Tài liệu PCR và giải trình tự

PCR và giải trình tự Giải trình tự là gì? DNA là cơ sở hóa học của gen. Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai mạch đơn được cấu tạo từ 4 loại nucleotide khác nhau nhờ các base của chúng, đó là: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotide này nối kết liên tiếp với nhau theo một thứ tự xác định. Giải trình tự của gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide này trên phân tử DNA. Các phương pháp giải trình tự gene 1. Phương pháp hóa học giải trình tự DNA Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh được một phương pháp hóa học để có thể giải trình tự một đoạn DNA. Nguyên tắc của phương pháp này là: (1) Trước hết là phải đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P); (2) Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA. Ví dụ, dimethylsulphate để biến đổi Guanine bằng các thêm một gốc methyl ở vị trí nitrogen thứ 7 (N7), hydrazine làm biến đổi Thymine và Cytosine, hydrazine và NaCl để làm biến đổi Cytosine, acid để làm biến đổi Guanine và Adenine, NaOH để làm biến đổi Adenine và Cytosine với Adenine ưu tiên hơn Cytosine. Như vậy trong giai đoạn này, phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và trong mỗi ống nghiệm, DNA được xử lý với một lượng rất giới hạn của một trong các chất hóa học nêu trên để mỗi ống nghiệm chỉ có chứa các đoạn DNA mà trên mỗi đoạn DNA này chỉ có một vị trí nucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi; (3) Các nucleotide bị biến đổi này sẽ bị lấy ra khỏi mạch khung đường-phosphate (sugar-phosphate backbone) của đoạn DNA và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn có một đầu đánh dấu 32P và một đầu bị mất phân tử base vì phân tử này đã bị lấy ra khỏi mạch khung (hình 37). (4) Thực hiện điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tính để các mạch đơn trong mẫu di chuyển trong gel không bị biến đổi trong quá trình điện di. Nhờ đó, sau khi hoàn tất điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng tại các vị trí khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc suốt chiều dài của gel. Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các vị trí dừng 81 lại của các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này đều bị đánh dấu phóng xạ do các mạch đơn đều có một đầu được đánh dấu bằng 32P. Từ các vạch trên phim xạ ký tự ghi này (autoradiography), có thể đọc được trình tự của các nucleotide của đoạn DNA (hình 38). Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert trên thực tế không phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm, trong đó khó nhất là phải xác định được nồng độ giới hạn nhất của các chất hóa học sao cho khi xử lý mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng với mỗi vị trí của base bị biến đổi thì sẽ có một mạch đơn có đầu đánh dấu 32P được tách ra. Chính vì sự phức tạp này, phương pháp Maxam Gilbert hiện nay ít được sử dụng, mà thay vào đó các nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội hơn. Mạch đơn DNA 32 P A p G p C p T p T p T p G p A p G p G p A p C p G p A.. 32 Các mạch DNA đơn có đầu bị đánh dấu 32P P P 32 P 32 P 32 P 32 Hình 37: Các mạch đơn có một đầu đánh dấu với 32P và một đầu base Guanine bị lấy khỏi mạch khung do bị biến đổi. Các mạch đơn này có chiều dài ngắn khác nhau tùy thuộc vào vị trí của Guanidine trên đoạn DNA. 3’ 5’ GCCCACTTCAGAAGAAAAAGG C T+G G A>C Hình 38: Hình xạ ký tự ghi trên phim nhạy tia X một gel polyacrylamide sau khi đã điện di. Các vạch là vị trí các mạch đơn bị dừng lại sau điện di. Các vị trí này gần hay xa khởi điểm là tuỳ kích thước của mạch đơn dài hay ngắn khác nhau. Từ các vạch này, đọc trình tự của đoạn DNA trong mẫu. 82 2. Phương pháp enzyme giải trình tự DNA Phương pháp enzyme được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm 1977, và ngày hôm nay phương pháp này càng ngày càng được hoàn thiện và thực hiện dễ dàng tại các phòng thí nghiệm. Nguyên tắc chung của phương pháp này có thể tóm tắt như sau: CATACGTGG CCTTACG mồi GGAATGC CATACGTGG thêm d*NTP, DNA polymerase, ddATP thêm d*NTP, DNA polymerase, ddCTP CGTAAGG*C*CdA CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA CCTTACG GGAATGC thêm d*NTP, DNA polymerase, ddGTP thêm d*NTP, DNA polymerase, ddTTP CGTAAGG*C*C*A*CdG CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG CGTAAGGdC CGTAAGG*CdC CGTAAGG*C*C*AdC CGTAAGG*C*C*A*C*GdT CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT điện di trên gel CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA CGTAAGG*C*C*A*C*GdT CGTAAGG*C*C*A*CdG CGTAAGG*C*C*AdC CGTAAGG*C*CdA CGTAAGG*CdC CGTAAGGdC Hình 39: Chiều điện di Phương pháp Enzyme giải trình tự DNA. Đoạn DNA được chèn vào một vector tại một vị trí biết rõ trình tự, nhờ đó có thể tổng hợp được các mạch đơn có một đầu là mồi, một đầu là các nucleotide 35 tận. Trong hình các nucleotide đánh dấu * là các nucleotide được dánh dấu S, nhờ vậy các mạch đơn được đánh dấu. 83 Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ. Chuyển thể tức là đưa các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vi khuẩn để nhân bản các vector này thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do. Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng rất giới hạn các nucleotide tận (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP, có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A, T, C và G). Phản ứng được thực hiện trong 4 ống, và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, men DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì dNTP. Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này chính là nơi để dNTP kế tiếp được gắn vào. Nhờ vậy trong ống phản ứng A C G T T 3’ C G C A G T C C T A có các mạch đơn DNA có các chiều dài khác G C nhau tương ứng với các vị trí trình tự các T T A nucleotide trên đoạn DNA gốc (hình 39). G C Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính. Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng G G 5’ Hình 40: Hình xạ ký tự ghi một kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide. Từ kết quả này, đọc được trình tự DNA đồng vị phóng xạ 32P hay 35S thì sau khi điện di, cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi, và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn DNA (hình 40). 84 3. Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer) Các phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương pháp enzyme, nhưng khi làm giải trình tự thì thường dùng các máy tự động chứ không dùng kỹ thuật xạ ký tự ghi như trước đây. Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chính yếu, đó là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện Mắt cảm quang Tia LASER A G C T T A C G G A C T A A TGC Màu 1 Màu 2 Máy tính Màu 3 Màu 4 Th i gian Hình 41: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tư dùng bản gel polyacrylamide. Máy gồm hai phần: phần điện di gel polyacrylamide, phần phát hiện các vạch điện di. Các vạch điện di được các con mắt cảm quang phát hiện khi đi qua chùm tia laser và phát sáng lên. Tín hiệu được mắt cảm quang truyền về máy tính để hiển thị thành các đỉnh cường độ sáng 85 di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang CATACGTGG CCTTACG GGAATGC ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng thêm dNTP, DNA polymerase, ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ CGTAAGGCCdA CGTAAGGCdC CGTAAGGCCACdG CGTAAGGCCACGTdA CGTAAGGdC CGTAAGGCCACGTA TdG CGTAAGGCCAdC CGTAAGGCCACGdT CGTAAGGCCACGTAdT sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA (hình 41). Với các máy thế hệ mới sau này, người ta có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉ *CGTAAGGCCACGTA TdG *CGTAAGGCCACGTAdT *CGTAAGGCCACGTdA *CGTAAGGCCACGdT *CGTAAGGCCACdG *CGTAAGGCCAdC *CGTAAGGCCdA *CGTAAGGCdC *CGTAAGGdC Chiều điện di Hình 42: Với các ddNTP đánh dấu hùynh quang khác nhau, các đọan trình tự tận cùng ở đầu 5’ sẽ được đánh dấu bằng 4 màu hùynh quang khác nhau tương ứng với nuleotide tận là A, hay T, hay C hay G. Chính nhờ vậy không cần phải thực hiện phản ứng giải trình tự trong 4 ống phản ứng. trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây (hình 42). Nếu dùng diện di mao quản thì tùy thuộc vào số mao quản có thể chạy một lần mà người làm thí nghiệm có thể có số mẫu cho mỗi lần chạy nhiều hay ít. Hình 43 là sơ đồ khối minh họa cho một giải trình tự 8 mao quản (CEQ8000, hay CEQ8800). Tùy thuộc vào qui mô của phòng thí nghiệm cùng với số mẫu giải trình tự mà phòng thí nghiệm có thể trang bị giải trình tự ít hay nhiều mao quản. Ví dụ với ABI thì có nhiều loại: chỉ 1 mao quản, 4 mao quản, 16 mao quản, 48 mao quản, rồi 96 mao quản. Phòng thí nghiệm R&D của công ty Nam Khoa trước đây nhu cầu giải trình tự không nhiều nên chỉ trang bị CEQ8000 có 8 mao quản (hình 44). Nhưng nay 86 do nhu cầu nghiên cứu và dịch vụ ngày càng nhiều nên đã trang bị thêm ABI 3130XL có đến 16 mao quản (hình 44). Các thế hệ máy về sau ngày càng có những chương trình đi kèm để chẳng những có thể hiển thị tự động các ký tự hoá học của trình tự DNA mà còn giúp các nhà nghiên cứu có thể: (1) Phát hiện các chi tiết cần thiết trên trình tự như mã khởi đầu, mã kết thúc, vùng đọc mở (ORF: Open Reading Frame), trình tự đặc hiệu cho các enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme), các dấu ấn di truyền...mà các chi tiết này rất cần thiết để lập bản đồ gen...(2) Phiên dịch trình tự trong vùng đọc mở (tức là vùng trình tự có ý nghĩa) thành trình tự acid amin của một protein, nhờ đó có thể xác định, phỏng đoán, hay làm cơ sở ban đầu để hiểu được chức năng của gen...(3) Tự động so sánh trình tự DNA trong thí nghiệm hay một trình tự DNA nạp vào máy, hay có thể trình tự acid Cảm quang amin của protein, với các Cực [+] trình tự khác đã có trong ngân hàng dữ liệu để phát hiện Mao quản được sự tương đồng với trình tự đã biết, nhờ đó làm cơ sở để xác định gen và chức năng gen... Laser Cực [-] Điện thế cao Hình 43: Sơ đồ khối một máy diện di mao quản dùng giải trình tự DNA Hình 44: Máy giải trình tự CEQ8000 có 8 mao quản của Beckman Coulter và ABI 3130XL có 16 mao quản của Applied Biosystem được trang bị tại phòng thí nghiệm R&D của công ty Nam Khoa 87 PCR là công cụ giúp hoàn thiện và mở rộng phổ áp dụng kỹ thuật giải trình tự PCR đã đóng góp rất nhiều vào công nghệ giải trình tự làm cho công nghệ giải trình tự ngày càng dễ dàng hơn và thuận tiện hơn. Không chỉ vậy PCR còn làm cho giải trình tự có nhiều ứng dụng hơn không chỉ trong nghiên cứu mà cả trong chẩn đoán nữa. Trước khi có PCR thì người ta chỉ có thể giải trình tự các đoạn gene được cô lập và chèn vào plasmid vì chỉ có như vậy thì mới có thể nhân bản được đoạn gene muốn giải trình tự thành nhiều bản sao với số lượng đủ để chạy được phản ứng giải trình tự. Ngoài ra, enzyme polymerase cũng là loại enzyme không chịu nhiệt nên phản ứng giải trình tự chỉ thực hiện ở 37oC, do vậy mà vấn đề tối ưu các thành phần của phản ứng rất là khó đồng thời hiệu quả của phản ứng giải trình tự cũng không cao. Từ khi có sự ra đời của kỹ thuật PCR thì kỹ thuật giải trình tự cũng có những tiến bộ rất vượt bực. Chỉ cần dùng PCR là có thể nhân bản đoạn gene muốn giải trình tự thành hàng tỷ bản sao hoàn toàn giống hệt nhau và sản phẩm khuếch đại này có thể đưa vào giải trình tự trực tiếp mà không cần phải chèn vào một plasmid giải trình tự nữa. Sự phát minh ra kỹ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm bằng PCR cũng giúp cho việc cải tiến phản ứng giải trình tự kém hiệu quả trước đây trở nên hiệu quả hơn nhờ áp dụng enzyme polymerase giải trình tự bền với nhiệt độ để phản ứng giải trình tự được thực hiện qua các chu kỳ nhiệt giống hệt PCR, mà ngày nay chúng ta gọi là phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự. Với phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự thì hiệu quả phản ứng tốt hơn rất nhiều, đồng thời tối ưu hóa các thành phần của phản ứng cũng dễ dàng hơn rất nhiều. Có thể nói chính sự ra đời và hoàn thiện kỹ thuật PCR đã giúp tăng tốc kỹ thuật giải trình tự không những trong vấn đề hoàn thiện nó, mà cả trong vấn đề phạm vi áp dụng. Giải trình tự bộ gene người 1. Làm thế nào giải trình tự bộ gene người Giải trình tự bộ gen người tức là giải trình tự toàn bộ thứ tự sắp xếp các nucleotide A, T, C, và G của DNA trong 23 cặp nhiễm sắc thể tế bào người. Dự án giải trình tự bộ gen người được Tiến Sĩ James Watson, cha đẻ của phát hiện cấu trúc DNA, đề ra từ giữa thập niên 1980. Đến tháng 10 năm 1990, dự án được ra đời với kinh phí 3 tỷ Mỹ kim do HGP (Human Genome Project) của Viện Quốc Gia Y Tế Hoa Kỳ lãnh đạo cùng với sự tham gia của nhiều trung tâm nghiên cứu bộ gen người của nhiều quốc gia 88 trên thế giới. Do tiên đoán giá trị kinh tế mang lại từ việc giải mã thành công bộ gen người sẽ rất lớn, nên đã có một số công ty sinh học chuyên về bộ gen người đã được hình thành. Sự nhập cuộc của các công ty tư nhân này đã tạo nên một bầu không khí thi đua cho việc khai phá bí mật về bộ gen của loài người chúng ta, càng gần đến những ngày đến đích càng cực kỳ ngoạn mục. Trong cuộc chạy đua này, nhờ đã áp dụng một phương pháp cực kỳ độc đáo kết hợp giữa công nghệ PCR, công nghệ giải trình tự DNA với công nghệ tin học, nên chỉ với kinh phí khoảng 200 triệu mỹ kim, Tiến Sĩ Crag Venter của Celera Genomics trở thành người dẫn đầu thành công nhất trong việc giải trình tự được gần như hoàn toàn bộ gen người. Cái khó khăn của việc giải trình tự bộ gene người là không thể nào tách từng đại phân tử DNA của từng nhiễm sắc thể rồi đem giải trình tự đại phân tử DNA nguyên vẹn này. Các nhà khoa học của HGP cũng như các trung tâm khác trên thế giới nghiên cứu về bộ gen người thường cắt các đại phân tử DNA của nhiễm sắc thể một cách định hướng theo bản đồ di truyền, rồi đem giải trình tự các đoạn cắt DNA này, và cuối cùng tìm cách ghép nối chúng lại với nhau cho đúng vị trí của chúng trên đại phân tử DNA. Phương pháp này đòi hỏi phải tốn nhiều thời gian và công sức vì có nhiều khi các đoạn cắt DNA quá lớn, rất khó giải trình tự cũng như khó cho kết quả giải trình tự chính xác. Do đó, với mỗi một đoạn DNA các nhà khoa học phải thực hiện giải trình tự ít nhất là 7 lần để đảm bảo độ lặp lại. Chính vì vậy, với cách tiếp cận này, nhiều vị trí trên các đại phân tử DNA vẫn không thể giải trình tự được mà từ đó các nhà khoa học của HGP có thể hoàn tất việc xếp đúng vị trí các đoạn DNA đã giải trình tự trên đại phân tử DNA của nhiễm sắc thể. Tiến sĩ Crag Venter đã thực hiện một phương pháp giải trình tự bộ gen người một cách hoàn toàn khác hẳn (hình 45). Trước hết ông cho tách chiết toàn bộ DNA nhiễm sắc thể tế bào người rồi phá bung một cách không định hướng các đại phân tử DNA thành các mảnh DNA nhỏ hơn. Đem giải trình tự tất cả các mảnh DNA nhỏ này. Cuối cùng dùng những máy điện toán cực mạnh mà ông đã hợp tác với công ty ABI chế tạo ra, dò tìm các đầu trùng lặp của các mảnh DNA nhỏ này để lắp nối vào đúng các vị trí của chúng trên đại phân tử DNA của nhiễm sắc thể. Chính nhờ áp dụng chiến lược giải trình tự này mà Celera Genomics đã giải trình tự rất nhanh các mảnh DNA, chỉ cần lặp lại cho mỗi mảnh DNA có 5 lần, và đã xếp đúng gần như hầu hết vị trí của các mảnh 89 DNA đã giải trình tự trên đại phân tử DNA của nhiễm sắc thể. Hơn thế nữa, TS. Crag Venter cũng tuyên bố công ty đã triển khai một kỹ thuật mới có thể làm cho phương pháp giải trình tự bộ gen của công ty, vốn dĩ đã là phương pháp nhanh nhất rồi, trở thành nhanh hơn nữa. Cuối năm 2000, Celera Genomics đã hoàn thành việc giải trình tự bộ gen của chuột với 2.3 tỷ “ký tự hóa học” trong đó có rất nhiều tương đồng với bộ gen người, nhờ vậy sẽ giúp các nhà khoa học dễ dàng hơn trong việc truy tìm các chức năng của các gen. 2. Kết quả giải trình tự bộ gene người Sau gần 10 năm nghiên cứu thực hiện với những năm càng về sau càng sôi động không khí thi DNA từ mhiễm sắc thể được phá bung thành nhiều mãnh nhỏ đua do sự nhập cuộc của các công ty tư nhân, ngày 26 tháng 6 năm 2000, tại Tòa Bạch Ốc với sự Các mãnh DNA nhỏ được giải trình tự hiện diện của Tổng Thống Hoa c ag Kỳ Bill Clinton, hai khoa học gia cca gc a diện cho Celera Genomic và Tiến Institute of Health) công bố một g g cg g c g ga g c a g a gc ga g t g ag g a c ag c Các mãnh DNA nhỏ được chương trình phân tích tự động tìm các đầu trùng lặp, nhờ đó tái hiện được trình tự của đại phân tử DNA Sĩ Francis Collins đại diện cho Project) của NIH (NIH: National t t t cc c g a g c g g cg g Mỹ là Tiến Sĩ Crag Venter đại HGP (HGP: Human Genome g ca g a ga c a g c g g ag c c a gc a t g ga g c a g g g c gg c cc a g c c a g g ca t t t tgtac c g a g c g g cg g a g a c a gc g t g ag g ca gc a g ca t t t c g gg c g g a g c a c ga gc g g c ccgtcaaccggagtta cách long trọng là chương trình giải trình tự bộ gen người đã acgttct hoàn tất. Đây chính là một thời khắc lịch sử cực kỳ quan trọng và đáng nhớ của nhân loại, đánh dấu ngày nhân loại đã có trong tay một bản đồ sinh học cần thiết để bước vào kỷ nguyên mới với nhiều hứa hẹn các thành tựu vĩ Hình 45: Phương pháp giải trình tự bộ gen người của công ty Celera Genomics: trước hết tách chiết toàn bộ DNA của nhiễm sắc thể tế bào người, sau đó phá tung DNA thành các mảnh nhỏ, giải trình tự tất cả các mảnh nhỏ này, cuối cùng nhờ chương trình vi tính cực mạnh để nối kết các đoạn DAN nhỏ này lại với nhau bằng cách dò tìm các đầu trùng lặp nhờ vậy tái hiện được mạch DNA nguyên thủy 90 đại về sinh y học trong tương lai. Dù thành công của các nhà khoa học giải trình tự được 3.1 tỷ các “ký tự hóa học” làm nên bộ gen người đã được ví như sự kiện lịch sử con người bước lên mặt trăng (ngày 26 tháng 7 năm 1969, từ khoang đổ bộ phi thuyền Apollo, Neil Armstrong bước xuống đi dạo trên mặt trăng và đánh dấu thời điểm con người thực hiện được hoàn toàn ước mơ đã từng ao ước bấy lâu: khắc dấu chân mình trên bề mặt chị Hằng), nhưng đây chưa phải là thời điểm mà con người đã toại nguyện được ước mơ hiểu biết tường tận được bộ gen của mình. Thật sự cho đến thời điểm đó các nhà khoa học ở Công ty Celera Genomic hãy còn chưa giải trình tự được 3% bộ gen người, tức khoảng 150 triệu, và công việc này đòi hỏi phải từ 1 đến 2 năm nữa mới có thể hoàn tất vì 3% còn lại này nằm trên phần khó giải trình tự nhất. Còn HGP thì thành công ít hơn, hãy còn nhiều đoạn trình tự của bộ gen mà các nhà khoa học của HGP chưa giải được và cũng có nhiều đoạn trình tự đã giải được nhưng họ vẫn chưa sắp xếp vào đúng vị trí. Ngoài ra, cho dù các nhà khoa học có giải trình tự được một cách trọn vẹn bộ gen con người, thì cuốn sách của đời sống (the book of life) này hãy còn chưa đọc được, như Gerald Rubin, Phó Giám đốc Nghiên Cứu Y Sinh Học của Viện Y Học Howard Hughes giải thích: “Cuốn sách được viết bằng một ngoại ngữ rất phức tạp, cần phải có một thời gian dài chúng ta mới hiểu được”. Thật vậy, có thể tưởng tượng là nếu các trình tự của bộ gen người được in ra thành sách thì sẽ cần phải khoảng 200 cuốn và mỗi cuốn dày phải 500 trang. Có 3000 trang nằm rải rác trong 200 cuốn sách trên là có ý nghĩa tức là có gen, mà cho đến hiện nay chỉ mới có một số ít trang trong 3 ngàn trang này là khoa học đã đọc được tức là xác định được gen. Hãy còn vài trang (khoảng 3%) chưa viết xong và những trang này là những trang khó viết nhất vì thuộc những vùng khó giải trình tự nhất trong bộ gen người. Cho đến tháng 4 năm 2003, các trang khuyết này đã được các nhà khoa học viết hoàn tất. Tuy vậy, một việc rất lớn hiện đang đặt ra trước mắt các nhà khoa học đó là phải xác định được các trình tự nào là gen và chức năng của các gen này. Chỉ có 3% của bộ gen người là mang gen tức là mang trình tự có ý nghĩa và hiện nay các nhà khoa học cũng chưa biết chính xác là thật sự có bao nhiêu gen trong bộ gen người. Câu trả lời phỏng chừng nhất là từ 28.000 đến 140.000 gen, và gần đây nhất có lẽ là đang gần đến con số chính xác hơn, đó là 30.000 gen. Trong khoảng 30.000 gen này, các nhà 91 khoa học hiện chỉ biết được chức năng của khoảng 10.000 gen, hãy còn 20.000 chưa biết chức năng của chúng. Đây chính là một cuộc đua mới cũng hứa hẹn đầy sôi động vì kết quả từng chặng một của cuộc đua, tức kết quả của việc xác định được chúc năng của từng gen, đều hứa hẹn những áp dụng cực kỳ ngoạn mục và đầy triển vọng trong sinh học cũng như y học. 3. Giải trình tự bộ gene người – cuộc đua chưa kết thúc Gen chính là trình tự các nucleotide trong chuỗi DNA chỉ huy được sự tổng hợp một protein. Chính vì vậy xác định được chức năng của một gen tức là xác định được protein mà gen tổng hợp có cấu trúc như thế nào và có nhiệm vụ gì trong cơ thể sống. Sau kết quả giải trình tự bộ gen người, hiện nay các nhà khoa học đang có nhiều chiến lược để có thể nhanh chóng phát hiện chức năng của các gen trong bộ gen người. Chúng tôi xin trình bày ra đây ba trong số những chiến lược đó. Dùng PCR để tổng hợp các gen Clone vào các vector (1) Nhờ kết quả giải trình tự bộ gen người, các nhà khoa học sẽ nhanh chóng xác định các trình tự Đưa vào các hệ thống tế bào biểu hiện mang gen. Với các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như kỹ thuật Lập thư viện protein PCR, các nhà khoa học sẽ dễ dàng nhân bản các gen này trong ống Thử nghiệm trên các loại tế bào đích nghiệm rồi dòng hóa chúng vào các vectơ để sau đó nhờ các hệ tế bào biểu hiện để biểu hiện các protein. Với cách này các nhà khoa học sẽ nhanh chóng thành lập được một Hình 46: Chiến lược tạo thư viện protein để đò tìm chức năng của gen, tóm tắt là từ gen tổng hợp các protein, trữ trong thư viện protein, rồi thử trên các hệ thống tế bào đích để phát hiện chức năng của protein, từ đó biết được chứng năng của gen. thư viện các protein của các gen có trong bộ gen người. Vấn đề tiếp theo là phải xác định các protein trong thư viện protein là có chức năng gì? Để biết được chức năng của protein trong thư viện, các nhà khoa học sẽ thử nghiệm các protein này hệ thống các loại nuôi cấy tế bào để tìm hiểu mối giao tiếp giữa protein thử nghiệm với tế bào đích, 92 nhờ đó xác định tế bào đích nào có phản ứng với protein thử nghiệm, và nhờ vậy sẽ biết được chức năng protein để biết được chức năng của gen. (hình 46). (2) Giải trình tự bộ gen của động vật hữu nhũ như dã nhân (rất giống bộ gen người) hay chuột, đây là những bộ gen của các động vật có nhiều tương đồng với bộ gen người, nhưng lại trên các động vật mà các nhà khoa học rất dễ làm thí nghiệm. Trên bộ gen động vật này, các nhà khoa học sẽ dễ dàng phát hiện các gen, và các chức năng của gen thông qua sự thay đổi hoặc biểu hiện của một tính trạng nào đó của động vật thí nghiệm một khi các nhà nghiên cứu dùng các kỹ thuật sinh học Hình 47: Hình dạng của phân tử kháng thể được vi tính hóa phân tử gây đột biến hay làm knock-out ngay trên những vùng mang gen của bộ gen. Một khi đã xác định được gen và chức năng của một gen trên động vật thí nghiệm, các nhà nghiên cứu sẽ dễ dàng truy tầm và phát hiện gen và chức năng của gen này trên bộ gen người nhờ phát hiện sự tương đồng về trình tự trong gen người với gen của động vật thí nghiệm. (3) Chúng ta biết rằng một protein được tổng hợp từ gen hoạt động như một vai trò cấu trúc hoặc vai trò chức năng là nhờ hình dáng của nó với các hốc nhỏ hay các nếp gấp. Chính vì vậy cho nên dù một gen có được giải mã và biểu hiện được một protein, thì cũng chưa thể xác định được chức năng của protein này nếu chưa biết được các hình dáng của nó. Chính vì vậy mà Viện Quốc Gia Khoa Học Y Khoa Tổng Quát tại Hoa Kỳ đang chi một khoảng 20 triệu đô la để thành lập các trung tâm Proteomics, là các trung tâm chuyên nghiên cứu và lưu trữ các cấu trúc và hình dáng được vi tính hóa (hình 47) của các protein có trong thiên nhiên. Các viện Proteomics như vậy cũng đang và sẽ thành lập tại các nước khác. Các nhà khoa học hy vọng rằng trong vòng 10 năm tới đây, các viện proteomics sẽ lưu trữ được hình dáng của gần 10.000 protein có trong thiên nhiên. Con số này dù hãy còn rất nhỏ so với một số lương khá lớn các protein thực sự có trong thiên nhiên, nhưng các nhà khoa học cũng hy vọng rằng thư viện này đủ sức bao gồm tất cả hình dạng của tất cả các protein có liên quan đến sinh học và y học, vì các protein khác không có trong danh sách cũng chỉ là các biến thể hay 93 các đồng dạng với các protein có trong danh sách mà thôi. Nhờ các trung tâm proteomics và thư viện các hình dạng protein, các nhà nghiên cứu chắc chắn sẽ dễ dàng hơn trong xác định các chức năng của gen. 4. Việt Nam có thể tham gia vào cuộc đua này không? Hiện nay các nhà khoa học đang cố gắng nghiên cứu khai phá các bí mật trong cuốn sách đời sống ghi chép đầy đủ trình tự bộ gen người với nhiều triển vọng sẽ có các ứng dụng cách mạng trong sinh học, y học, cũng như các lĩnh vực khoa học khác và sẽ đưa đến nhiều tiến bộ mới cho loài người trong kỷ nguyên mới này. Các nhà ysinh học của chúng ta hoàn toàn có thể tham gia trong cuộc đua này, vì theo chúng tôi thì sinh học phân tử đối với các quốc gia thu nhập thấp có thể coi như là một ngành khoa học tiểu thủ công nghiệp hiện đại. Tiểu thủ công nghiệp vì không nhất thiết phải có các máy móc cực kỳ hiện đại và tốn kém mà vẫn có thể thực hiện được các kỹ thuật bằng các thiết bị không quá đắt tiền. Hiện đại vì nhà nghiên cứu thực hiện kỹ thuật dựa trên các kiến thức hiện đại với các kết quả hoàn toàn có thể có đóng góp lớn vào kho tàng kiến thức hiện đại của nhân loại. Vấn đề chính là chúng ta phải có chuẩn bị như thế nào và phải có chiến lược tham gia vào cuộc đua như thế nào. Để chuẩn bị, quan trọng nhất là chúng ta phải cố gắng xây dựng và đào tạo trong cũng như ngoài nước đội ngũ các nhà nghiên cứu y sinh học có trình độ và bản lĩnh ngang tầm với thế giới. Các nhà nghiên cứu của chúng ta không chỉ phải có kiến thức và kỹ năng về chuyên môn sinh-y học mà còn phải có khả năng tiếp cận để khai thác được kho tàng kiến thức cũng như các dữ liệu ngày càng cập nhật trên mạng internet. Ngoài ra, chúng ta phải tránh tình trạng đào tạo các nhà nghiên cứu nhưng lại không chuẩn bị cho họ các điều kiện cũng như phương tiện làm việc. Chính vì sự thiếu thốn điều kiện cũng như phương tiện làm việc mà các nhà nghiên cứu của chúng ta dù có trình độ và bản lĩnh đến đâu cũng sẽ thui chột dần nhiệt huyết cũng như khả năng theo thời gian, và dần dần tình trạng chảy máu chất xám trong cũng như ngoài nước sẽ không thể tránh khỏi. Về chiến lược, thì có lẽ chúng ta cũng cố gắng tham gia cuộc đua với những đích nhắm là giải quyết và khai thác những đặc thù trong nước. Chẳn hạn khai thác nghiên cứu cơ chế ở mức độ sinh học phân tử tác động của các dược liệu trong nước bằng cách xây dựng các mô hình thí nghiệm ex-vivo trên các cấy tế bào để phát hiện sự cảm ứng 94 biểu hiện gen khi cho các hệ thống nuôi cấy tế bào này tiếp cận với các trích phân của dược liệu. Phát hiện các cơ chế tác động của dược liệu ở mức độ sinh học phân tử, chắc chắn chúng ta sẽ khai thác được các nguồn dược liệu quí mà chúng ta vốn có sẵn trong nước. Ngoài ra, dân tộc Việt của chúng ta là một dân tộc khá thuần nhất, bên cạnh đó chúng ta cũng có những dân tộc ít người sống rất tập trung và chưa hề bị lai trộn, đây chính là cơ sở cho các nghiên cứu về sự phân bố các gen cũng như các mã di truyền cho các nghiên cứu ứng dụng sau này để phát hiện, chữa trị hoặc phòng ngừa các bệnh lý di truyền. Nhân loại đang bước vào thiên niên kỷ 21 với hành trang mang theo là các tiến bộ vượt bậc ở nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau, trong đó có khoa học Y học và Sinh học. Một hành trang cần yếu nhất cho một cuộc sống dễ dàng hơn và tốt đẹp hơn là cuốn sách của đời sống với hầu như toàn bộ trình tự của bộ gen người mà các nhà khoa học mới vừa kịp hoàn tất. Việc khai thác cuốn cẩm nang sinh học cần yếu nhất này của nhân loại đòi hỏi một sự hợp tác đa ngành cũng như chuyên ngành. Chính vì vậy nên chúng tôi cho rằng chúng ta cũng không thể bỏ qua yếu tố hợp tác và học hỏi: chúng ta phải hợp tác và học hỏi từ bạn bè quốc tế, và quan trọng nhất là phải biết học hỏi và biết hợp tác giữa chúng ta với nhau. Ứng dụng công nghệ giải trình tự tại phòng thí nghiệm NK-Biotek Phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã ứng dụng khá thành công kỹ thuật giải trình tự vào các dịch vụ chẩn đoán và nghiên cứu. Dưới đây xin đưa ra một số thành tựu tiêu biểu. 1. Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi khuẩn Nhờ phát hiện được một cặp mồi mà sau đó được đặt tên là NK 16s-F và NK 16s-R khuếch đại được đoạn DNA dài 527 bps chứa các trình tự giúp phân biệt giống và loài các vi khuẩn, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã xây dựng thành công qui trình PCR cho gene 16s rDNA và qui trình giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR này để định danh vi khuẩn. Thành công này đã giúp phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của Nam Khoa thực hiện được khá nhiều ứng dụng trong các xét nghiệm dịch vụ và nghiên cứu. 95 a. Ứng dụng trong xét nghiệm vi sinh lâm sàng định danh vi khuẩn kị khí Vi khuẩn kị khí là các vi khuẩn chỉ có thể tăng trưởng trong điều kiện khí trường không có oxygene phân tử (O2). Vi khuẩn kị khí có thể là các vi khuẩn có lợi được sử dụng trong công nghệ vi sinh, tuy nhiên về mặt y học rất có nhiều loài vi khuẩn kị khí là các tác nhân nhiễm khuẩn nội sinh hay ngoại sinh. Bệnh lý nhiễm khuẩn kị khí rất đa dạng, từ các nhiễm khuẩn tại chỗ kết hợp với các vi khuẩn không kị khí, hay các nhiễm khuẩn hệ thống, hay các nhiễm khuẩn đặc hiệu. Do đa dạng như vậy nên việc xác định một nhiễm khuẩn kị khí về mặt lâm sàng không phải dễ dàng. Trong khi đó xét nghiệm vi sinh lâm sàng tại các phòng thí nghiệm thường bỏ hẳn xét nghiệm vi khuẩn kị khí vì gặp phải nhiều trở ngại về kỹ thuật như là: (1) Có được phương tiện chuyên chở bệnh phẩm sao cho giữ được bệnh phẩm luôn ở điều kiện kị khí cho đến khi đến được phòng thí nghiệm. (2) Tạo khí trường kị khí để nuôi cấy phân lập được vi khuẩn kị khí từ các bệnh phẩm. (3) Định danh cho được vi khuẩn kị khí. (4) Làm được kháng sinh đồ vi khuẩn kị khí. Trong các trở ngại trên, trở ngại khó giải quyết nhất là vấn đề định danh vi khuẩn kị khí phân lập được từ các bệnh phẩm. Có nhiều bộ thử nghiệm như API 20A của BioMerieux, RapIDTM ANA II của Oxoid, PRAS II (Scott), AN Ident (Analytab), ANA card (Vitek)...có sẵn trên thị trường để cho các phòng thí nghiệm chuyên dùng cho định danh vi khuẩn kị khí. Tuy nhiên các bộ thử nghiệm này khó có sẵn tại Việt Nam vì nhu cầu không nhiều. Hơn nữa các bộ thử nghiệm này cũng có nhiểu hạn chế như tỷ lệ định danh sai khá cao (19% đối với API 20A, 10% đối với RapIDTM ANA II), tỷ lệ không thể định danh đến loài cũng nhiều (38% đối với RapIDTM ANA II, 29% đối với API 20A). Chính vì vậy nên để có thể thực hiện được xét nghiệm vi sinh lâm sàng vi khuẩn kị khí, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã triển khai một giải pháp toàn diện, bao gồm chế tạo được môi trường chuyên chở CaryBac có thể giữ bệnh phẩm ở điểu kiện kị khí trong thời gian 24 giờ hơn cả thời gian cần thiết để chuyển mẫu từ lâm sàng đến phòng thí nghiệm, sử dụng ổn định phương tiện tạo khí trường kị khí bằng các túi Anaerocult A của Merck, thực hiện được kháng sinh đồ vi khuẩn kị khí bằng bộ thử nghiệm kháng sinh đồ kị khí do đơn vị R&D nghiên cứu và thiết kế ra. Trong định danh vi khuẩn kị khí, phòng thí nghiệm NK-Biotek và 96 đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã đưa ra một tiếp cận hoàn toàn mới và hiện đại, nhưng lại ít tốn kém nhất, đó là giải pháp giải trình tự một đoạn chứa trình tự đặc hiệu giống và loài nằm trong gene 16S của vi khuẩn. Có thể tóm tắt qui trình như sau: Vi khuẩn mọc trên hộp thạch phân lập được gặt vào nước muối sinh lý vô khuẩn để đạt độ đục 0.5 – 1 McF. Sau đó đun cách thủy sôi trong 10 phút. Để nguội rồi ly tâm 13.000RPM trong 5’. Lấy 5ml dịch nổi cho vào PCR mix 45ml chứa sẵn các thành phần kể cả cặp mồi NK16s-F và NK16s-R khuếch đại đoạn DNA dài 527 bps chứa trình tự đặc hiệu loài trên gene 16S của vi khuẩn. Chạy chương trình nhiệt PCR gồm 1 chu kỳ 95oC/5’ để kích hoạt enzyme hot start Taq polymerase, rồi 40 chu kỳ 94oC/15”-60oC/30”-72oC/1’. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng bộ “Wizard SV Gel and PCR clean-up Sytem” của Promega. Sản phẩm tinh sạch được điện di trên thạch và sau đó định lượng bằng quang phổ GenQuant của Pharmacia, sau đó được đưa vào phản ứng giải trình tự 2 chiều sử dụng mồi xuôi và mồi ngược của PCR thực hiện trên bộ thuốc thử “DTCS cycle sequencing kit” của Beckman Coulter. Chương trình luân nhiệt của phản ứng giải trình tự với bộ thuốc thử trên là 30 chu kỳ 96oC/20”-50oC/20”-60oC/4’. Sản phẩm của phản ứng giải trình tự được tủa bằng ethanol, rồi sau đó được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự CEQ8000. Kết quả giải trình tự được so chuỗi bằng chương trình blast search trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI. Từ kết quả so chuỗi, chúng ta sẽ có được kết quả định danh vi khuẩn. Sau này, với các trang bị thêm như điện di bằng DNA chip của Bio-analyzer và máy giải trình tự ABI 3130XL 16 capillary, qui trình của phản ứng giải trình tự và điện di giải trình tự cũng đã được nghiên cứu để tương thích với các trang bị này. Cụ thể là thay vì điện di trên gel rồi định lượng bằng quang phổ 260/280 thì kết hợp cả hai bằng điện di và định lượng trên Bio-analyzer DNA chip của Agilent; thay vì dùng DTCS để là phản ứng giải trình tự thì dùng “BigDye Terminator V. 3.1 Cycle Sequencing kit” của ABI với chương trình luân nhiệt của phản ứng giải trình tự là trước hết 1 chu kỳ 96oC/1’, theo sau 25 chu kỳ 96oC/10”-50oC/5”-60oC/4’. Sản phẩm của phản ứng giải trình tự sau khi tủa bằng ethanol, được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự ABI 3130XL với gel POP 7 và mao quản 50cm. Hình 48 là một kết quả định danh bằng giải trình tự 16s rDNA vi khuẩn kị khí phân lập từ mẫu mủ xoang của bệnh nhân. Phòng thí nghiệm NK biotek đã áp dụng tiếp cận này trong năm 2008 cho xét nghiệm 97 vi sinh lâm sàng vi khuẩn kị khí với các mẫu bệnh phẩm là 39 mẫu mủ xoang lấy từ bệnh nhân bị viêm xoang mạn tính. Kết quả xét nghiệm cho thấy có 31% (18/59) cấy ra tác nhân vi khuẩn kị khí và kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự 16s rDNA cho thấy có 11% (2/18) Veillonella (cầu khuẩn Gram -), 17% (3/18) Prevotella buccae (trực khuẩn Gram -), 22% (4/18) là Propionibacterium acnes, 6% (1/18) là Streptococcus aginosus, 17% (3/18) là Streptococcus constellatus, 17% (3/18) là Streptococcus gordonii, 6% (1/18) là Peptostreptococcus micros, và 6% (1/18) là Peptostreptococcus stomatis. Kết quả này cho thấy PCR và giải trình tự 16s rDNA là một giải pháp kỹ thuật hoàn toàn có thể sử dụng để định danh vi khuẩn kị khí, giải quyết được khâu kỹ thuật phức tạp và khó khăn nhất trong qui trình xét nghiệm vi sinh lâm sàng vi khuẩn kị khí. Hình 48: Kết quả giải trình tự 16s rDNA trực khuẩn Gram [+] phân lập kị khí từ bệnh phẩm mũ xoang lấy từ bệnh nhân cho phép kết luận đây là Propionibacterium acnes b. Phát hiện chất lượng các sản phẩm probiotic cho người và cho thủy sản Probiotic chính là các vi sinh vật không gây bệnh, được dùng làm sản phẩm trợ sinh qua đường ăn hay uống sử dụng trên người, gia súc, hay thủy sản để phát huy hiệu quả chống lại các nhiễm trùng nhờ các cơ chế như cạnh tranh chất dinh dưỡng và chổ 98 bám của vi sinh vật gây bệnh, phục hồi vi khuẩn chí bình thường cho ruột hay cho môi trường, kích thích hệ thống miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể vật chủ chống lại vi sinh vật gây bệnh, hay tiết ra các chất có tính kháng sinh kháng được các vi sinh vật gây bệnh. Các vi khuẩn thường được dùng làm probiotic là Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium...và thường được cung cấp dưới dạng bột ghi hàm lượng và các loại vi khuẩn có trong sản phẩm. Do các vi khuẩn này thường là các vi khuẩn dễ mọc nên chỉ với các phương tiện phòng thí nghiệm và các môi trường nuôi cấy thông thường là có thể sản xuất được các sản phẩm probiotic nên hiện nay trên thị trường của chúng ta xuất hiện khá nhiều sản phẩm probiotic được sản xuất từ rất nhiều cơ sở trong và ngoài nước để sử dụng không chỉ cho gia súc, thủy sản mà cả cho người. Chính vì tình trạng này nên có một vấn đề mà nhiều người rất quan tâm, đó là liệu chất lượng của các sản phẩm probiotic hiện đang có mặt trong thị trường có thật sự đúng như nhà sản xuất công bố hay không, đặc biệt là liệu các vi khuẩn được ghi trong nhãn hiệu sản phẩm có đúng là vi khuẩn có trong sản phẩm hay không, và hàm lượng có đảm bảo đúng như vậy hay không. Để trả lời câu hỏi trên, trong năm 2008 phòng thí nghiệm NK-Biotek và bộ phận R&D của Nam Khoa đã hướng dẫn một số đề tài tốt nghiệp luận văn Thạc Sĩ có nội dung tìm hiểu chất lượng các sản phẩm probiotic dùng cho người và thủy sản hiện đang lưu thông trên thị trường. Để kiểm tra hàm lượng thì giải pháp kỹ thuật không khó, chỉ cần thực hiện cấy định lượng bằng phương pháp thạch đổ hay phương pháp láng trên bề mặt môi trường dinh dưỡng và ủ ở điều kiện thích hợp là có thể cho được kết quả định lượng chính xác hàm lượng vi khuẩn đích có trong mẫu sản phẩm cần phải kiểm tra. Tuy nhiên để xác định chính xác tên vi khuẩn có trong sản phẩm có đúng như tên được nêu trong nhãn sản phẩm hay không lại là một vấn đề không đơn giản vì các vi khuẩn probiotic như B. subtilis, L. acidophilus...không phải là các vi khuẩn dễ dàng được định danh đến loài nếu chỉ dựa vào các tính chất sinh vật hóa học. Chính vì vậy, chúng tôi đã giải pháp PCR và giải trình tự gene 16s rDNA của vi khuẩn phân lập được từ các sản phẩm probiotic để xác định danh tính của vi khuẩn. Kết quả cho thấy có khá nhiều loại sản phẩm probiotic sử dụng cho người và cho thủy sản có vấn đề về mặt chất lượng cả về hàm lượng lẫn về vi khuẩn thật sự có trong sản phẩm. 99 Bảng 13 và 14 trình bày kết quả cho thấy sự khác biệt giữa vi khuẩn thật sự có trong sản phẩm probiotic so với kết quả được nhà sản xuất công bố trên nhãn. Bảng 13: Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 16s rDNA và kết quả định lượng các vi khuẩn thật sự có trong các probiotic sử dụng trên người STT Tên sản phẩm Tên vi khuẩn trên nhãn sản phẩm Kết quả PCR và giải trình tự 16sDNA 6 1 Biosubtyl DL Bacillus subtilis 10 /gr 7 Bacillus subtilis 10 /gr 2 Bidisubtilis (gói giấy) Bacillus subtilis 10 /gr 8 Bacillus cereus 10 /gr 3 Bidisubtilis (gói nhôm) Bacillus subtilis 10 /gr 8 Bacillus subtilis 10 /gr 4 Bio – Acimin Bacillus subtilis 10 /gr 8 Bacillus cereus 10 /gr 5 Biosubtyl II (gói) Bacillus subtilis 10 /gr 7 Bacillus pumilus 10 /gr 6 Biosubtyl II (viên) Bacillus subtilis 10 /gr 8 Bacillus subtilis 10 /gr 7 Subtyl Bacillus subtilis 10 /gr 7 Bacillus cereus 10 /gr 8 Medilac – Vita Bacillus subtilis 10 /gr 6 Bacillus cereus 10 /gr 9 Bio Baby Bacillus subtilis 10 /gr 6 Bacillus subtilis 10 /gr 10 Bio Vita Bacillus subtilis 10 /gr 6 Bacillus subtilis 10 /gr 7 6 7 7 8 7 6 6 6 Bảng 14: Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 16s rDNA và kết quả định lượng* các vi khuẩn thật sự có trong các probiotic sử dụng cho thủy sản STT Tên sản phẩm Tên và lượng* vi khuẩn trên nhãn sản phẩm 1 DT-LACTO Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 2 Bio-DW Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 3 Probiotex-one Kết quả định danh và định lượng* thực tế Bacillus pumilus Không tìm thấyL. acidophilus Bacillus subtilis 9 10 /gr Bacillus subtilis Không tìm thấyL. acidophilus 6 10 /gr B. megaterium 11 Bacillus subtilis 10 /gr 4 4 Vime-Subtyl Bacillus subtilis 10 /gr 5 Biozyme for fish Bacillus subtilis 10 /gr 9 Bacillus subtilis 10 /gr 6 Novazyme F Bacillus subtilis 10 /gr 9 Bacillus subtilis 10 /gr 7 Subtyl-LA Bacillus subtilis 8 NPV-Prozyme 90 Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 6 10 /gr 9 ProKura Bacillus subtilis 10 Men gấu vàng Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 11 Biobac Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis Không tìm thấyL. acidophilus 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr 6 7 Bacillus cereus Không tìm thấyL. acidophilus Bacillus pumilus 11 Bacillus subtilis Không tìm thấyL. acidophilus 10 /gr 8 Bacillus subtilis Không tìm thấyL. acidophilus 10 /gr 12 Pond clear Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 10 /gr 13 Bio Pond Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 10 /gr 14 Men Bac Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 15 Microzyme Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 16 Zymmix Lactobacillus acidophilus 17 Lactovet Lactobacillus acidophilus Zeofarm 5 Bacillus pumilus 9 18 6 Lactobacillus acidophilus 5 5 Bacillus cereus Không tìm thấyL. acidophilus ? Bacillus subtilis Không tìm thấyL. acidophilus 5 10 /gr Acidovorax sp. Clostridium phylofermentant 9 10 /gr L. acidophilus 6 10 /gr *Chỉ nêu lên lượng các vi khuẩn mà định danh bằng PCR và giải trình tự cho thấy kết quả không sai lệch 100