Tài liệu Peniccilium roquefoti

ĐỀ TÀI PENICCILIUM ROQUEFOTI GVHD: K.S. PHẠM MINH NHỰT NHÓM 7 TRẦN THUỴ KIM BÌNH TRƯƠNG THỊ TRÚC HÀ PHẠM NGÔ ÁNH THƯ HUỲNH THỊ DIỆU HIỀN MỤC LỤC Lời nói đầu Phần I Tổng Quan Về Penicillium Roqueforti I. Lịch sử phát hiện ........................................................................ 4 II. Phân loại khoa học ..................................................................... 4 III. Đặc điểm nhận dạng ................................................................... 6 IV. Đặc điểm sinh hoá ...................................................................... 9 Phần II Các Phương Pháp Xác Định I. Phương pháp truyền thống ........................................................... 8 II. Các phương pháp hiện đại 1. Phương pháp PCR .................................................................... 22 2. Phương pháp RAPD ................................................................... 25 Phần III: Kết Luận 2 LỜI NÓI ĐẦU Trong những năm gần đây với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, quá trình định danh cho nhiều loài vi sinh vật cũng như dễ dàng hơn với thiết bị hiện đại hơn. Nhiểu loại vi sinh có lợi, hại đều được biết đến rõ ràng hơn. Trong những năm vi sinh học phát triển một loài sinh độc tố nhưng có ít trong đó có loại nấm mốc Peniccilium roqueforti được xác định từ trong sản phẩm phomat xanh vốn quen thuộc với dân châu Âu. Penicilium roqueforti được các nhà khoa học tìm hướng đi mới ngoài việc sử dụng để sản xuất phomat xanh. 3 PHẦN I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN Đầu tiên được mô tả bởi Thom vào năm 1906, Penicillium roqueforti thoạt đầu là một loài hỗn tạp của nấm xanh sinh bào tử. Chúng được chia thành các nhóm loài khác nhau dựa trên sự khác biệt về kiểu hình, và sau đó chúng được kết hợp thành một loài bởi Raper và Thom. Charles Thom (1872-1956) Nhóm Pencillium được phân loại lại vào năm 1996 dựa vào sự khác nhau của dãy DNA ribosom và đặc tính chuyển hoá thứ cấp. Trước đây được chia thành hai loại khác nhau – một là được dùng cho phomat ( Penicillium roqueforti var. roqueforti) và một là tạo patulin. II. PHÂN LOẠI KHOA HỌC Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Giống: Penicillium Loài: Penicillium roqueforti Hình ảnh được phóng đại vài trăm triệu lần dưới kính hiển vi điện tử 4 Hình ảnh Penicilium roqueforti (Penicillium roqueforti var. carneum), Penicillium roqueforti được phân loại thành ba loài là Pencillium roqueforti, Penicillium carneum và Penicillium paneum. III. ĐẶC ĐIỂM 1. Đặc điểm hình thái 5 Penicilium roqueforti là loại mốc có màu xanh, có cuốn đính bào từ, sinh bào tử, sinh sản hữu tính, hình sợi, thuộc ngành nấm nang. Qúa trình hợp giao tử (A – F) ; Toàn giao (Hologamy)(G – J); Tiếp xúc giữa 2 giao tử (K– L); Tự giao (autogamy)(M – N: sinh sản ở nấm mốc. 6 2. Đặcđiểm bào tử Bào tử của nấm mốc Penicilium roqueforti : hình cầu gần như hình tròn, bề mặt tròn nhẵn(kích thước 3,5- 5,5 µm), không có màng tế bào. Cuống dài 100-200 x 4-5,5,…. Bào tử Penicilium roqueforti Khuẩn lạc Penicilium roqueforti 7 Hình ảnh P.roqueforti 3. Môi trường sống Đặc điểm trên môi tổng hợp: Penicillium roqueforti chỉ là một loài của Penicillium mà nó có thể phát triển trên môi trường chứa 0-5% acid acetic, ở nồng độ rượu cao, và ở nồng độ oxy thấp (nói rõ trong phần sau). Khuẩn lạc trên môi trường Czapek thạch và MEA 25oC phát triển rất nhanh chóng, đường kính đạt 4-5 cm, trong vòng 14 ngày, các bào tử có các cuống mọc dày đặc, mượt, Màu xanh xanh, sau đó trở nên tối hơn. Dịch tươi do loài này tiết ra trong như giọt pha lê. Mùi không rõ nét. Sau đó môi trường thay đổi màu sắc từ màu xanh sang xanh đậm. Cuống bào tử đính kích thích 100-200 x 4,0-6,5 µm. Hạt bào tử đính trong cột lỏng lẻo,hình cầu, màu xanh lục, nhẵn-tường, chủ yếu là từ 4-6 mm, có khi đến 8mm. Phân bố trong tự nhiên: Roqueforti Penicillium là một loại nấm hoại sinh phổ biến , nó thì tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và có thể được phân lập từ đất, các chất hữu cơ phân hủy và các bộ phận của cây .. Ngoài ra, chúng được tìm thấy trong ẩm ướt, hầm tối, 8 đến vườn đất và tán lá, mà còn trong phòng tắm, nước, đường ống, con dấu cao su, ngưỡng cửa sổ, thảm, nệm và đồ nội thất… 4. Tốc độ phát triển Tốc độ phát triển nhanh trên các môi trường và đạt kích thước sau: CYA: 34-55mm, MEA: 35-56 mm, YES: 47-74 mm. Khuẩn lạc của Penicilium roqueforti phát triển rất tốt trên môi trường acid acetic : 0,5%, và cũng phát triển tốt trên CREA thích hợp trên môi trường acid. IV. ĐẶC TÍNH SINH HOÁ 1. Sinh hợp chất thứ cấp 1.1. Penicilium roqueforti là loài sinh ra hợp chất thứ cấp marcfortines và fumigaclvine A. Marcfortines từ Penicilium roqueforti 9 Những tư liệu về những hợp chất này tạm thời chưa được rộng nên khó khăn trong việc lấy nó làm tư liệu. 1.2. Độc tố PR và eremofortin C Là chất chuyển hóa thông thường của Penicilium roqueforti. Các cấu trúc hóa học của hai hợp chất liên quan chặt chẽ với nhau và khác nhau chỉ bởi một aldehyde và một nhóm acohol tại vị trí C-12 . Định tính, định lượng độc tính enzyme: Các hoạt động tối đa các enzym trong các môi trường đã được tìm thấy vừa xảy ra vào ngày 13 tính từ khi bắt đầu thí nghiệm, trong đó tương ứng cực đại của PR trong vật chứa độc tố. Enzyme này được phân lập và tinh chế từ các môi trường và vừa khuẩn ty thể của nấm tương ứng thông qua một thao tác liên quan đến amoni sulfat và fractionation DEAE-cellulose sắc ký. Sản lượng đã được 33,3 và 21,6% cho các enzym có hoạt tính trung. Độ pH tối ưu cho enzym khi pH 5,6. Khi nó xúc tác sự chuyển đổi ở 30 ° C và phân rã với thời gian phản ứng khi ở nhiệt độ cao. Ở 100 ° C, hoạt động của enzyme đã hoàn toàn bị mất. Các K. và Vmax của các enzym như được xác định ở 30 ° C là 0,02 mM và 4.0, umol / phút mỗi mg, tương ứng. Trọng lượng phân tử của enzyme đã được ước tính bằng cách lọc ,áp suất sắc ký lỏng thu được là I-250 protein đến 40.000. Độc tố PR và eremofortin C (EC) là chất chuyển hóa thứ cấp của nấm Penicillium roqueforti, những độc tố này gây nguy hiểm cho những người sử dụng sản phẩm phomat bị nhiễm penicilium roqueforti. Hình: phân tích chất độc bằng phương pháp HPLC . sự hoạt động của độc tính trong Penicilium roqueforti. 10 Kể từ khi phát hiện và cô lập PR độc tố , nó làm sáng tỏ độc tố nấm mốc con đường tổng hợp sinh học của các độc tố khác có liên quan và chuyển hóa qua lại lẫn nhau. Cấu trúc của PR : 11 Công thức một số loại chất độc do Penicilium roqueforti sinh tổng hợp 2. Oxy hoá các acib béo Khả năng của nấm để ôxi hóa của các axit béo chuỗi trung bình được thu Ketones methyl lần đầu tiên được ghi nhận, người đã cho thấy Penicillium roqueforti và hai loài của chi Aspergillus sản xuất Ketones methyl khi nuôi vi nấm trong vài tuần trong môi trường acid béo. Năng lực của các bào tử của P. roqueforti để tạo Ketones methyl nhanh chóng biến mất dần dần khi bào tử nảy mầm.Tỷ lệ sự hình thành của 1-2-heptan trong những axít octanoic do sự không hoạt động P.roqueforti đã được tăng lên đáng kể bằng cách thêm những axít amin và đường khi kích thích nảy mầm của các bào tử. Phương pháp: Gehrig & Knight (1963) đã tăng trưởng của khuẩn ty thể Penicillium roqueforti trên phương diện hóa học trong đó có cả acetate và oleate. Ban đầu ở pH 4,0 thể khuẩn ty ở pH 4,0 lần ít hoạt động trong ôxi hóa axít béo hơn khoảng 5 sự phát triển ở pH 6,5. 12 Môi trường Ammonium nitrate, 2 g. ; Magiê sulfat (MgSO,. 7H, O), 0,1 5 g. ; Kali clorua, 0,25 g. ; Sắt sulfat (FeSO,. 7H20), 0,0125 g. Tăng trưởng của khuẩn ty thể: Bào tử của Penicillium roqueforti đã được nhân giống trên môi trường CzapekDox agar (Oxoid) . Sau 5-6 ngày các bào tử đã được chuyển giao cho 100 ml của trung bình trong 500 ml trong Erlenmeyer Flasks. Việc nhân giống được ủ qua đêm, để cho phép bào tử nảy mầm trong 24 giờ. Nồng độ của khuẩn ty thể pha trộn đã được điều chỉnh để khoảng 10 mg. / ml. Wt khô, nồng độ chính xác được xác định bằng cách đo lường trọng lượng khô. Hình 1: Sự hấp thu oxy ở pH 5,2 do khuẩn ty thể của roqueforti Penicillium ủ với axít béo. Phản ứng các điều kiện: Iomg. khô wt equiv. khuẩn ty thể, thu hoạch sau khi 66h. Hình 2: Các ức chế hấp thu oxy bằng cách bổ sung của C, hoặc C, các axit béo để khuẩn ty thể của Penicillium roquefortiincubated với axít béo Kết quả: Ảnh hưởng trung vào khả năng tăng trưởng của khuẩn ty thể để ôxi hóa axít béo . Sản lượng của Ketones methyl thấp từ axit béo đã thu được với khuẩn ty thể trồng trong các axit Casamino (3 g./500 ml). 13 3. Độc tính: Penicilium roqueforti sinh độc tố roquefortine. Độ độc thấp của roquefortine C đã được tìm thấy trong pho mát xanh nhưng nồng độ chính xác đã không báo cáo. Scott và Kennedy (1976) tìm thấy nồng độ roquefortine lên đến 6,8 mg / kg trong các mẫu phó mát xanh trên thị trường mà họ kiểm tra. Trong thực tế,độc tính roquefortine tạo ra bởi hầu hết các chủng của P. roqueforti được phân lập từ phô mai xanh. Một tỷ lệ nhỏ các chủng tìm thấy từ thịt cũng tạo ra roquefortine. Khả năng gây bệnh của Penicillium roqueforti là rất thấp, thậm chí là ít cơ hội gây bệnh. Giá trị LD50 của roquefortine khoảng 10 mg / kg được thử nghiệm trên chuột. Cho bò ăn ngô bị nhiễm P. roqueforti làm bò biếng ăn, và viêm đường ruột . Con người tiếp xúc độc tính đó qua da và đường hô hấp và tiêu hoá Một trường hợp được Campbell et al (1983) mô tả về một bệnh nhân làm việc tại một nhà máy, nơi pho mai xanh được sản xuất bằng cách sử dụng. Penicillium roqueforti. Triệu chứng là ho, khó thở, khó chịu, thể tích phổi giảm. Penicillium Roqueforti có thể gây ra phản ứng dị ứng như sổ mũi, ho, hắt hơi, nổi mề đay, hoặc bệnh suyễn.. Không có bằng chứng để kết luận độc tính roquefortine có khả năng gây ung thư. V. ỨNG DỤNG Sản xuất poliscchacarides, sản xuất hợp chất thứ cấp,…. 1. Sản xuất Exo-polygalacturonase (Exo-p): Dựa trên môi trường kem dầu bí ngô (PuOC ) kết hợp bổ sung lúa mì, cám (WB), và vi nấm mốc Penicilium roqueforti, nhằm thực hiện quá trình lên men bề mặt bán rắn SSF. 14 Hình trên cho thấy : Khả năng tổng hợp của Penicilium roqueforti sản sinh Exo- P, trên môi trường PuoC. Exo-P tăng từ đầu quá trình và đạt những giá trị tối đa là 1452U/g.d.w. 2. Sản xuất protease trong sản xuất phomat xanh, Roquefort, Stilton Khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa và protein 2.1. Phomat xanh(Stilton): Stilton là một pho mát kem với làn vân màu xanh, và nó có một hương vị đặc trưng, với khả năng chống oxy hoá. Stilton là một loại phomat làm từ sữa tiệt trùng. Sữa được bổ sung nấm mốc roqueforti, thêm muối và không ép khuôn để sản phẩm có kết cấu lỏng lẽo, để nấm mốc phát triển tự nhiên ăn lan thành các đường vân trước khi thành phẩm. 15 Phomat xanh 2.2. Roquefort Roquefort là sản phẩm lên men từ sữa cừu hoà với nước nóng ở 32o C , sản phẩm đông tụ nhờ các enzyme protease( trong đó một là pepsin), giai đoạn này người ta bổ sung vi nấm Penicilium roqueforti Phô mai này sau đó tăng trưởng và phát triển ở nhiệt độ thích hợp là 8oC, với điều kiện nhiệt độ. Roquefort sinh trưởng thoát hơi CO2 trong quá trình lên men. 16 Sản phẩm sau đó được đóng gói và bảo quản trong điều kiện thiếu O 2. Hình ảnh sản phẩm Roquefort PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH I. XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG 1. Phân tích định tính Quy trình: 17 Đồng nhất mẫu trong SDB thành độ pha loãng 10-1, ủ ở 30o trong 17 ngày ↓ Cấy canh trường có mốc mọc lên đĩa SDA, MEA hay PDA ủ ở 30o C trong 7 ngày ↓ Kết luận có hay không có nấm mốc phát triển. Sơ đồ: quy trình định tính nấm mốc Thuyết minh quy trình: - Môi trường sử dụng: SDB: Sabouraud’s Dextrose Broth . Thành phần môi trường gồm có: Polypeptone hoặc neopeptone :10g Dextrone: 40 g Nước cất: 1000ml. ph= 5,8. SDA: như môi trường SDB trên nhưng thêm 15- 20g agar. Phân phối vào đĩa petri sau khi hấp khử trùng. MEA: malt extract agar Cao malt 30g Agar 20g Nước cất 1000ml Hấp khử trùng, phân phối vào đĩa petri. pH= 5,5 18 Hình ảnh:a) khuẩn lạc sau một tuần trên. Hình c,d: miếng phó mát Roquefort trong đó khuôn được thấy như tĩnh mạch sẫm màu (màu xanh) trong phô mai. PDA: Potato Dextrose Agar. Thành phần: 19 Potato infusion 200g Dextrone 20 g Agar 20g Nước cất 1000ml. Môi trường trên chỉ xác định nấm mốc, muốn định danh Penicilium roqueforti cần môi trường CYA(môi trường thạch Czapek Yeast Autolysate), YES. Khuẩn lạc phát triển trên môi trường CYA: làm môi trường chuyển từ màu vàng kem sang màu nâu nhạt. Khuẩn lạc có màu xanh nhạt.Trên môi trường YES: khuẩn lạc làm môi trường từ vàng nhạt sang màu nâu. Khuẩn lạc có màu xanh lục. Penicilium roqueforti trên CYA 2. Penicilium roqueforti trên YES Phân tích định lượng: Quy trình: 20