.1.2 Điều kiện tự nhiên: ......................................................................... 4 2.2 Tổng quan về cây Diếp cá. .................................................................... 5 2.2.1 Tên gọi và phân loại........................................................................ 5 2.2.2 Mô tả: .............................................................................................. 6 2.2.3 Phân bố:.......................................................................................... 6 2.2.4 Thành phần hóa học:....................................................................... 6 2.2.5 Tác dụng dược lý: .......................................................................... 7 2.2.6 Tính vị, công năng: ......................................................................... 7 2.2.7 Công dụng: ..................................................................................... 7 2.3 Tổng quan về vi khuẩn nội sinh:........................................................... 7 2.3.1 2.4 Một số nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp: .................................. 9 Một số vi khuẩn gây bệnh ................................................................. 15 2.4.1 Vi khuẩn Escherichia coli............................................................ 15 2.4.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila................................................. 17 2.5 Tình hình nghiên cứu cây Diếp cá trong và ngoài nước...................... 18 Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT 2.5.1 Trong nước .................................................................................. 18 2.5.2 Ngoài nước .................................................................................. 18 2.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ...................................... 20 2.6.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR ............................................. 20 2.6.2 Mồi (primer) sử dụng trong kỹ thuật PCR.................................... 21 2.6.3 Điện di gel agarose ...................................................................... 22 2.6.4 Phần mềm phân tích trình tự DNA được giải mã.......................... 24 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... 25 3.1. Phương tiện nghiên cứu...................................................................... 25 3.1.1. Thời gian – Địa điểm thực hiện .................................................... 25 3.1.2. Vật liệu ........................................................................................ 25 3.1.3. Dụng cụ - Thiết bị ........................................................................ 25 3.1.4. Hóa chất ....................................................................................... 26 3.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................... 30 3.2.1 Thu thập và xử lý mẫu.................................................................. 30 3.2.2 Phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá......... 30 3.2.3 Quan sát hình dạng, khả năng chuyển động và kích thước vi khuẩn…................................................................................................ ….31 3.2.4 Nhuộm Gram vi khuẩn ................................................................. 33 3.2.5 Xác định khả năng tổng hợp NH4+ của một số dòng vi khuẩn đã phân lập được ............................................................................................ 34 2.3. Phương pháp xử lý số liệu:............................................................. 41 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................... 42 4.1 Kết quả phân lập và đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn......... 42 4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn............................................................ 42 4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập.................... 43 4.1.3 Hình dạng và khả năng di chuyển của 21 dòng vi khuẩn:............. 46 4.2 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập dựa trên lượng NH4+ (ammonium) tổng hợp được. .................................................... 49 Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 4.2.1 Trường ĐHCT So sánh khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ. ................................................................................................. 50 4.2.2 So sánh khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được từ thân............................................................................................... 51 4.2.3 So sánh khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được từ lá. ................................................................................................. 52 4.2.4 So sánh khả năng cố định đạm của 6 dòng vi khuẩn triển vọng sống nội sinh trong cây Diếp cá. ........................................................................ 53 4.3 Khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Diếp cá ................................................................... 55 4.3.1 So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ .................................................................................................. 55 4.3.2 So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ thân............................................................................................... 56 4.3.3 So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ lá .................................................................................................. 58 4.3.4 So sánh khả năng tổng hợp IAA của 8 dòng vi khuẩn triển vọng nội sinh trong cây Diếp cá ............................................................................... 59 4.4 Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn phân lập được. . 62 4.5 Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn được phân lập: ........... 64 4.5.1 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn Escherichia coli .................. 64 4.5.2 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn Aeromonas hydrophila ....... 66 4.6 Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR ............. 69 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 72 5.1 Kết luận.............................................................................................. 72 5.2 Đề nghị ............................................................................................ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 73 Tiếng việt:..................................................................................................... 73 Tiếng Anh..................................................................................................... 75 Trang web:.................................................................................................... 84 Chuyên ngành Vi sinh vật học vii Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT PHỤ LỤC………………………………………………………………………... PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA 21 DÒNG VI KHUẨN. PHỤ LỤC 2: ĐƯỜNG CHUẨN NH4+ CỦA 3 NGÀY ĐO. PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA 21 DÒNG VI KHUẨN. PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN Ở RỄ. PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN Ở THÂN. PHỤ LỤC 6: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN Ở LÁ. PHỤ LỤC 7: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN TRIỂN VỌNG. PHỤ LỤC 8: KẾT QUẢ HÀM LƯỢNG IAA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN PHỤ LỤC 9: ĐƯỜNG CHUẨN IAA CỦA 3 NGÀY ĐO. PHỤ LỤC 10: KẾT QUẢ THỐNG KÊ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP IAA CỦA 21 DÒNG VI KHUẨN. PHỤ LỤC 11: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG IAA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN Ở RỄ. PHỤ LỤC 12: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG IAA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN Ở THÂN PHỤ LỤC 13: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG IAA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN Ở LÁ PHỤ LỤC 14: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG IAA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN TRIỂN VỌNG. PHỤ LỤC 15: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HIỆU SUẤT HÒA TAN LÂN CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN. PHỤ LỤC 17 : KẾT QUẢ THỐNG KÊ KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN A. HYDROPHILA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ. PHỤ LỤC 18: KẾT QUẢ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN ĐỊNH DANH. Chuyên ngành Vi sinh vật học viii Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Thành phần các chất trong phản ứng PCR................................................. 30 Bảng 2: Môi trường PDA....................................................................................... 30 Bảng 3: Môi trường NFb (g/l) (Kirchhof et al., 1997) ............................................ 30 Bảng 4: Thành phần dung dịch vi lượng............................................................... ..31 Bảng 5: Thành phần dung dịch Vitamin ............................................................... ..31 Bảng 6: Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999) ................................................. .31 Bảng 7: Môi trường LB (Lauria Betani) .......................................................... …...31 Bảng 8: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA..….…….…44 Bảng 9: Đặc tính khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA.…...……..45 Bảng 10: Hình dạng, kích thước, khả năng chuyển động cùa các dòng vi khuẩn.....48 Bảng 11: Kết quả nhuộm Gram của 21 dòng vi khuẩn………………………......…49 Bảng 12: Kết quả giải trình tự của một số dòng triển vọng...……….…………......70 Chuyên ngành Vi sinh vật học ix Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Bản đồ hành chính tỉnh Cà Mau... ............................................................... 3 Hình 2: Cây Diếp cá (Houttuynia cordata T) ........................................................... 5 Hình 3: Mối liên hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ phản ứng PCR ............ 23 Hình4: Phản ứng màu của đường chuẩn NH4+ ……… . ………….………………..36 Hình 5: Phản ứng màu của đường chuẩn IAA…………..………………………….38 Hình 6: Sự phát triển của vi khuẩn tạo vòng pellicle trong môi trường NFb bán đặc .…………….....……………………………………………………………….....…43 Hình 7: Hình ảnh một số khuẩn lạc phát triển trên môi trường PDA..…………...….47 Hình 8: hình ảnh nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn phân lập…...………………50 Hình 9: Hàm lượng trung bình NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ ………..51 Hình 10: Hàm lượng trung bình NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân.…….53 Hình 11: Hàm lượng trung bình NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá..……..54 Hình12: Hàm lượng trung bình NH4+ của các dòng vi khuẩn triển vọng..…….……55 Hình 13: Hàm lượng trung bình IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ..….…...57 Hình 14: Hàm lượng trung bình IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân...…...59 Hình 15: Hàm lượng trung bình IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá…...…...60 Hình 16: Hàm lượng trung bình IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng…...……….61 Hình 17: Vòng sáng halo của các dòng vi khuẩn phát triển trên môi trường NBRIP đặc……………………………………………………………….…………………….63 Hình18: Hiệu suất hòa tan lân (E) của các dòng vi khuẩn nội sinh qua các ngày…..64 Hình 19: Khả năng kháng khuẩn của dòng T6-DD1 và R1-DD2 với vi khuẩn E. Coli………………………………………………………………………………………………66 Hình 20: Khả năng của các dòng vi khuẩn phân lập được với E. Coli...…….….…..66 Hình 21: Khả năng kháng khuẩn của dòng R1-DD2 và L1-DD2 trên Aeromonas hydrophila ……………………………………………………….…….………….…..67 Hình 22: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Aeromonas hydrophila…………………………………………………….…….……68 Chuyên ngành Vi sinh vật học x Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Hình 23: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rRNA …………………70 Chuyên ngành Vi sinh vật học xi Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT BLAST Basic Local Alignment Search Tool DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribo Nucleic Acid dNTP deoxyribonucleotide triphosphates ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long ĐK Đường kính EAC Ehrlich Ascites Carcinoma EAEC Enteroaggregative E. coli EHEC Enterohemorrhagic E. coli EIEC Enteroinvasive E. coli EPEC Enteropacthogenic E. coli ETEC Enterotoxigenic E. coli IAA Indole – 3 – Acetic Acid LB Luria - Bertani MEWC Methanolic Wedelia chinensis NBRIP National Botanical Research Institute's phosphate Nfb nitrogen-free semisolid malate OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato dextrose agar rRNA ribosomal ribonucleic acid VKNS Vi khuẩn nội sinh Chuyên ngành Vi sinh vật học xii Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Trong thiên nhiên có rất nhiều cây có chất kháng sinh và nguồn dược liệu của Việt Nam thì vô cùng phong phú, theo số liệu thống kê gần đây ở nước ta có hơn 3.800 loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật. Hàng năm cả nước sử dụng hơn 50.000 tấn cây dược liệu (htt://duoclieu.net/caythuocvn.html. ngày 19/06/2014), trong đó có nhiều cây thuốc có tính kháng khuẩn đã được y học dân gian sử dụng từ lâu. Chúng thường là những cây cỏ quen thuộc, mọc hoang dại hay trồng ngay trong vườn nhà. So sánh với kháng sinh tổng hợp, có thể thấy các cây thuốc dược liệu có chất kháng sinh nhưng hiệu lực kháng khuẩn không mạnh bằng kháng sinh tổng hợp. Tuy vậy chất kháng sinh từ cây dược liệu có những ưu điểm mà chất kháng sinh tổng hợp không có. Một trong những vấn đề đó là hiện tượng quen thuốc, kháng thuốc và loạn khuẩn do tình trạng sử dụng chất kháng sinh bị lạm dụng, tuy nhiên chất kháng sinh có nguồn gốc từ thực vật thì các nhà khoa học chưa thấy điều này. Kháng sinh từ thực vật rất bền vững và dễ hòa tan trong nước, nên có thể dung dưới dạng thuốc sắc là dạng bào chế đơn giản và thông dụng nhất. Chính vì vậy, gần đây người ta chú ý nhiều đến kháng sinh thực vật và có xu hướng trở lại với cây thuốc hoặc sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên. Nhiều nghiên cứu sản xuất cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất (Wedelia chinensis M.), cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.), cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria L.)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyde và các dẫn xuất ceton như methyl n-nonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất α pinen, camphen,… Có tác dụng diệt các vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2004; Shu-Chen et al., 2008). Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật nội sinh ở cây dược liệu chưa được quan tâm nhiều. Do đó việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật hữu ích này để phát triển cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn sẽ mang nhiều ý nghĩa quan trọng trong giai đoạn hiện nay. Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập và khảo sát được một số đặc tính tốt như tính kháng khuẩn, khả năng tổng hợp đạm, IAA và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn sống nội sinh trong cây Diếp cá ở tỉnh Cà Mau. Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về Cà Mau 2.1.1 Vị trí địa lý Cà Mau là tỉnh ven biển nằm ở cực nam tổ quốc Việt Nam và nằm trong các tỉnh thuộc khu vực vùng Đồng bằng sông Cửu Long, nằm ở tọa độ từ 8o30’ – 9o10’ vĩ Bắc và 104o80’- 105o5’ kinh Đông , Cà Mau với ba mặt giáp biển, phía Đông giáp với biển Đông, phía Tây và phía Nam giáp với vịnh Thái Lan, phía Bắc giáp với hai tỉnh Bạc Liêu và Kiên Giang, vùng biển của Cà mau rộng lớn với chiều dài 254 km, tiếp giáp với 3 nước như Thái Lan, Malaysia, Indonesia và là trung tâm vùng biển của thế giới ở Đông Nam Á. Diện tích tự nhiên của tỉnh Cà Mau là 5.329 km2 chiếm 15,3% diện tích cả nước, dân số trên 17 triệu người, đây là vùng giàu tiềm năng phát triển. Theo: http://www.mdec.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=1160&Itemid=92 (truy cập 29/05/2014). http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%A0_Mau (truy cập 29/05/2104). Hình 1: Bảng đồ tỉnh Cà Mau (Nguồn:http://www.geology.hcmus.edu.vn/vietnamese/thuvien/map, ngày 17/06/2014). Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 2.1.2 Trường ĐHCT Điều kiện tự nhiên: Cà Mau là vùng đất thấp thường xuyên bị ngập nước, khí hậu của Cà Mau đặc trưng của khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo với nền nhiệt độ cao vào loại trung bình trong các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, nhiệt độ trung bình hàng năm là 26,5oC. Cà Mau có hai mùa rõ rệt là mùa mưa và mùa khô, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 đến tháng 4 năm sau, lượng mưa trung bình là 165 ngày mưa/năm với 2.360 mml, độ ẩm trung bình hàng năm là 85,6%. Chế độ thủy triều ở khu vực tỉnh Cà Mau chịu tác động trực tiếp của chế độ bán nhật triều không đều ở biển Đông và chế độ bán nhật triều không đều ở biển Tây, biên độ triều ở biển Đông tương đối lớn khoảng 300-350 cm vào các ngày triều cường. Chế độ thủy văn của hệ thống kênh rạch chịu ảnh hưởng của chế độ thủy triều quanh năm, Cà Mau có hệ thống kênh rạch dày đặc, tổng chiều dài của hệ thống kênh rạch lên tới 7000km chiếm 4% diện tích tự nhiên của tỉnh. Tài nguyên đất đai, Cà Mau có các nhóm đất chính sau: Nhóm đất mặn có diện tích 208,496 ha chiếm 40% diện tích đất tự nhiên, đất mặn phân bố chủ yếu các huyện Đầm Dơi, U Minh, Trần Văn Thời, Tp Cà Mau, Cái Nước, Ngọc Hiển,Thới Bình. Do đây là vùng đất mặn cùng với hiện tượng biển lấn nên các vùng bị nhiễm mặn chủ yếu là nuôi trồng thủy sản, một số vùng như U Minh, Trần Văn Thời có thể kết hợp một vụ lúa một vụ tôm khi mùa mưa tới. Đất phèn có diện tích 271,926 ha chiếm 52,18% đất tự nhiên, phân bố chủ yếu các huyện Thới Bình, U Minh, Trần Văn Thời. Nhóm đất phèn nhiễm mặn phân bố chủ yếu ở những vùng ven biển. Ngoài các loại đất trên còn có nhóm đất than bùn, với diện tích khoảng 8.000 ha phân bố U Minh, Trần Văn Thời và nhóm đất bãi bồi với diện tích 15.488 ha phân bố các huyện Ngọc Hiển và Cái Nước. Theo;http://www.chinhphu.vn/portal/page/portal/chinhphu/cactinhvathanhpho/tinhcamau/thongtintinhth anh?view=introduction&provinceId=1341 (truy cập 01/06/2014). Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 2.2 Trường ĐHCT Tổng quan về cây Diếp cá. 2.2.1 Tên gọi và phân loại - Cây Diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, Lá giấp, Ngư tinh thảo. - Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb. Saururaceae. - Tên tiếng Anh là heartleaf (lá hình tim) hay lizardtail (đuôi thằn lằn) (Võ Văn Chi, 2004). - Giới Thực vật (Plantae) - Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) - Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) - Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae) - Bộ Hồ tiêu (Piperales) - Họ Lá giấp (Saururaceae) - Chi Diếp Cá (Houttuynia Thunb.) - Diếp Cá (Houttuynia cordata Thunb.) (Nguồn: Phạm Thành Hộ, 1999).  Hình 2: Diếp cá (Houttuynia cordata T) (Hình chụp, ngày 07/06/2014) Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT 2.2.2 Mô tả: Cây thảo, sống lâu năm, cao 20-40 cm. Thân ngầm mọc bò ngang trong đất, màu trắng, hơi có lông, bén rễ ở các mấu. Thân đứng nhẵn, màu lục hoặc tím đỏ. Lá mọc so le, hình tim, đầu nhọn, mặt trên màu lục sẵm, mặt dưới màu tím hơi có lông dọc theo gân lá của cả hai mặt, cuống lá dài có bẹ. Cụm hoa mọc ở ngọn thân thành bông dài 2-2,5cm, mang nhiều hoa màu vàng nhạt. Toàn thân vò ra có mùi tanh như mùi cá. (Võ Văn Chi, 2004). 2.2.3 Phân bố: Chi Houttuynia Thunb, chỉ có một vài loài diếp cá, phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, từ Nhật Bản, Trung Quốc đến Việt Nam, Lào, Ấn Độ và các nước Đông Nam Á khác. Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở các tỉnh miền núi, trung du và đồng bằng. Độ cao đến 1500 mét (Sa Pa). Cây còn trồng được nhiều nơi để làm rau và làm thuốc. Diếp cá thuộc loại ưa ẩm và hơi chịu bóng, thường mọc ở đất ẩm, cây sinh trưởng gần như quanh năm, mạnh nhất là mùa xuân hè, có hoa quả hàng năm trên những cây không bị ngắt ngọn và hái lá thường xuyên, có khả năng tái sinh mạnh từ thân rễ. Ở vùng thị trấn Tam Đảo và núi Ngọc Linh, diếp cá mọc nhiều đến mức ảnh hưởng tới cây trồng. 2.2.4 Thành phần hóa học: Toàn thân cây Diếp cá có chứa tinh dầu. Thành phần chủ yếu là: Nhóm aldehyl và các dẫn xuất ceton như methyl-n-nonyl ceton, 1-decanal, 1-dodecanal là những chất không có tác dụng kháng khuẩn, chất có tác dụng kháng khuẩn là 3-oxododecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất: α-pinen, camphen, myrcen limonene, linalool, bornyl, acetate, geraniol và caryophylen. Ngoài ra tinh dầu còn chứa acid caprinic, laurinaldehyd, benzamid, acid hexadecanoic, acid decanoic, acid palmitic, acid linoleic, acid oleic, acid stearic, aldehyd capric, acid clorogenic, lipid và vitamin K. Từ lá diếp cá người ta đã phân lập được β – sitosterol, một alkaloid gọi là cordalin và các flavonoid như afzelin, hyperin, rutin, isoquercitrin và quercitrin. (Đỗ Tất Lợi, 2004). Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 2.2.5 Trường ĐHCT Tác dụng dược lý: Theo Zhang Y et al., (2008) Diếp cá có khả năng diệt được Gonococcus (gây bệnh lậu mủ) và ngăn cản sự phát triển của các siêu vi khuẩn cúm. Còn theo Kim et al., (2010) cây Diếp cá còn có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn E. Coli O157-H7. Hoạt chất quercitrin có trong diếp cá có tác dụng lợi tiểu mạnh. Một số hoạt chất có tác dụng điều trị loét dạ dày được phân lập từ cây diếp cá. Một chất sterol, tương tự sitosterol phân lập từ thân rễ, kích thích tiết các chất kháng sinh từ một chủng Bacillus tạo bào tử Gram dương. 2.2.6 Tính vị, công năng: Diếp cá có vị chua cay, mùi tanh của cá, tính mát hơi có độc, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, sát trùng. 2.2.7 Công dụng: Diếp cá dung trị táo bón, trĩ, mụn nhọt, lở ngứa, trẻ con lên sởi, viêm phổi hoặc phổi có mủ, đau mắt đỏ hoặc đau mắt đỏ do trực khuẩn mủ xanh, viêm ruột, kiết lỵ, bí tiểu tiện, kinh nguyệt không đều. Còn dùng chữa sốt rét, sài giật trẻ em, đau răng, trâu bò bị cắn. Ở Trung Quốc, một số hợp chất kháng khuẩn đã được phân lập từ cây diếp cá và bào chế thành thuốc viên và thuốc tiêm để trị bệnh nhiễm khuẩn. Ở Ấn Độ, Trung Quốc, thân rễ diếp cá được ăn như rau, dùng sống hoặc nấu chin. Ở Nhật Bản, thân rễ cây diếp cá có trong thành phần một số chế phẩm thuốc dùng để chữa một số bệnh phụ nữ. Ở Trung Quốc, diếp cá còn dùng chữa bệnh khó tiêu và làm thuốc bó những chỗ bị tổn thương để kích thích sự phát triển của xương. Ở Nepan, thân rễ cây diếp cá có trong thành phần một số chế phẩm thuốc dùng để chữa một số bệnh phụ nữ. Cả cây được coi là như thuốc làm mát, tiêu độc, chữa khó tiêu và điều kinh. Lá được dùng trị bệnh lậu, bệnh về mắt, bệnh về da, trĩ. 2.3 Tổng quan về vi khuẩn nội sinh: Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng (Quispel, 1992). Chúng cư trú ở trong nội mô của thực vật ký chủ, qua đó hình thành mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với thực vật khác nhau như cộng sinh, hội sinh… Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như: Azotobacter, Bacillus, Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Viện NC & PT Công nghệ sinh học