Tài liệu ÔN THI VIÊN CHỨC NGÀNH Y TẾ - TÀI LIỆU MÔN CỬ NHÂN XÉT NGHỆM, CAO ĐẲNG XÉT NGHIỆM, XÉT NGHIỆM TRUNG HỌC (phần thực hành)

Bài 1 KYÕ THUAÄT ÑÒNH NHOÙM MAÙU HEÄ ABO NHÖÕNG KHOÙ KHAÊN VAØ CAÙCH GIẢÛI QUYEÁT I.Ñaët vaán ñeà: Heä ABO laø heä thoáng nhoùm maùu ñöôïc phaùt hieän sôùm nhaát do Landsteiner (1900). Ñaây laø nhoùm maùu cöïc kyø quan troïng vì laø nguyeân nhaân chính yeáu cuûa caùc tai bieán truyeàn maùu. Do ñoù vieäc xaùc ñònh chính xaùc nhoùm maùu heä ABO laø raát caàn thieát . II.Khaùng nguyeân – khaùng theå heä ABO: 1.Khaùng nguyeân ABO Baét ñaàu xuaát hieän ôû baøo thai 37 ngaøy tuoåi. Phaùt trieån hoaøn toaøn luùc 3 tuoåi. Khaùng nguyeân coù caáu truùc goàm 2 phaàn: + Moät phaàn coù baûn chaát Protein coù khaû naêng sinh khaùng theå. + Moät phaàn coù baûn chaát Gluxit hoaëc Lipit ( coøn goïi laø Hapten ),coù khaû naêng keát hôïp khaùng theå. Toàn taïi ôû haàu heát caùc teá baøo cuûa cô theå ( ngoaïi tröø caùc teá baøo thaàn kinh, teá baøo gan, teá baøo Malpighi vaø moâ lieân keát ) Khaùng nguyeân thöôøng toàn taïi suoát cuoäc soáng nhöng coù theå suy giaûm, yeáu ñi khi veà giaø hoaëc trong 1 soá tröôøng hôïp beänh lyù. Khaùng nguyeân heä ABO cuõng tuaân theo ñònh luaät di truyeàn Mendel. 2) Khaùng theå ABO: - Baûn chaát laø khaùng theå töï nhieân. - Thoâng thöôøng laø IgM, 1 soá raát ít tröôøng hôïp laø IgM + IgA hay IgM + IgG. - Hoaït ñoäng toát ôû nhieät ñoä töø 40C ñeán 200C trong moâi tröôøng NaCl 0,9%. - Noàng ñoä thay ñoåi töø ngöôøi naøy sang ngöôøi khaùc. 3) Caùc heä thoáng nhoùm maùu ABO: Döïa vaøo caùc khaùng nguyeân treân maøng hoàng caàu vaø khaùng theå trong huyeát thanh ta coù caùc nhoùm maùu: Ngoaøi ra ta coøn coù caùc nhoùm maùu phuï khaùc nhö A1, A2, Ax, B3, Bm, A1B, A2B……. III.Kyõ thuaät ñònh nhoùm maùu heä ABO 1.Nguyeân lyù: Döïa treân nguyeân lyù cuûa phaûn öùng ngöng keát. Ñöôïc xaùc ñònh nhôø khaùng nguyeân treân maøng hoàng caàu vaø khaùng theå trong huyeát thanh. Coù 2 phöông phaùp : hoàng caàu maãu vaø huyeát thanh maãu. 2.Duïng cuï vaø thuoác thöû: Maùy ly taâm oáng thaúng. Pipette caùc loaïi. Ống nghieäm thuyû tinh. Lam kieáng. Buùt daï quang hay buùt chì kính. Tuû laïnh baûo quaûn thuoác. Bình ñöïng nöôùc muoái. Giaù ñöïng oáng nghieäm. Kính hieån vi. Que thuûy tinh. Boâng thaám. Huyeát thanh maãu: choáng A, choáng B, choáng AB. Hoàng caàu maãu: A, B, O. Nöôùc muoái 0,9%. Huyeát thanh maùu AB. 3.Tieán haønh kyõ thuaät 3.1) Ñònh nhoùm treân lam kính: 3.1.1) Phöông phaùp huyeát thanh maãu: Treân 1 lam kính: nhoû 3 gioït huyeát thanh maãu choáng A, choáng B, choáng AB vaøo 3 vò trí khaùc nhau. Theâm 1 gioït hoàng caàu caàn ñònh nhoùm 10 – 20% (ñöôïc pha vôùi NaCl 0,9%). Troän ñeàu baèng que thuûy tinh thaønh 1 voøng troøn coù ñöôøng kính 2 – 3cm. Laéc nheï lieân tuïc trong voøng 2 phuùt roài ñoïc keát quaû. 3.1.2) Phöông phaùp hoàng caàu maãu: trí Treân 1 lam kính: nhoû 2 gioït huyeát thanh caàn ñònh nhoùm vaøo 2 vò khaùc nhau. Theâm 1 gioït hoàng caàu maãu A, 1 gioït hoàng caàu maãu B vaøo 2 vò trí treân (hoàng caàu maãu ñaõ ñöôïc pha 10 – 20% trong NaCl 0,9% ). Troän ñeàu vaø laéc nheï lieân tuïc trong voøng 2 phuùt roài ñoïc keát quaû. 3.2) Ñònh nhoùm trong oáng nghieäm 3.2.1) Phöông phaùp huyeát thanh maãu: - Nhoû vaøo 3 oáng nghieäm moãi oáng 1 gioït huyeát thanh maãu choáng A, choáng B, choáng AB. - Theâm 1 gioït hoàng caàu caàn ñònh nhoùm 2 – 5% ( pha trong NaCl 0,9% ) vaøo moãi oáng nghieäm treân. - Laéc ñeàu, quay ly taâm 1000 voøng/ phuùt/ 1 phuùt. - Nghieâng nheï thaønh oáng nghieäm, ñoïc keát quaû baèng maét thöôøng vaø kính hieån vi. 3.2.2) Phöông phaùp hoàng caàu maãu: - Nhoû 1 gioït huyeát thanh caàn ñònh nhoùm vaøo 2 oáng nghieäm. - Theâm 1 gioït hoàng caàu maãu A, 1 gioït hoàng caàu maãu B 2 – 5% vaøo moãi oáng nghieäm treân. - Laéc ñeàu, quay ly taâm 1000 voøng/ phuùt/ 1 phuùt. - Nghieâng nheï thaønh oáng nghieäm, ñoïc keát quaû baèng maét thöôøng vaø kính hieån vi. - Nhoû 1 gioït hoàng caàu caàn ñònh nhoùm ( ñaõ pha loaõng thaønh 1% trong dung dòch Diluent coù LISS ) vaøo caùc gieáng Anti A, Anti B, Anti AB, Ctl. - Nhoû 1 gioït huyeát thanh caàn ñònh nhoùm vaøo caùc gieáng Ctl, HC A, HC B. - Quay ly taâm Card trong 10 phuùt. - Ñoïc keát quaû baèng maét thöôøng vaø baèng maùy ñoïc. 3.3) Nhöõng nguyeân nhaân gaây sai laàm trong ñònh nhoùm maùu heä ABO: - Tyû leä giöõa huyeát thanh maãu vaø hoàng caàu maãu khoâng töông öùng. - Ñoïc keát quaû quaù nhanh hoaëc ñeå quaù laâu môùi ñoïc keát quaû. - Maãu maùu ñònh nhoùm laáy khoâng ñuùng quy caùch, hoaëc bò nhieãm truøng. - Thuoác thöû bò hö, nhieãm truøng hay quaù haïn. - Tay ngheà vaø trình ñoä cuûa ngöôøi laøm kyõ thuaät. IV.Caùch giaûi quyeát nhöõng khoù khaên - Vieäc xaùc ñònh nhoùm maùu heä ABO döïa vaøo khaùng nguyeân treân maøng hoàng caàu vaø khaùng theå trong huyeát thanh. - Hai phöông phaùp huyeát thanh maãu vaø hoàng caàu maãu phaûi ñöôïc tieán haønh ñoàng thôøi vaø phaûi luoân cho keát quaû phuø hôïp. - Taát caû nhöõng khoù khaên xaûy ra khi khoâng coù söï phuø hôïp giöõa 2 phöông phaùp. Ñeå giaûi quyeát ta tieán haønh caùc böôùc sau: + Röûa hoàng caàu caàn ñònh nhoùm vaø hoàng caàu O ( coù ñaày ñuû khaùng nguyeân heä hoàng caàu ) baèng NaCl 0,9% 3 laàn. Pha thaønh hoàng caàu 5%. Chöùng töï thaân: Nhoû vaøo oáng nghieäm 2 gioït huyeát thanh vaø 1 gioït hoàng caàu caàn ñònh nhoùm. Laéc ñeàu, quay ly taâm 1000 voøng/ phuùt/ 1 phuùt. Ñoïc keát quaû baèng maét thöôøng vaø kính hieån vi. + Chöùng AB: Nhoû vaøo oáng nghieäm 2 gioït huyeát thanh maùu AB vaø 1 gioït hoàng caàu caàn ñònh nhoùm. Laéc ñeàu, quay ly taâm 1000 voøng/ phuùt/ 1 phuùt. Ñoïc keát quaû baèng maét thöôøng vaø kính hieån vi. Löu yù: phaûn öùng aâm tính thì phöông phaùp ñònh nhoùm baèng huyeát thanh maãu ñöôïc baûo ñaûm. + Chöùng ñoàng loaøi: Nhoû vaøo oáng nghieäm 2 gioït huyeát thanh caàn ñònh nhoùm vaø 1 gioït hoàng caàu O. Laéc ñeàu, quay ly taâm 1000 voøng/ phuùt/ 1 phuùt. Ñoïc keát quaû baèng maét thöôøng vaø kính hieån vi. Löu yù: phaûn öùng aâm tính thì phöông phaùp ñònh nhoùm baèng hoàng caàu maãu ñöôïc baûo ñaûm. Döïa vaøo keát quaû 3 chöùng, ta coù theå chia nhöõng tröôøng hôïp khoù khaên thaønh 2 nhoùm chính nhö sau: 1/Khi caû 3 chöùng noùi treân ñeàu aâm tính 2/Khi 1 hay caû 3 chöùng noùi treân ñeàu döông tính Khi caû 3 chöùng noùi treân ñeàu aâm tính 1.1) Tröôøng hôïp coù khaùng – khaùng theå: Nhaän xeùt: - Coù theå coù khaùng – khaùng theå choáng A. - Khaùng – khaùng theå chæ xaûy ra khi coù boå theå. - Giaûi quyeát baèng caùch khöû boå theå trong huyeát thanh caàn ñònh nhoùm ôû 560C/ 30 phuùt. - Ñònh nhoùm laïi, neáu coù khaùng – khaùng theå thì sau khi khöû boå theå phaûn öùng seõ trôû veà bình thöôøng nhö sau: 1.2)Tröôøng hôïp chia thaønh 2 quaàn theå hoàng caàu: Nhaän xeùt: - Nhoùm maùu coù theå laø A. - Nhöng hoàng caàu caàn ñònh nhoùm ngöng keát vôùi huyeát thanh maãu choáng A, choáng AB khoâng hoaøn toaøn, coøn nhieàu hoàng caàu töï do. - Gaëp trong caùc tröôøng hôïp ñaõ ñöôïc truyeàn maùu, hoaëc coù caùc nhoùm maùu yeáu, hay coù caùc beänh lyù nhö Leucemie, Ña u tuyû xöông… - Giaûi quyeát baèng caùch hoûi laïi caùc trieäu chöùng laâm saøng vaø tieàn söû truyeàn maùu. 1.3)Tröôøng hôïp khaùng theå yeáu Nhaän xeùt: - Nhoùm maùu coù theå laø A. - Gaëp ôû treû nhoû do khaùng theå chöa hình thaønh ñuû, hoaëc ngöôøi giaø > 70 tuoåi. - Caùc tröôøng hôïp thieáu huït mieãn dòch baåm sinh hay maéc phaûi. - Giaûi quyeát baèng caùch ñònh laïi nhoùm maùu sau 1 thôøi gian, hay ñieàu trò caùc nguyeân nhaân gaây thieáu huït mieãn dòch. 2.Khi 1 hay caû 3 chöùng noùi treân ñeàu döông tính 2.1) Tröôøng hôïp coù khaùng theå laïnh Nhaän xeùt: - Coù theå coù khaùng theå laïnh. - Khi ñeå hoàng caàu caàn ñònh nhoùm uû ôû 370C thì hieän töôïng ngöng keát maát daàn. - Giaûi quyeát baèng caùch röûa hoàng caàu caàn ñònh nhoùm baèng NaCl 0,9% aám 370C vaø ñònh nhoùm trong oáng nghieäm ôû 370C 2.2) Tröôøng hôïp coù khaùng theå töï mieãn: Nhaän xeùt: - Coù theå coù khaùng theå töï mieãn. - Caùc khaùng theå naøy thöôøng ñaõ coá ñònh treân beà maët hoàng caàu. - Giaûi quyeát baèng caùch xem laïi chaån ñoaùn laâm saøng, röûa hoàng caàu caàn ñònh nhoùm baèng NaCl 0,9% aám 370Cvaø ñònh laïi. - Neáu caàn thieát phaûi tieán haønh caùc kyõ thuaät saâu hôn. 2.3) Tröôøng hôïp hoàng caàu chuoãi tieàn Nhaän xeùt: - Coù söï taêng baát thöôøng Protein trong huyeát thanh. - Coù söï ngöng keát taàng nhanh vaø noù seõ ñöôïc phaân taùn raát nhanh khi ta nhoû vaøo hoàng caàu caàn ñònh nhoùm 1 gioït NaCl 0,9%. - Giaûi quyeát baèng caùch röûa hoàng caàu caàn ñònh nhoùm baèng NaCl 0,9%; ñònh laïi phöông phaùp huyeát thanh maãu. - Phöông phaùp hoàng caàu maãu thì pha loaõng huyeát thanh caàn ñònh nhoùm trong NaCl 0,9% cho ñeán khi noàng ñoä Protein trong huyeát thanh khoâng ñuû ñeå keát taàng thaønh hình chuoãi tieàn thì ñònh laïi. V.Keát luaän - Xaùc ñònh nhoùm maùu heä ABO laø 1 khaâu cöïc kyø quan troïng. - Phaûi kieåm tra ñaày ñuû caùc thuû tuïc haønh chaùnh. - Ñònh nhoùm 2 laàn baèng 2 phöông phaùp. - Ñoái chieáu keát quaû: + Neáu keát quaû phuø hôïp traû keát quaû nhoùm maùu. + Neáu keát quaû khoâng phuø hôïp, kieåm tra laïi toaøn boä caùc böôùc, giaûi quyeát caùc khoù khaên ( neáu coù ) vaø laøm laïi. Bài 3 KỸ THUẬT CHỨNG NGHIỆM PHÙ HỢP Nguyên tắc căn bản Lựa chọn được túi máu phù hợp. Bảo đảm an toaøn truyền máu. Nền tảng là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể. Phản ứng thuận hợp ( phản ứng chéo ) chỉ là 1 trong các xét nghiệm để tìm được túi máu phù hợp cho bệnh nhân. Các kỹ thuật trước truyền máu Kiểm tra tiền sử truyền máu của bệnh nhân. Xác định nhóm máu ABO, Rh của bệnh nhân và túi máu. Sàng lọc kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân và túi máu. Định danh kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân ( nếu có ). Phản ứng chéo. Các loại phản ứng chéo Phản ứng chéo điện tử: + Sử dụng máy vi tính để phân tích các dữ liệu của túi máu và bệnh nhân: . Nhóm máu ABO, Rh của túi máu và bệnh nhân. . Sàng lọc kháng thể bệnh nhân. + Chỉ có thể sử dụng trong trường hợp sàng lọc kháng thể ở bệnh nhân (-). + Khi các dữ liệu đều phù hợp thì máy vi tính sẽ in ra nhãn dán để dán lên túi máu. Phản ứng chéo trong huyết thanh học: + Trước truyền máu, hồng cầu túi máu được kiểm tra với huyết thanh bệnh nhân. + Nếu trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể chống lại các kháng nguyên tương ứng trên hồng cầu túi máu thì sự ngưng kết sẽ xuất hiện. + Điều đó thể hiện sự không thuận hợp ở bệnh nhân này đối với túi máu. + Nếu không có sự ngưng kết xảy ra, túi máu được xem như thuận hợp hay an tòan để truyền cho bệnh nhân. Mục đích phản ứng chéo Đây là bước kiểm tra cuối cùng sự thuận hợp của nhóm máu ABO. Có thể phát hiện được sự hiện diện của kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân trong 1 số trường hợp. Quy trình phản ứng chéo Gồm các bước: Kiểm tra thông tin bệnh nhân: + Họ tên bệnh nhân phải đầy đủ, rõ ràng. + Cần có mã số hồ sơ bệnh án, hay số nhập viện. + Tiền sử truyền máu và các phản ứng truyền máu trước đó ( nếu có ). 2) Kiểm tra mẫu máu bệnh nhân: + Phải đầy đủ họ tên, mã số bệnh nhân trên mẫu máu và khớp với phiếu yêu cầu. + Mẫu máu được lấy tối đa trong vòng 3 ngày. + Kiểm tra hiện tượng tán huyết, các cục fibrin trong mẫu máu. 3) Xác định lại nhóm máu ABO, Rh: + Định lại nhóm máu ABO bằng cả 2 phương pháp. + Định lại nhóm máu Rh bằng huyết thanh mẫu D. + Để xác định nhóm máu có thể dùng lam kính hoặc ống nghiệm. 4) Tiến hành phản ứng chéo. Trang thiết bị + Nước muối sinh lý 0,9%. + Lam kính thủy tinh. + Ống nghiệm thủy tinh 10x75mm. + Ống nghiệm nhựa 12x75mm. + Chai nhựa đựng nước muối dùng để rửa. + Pipette có chia độ. + Thuốc thử: hồng cầu mẫu, AHG, LISS, hồng cầu cảm ứng. + Card gel, dung dòch ñeäm ( coù LISS ). + Máy quay ly tâm ống nghiệm, máy quay ly tâm Card gel. + Máy rửa tự động ( nếu có ). + Máy ủ Card gel, ống nghiệm. + Kính hiển vi. Kỹ thuật Phản ứng chéo sử dụng kỹ thuật trong ống nghiệm. Phản ứng chéo sử dụng kỹ thuật Card gel. Phản ứng chéo gồm 2 phần: + Phần chính: phản ứng giữa huyết thanh bệnh nhân và hồng cầu túi máu. + Phần phụ: phản ứng giữa huyết thanh túi máu và hồng cầu bệnh nhân. Kỹ thuật trong ống nghiệm Pha loãng hồng cầu túi máu từ 2 – 4% bằng nước muối sinh lý 0,9% ( thường là 3% ). Cho 50L hồng cầu đã pha loãng vào ống nghiệm. Cho thêm 100µL huyết thanh bệnh nhân vào cùng ống nghiệm trên. Trộn kỹ, quay ly tâm dung dịch ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 giây. Lắc nhẹ nhàng và đọc kết quả dưới kính hiển vi ( giai đoạn 1 ). Thêm 100L LISS vào trong cùng ống nghiệm. Trộn kỹ, ủ dung dịch ở 370C trong 15 phút. Sau ủ, quay ly taâm dung dòch ôû toác ñoä 3000 voøng/phuùt trong 15 giaây, lắc nhẹ nhàng và đọc kết quả ( nếu cần thiết ). Rửa dung dịch 03 - 04 lần bằng nước muối sinh lý 0,9% và đổ bỏ hoaøn toaøn nước rửa cuối cùng. Thêm 100µL AHG, trộn kỹ và quay ly tâm dung dịch ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 giaây. Lắc nhẹ nhàng và đọc kết quả dưới kính hiển vi ( giai đoaïn 2 ). Nếu kết quả (-) cho thêm 50L hồng cầu cảm ứng, trộn kỹ và quay ly tâm dung dịch ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 giaây. Lắc nhẹ nhàng và kiểm tra kết quả lại dưới kính hiển vi. Kỹ thuật Card gel Pha loãng hồng cầu túi máu 1% bằng dung dòch ñeäm. Cho 50L hồng cầu 1% vào lỗ Card gel. Thêm 25µL huyết thanh bệnh nhân vào cùng lỗ Card gel trên. Ủ Card gel ở 370C trong 15 phút. Sau ủ, quay ly tâm Card gel trong 10 phút. Đọc và ghi nhận kết quả. Lưu ý: các bước kỹ thuật cần được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kỹ thuật tự chứng Cần tiến hành khi phản ứng chéo (+). Pha loãng hồng cầu bệnh nhân bằng nước muối sinh lý 0,9%. Tiến hành các bước kỹ thuật giống như phản ứng chéo. Đọc và so sánh kết quả của ống tự chứng với phản ứng chéo. Lưu ý: nồng độ, tỷ lệ của hồng cầu và huyết thanh cần tuân theo kỹ thuật sử dụng. Các nguyên nhân (+) trong phản ứng chéo Không đúng nhóm máu ABO. Kháng thể miễn dòch trong huyết thanh bệnh nhân. Kháng thể töï sinh trong huyết thanh bệnh nhân. Hồng cầu túi máu tự ngưng kết. Các bất thường trong huyết thanh bệnh nhân. Nhiễm trùng. Sàng lọc kháng thể (-), phản ứng chéo giai đoạn 1 (+): Không đúng nhóm máu ABO của túi máu và bệnh nhân. . Hồng cầu túi máu tự ngưng kết. . Kháng thể chống A1 ở bệnh nhân A2 hoặc A2B. . Các kháng thể miễn dịch hoạt động ở nhiệt độ phòng. . Các kháng thể tự sinh loại lạnh. 2) Sàng lọc kháng thể (-), phản ứng chéo giai đoạn 2 (+): . Hồng cầu túi máu ngưng kết. . Kháng thể trong huyết thanh phản ứng với các kháng nguyên trong túi máu. . Các kháng thể do truyền tiểu cầu không phù hợp nhóm máu ABO ( thường là kháng thể chống A hoặc B ). 3) Sàng lọc kháng thể (+), phản ứng chéo (-): . Kháng thể tự sinh -I. . Các kháng thể phụ thuộc vào số lượng kháng nguyên. 4) Sàng lọc kháng thể (+), phản ứng chéo (+), tự chứng (-): . Kháng thể miễn dịch. . Hồng cầu túi máu ngưng kết. 5) Sàng lọc kháng thể (+), phản ứng chéo (+), tự chứng (+): . Kháng thể miễn dịch. . Kháng thể tự sinh loại lạnh. . Kháng thể tự sinh loaïi nóng. . Các vấn đề liên quan đến thuốc thử. Các bước giải quyết trường hợp (+) Kiểm tra nhóm máu ABO, Rh túi máu và bệnh nhân. Làm tự chứng và Coombs trực tiếp. Kiểm tra lại sàng lọc kháng thể ở bệnh nhân, định danh kháng thể ( nếu có và cần thiết ). Tiến hành thêm các kỹ thuật khác. Kỹ thuật trong trường hợp khẩn cấp,Cố gắng xác định nhóm máu ABO, Rh của bệnh nhân. Nếu không xác định được, sử dụng túi máu O- . Ngay khi bệnh nhân đã được truyền máu, vẫn phải tiếp tục tiến hành kỹ thuật phản ứng chéo. Tài liệu tham khảo Technical manual, 15th edition. Modern blood Banking and Transfusion Practices, 4th edition. HealthAtoZ.com Redcross.org Nobelprize.org Bài 4 KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN VÀ NHUỘM I. KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN TIÊU BẢN MÁU DÀN: Chuẩn bi: Lam kính khô sạch,lam kéo, bút đánh dấu tiêu bản Hóa chất cồn 700, 900 Bệnh phẩm là máu lấy từ mao mạch I. KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN (TT) Tiến hành: Lấy 1 giọt máu bằng que diêm đặt nhẹ nhàng lên 1 đầu của lam kính( cách đầu lam khoảng 1cm ) Đặt lam kéo ngay phía trước giọt máu Lùi lam kéo đến chạm giọt máu, để máu tràn hết chiều ngang của cạnh lam kéo Để lam kéo 1 góc khoảng 30-450 so với lam kính nằm ngang Từ từ đẩy ngược cho đều tay về phía trước *Chú ý: đẩy nhanh tiêu bản sẽ dầy,đẩy chậm tiêu bản sẽ mỏng quá hoặc thành từng lớp sóng rất khó xem I. KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN (TT) Kết quả: Máu tràn đều càng về đuôi càng mỏng Lam có màu hồng tươi, nhìn xuyên qua lam đọc được chữ Đuôi có hình lưỡi bò hoặc răng cưa Để khô tự nhiên I. KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN (TT) TIÊU BẢN MÁU GIỌT DẦY: Chuẩn bi: Lam kính khô sạch, que thủy tinh, bút đánh dấu tiêu bản Hóa chất cồn 700, 900 Bệnh phẩm là máu lấy từ mao mạch I. KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN (TT) Tiến hành: Cho 2 giọt máu lên 2 đầu lam kính Dùng que thủy tinh hoặc 1 góc của lam kính khác ngoáy nhẹ lên giọt máu theo vòng tròn rộng ra đến khi giọt máu có đường kính khoảng 1-1,5cm Lắc khô hoặc để khô tự nhiên Không cần cố định mà nhuộm ngay Ngoài ra còn làm tiêu bản: soi tươi, tiêu bản tủy đồ, làm tiêu bản dịch II.KỸ THUẬT NHUỘM Có nhiều cách nhuộm nhưng trong huyết học thường nhuộm Giemsa Dụng cụ: Giá nhuộm, ống đong hoặc cốc có vạch hoặc pipet Hóa chất: Giemsa mẹ, cồn cố định, nước cất, nước thường Tiêu bản máu Tiến hành: Cố định tiêu bản bằng cách cho 1-2 giọt cồn tuyệt đối lên tiêu bản Và lăn cho cồn chảy khắp tiêu bản. Để khô tự nhiên Pha thuốc nhuộm Giemsa tỉ lệ 1/10 Đặt lam cần nhuộm lên giá Phủ lên khắp tiêu bản dd Giemsa 1/10 Để 15 phút, rửa nước thường cho sạch hết cặn Để khô trên giá đỡ thẳng đứng Và đọc khi cần thiết Bài 5 KỸ THUẬT LẤY MÁU MAO MẠCH I. CHUẨN BỊ: Dụng cụ: Kim chích, bông thấm, dây garo. Hóa chất: Cồn 700 - Bệnh nhân: + Để bệnh nhân ngồi hoặc nằm thoải mái + Chọn vị trí lấy máu ở đầu ngón tay 3,4(người lớn) hoặc ở gót chân, đầu ngón chân cái đối với trẻ en nhỏ. II. TIẾN HÀNH: Sát khuẩn nơi định lấy máu bằng bông tẩm cồn 700 Để khô tự nhiên Garo đầu ngón tay Dùng kim tiệt khuẩn chích sâu độ 1-1,5 mm Lau bỏ giọt máu đầu bằng bông khô Lấy máu để xét nghiệm từ giọt thứ 2 trở đi Sau khi lấy đủ máu, ta tháo dây garo, lau sạch máu nơi đã chích cho bệnh nhân III. CHÚ Ý Trước khi lấy máu phải đối chiếu họ, tên, tuổi, chẩn đoán, chỉ định xét nghiệm của bệnh nhân... Không được lấy máu ở nơi nghi do tắc mạch, phù nề, viêm nhiễm. Không bóp nặn quá nhiều. Bài 6: KỸ THUẬT LẤY MÁU TĨNH MẠCH I. CHUẨN BỊ: Dụng cụ: Bơm kim tiêm, dụng cụ chứa máu, bông khô, dây garo. Hóa chất: Cồn 700 - Bệnh nhân: + Nếu làm tại phòng xét nghiệm cho bệnh nhân ngồi cạnh bàn riêng lấy máu + Nếu làm tại giường bệnh thì cho bệnh nhân nằmngay ngắn, đầu gối cẩn thận II. TIẾN HÀNH: Chọn vị trí lấy máu: thường là ở tĩnh mạch khuỷu tay Sát khuẩn da lần thứ 1 bằng bông tẩm cồn 700 Garo phía trên nơi chích để vài phút cho TM nổi lên Sát khuẩn da lần 2 Cầm bơm kim tiêm trong lòng bàn tay phải,ngón trỏ tỳ vào đốc kim Đặt đúng hướng của TM đi lên, đầu vát của kim hướng lên trên Đặt kim tiêm so với cánh tay 1 góc khoảng 300 Tỳ chắc ngón tay vào đốc kim và chọc qua da với động tác dứt khoát II. TIẾN HÀNH (TT) Luồn kim vào TM Khi kim vào TM có thể nới dây garo ra và rút máu sao cho đủ số lượng cần thiết Tháo dây garo, đặt miếng bông tẩm cồn lên chỗ tiêm chích, rút kim ra với động tác nhanh, bảo bệnh nhân ép lên chỗ lấy máu khoảng 5p Tháo kim ra cho vào thùng hủy kim, bơm đủ số lượng máu vào lọ chứa mẫu III. CHÚ Ý Trước khi lấy máu phải đối chiếu họ, tên, tuổi, chẩn đoán, chỉ định xét nghiệm của bệnh nhân... Không được lấy máu ở nơi nghi do tắc mạch, phù nề, viêm nhiễm Không lấy máu quá lâu. Khi bơm vào ống nhớ lắc trộn đều. Bài 7 PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH NHUỘM 1. DUNG DỊCH GIEMSA ĐẬM ĐẶC - Giemsa bột : 0,75 g - Glycerin : 35 ml - Cồn Methylic : 65 ml Cho Giemsa bột vào cối bằng sứ, cho từ từ Glycerin vào và dùng chầy bằng sứ nghiền thật mịn, tiếp tục cho cồn vào hòa đều. Sau đó dùng lọ màu đựng dung dịch, dùng nút lọ thật kín, Bọc lọ bằng giấy đen hoặc để chỗ tối, ngày lắc 3 lần trong 4 ngày liền. Giemsa mẹ để 6 tháng mới dùng là tốt nhất 2. DUNG DỊCH WRIGHT ĐẬM ĐẶC - Wright bột : 0,75 g - Glycerin : 3 ml - Cồn Methylic : 97 ml Cho Wright bột vào cối bằng sứ, cho từ từ Glycerin vào và dùng chầy bằng sứ nghiền thật mịn, tiếp tục cho cồn vào hòa đều. Sau đó dùng lọ màu đựng dung dịch, dùng nút lọ thật kín, Bọc lọ bằng giấy đen hoặc để chỗ tối, ngày lắc 3 lần trong 4 ngày liền. Wright mẹ để 6 tháng mới dùng là tốt nhất 3. DUNG DỊCH NHUỘM HỒNG CẦU LƯỚI 3.1 Dung Dịch Xanh Cresyl 1%: - Xanh Cresyl : 1g - Natri Citrat 3% : 20 ml - NaCl 0,9% : 80 ml ml Lắc cho tan đều rồi lọc. Chỉ dùng trong 1 tháng 3.2 Dung Dịch Xanh Cresyl trong cồn: - Xanh Cresyl ánh : 1g - Cồn tuyệt đối : 100 ml 4. DUNG DỊCH NHUỘM PEROXYDAZA: + Dung dịch A: - Benzidin : 0,25g - Cồn Ethylic 95% : 100 ml + Dung dịch B: - Nitroprussiate sodium : 25g - Nước cất : 100 ml + Dung dịch C: - Dung dịch A : 100 ml - Dung dịch B : 2 ml + Dung dịch D - Nước oxy già 3% : 3ml - Nước cất : 100ml + Dung dịch Giemsa 10% 5. DUNG DỊCH NHUỘM SOUDAN NOIR + Dung dịch A: - Soudan Noir : 0,3g - Cồn Ethylic tuyệt đối : 100ml + Dung dịch B: -Tinh thể Phenol : 16g - Disodic Phosphat : 0,3g - Cồn Ethylic tuyệt đối : 30ml - Nước cất : 100ml + Dung dịch C: - Dung dịch A : 60ml - Dung dịch B : 40ml 0 + Cồn Ethylic 70 + Dung dich Giemsa 10% 6. DUNG DỊCH NHUỘM RNA TRONG NGUYÊN SINH CHẤT: 6.1 Dung dịch cố định: - Cồn Ethylic tuyệt đối : 60ml - Chloroform : 30ml - Acid Acetic : 10ml 6.2 Dung dịch đệm walpole ( PH = 4.8 ) - Dung dịch Acid Acetic 0,6g/100ml : 80ml - Dung dịch Acetat sodium 0,8/100ml : 120ml 6.3 Dung dịch nhuộm: + Dung dịch A: - Vert methy 2g - Nước cất 100ml + Dung dịch B: - Pyrinin G 2g - Nước cất 100ml + Dung dịch C: - Dung dịch A 4ml - Dung dịch B 6ml Cồn Ethylic Tuyệt đối 2ml DD đệm walpole 100ml Bài 8 PHA CHẾ DUNG DỊCH CHỐNG ĐÔNG 1. DUNG DỊCH EDTA : Muối dipotassic của acid ethylen diamin tetra acetic : 1,5g - Nước cất vừa đủ : 100ml 2. DUNG DỊCH NATRI CITRAT 3,8% - Natri Citrat : 3,8 g - Dung dịch NaCl (0,85%) : 100ml 3. DUNG DỊCH HEPARIN - Heparin nguyên chất : 5000đơn vị - Nước cất vừa đủ : 10ml Hoặc: - Heparin : 10mg - NaCl 0,9% : 0,25ml 4. DUNG DỊCH ACD: - Acid Citric : 0,8g - Citrat natri : 2,2g - Gluco : 2,2g - Nước cất : 100ml 5. DUNG DỊCH CPD: - Acid citric : 0,32g - Citrat natri : 2,63g - Phosphat : 0,25g - Destroze : 2,32g - Nước cất : 100ml 6. DUNG DỊCH WINTROBE - Amoni oxalat : 1,2g - Kali oxalat : 0,8g - Nước cất : 100ml Pha xong lọc qua giấy lọc hoặc bông, dùng dần. Bài 9 PHA CHẾ DUNG DỊCH DÙNG TRONG XÉT NGHIỆM ĐÔNG MÁU 1.DUNG DỊCH CANXICLORUA 0,1M: - Canxiclorua khan : 11,1g - Nước cất vừa đủ : 1000ml Điều chỉnh PH = 6 Bảo quản 4oC, dùng trong 1 tuần 2. DUNG DỊCH CANXICLORUA 0,025M - Dung dịch Canxiclorua 0,1M : - Nước cất 3 thể tích : 1 thể tích Chỉnh PH = 6 Chỉ pha khi dùng 3. DUNG DỊCH THROMBOPLASTINCANXI: - Bột hoạt chất Thromboplastin : 50mg - NaCl 0,9% : 1ml Để vào nồi cách thủy, khuấy liên tục bằng đũa thủy tinh trong 30phút Li tâm 3-4 phút hoặc để lắng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm Thu phần dịch trong ở trên sang ống nghiệm khác Pha Thromboplastincanxi: Cứ 1 thể tích Thromplastin thêm 1 thể tích canxiclorua 0,025M Trộn đều, để vào bình cách thủy dùng ngay trong phòng xét nghiệm PHA CÁC DUNG DỊCH KHÁC 1.DUNG DỊCH ĐO SỨC BỀN HỒNG CẦU: Dung dịch NaCl 0,7% Hoặc là NaCl có dung dịch đệm phosphat (PH=&) + NaCl 90g + Phosphatdisodic 13,65 g + Phosphat monosodic 2,43g 1000ml + Nước cất vừa đủ Bảo quản được hàng tháng 2. DUNG DỊCH NGÂM RỬA DỤNG CỤ THỦY TINH:: 2.1 Dung dịch sunfocromic đậm đặc: - Kalibicromat : 40g - Nước : 180ml - Acid sunfuric nguyên chất : 180ml 2.2 Dung dịch Sunfocromic loại thường: - Kalibicromat : 50g - Acidsunfuric nguyên chất : 50ml - Nước cất 1000ml : 3. PHA LOÃNG VÀ BẢO QUẢN CỒN: 3.1 Pha loãng cồn theo phương pháp Lowi: Cho vào ống đong chia độ số lượng mililit cồn dùng để pha loãng bằng số độ cồn cần pha. Thêm nước cất vào đến khi được khối lượng chung bằng số độ cồn trước khi pha 3.2 Cách bảo quản cồn tuyệt đối: Cứ 1000ml cồn tuyệt đối Thêm 50g Kalicarbonat hoặc 50g đồng sunfat khan Sẽ giữ được đôn cồn trong thời gian dài Bài 10 PHA CHẾ DUNG DỊCH ĐẾM TẾ BÀO DUNG DỊCH ĐẾM SỐ LƯỢNG HỒNG CẦU : DUNG DỊCH HAYEM : - Natri clorua : 1g - Natri sulfat : 5g - Sublimat : 1,5g - Nước cất : 200 ml DUNG DỊCH MARCANO : - Natri sulfat : 50 g - Formol 40 % : 5 ml - Nước cất : 1000ml DUNG DỊCH NƯỚC MUỐI SINH LÝ - NaCl : 8,5 g - Nước cất : 1000 ml II. DUNG DỊCH ĐẾM SỐ LƯỢNG BẠCH CẦU DUNG DỊCH LAZARUS : - Acid Acetic : 50 ml - Xanh Methylen 1% : 20 giọt - Nước cất vừa đủ : 1000 ml DUNG DỊCH TURK : - Acid Acetic : 2 ml - Gentian violet : 1 giọt - Nước cất : 98 ml DUNG DỊCH XANH ACETIC : - Acid Acetic : 10 ml - Xanh Toludin o,25% : 10 ml - Nước cất : 1000ml DUNG DỊCH ĐẾM SỐ LƯỢNG TIỂU CẦU : DUNG DỊCH MARCANO : DUNG DỊCH URE : - Ure nguyên chất : 0,7 g - NaCl 0,9% : 7 ml - Nước cất : 3 ml DUNG DỊCH NOVOCAIN: - Novocain chlohydrat : 30 g - Natri clorua : 2g - Nước cất vừa đủ : 1000 ml DUNG DỊCH MAGNESIUM SULFAT 14% : - Magnesium sulfat : 14 g - Nước cất vừa đủ : 100 ml DUNG DỊCH PHA LOÃNG NƯỚC NÃO TỦY ĐỂ ĐẾM TẾ BÀO MÁU : - Acid acetic : 10 ml - Crystal violet : 0,1 ml - Nước cất : 90 ml Lọc kỹ trước khi dùng V. DUNG DỊCH ĐỊNH LƯỢNG HUYẾT SẮC TỐ DUNG DỊCH ACID CLOHYDRIC 0.1N Acid clohydric nguyên chất (HCL) : 8,6 ml Nước cất vừa đủ : 1000ml