Tài liệu Phân biệt thịt trâu và thịt bò bằng kỹ thuật pcr

i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn với tấm lòng biết ơn sâu sắc đến: * Ban Giám hiệu trường Đại học Lạc Hồng, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học và Môi trường – trường Đại học Lạc Hồng. * PGS. TS Nguyễn Ngọc Tuân, giảng viên Khoa Chăn Nuôi Thú Y trường ĐHNL. TP. HCM. * TS. Hồ Thị Kim Hoa, giảng viên Khoa Chăn Nuôi Thú Y trường ĐHNL. TP. HCM. * Quý cán bộ công chức tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - trường ĐHNL. TP. HCM đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện để hoàn thành đề tài. * Các bạn bè và người thân đã luôn quan tâm động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn, Đoàn Thị Tuyết Lê ii TÓM TẮT Đề tài “Phân biệt thịt trâu và thịt bò bằng kỹ thuật PCR” được tiến hành tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi Trường, trường Đại học Nông Lâm TP. HCM từ ngày 15/10/2010 đến ngày 1/5/2011. Mục tiêu nghiên cứu là: xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt trâu, thịt bò sử dụng primer tự thiết kế; ứng dụng quy trình PCR-trâu và PCR-bò để phát hiện thịt trâu và thịt bò đối với hỗn hợp DNA, hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt, có có xử lý nhiệt và mẫu bột thịt trên thị trường nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc. Kết quả đạt được như sau: Quy trình PCR phát hiện thịt trâu với forward primer và reverse primer có trình tự như sau 5’- CTACACATCCGA CACAACAACAGC-3’, 5’- ATGTAGCAGGGGCAT GAGAA-3’. Mẫu DNA được biến tính ở 94oC trong 4 phút sau đó được khuếch đại qua 35 chu kỳ nhiệt: biến tính 94oC/1’, ủ bắt cặp ở 56oC/ 45’’, kéo dài ở 72oC/1’ và kết thúc ở 72oC/5’. Nồng độ DNA trâu thấp nhất mà PCR-trâu có thể phát hiện là 0,001 ng/μl. Tỷ lệ DNA thịt trâu thấp nhất trong hỗn hợp DNA giảm dần của trâu, bò, dê, cừu mà PCR-trâu có thể phát hiện là 0,1%. Tỷ lệ thịt trâu thấp nhất mà PCR-trâu có thể phát hiện trong hỗn hợp thịt giảm dần của trâu, bò, dê, cừu là 0,1%. Quy trình PCR-trâu có khả năng phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý ở 80oC/15’, 120oC/15’, 130oC/15’, 180oC/15’ nhưng không có khả năng phát hiện thịt trâu với tỷ lệ ≤ 10% trong hỗn hợp thịt xử lý ở 120oC/30’ và 130oC/30’. Quy trình PCR phát hiện thịt bò với forward primer là 5’-CTACACATCCGA CACAACAACAGC-3’, reverse primer là 5’-TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC -3’. Quy trình nhiệt như sau: tiền biến tính 94oC/4’; 35 chu kỳ: biến tính ở 94oC/1’, bắt cặp ở 54oC/ 45’’, kéo dài ở 72oC/1’; kéo dài cuối cùng ở 72oC/5’. Nồng độ DNA bò thấp nhất mà PCR-bò có thể phát hiện là 0,001 ng/μl. Tỷ lệ DNA bò thấp nhất trong hỗn hợp DNA giảm dần của trâu, bò, dê, cừu mà PCR-bò có thể phát hiện là 0,05%. Tỷ lệ thịt bò thấp nhất mà PCR-bò có thể phát hiện trong hỗn hợp thịt giảm dần của trâu, bò, dê, cừu là 0,1%. PCR-bò có khả năng phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý ở 80oC/15’, 180oC/15’ nhưng không có khả năng phát hiện thịt bò với tỷ lệ ≤ 10% trong hỗn hợp thịt xử lý ở 120oC/15’, 120oC/30’, 130oC/15’ và 130oC/30’. iii SUMMARY Research project “Differentiation of meat species of buffalo, cattle by PCR techniques” was carried out at Institute of Biotechnology & Environment, Nong Lam University Ho Chi Minh city from October 15, 2010 to May 1, 2011. The project was aimed: (i) to establish PCR reactions for identification of beef and buffalo meat; (ii) consequently, to apply these reactions in identification of meat species in raw and processed meat mixtures. The results were summarized as follows: PCR protocol for detection of buffalo meat (buffalo-PCR) using specific primers was accomplished. A new set of primers for buffalo meat were designed and tested (Forward primer, 5'-CTACACATCCGACACAACAACAGC-3' and reverse primer, 5'-ATGTAGCAGGGGCATGAGAA-3'). Amplification reaction was started with predenaturation step at 94oC/4', followed by 35 cycles including 94oC/1', 56oC/45'', 72oC/1’ and final extension at 72oC/5'. The lowest concentration of buffalo DNA that could be detected by buffalo-PCR was 0.001 ng/μl. The lowest rate of buffalo DNA in the DNA mixture reduced ratio of DNA from raw meat of buffalo, cattle, goat, sheep that buffalo-PCR could detect was 0.1%, which is the same as the lowest rate of buffalo meat that buffalo-PCR could detect in the meat mixture with reduced ratio of buffalo, beef, goat, sheep. The PCR was successfully applied to detect buffalo meat in mixtures having been processed at 80oC/15’, 120oC/15’, 130oC/15’, 180oC/15’ but was not in the case of meat mixtures that had ≤ 10% buffalo meat and had been heated at 120oC/30’ and 130oC/30’. PCR protocol for detection of beef (cattle-PCR) was set up. The new set of primers for the PCR to detect beef were: forward primer, 5'-CTACACATCCGACAC AACAACAGC-3’, and reverse primer, 5'-TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC-3'. The thermal process was as follows: 94oC/4' for initial denaturation, 35 cycles of denaturation at 94oC/1’, annealing at 54oC/45'', enlongation at 72oC/1’ and final extension at 72oC/5’. The cattle-PCR could detect cattle DNA with the concentration as low as 0.001 ng/μl. The lowest rate of cattle DNA in the mixture reduced ratio of DNA from the raw meat of the buffalo, cattle, goat, sheep that cattle-PCR could detect was 0.05%. The lowest rate of cattle meat that cattle-PCR could detect in the reduced ratio mixture of buffalo, goats, sheep meat was 0.1%. This PCR protocol was successfully to detect beef in meat mixtures which was processed at 80oC/15', 180oC/15' but was not to identify the meat in those had ≤ 10% buffalo meat and had been processed at 120oC/15’, 120oC/30’, 130oC/15’, and 130oC/30’. iv MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................i TÓM TẮT....................................................................................................................... ii SUMMARY................................................................................................................... iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... vii DANH SÁCH CÁC HÌNH.......................................................................................... viii DANH SÁCH SƠ ĐỒ ................................................................................................. viii DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................ix Chương 1 .........................................................................................................................1 MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................1 1.2 Mục tiêu ................................................................................................................2 1.3 Mục đích ................................................................................................................2 Chương 2 .........................................................................................................................3 TỔNG QUAN..................................................................................................................3 2.1. Sơ lược về thịt và thịt chế biến .............................................................................3 2.1.1 Giới thiệu sơ lược về thịt ................................................................................3 2.1.2 Giới thiệu sơ lược về thịt chế biến ..................................................................4 2.1.3 Tình hình gian lận trên thị trường thịt của thế giới và Việt Nam ...................4 2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế giới........................................................................................................................4 2.1.3.2 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến ở Việt Nam ......................................................................................................................5 2.2. Các phương pháp phát hiện thịt ............................................................................6 2.2.1 Phương pháp dựa vào protein .........................................................................6 2.2.1.1 Phương pháp điện di.................................................................................6 2.2.1.2 Phương pháp miễn dịch............................................................................8 2.2.1.3. Phương pháp sắc ký.................................................................................8 2.2.2. Phương pháp dựa vào DNA ...........................................................................9 2.2.2.1 Phương pháp lai DNA ..............................................................................9 2.2.2.2 Phương pháp dựa vào PCR ....................................................................11 2.3 DNA ty thể và gen cytochrome b trong việc phát hiện loài ................................21 2.3.1 DNA ty thể ....................................................................................................21 2.3.2 Di truyền của ty thể.......................................................................................25 2.3.3 Sử dụng gen cytochrome b để phát hiện nguồn gốc loài trong các sản phẩm thịt chế biến ..................................................................................................25 2.4 Tổng quan các công trình nghiên cứu về phát hiện loài của thịt bằng phương pháp PCR......................................................................................................26 Chương 3 .......................................................................................................................29 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................................29 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành ..........................................................................29 3.2 Nội dung nghiên cứu...........................................................................................29 3.3 Vật liệu.................................................................................................................29 3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA..........................................................................29 3.3.2 Primer............................................................................................................29 3.3.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ.........................................................................29 v 3.4 Phương pháp tiến hành ........................................................................................30 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu ....................................................................................30 3.4.2 Tách chiết DNA ............................................................................................30 3.4.3 Thiết kế và kiểm tra primer phát hiện thịt trâu và thịt bò .............................31 3.4.3.1 Thiết kế primer .......................................................................................31 3.4.3.3 Kiểm tra trên thực tế độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC ..........32 3.4.4 Xác định quy trình PCR- trâu và PCR-bò.....................................................33 3.4.5 Ứng dụng PCR-trâu, PCR-bò để phát hiện thịt trâu, bò ...............................33 3.4.5.1 Ứng dụng PCR-trâu................................................................................33 a. Xác định giới hạn phát hiện của PCR-trâu .................................................33 b. PCR-trâu với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu ..............................................................................................33 c. PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt .......................................................................................................34 d. PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ................................................................................................................34 e. PCR-trâu với bột thịt trên thị trường...........................................................34 3.4.5.2 Ứng dụng PCR-bò ..................................................................................36 a. Xác định giới hạn phát hiện của PCR-bò....................................................36 b. PCR-bò với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu ..............................................................................................36 c. PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ............................................................................................................36 d. PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt......................36 e. PCR-bò với bột thịt trên thị trường.............................................................36 Chương 4 .......................................................................................................................38 KẾT QUẢ THẢO LUẬN .............................................................................................38 4.1 Kết quả thiết kế và tổng hợp primer phát hiện thịt trâu, thịt bò ..........................38 4.2 Kết quả kiểm tra lý thuyết độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC ...............38 4.2.1 Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR.................................................................38 4.2.2 Kết quả kiểm tra bằng Clustal W ..................................................................39 4.2.3 Kết quả BLAST ............................................................................................39 4.3 Kết quả kiểm tra trên thực tế độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC ...........40 4.3.1 Bằng PCR .........................................................................................................40 4.3.1.1 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A và B ..................................................40 4.3.1.2 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C và D ..................................................41 4.3.1.3 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E và F...................................................41 4.3.1.4 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G và H..................................................41 4.3.1.5 Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2&RBU2 và F2&RC2 với các DNA template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua .........................................43 4.3.2 Giải trình tự sản phẩm PCR của cặp F&RB; F&RC đặc hiệu ......................43 4.3.3 Xác nhận sản phẩm khuếch đại là của thịt trâu và bò...................................44 4.3.3.1 BLAST ...................................................................................................44 4.3.3.2 Gởi mã số lên NCBI cho trình tự đoạn DNA của thịt trâu và bò...........44 4.4 Xác định quy trình PCR-trâu ...............................................................................45 4.5 Xác định quy trình PCR-bò .................................................................................45 4.6 Ứng dụng PCR-trâu, PCR-bò...........................................................................45 4.6.1 Ứng dụng PCR-trâu ......................................................................................45 vi 4.6.1.1 Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCR-trâu.........45 4.6.1.2 PCR-trâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu ..........................................................................................................46 4.6.1.3 PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ....................................................................................................................46 4.6.1.4 PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt.............47 4.6.1.5 PCR-trâu với bột thịt trên thị trường ......................................................48 4.6.2 Ứng dụng PCR-bò.........................................................................................49 4.6.2.1 Giới hạn nồng độ DNA bò có thể phát hiện được của PCR-bò .............49 4.6.2.2 PCR-bò đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu ..........................................................................................................49 4.6.2.3 PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ......50 4.6.2.4 PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt .................50 4.6.2.5 PCR-bò với bột thịt trên thị trường ........................................................53 Chương 5 .......................................................................................................................54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................................54 5.1 Kết luận................................................................................................................54 5.2 Đề nghị.................................................................................................................54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................55 PHỤ LỤC ......................................................................................................................65 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSE : bovine spongiform encephalophathy GC : gas chromatography HPLC : high performance liquid chromatography IEF : isoelectric focusing LC : liquid chromatography LTRs : long terminal repeats MT-ATP6 : mitochondrially encoded ATP synthase 6 mtDNA : mitochondrial deoxyribonucleic acid MT-ND1 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 1 MT-ND4 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4 MT-ND4L : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4L MT-ND5 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 5 MT-ND6 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 6 MT-RNR1 : mitochondrially encoded 12S RNA MT-TH : mitochondrially encoded tRNA histidine MT-TL1 : mitochondrially encoded tRNA leucine 1 (UUA/G) MT-TS1 : mitochondrially encoded tRNA serine 1 (UCN) MT-TV : mitochondrially encoded tRNA valine NADH : Nicotinamide adenine dinucleotide PCR : polymerase chain reaction Prion : proteinaceous infectious particle RCB : reverse primer cattle &/ buffalo (theo Matsunaga & ctv, 1999) RP- HPLC : reverse phase high performance liquid chromatography SSRs : simple sequence repeats viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Mô hình kiểm tra một mẫu bằng kỹ thuật lai DNA ......................................10 Hình 2.2: Genome của ty thể.........................................................................................24 Hình 4.1: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A (F1-RBU1) và B (F1-RBU2)..................41 Hình 4.2: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C (F1-RC1) và D (F1-RC2)........................41 Hình 4.3: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E (F2-RBU1)và F (F2-RBU2)....................42 Hình 4.4: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G ((F2-RC1) và H (F2-RC2) ......................42 Hình 4.5: Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2 &RBU2 (Ta=56oC) ....................................42 Hình 4.6: Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2&RBU2 và F2&RC2 với các DNA template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua...................................................43 Hình 4.7: Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCR-trâu................45 Hình 4.8: PCR-trâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu.................................................................................................................46 Hình 4.9: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt.........46 Hình 4.10: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 80oC/15’(M2.1-M2.7) và 180oC/15’ (M7.1-M7.7).......................................47 Hình 4.11: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130oC/30’(M6.1-M6.7) và 120oC/15’ (M3.1-M3.7).....................................47 Hình 4.12: PCR-trâu phát hiện thịt trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130oC/15’(M5.1-M5.7) và 120oC/30’ (M4.1-M4.7).....................................48 Hình 4.13: PCR-trâu với bột thịt ...................................................................................48 Hình 4.14: Giới hạn nồng độ DNA bò có thể phát hiện được của PCR-bò ..................49 Hình 4.15: PCR-bò đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu.................................................................................................................49 Hình 4.16: PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ...........50 Hình 4.17: PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 80oC/15’(M2.1-M2.7) và 120oC/15’ (M3.1-M3.7).......................................51 Hình 4.18: PCR-bò phát hiện thịt bòtrong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 120oC/30’(M4.1-M4.7) và 130oC/15’ (M5.1-M5.7).....................................52 Hình 4.19: PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130oC/30’(M6.1-M6.7) và 180oC/15’ (M7.1-M7.7).....................................52 Hình 4.20: PCR-bò với bột thịt trên thị trường .............................................................53 DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Các phương pháp phân biệt loài của thịt......................................................20 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu .........................................................................................37 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Tỉ lệ phần trăm (%) của các mô trong các loại thịt (tính theo khối lượng thịt xẻ) ...................................................................................................................3 Bảng 2.2: 13 gen mã hóa protein trong chuỗi vận chuyển ............................................21 Bảng 2.3: 22 gen mã hóa tRNA.....................................................................................23 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất phản ứng PCR kiểm tra độ đặc hiệu primer ...............32 Bảng 3.2: Tỷ lệ DNA heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp ..............................34 Bảng 3.3: Hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt ...............................35 Bảng 4.1: Các primer thiết kế........................................................................................38 Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR.................................................................39 Bảng 4.3: Kết quả sắp gióng cột bằng Clustal W của các primer với trình tự cytochrome b các loài trâu, bò, heo, gà, dê, cừu...........................................39 Bảng 4.4: Các tổ hợp primer .........................................................................................40 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, khi nhu cầu về lương thực thực phẩm tăng cao thì việc đảm bảo chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm là điều cần thiết. Trong đó, các sản phẩm có nguồn gốc từ thịt đã và đang là mối quan tâm của xã hội. Sản phẩm thịt chế biến thường có nguồn gốc từ một hay nhiều loại thịt khác nhau. Do sự đa dạng về hình thức, chất lượng và giá thành của các sản phẩm thịt chế biến đã gây ra vấn đề gian lận thương mại. Trên thị trường có nhiều sản phẩm thịt ghi thành phần trên nhãn hiệu, công thức lệch với thực tế để nâng cao giá trị cho sản phẩm. Đặc biệt, sự gian lận này có thể ảnh hưởng đến việc kiêng sử dụng một hay một vài loài thịt nào đó vì lý do sức khỏe (ví dụ bị dị ứng) hay vì lý do tôn giáo (ví dụ, đạo Hindu không ăn thịt bò). Thịt chế biến thường xử lý ở nhiệt độ cao trên 1000C (khoảng 1200C đối với thịt hộp, xúc xích tiệt trùng…). Đặc biệt đối với bột xương thịt làm thức ăn cho gia súc tuy xử lý ở nhiệt độ khoảng 1300C nhưng được sản xuất từ những phụ phế phẩm trong công nghiệp giết mổ heo, trâu, bò, cừu, gà, dê,…nên một số mầm bệnh nguy hiểm vẫn tồn tại và có khả năng gây bệnh. Ví dụ bệnh BSE (Bovine spongiform encephalopathy) - bệnh bò điên - gây hại gia súc và có khả năng lây lan sang người. Vì lý do này, các nước trên thế giới trong đó có cả Việt Nam không cho nhập bột xuơng thịt có nguồn gốc từ thịt bò... của các vùng lãnh thổ có mầm bệnh BSE. Vì thế, việc phát triển và ứng dụng các phương pháp phát hiện chính xác và nhanh chóng các loại thịt trong những sản phẩm chế biến từ thịt gia súc, gia cầm khác nhau là nhu cầu cần thiết của thị trường và xã hội. Có nhiều phương pháp để xác định nguồn gốc thịt như phương pháp phát hiện dựa vào protein (ví dụ điện di, miễn dịch, sắc ký), phương pháp phát hiện dựa vào DNA (lai DNA, RAPD-PCR, PCR đặc trưng cho loài như standard-PCR, multiplex-PCR, Realtime PCR, PCR-RFLP, PCR sequencing, PCR-SSCP.) Các phương pháp phát hiện dựa vào protein hoặc chậm hoặc không thể ứng dụng cho các sản phẩm thịt đã xử lý nhiệt. Do đó, các phương pháp dựa vào DNA 2 thường được sử dụng hơn đặc biệt là các phương pháp PCR đặc trưng cho loài. Trong đó, các phương pháp Realtime PCR, PCR-RFLP, PCR sequencing, PCR-SSCP đòi hỏi máy móc, trang thiết bị, hóa chất phức tạp, giá thành cao. Còn phương pháp PCR dễ thực hiện nên được sử dụng rộng rãi trong việc phân biệt loài của thịt. Nếu có quy trình ly trích hợp lý, xác định gen mục tiêu thích hợp sẽ có thể phân biệt được các loại thịt đã xử lý nhiệt. 1.2 Mục tiêu - Xây dựng quy trình phát hiện thịt trâu và thịt bò bằng kỹ thuật PCR 1.3 Mục đích - Góp phần giảm vấn nạn gian lận thương mại đối với sản phẩm thịt chế biến cho con người và bột thịt làm nguyên liệu trong chế biến thức ăn gia súc. - Ngăn ngừa sự lan truyền mầm bệnh BSE từ thức ăn gia súc sang các loài thú nhai lại và người 3 Chương 2 TỔNG QUAN 2.1. Sơ lược về thịt và thịt chế biến 2.1.1 Giới thiệu sơ lược về thịt Thịt là một khái niệm dùng để chỉ một số mô có giá trị sử dụng làm thực phẩm có nguồn gốc từ động vật. Trong thương mại, thịt gồm có các mô: mô cơ, mô mỡ, mô liên kết, mô xương sụn và mô máu. Thành phần hóa học của thịt bao gồm nước, protein, lipid, glucid, các chất trích ly chứa nitơ và không chứa nitơ, khoáng, vitamin và enzym. Các thành phần này phụ thuộc vào loài thú, tuổi, giới tính, mục tiêu sử dụng, khẩu phần nuôi dưỡng, mức độ và giai đoạn vỗ béo, bộ phận súc thịt và cơ thể học (Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004). Bảng 2.1 Tỉ lệ phần trăm (%) của các mô trong các loại thịt (tính theo khối lượng thịt xẻ) Loại mô Thịt bò (%) Thịt heo (%) Thịt cừu (%) Mô cơ 57-62 40-62 49-58 Mô mơ 3-16 15-40 4-18 Mô liên kết 9-12 6-8 7-11 Mô xương sụn 17-29 8-18 18-38 Mô máu 0,8-1 0,6-0,8 0,8-1 (Theo Xmolxki, 1975) Tính chất của các mô và thành phần cấu tạo của nó đều khác nhau. Do đó, tùy theo đặc tính và tỉ lệ của các thành phần cấu tạo trong mỗi loại mô sẽ quyết định tính chất của thịt. Trong súc thịt, mô cơ là mô có giá trị dinh dưỡng cao nhất, thấp nhất là mô liên kết. Mô mỡ có giá trị năng lượng cao và còn làm cho thịt có vị béo. Giá trị thực phẩm của thịt đầu tiên được đánh giá qua tỉ lệ protein chứa trong đó và giá trị sinh học của lượng protein đó. Trong dinh dưỡng con người và động vật, thịt và sản phẩm của thịt là nguồn đạm, chất béo, vitamin, chất khoáng và các chất hòa tan. Tất cả được sử dụng trong 4 cơ thể nhằm mục đích sinh tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể cũng như bù đắp năng lượng tiêu hao do hoạt động. Thịt các loài động vật chứa hầu hết các nguyên tố đa lượng và vi lượng cần thiết cho cơ thể, các vitamin nhóm B, acid pantotenic, vitamin PP. Thịt heo chứa nhiều vitamin B1, B6 và acid pantotenic. Thịt bò chứa nhiều vitamin B12. 2.1.2 Giới thiệu sơ lược về thịt chế biến Nguyên liệu chủ yếu để sản xuất thịt và các sản phẩm thịt là đại gia súc có sừng (trâu, bò…); gia súc (heo, cừu, dê...); và gia cầm (như gà, vịt, ngỗng,…). Để đa dạng hóa sản phẩm chế biến từ thịt và nâng cao giá trị sử dụng của thịt thì chúng phải được chế biến thành nhiều dạng sản phẩm khác nhau tùy theo mục tiêu sử dụng. Chế biến làm tăng sự ngon miệng, tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ các chất dinh dưỡng từ thịt, hạn chế sự nhiễm vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm, kéo dài tuổi thọ của sản phẩm do đó tăng giá trị sử dụng của thịt chế biến. Thịt chế biến có hai nhóm lớn: thịt chế biến làm thức ăn cho người và thịt chế biến làm thức ăn cho gia súc. Thịt chế biến làm thức ăn cho người thường được chế biến từ mô cơ, mô mỡ. Thịt chế biến dùng làm thức ăn gia súc (thường là bột thịt) còn được chế biến từ các nguồn vật liệu giàu protein khác là phụ phế phẩm trong giết mổ gia súc như da, lông, xương, móng và các nội quan. Có nhiều phương pháp chế biến thịt cung cấp thực phẩm cho con người: phơi khô, ướp muối, ướp đường, lên men, xử lý nhiệt (nấu, hấp, sấy), hun khói. Trong đó phương pháp sử dụng nhiệt độ là phổ biến nhất. Tùy theo loại sản phẩm và mục tiêu sử dụng mà người ta xử lý ở mức nhiệt độ khác nhau. Hiện nay, hầu hết các sản phẩm chế biến như xúc xích, lạp xưởng, thịt hộp, cá hộp... được xử lý ở 800C; xúc xích tiệt trùng, thịt hộp được xử lý ở 1200C; đối với bột thịt sử dụng cho gia súc và con người, nhiệt độ xử lý là 1300C (Hồ Thị Thu Nguyệt, 2003). 2.1.3 Tình hình gian lận trên thị trường thịt của thế giới và Việt Nam 2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế giới Cơ quan tiêu chuẩn về thực phẩm (FSA – Food standard Agency) đã tổ chức nhiều cuộc điều tra trên đối tượng thịt và các sản phẩm thịt chế biến, kết quả cho thấy có rất nhiều sai lệch giữa thành phần thực tế với nhãn hiệu của sản phẩm. Đặc biệt là 5 sản phẩm thịt chế biến gồm nhiều loại thịt gia súc khác nhau, các nhà sản xuất thường ghi trên nhãn sản phẩm những loại thịt có giá trị cao và tránh ghi những loại thịt có giá trị thấp được trộn vào trong sản phẩm. Một số trường hợp lại ghi sai tỷ lệ giữa các loại thịt. Trong khi đó, khả năng kiểm soát thành phần loài, độ an toàn và chất lượng sản phẩm thịt chế biến trên thị trường của các tổ chức ban ngành có liên quan vẫn còn ít (http://archive.food.gov.uk). Một cuộc điều tra khác của bộ môn Công Nghệ thực phẩm và vệ sinh thực phẩm, trường Thú y, Đại học Ankara (Mỹ) (2006) về các loại thịt được trộn vào trong các sản phẩm thịt tươi và thịt chế biến. Trên 100 mẫu điều tra, kết quả là 39,2% xúc xích lên men 35,7% xúc xích Ý, 27,2% xúc xích Đức, 22,2% thịt tươi, 6,2% thịt viên có chứa thịt của những loài động vật không công bố trên nhãn sản phẩm. Cụ thể là xúc xích lên men, xúc xích Ý, xúc xích Đức với thành phần ghi trên nhãn là thịt bò nhưng kết quả kiểm tra lại có lẫn thịt gia cầm. Các mẫu thịt bò tươi kiểm tra cho thấy dương tính với thịt hươu và thịt ngựa. 2.1.3.2 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến ở Việt Nam Ở Việt Nam, tình hình gian lận thương mại trong sản xuất, tiêu thụ thịt và sản phẩm chế biến từ thịt là vấn đề nhức nhối đối với nhà quản lý. Ngay cả thịt tươi bán ở chợ hay ở các cửa hàng cũng bị gian lận như thịt trâu giả bò, thịt ngựa giả bò...Đối với các sản phẩm thịt chế biến như xúc xích bò, chả giò bò, thịt hộp...trên thị trường có nhiều sản phẩm nghi ngờ không đúng với thành phần trên nhãn hiệu đã đăng kí, đặc biệt các thực phẩm chế biến nhập khẩu. Những năm gần đây, Việt Nam đặc biệt quan tâm đến vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm. Các bệnh dịch nguy hiểm đã và đang diễn ra. Tình trạng vận chuyển lậu động vật và các sản phẩm động vật vẫn thường xảy ra. Cục Thú y đã phối hợp với Vụ pháp chế - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm – Bộ Y tế, Cục quản lý Thị trường – Bộ Công thương thường xuyên tổ chức thanh tra, kiểm tra công tác kiểm dịch nhập khẩu động vật, sản phẩm động vật, đặc biệt là hoạt động chống nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới diễn biến hết sức phức tạp. Tuy nhiên, chính quyền địa phương chưa thực sự quan tâm chỉ đạo công tác ngăn chặn và xử lý nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới, sự phối hợp giữa các cơ quan, ban ngành tại địa phương chưa thống nhất và chặt chẽ 6 (http://www.cucthuy.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=182&It emid=65). Thêm vào đó, công tác kiểm tra đối với các mặt hàng xuất nhập khẩu có nguồn gốc động vật vẫn còn nhiều vấn đề bất cập: - Các nhà xuất nhập khẩu đều có thể đáp ứng được các yêu cầu tiêu chuẩn kỹ thuật và tiêu chuẩn của Việt Nam. Tuy nhiên, do thiếu trang thiết bị và cán bộ, nên việc kiểm tra chất lượng , kiểm dịch và thủ tục phê duyệt thường kéo dài. - Trong khi đó, các nước nhập khẩu yêu cầu về đăng ký công bố chất lượng, kiểm dịch, kiểm soát giết mổ của các nước nhập khẩu thường rất chặt chẽ. Các yêu cầu, tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm của các nước này cũng rất cao. - Các nhà nhập khẩu nước ngoài còn yêu cầu thịt và sản phẩm của thịt phải được lấy từ vùng an toàn đối với bệnh lở mồm lông móng, dịch tả heo, dịch tả gà (newcastle), BSE và những vùng này phải được tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) công nhận. - Yêu cầu tiêu chuẩn của Việt Nam thường không chặt chẽ bằng các yêu cầu tiêu chuẩn của các nước nhập khẩu (Bùi Thị Cúc, 2006). 2.2. Các phương pháp phát hiện thịt 2.2.1 Phương pháp dựa vào protein Những phương pháp dựa vào protein sau đây có thể ứng dụng để xác định thành phần và nguồn gốc của các sản phẩm thịt và từ thịt: Phương pháp điện di Phương pháp miễn dịch Phương pháp sắc ký 2.2.1.1 Phương pháp điện di Bản chất của phương pháp điện di Phương pháp điện di dựa vào sự phân tách của các phân tử protein trong điện trường sau khi ly trích từ mô. Đầu tiên, protein đi qua lớp starch gel, sau đó đi qua lớp polyarylamide và agarose. Sự phân tách protein được biểu hiện trên polyarylamide gel (PAGE), trên polyacrylamide gel chứa một tác nhân biến tính (sodium dodecyl sulfate) (SDS-PAGE) hoặc nhờ điểm đẳng điện (isoelectric focusing - IEF) trên gel 7 agarose hoặc gel polyacrylamide (PAGIF). Phương pháp IEF bao gồm sự phân tách trên một gel mà được xác định nhờ sự thay đổi pH. Các protein riêng lẻ di chuyển theo giá trị pH mà tương đương với điểm đẳng điện (isoelectric point ). Điện di PAGE cũng được quan tâm nhờ sự vắng mặt của tác nhân biến tính. Trong phương pháp này, sự phân tách protein phụ thuộc vào vật mang và kích thước của phân tử protein. Các protein di chuyển từ cực dương sang cực âm phụ thuộc vào điện tích của chúng. Trong trường hợp của SDS – PAGE, phân tử protein mang điện tích âm được lấy từ SDS di chuyển từ cực dương với vận tốc phụ thuộc chủ yếu vào trọng lượng phân tử của chúng. Có một mối tương quan tuyến tính giữa khoảng cách di chuyển của protein và giá trị logarit thập phân của trọng lượng phân tử mà có thể dùng để xác định trọng lượng phân tử của protein. Với sự hỗ trợ của điện di hai chiều (two dimensional electrophoresis 2-DE), nó có thể dùng để xác định thịt của nhiều loài liên quan của cá, chim, gia súc. Sự phân tách protein có thể nhìn thấy được bằng mắt thường (trong trường hợp protein có chứa chất màu) hoặc sau khi nhuộm màu. Những thuốc nhuộm thông thường gồm: coomasie blue, muối bạc, hoặc chất nhuộm có bản chất enzym (Hofmann, 1997). Ứng dụng của phương pháp IEF Sự phân tách protein nhờ IEF chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: pH thịt, tuổi và giới tính của gia súc cho thịt, dinh dưỡng, điều kiện nuôi, điều kiện dự trữ, hoạt tính tự nhiên hoặc protease vi sinh vật. Có thể phân tách dựa vào thành phần đơn, ví dụ myoglobin là sắc tố cơ chuyên biệt loài. Myoglobin sử dụng như là chỉ thị loài, sự phân tách cùng nhau có thể đạt được bởi những thịt thí nghiệm khác nhau của cùng một con vật hay của những con vật khác nhau của cùng một loài. Điều này đã được chứng minh đối với thịt của các loài như bò, ngựa, heo, cừu, dê, kangaroo, lạc đà, gấu, thỏ, gà, vịt, đà điểu, band myoglobin được xác định và chúng có thể được phân biệt cơ bản những myoglobin (Hofmann, 1997). Trong trường hợp, những thú có quan hệ gần nhau, ví dụ như heo và heo rừng, mẫu myoglobin thì tương tự nhau. Kỹ thuật IEF có thể được sử dụng để xác định những thú có liên quan nhau với lượng myoglobulin thấp. Ví dụ, thịt gà và thịt gà tây. Ứng dụng của phương pháp PAGE và SDS-PAGE Phương pháp điện di PAGE có thể được sử dụng để xác định protein của các 8 loại thịt heo, bò, ngựa, cừu, cá, dê, hươu...Phương pháp này cũng có thể sử dụng để phát hiện thịt của những loài có quan hệ với nhau, nhưng protein dùng để kiểm tra không được xử lý nhiệt. Việc xác định các sản phẩm thức ăn bổ sung từ thịt của những loài khác nhau đã xử lý nhiệt có thể thực hiện trong điều kiện protein kiểm tra được phân hủy trong dung dịch guanidine chloride và điện di đẳng điện sau khi nhuộm enzym (Pyz, 1998). Phương pháp SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis) có thể phân tích các protein khó tan trong các dung môi khác hơn là trong dung dịch SDS. Phương pháp này cũng có thể ứng dụng cho các protein không tan trong dung dịch có chứa urê, được sử dụng để phân tích chất lượng của protein, ví dụ protein nhiều loài cá hoặc phân tích số lượng dựa vào thuốc nhuộm. Tuy nhiên, phương pháp này không tiện lợi vì kết quả đạt được có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như tuổi, dinh dưỡng, stress, sự sai khác về chất lượng của thịt cũng như thịt đông lạnh bảo quản không tốt so với thịt tươi (Minkiewicz & ctv, 2000). 2.2.1.2 Phương pháp miễn dịch Phương pháp miễn dịch được sử dụng trong phân tích thực phẩm bao gồm phân tích những phân tử có trọng lượng nhỏ như mycotoxins, kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật và vitamin cũng như những phân tử lớn như độc tố vi khuẩn, enzym, kích thích tố, protein thực phẩm, và thậm chí phân tích những vi sinh vật sống như vi khuẩn và nấm mốc (Hitchcock, 1988; Fukall & Kas, 1989). Từ đầu thế kỷ XX, phương pháp miễn dịch dựa vào phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể đã được ứng dụng để phân biệt loài của thịt. Những thành tựu trong hóa miễn dịch đã dẫn đến sự xuất hiện nhiều phương pháp miễn dịch mới, bao gồm các phương pháp miễn dịch phóng xạ, các phương pháp miễn dịch enzym, và các phương pháp miễn dịch sắc ký không enzyme (non-enzymatic chromatographic immunoassays hay lateral flow) với độ nhạy và độ chính xác được cải thiện rất nhiều. 2.2.1.3. Phương pháp sắc ký Phương pháp sắc ký gồm sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng (LC), sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đã được ứng dụng để phân biệt loài trong các mẫu thịt dựa vào sự kiểm tra thành phần acid béo (Verbeke & Brabander, 1985), histidine dipeptides (Carnegie & ctv, 1983; Chung & ctv, 1998). Trong các kỹ thuật trên, HPLC được sử dụng rộng rãi 9 nhất. Ví dụ, phương pháp sắc ký lỏng cao áp ngược pha (RP-HPLC) được sử dụng để phân biệt loài của thịt tươi và thịt chế biến dựa vào histidine peptides phụ thuộc vào loài, tỷ lệ đặc trưng của carnosine với serine (C/E) (Chung & ctv, 1998). Mặc dù, mẫu sắc ký giống nhau ở các cơ khác nhau trong một loài, nhưng có nhiều protein đặc trưng và có nhiều peak protein thay đổi (Toorop & ctv, 1997; Ashoor & ctv,1998) gây khó khăn cho việc phân tích dữ liệu. Dựa vào lý do căn bản là chất béo không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, phương pháp LC được phát triển cho việc phát hiện thịt heo và mỡ heo trong các sản phẩm thịt tươi và thịt chế biến dựa vào tăng tỷ lệ triglyceride có trong acid béo bão hòa với triglyceride chứa trong acid béo không bão hòa (Saeed & ctv, 1989). Tuy nhiên, vì lượng mỡ trong sản phẩm thịt thường thay đổi nên khó xác định lượng thịt giả mạo (bị pha trộn) từ phương pháp dựa vào chất béo. Cũng như phương pháp điện di, phương pháp sắc ký có thể phân biệt loài riêng biệt, nhưng phương pháp sắc ký ít hiệu quả trong việc phát hiện loài thịt giả mạo được pha trộn trong các hỗn hợp thịt tươi và thịt chế biến vì tính phức tạp cao của các peak. Thêm vào đó, phương pháp sắc ký đòi hỏi trang thiết bị đắc tiền và quy trình chuẩn bị mẫu khó khăn. 2.2.2. Phương pháp dựa vào DNA 2.2.2.1 Phương pháp lai DNA Các nghiên cứu ban đầu sử dụng DNA để phát hiện loài của thịt đã sử dụng những phương pháp đơn giản. Nhờ đó mà những probe DNA đã đánh dấu được lai với DNA bộ gen của mẫu thấm trên màn nilong. Mô hình thí nghiệm cho một kiểm tra được chỉ ra ở hình 2.4. Sự chuẩn bị probe không đòi hỏi bất kỳ kiến thức trước như tính chính xác về trình tự DNA nghiên cứu. Sự gắn kết chuyên biệt về loài của probe với DNA mục tiêu là nhờ probe lai với trình tự bổ sung với probe trên DNA mục tiêu. Những trình tự bổ sung với probe được sắp xếp một cách ngẫu nhiên và được tìm thấy xuyên suốt genome như trình tự “satellite”. 10 Mẫu Probe Ly trích DNA Ly trích DNA Biến tính DNA và gắn kết lên màng Tổng hợp probe và đánh dấu Lai probe với màng Rửa để loại bỏ probe không gắn kết Phát hiện probe được lai Hình 2.1: Mô hình kiểm tra một mẫu bằng kỹ thuật lai DNA 3 mẫu thuộc 3 loài: X, Y, và Z; sử dụng probe được chuẩn bị từ loài Y (Lockley & ctv, 2000) 11 2.2.2.2 Phương pháp dựa vào PCR Phương pháp PCR được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua vì khả năng khuếch đại của kỹ thuật PCR có thể phát hiện trình tự DNA mục tiêu khi lượng mẫu hạn chế. Các phương pháp dựa vào PCR để phân biệt loài của thịt đã được phát triển từ thập niên trước. Tất cả những phương pháp PCR này được phân thành 2 nhóm (Hui, 2006). Đó là Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) và PCR đặc trưng cho loài (species-specific PCR). RAPD khuếch đại nhiều trình tự chưa được biết trước sử dụng các primer không chuyên biệt, dẫn đến kết quả fingerprint đặc trưng cho từng loài (species-specific fingerprints) của sản phẩm PCR được quan sát trên gel điện di. Species-specific PCR (species-specific PCR) sử dụng các cặp primer đặc trưng và bảo tồn mà các primer này bắt cặp với những trình tự dùng để phân biệt loài của DNA nhân hay DNA ty thể. Vì thế cần phải biết trước về trình tự DNA mục tiêu để thiết kế primer. Sản phẩm PCR sau đó có thể được phân biệt dựa vào kích thước, giải trình tự, hoặc dựa vào những phân tích tiếp theo như đa hình chiều dài phân đoạn (Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) hoặc đa hình cấu tạo chuỗi đơn (Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP). Ưu điểm của kỹ thuật PCR là tính hiệu quả và ít tốn thời gian. a. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Những primer chuyên biệt hoặc ngẫu nhiên khuếch đại những marker DNA đa hình được sử dụng để phân biệt loài của thịt. Những primer chuyên biệt này thường ngắn, kích thước khoảng 10 bp. Do trình tự của những primer này chuyên biệt nên không cần biết trước trình tự DNA của loài. Trong cùng điều kiện PCR, các primer này sẽ khuếch đại hàng loạt vị trí cho ra nhiều band khác nhau khi điện di. Từ đó xác định được band chuyên biệt về loài. Những cặp primer khác nhau sẽ cho ra sản phẩm khác nhau (Lee & ctv, 1994; Cushwa, 1996; Roa & ctv, 1996; Koh, 1998). Phương pháp RAPD sử dụng những primer bất kỳ dựa trên những trình tự oligonucleotide ngắn khuếch đại nhiều trình tự không xác định cùng một lúc. Sau khi điện di trên gel, sản phẩm PCR sẽ cho ra các dạng fingerprint có tính duy nhất cho một loài chuyên biệt. Khả năng phân biệt của RAPD-PCR thì gần như không có giới hạn vì sự lựa chọn các primer bất kỳ là không giới hạn. Tuy nhiên, không phải tất cả các primer ngẫu nhiên có thể phân biệt một cách thỏa đáng giữa các loài. Sàng lọc và lựa chọn kỹ lưỡng các primer là điều quan trọng cho việc áp dụng thành công kỹ