Nuôi cấy quang tự dƣỡng cây hoa cúc cắt cành (chrysanthemum sp. ) bằng hệ thống túi nylon

  • Số trang: 95 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 19 |
  • Lượt tải: 0
nganguyen

Đã đăng 34173 tài liệu

Mô tả:

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  TRẦN PHƢỚC LINH NUÔI CẤY QUANG TỰ DƢỠNG CÂY HOA CÚC CẮT CÀNH (Chrysanthemum sp. ) BẰNG HỆ THỐNG TÚI NYLON Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh 2006 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NUÔI CẤY QUANG TỰ DƢỠNG CÂY HOA CÚC CẮT CÀNH (Chrysanthemum sp. ) BẰNG HỆ THỐNG TÚI NYLON Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN TIẾN THỊNH TRẦN PHƢỚC LINH Niên khóa: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh 8/2006 3 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY,HCHC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** PHOTOAUTOTROPHIC CULTURE OF CUT MUM (Chrysanthemum sp. ) USING NYLON – BAG SYSTEM GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: PhD. NGUYEN TIEN THINH TRAN PHUOC LINH Term: 2002 - 2006 HCMC 9/2006 4 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về hoa trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng tăng nhanh hơn bao giờ hết. Hoa tươi trở thành một loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí đặc biệt trong thị trường sản phẩm hàng hóa nông nghiệp thế giới.Trong đó, hoa Cúc là một trong những loại hoa được nhiều người ưa chuộng và phổ biến nhất. Trong xu thế hội nhập, cùng với chính sách mở cửa của nhà nước, nhiều nhà đầu tư nước ngoài như Công ty Hasfarm ở Đà Lạt không ngừng đưa vào Việt Nam những giống hoa Cúc đẹp và có giá trị kinh tế cao. Chính vì vậy, hiện nay sản phẩm hoa Cúc rất đa dạng về chủng loại, phong phú về màu sắc. Việc xuất hiện liên tục của những giống hoa Cúc ngoại nhập, bên cạnh các giống hoa nội địa, đã giúp mở rộng sản xuất và qua đó đáp ứng được nhu cầu thị hiếu của người tiêu dùng. Khi sản xuất được mở rộng, nhu cầu về giống cũng tăng theo, và phương pháp nhân giống cũng không ngừng cải tiến. Cây hoa Cúc được nhân giống chủ yếu bằng phương pháp vô tính qua phương pháp giâm cành truyền thống. Nhiều năm qua, thực tế cho thấy phương pháp này không đáp ứng kịp nhu cầu giống, mặt khác còn mang nguy cơ làm lây lan bệnh hại và làm thoái hóa giống.Vì vậy trong sản xuất số lượng lớn cây giống sạch bệnh với tốc độ nhanh, chất lượng đồng đều và đồng nhất về mặt di truyền, phương pháp nhân giống vô tính in vitro cây hoa Cúc rất hiệu quả. Các nghiên cứu nuôi cấy mô truyền thống thường không quan tâm nhiều đến các yếu tố môi trường, và thường dựa quá nhiều vào những ứng dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh. Bên cạnh đó, việc bổ sung đường, agar và vitamin vào môi trường nuôi cấy, cùng với việc sử dụng hệ thống nuôi cấy kín dẫn đến nhu cầu đòi hỏi sự vô trùng tuyệt đối. Điều này làm tăng chi phí sản xuất; gây ra sự mất mát một số lượng lớn cây con do nhiễm nấm khuẩn trong quá trình nuôi cấy; cảm ứng sự biến dị về hình thái, sinh lý cây nuôi cấy; đặc biệt là hiện tượng thủy tinh thể (vitrification) 5 thường xuất hiện. Chính vì vậy mà tỷ lệ sống của cây in vitro trong giai đoạn thuần hóa sau ống nghiệm thấp. Nhiều nghiên cứu ở những loài thực vật khác nhau đã cho thấy phương pháp có thể giúp khắc phục những nhược điểm trên, nâng cao rõ rệt chất lượng cây giống là phương pháp: Vi nhân giống bằng công nghệ quang tự dƣỡng. Theo phương pháp này khả năng tự quang hợp của cây được tạo điều kiện phát triển, sử dụng môi trường nhân giống chỉ bao gồm các loại muối khoáng, mà không có sự bổ sung đường hay các loại vitamin. Song song với những nghiên cứu về quang tự dưỡng, hệ thống nuôi cấy cũng không ngừng được cải tiến. Trong đó hệ thống nghiên cứu trong túi nylon rẻ tiền tỏ ra có nhiều triển vọng trong hạ giá thành sản phẩm cây con. Với những lý do đã nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “nuôi cấy quang tự dƣỡng cây hoa Cúc cắt cành (chrysanthemum sp. ) bằng hệ thống túi Nylon”. 1.2. Mục đích – yêu cầu 1.2.1. Mục đích Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng thích hợp, sử dụng các bịch nylon dân dụng, nhằm nâng cao chất lượng và hạ giá thành cây giống Cúc in vitro. 1.2.2. Yêu cầu Theo dõi các chỉ tiêu tăng trưởng của cây hoa Cúc trong phòng thí nghiệm và ngoài vườn ươm ở các điều kiện thí nghiệm quang tự dưỡng khác nhau. Tính toán sơ bộ chi phí giữa các hệ thống và phương pháp nuôi cấy. Từ đó xác định được giá thành của chúng. 6 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về cây hoa Cúc 2.1.1. Nguồn gốc cây hoa Cúc Hoa Cúc có tên khoa học là Chrysanthemum sp. (hiện nay chi Chrysanthemum còn có tên là Dendrathema). Hoa Cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản. Các nhà khảo cổ học Trung Quốc đã chứng minh rằng từ đời Khổng Tử người ta đã làm lễ thắng lợi hoa vàng (hoa Cúc) và cây hoa Cúc cũng đã đi vào các tác phẩm hội họa từ thời gian này. Ở Nhật Bản, Cúc là một loài hoa quí (Quốc hoa) thường được dùng trong các buổi lễ quan trọng. 2.1.2. Tình hình sản xuất và thƣơng mại cây hoa Cúc trên thế giới và Việt Nam Tuy cây Cúc có nguồn gốc từ lâu đời nhưng đến năm 1688 Jacob Layn người Hà Lan mới trồng phát triển mang tính thương mại ở đất nước này. Đến đầu thế kỷ 18, cây hoa Cúc là cây hoa quan trọng nhất đối với Trung Quốc, Nhật Bản. Ở Hà Lan, Cúc là cây quan trọng thứ hai sau hoa hồng. Hàng năm kim ngạch giao lưu buôn bán hoa cúc trên thị trường thế giới ước đạt tới 1,5 tỷ USD (Đặng Văn Đông, 2003). Bảng 2.1. Những nƣớc xuất khẩu và nhập khẩu hoa Cúc hàng năm Tên nƣớc Xuất khẩu (triệu USD) Nhập khẩu (triệu USD) Trung Quốc 300 200 Nhật Bản 150 200 Hà Lan 250 100 Pháp 70 110 Đức 80 50 Nga 120 Mỹ 50 Singapo 15 Israel 12 (Theo Đặng văn Đông, 2003). 70 7 Ở Việt Nam, hoa Cúc được du nhập vào từ thế kỷ 15. Đến đầu thế kỷ 19 đã hình thành các vùng chuyên canh cung cấp cho người tiêu dùng, một phần để chơi thưởng thức, một phần phục vụ việc cúng lễ và một phần dùng làm dược liệu. Hiện nay hoa Cúc có mặt ở khắp mọi nơi từ vùng núi cao đến đồng bằng, từ nông thôn đến thành thị. Các vùng trồng nhiều mang tính tập trung là Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh, Đà Lạt, và Hải Phòng. Riêng ở Đà Lạt là nơi lý tưởng cho việc trồng hoa Cúc quanh năm. Ngoài ra điều kiện khí hậu rất thích hợp cho việc sinh trưởng, phát triển của hầu hết các giống Cúc được nhập từ nước ngoài vào. Hiện nay ở Đà Lạt có trên 70 giống Cúc được trồng với mục đích cắt cành. Giống hoa Cúc hiện nay chủ yếu xuất phát từ Hà Lan và được du nhập vào Đà Lạt với nhiều hình thức khác nhau. Trong đó các công ty nước ngoài như Harfarm, Bonifarm góp một phần không nhỏ trong việc tạo sự đa dạng cho thị trường giống Cúc Việt Nam. Theo số liệu thống kê về tình hình sản xuất hoa tại thành phố Đà Lạt, cho thấy diện tích và sản lượng hoa Cúc là lớn nhất so với những loại hoa khác. Bảng 2.2. Tình hình sản xuất hoa tại thành phố Đà Lạt Chủng loại Diện tích (ha) Sản lƣợng (triệu cành) Hoa Cúc 300 120 Hoa Hồng 122 56 Hoa Cẩm Chƣớng 13,5 12 Hoa Lys Lys 12 4 (Nguồn: thông tin kinh tế-xã hội tỉnh Lâm Đồng, 2005) 2.1.3. Vị trí phân loại - Ngành : Angiospermatophyta - Lớp : Dicotyledoneae - Bộ : Asterales - Họ : Asteraceae - Chi :Chrysanthemum (Dendrathema). - Loài: Có nhiều loài, nhưng phổ biến như hoa cắt cành có thể kể là: morifolium. 8 2.1.4. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây hoa Cúc 2.1.4.1. Đặc điểm thực vật học  Rễ Rễ của Cúc là loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều ngang, phân bố ở tầng đất mặt từ 5 – 20cm. Số lượng rễ rất lớn nên khả năng hút nước và các chất dinh dưỡng rất mạnh.  Thân Cây thuộc loại thân thảo nhỏ, có nhiều đốt giòn dễ gãy. Kích thước thân cao hay thấp, to hay nhỏ, cứng hay mềm phụ thuộc từng giống và thời vụ trồng.  Lá Thường là lá đơn không có lá kèm, mọc so le nhau, bản lá xẻ thùy lông chim, phiến lá mềm mỏng có thể to hay nhỏ, màu sắc xanh đậm hay nhạt phụ thuộc vào từng giống. Mặt dưới phiến lá bao phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn, gân hình mạng. Trong một chu kỳ sinh trưởng tùy từng giống mà trên một thân cây Cúc có từ 30 – 50 lá.  Hoa Hoa Cúc chủ yếu ở hai dạng: - Dạng lưỡng tính: trong hoa có cả nhị đực và nhụy cái. - Dạng đơn tính: chỉ có nhị đực hoặc nhụy cái, đôi khi có loại vô tính (không có cả nhụy, nhị). Màu sắc hoa Cúc rất khác nhau, hầu như có tất cả các màu của tự nhiên: trắng, vàng, đỏ, tím, hồng, xanh. Trong đó trên mỗi bông hoa có thể có một màu duy nhất, hoặc có vài màu riêng biệt hoặc có thể có rất nhiều màu pha trộn, tạo nên một thế giới màu sắc vô cùng phong phú và đa dạng. Tùy theo cách sắp xếp của cánh hoa mà người ta phân ra thành nhóm hoa kép (có nhiều vòng hoa sắp xếp trên bông) và nhóm hoa đơn (chỉ có một vòng hoa trên bông). Những cánh hoa nằm ở phía ngoài có màu sắc đậm hơn. Cánh hoa có nhiều hình dáng khác nhau: có dạng cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn hoặc cánh dài, cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong. Đường kính của bông hoa phụ thuộc vào giống. Giống hoa to có đường kính 10 – 12cm, loại trung bình 5 – 7cm và loại nhỏ từ 1 – 2cm. 9 2.1.4.2. Sinh thái cây hoa Cúc  Nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự sinh trưởng, phát triển, nở hoa và chất lượng của hoa Cúc. Đa số các giống Cúc được trồng hiện nay đều ưa khí hậu mát mẻ, nhiệt độ dao động từ 15 – 200C. Bên cạnh đó có một số giống chịu nhiệt độ cao (30 – 350C). Trong thời kỳ ra hoa cần đảm bảo nhiệt độ thích hợp (cho từng loại giống Cúc) thì hoa sẽ to và đẹp.  Ánh sáng Ánh sáng có hai tác dụng chính đối với Cúc: + Ánh sáng là một yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển của cây. Nó cung cấp năng lượng cho quá trình quang hợp tạo ra chất hữu cơ cho cây. + Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân hóa mầm hoa và nở hoa của Cúc. Cúc được xếp vào loại cây ngày ngắn. Thời gian chiếu sáng thời kỳ phân hóa mầm hoa tốt nhất là 10 giờ chiếu sáng/ngày. Thời gian chiếu sáng kéo dài thì sự sinh trưởng của cây hoa Cúc dài hơn, thân cây cao, lá to, hoa ra muộn, chất lượng hoa tăng. Thời gian chiếu sáng 11 giờ/ngày cho chất lượng hoa Cúc tốt nhất.  Ẩm độ Cúc là cây trồng cạn, không chịu được úng. Đồng thời là cây có sinh khối lớn, bộ lá to, tiêu hao nước nhiều nên cũng kém chịu hạn. Độ ẩm đất từ 60 – 70%, độ ẩm không khí 55 – 65% thuận lợi cho cây Cúc sinh trưởng tốt.  Đất và dinh dƣỡng - Đất: có vai trò cung cấp nước, dinh dưỡng cho sự sống của cây. Cây hoa Cúc có bộ rễ ăn nông do vậy yêu cầu đất cao ráo, thoát nước, tơi xốp. - Các chất dinh dưỡng: các loại phân hữu cơ (phân chuồng, phân vi sinh, than bùn), phân vô cơ (đạm, lân, kali) và các loại phân trung, vi lượng (Ca, Mg, Zn, Cu, Fe, Mn, Bo…) có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng của hoa Cúc. 10 2.1.5. Phân loại 2.1.5.1. Nhóm giống cũ (1) Cúc đại đóa vàng: Cây cao 60-80cm, thân yếu, mềm, lá to, không đứng thẳng được tự nhiên mà phải có cọc đỡ. Hoa kép to đường kính 8-10cm, cánh dài hơi cong vào trong, cánh không sít vào nhau. Khả năng chịu rét kém nhưng chịu hạn tốt. Thời gian sinh trưởng rất dài 150-180 ngày, hiện nay ít trồng. (2) Cúc vàng hè Đà Lạt: Cây cao 40-50cm, thân nhỏ mảnh và cong. hoa to trung bình 4-5cm, cánh ngắn, mềm, màu vàng tươi. Nhiều lá to màu xanh vàng, chịu nóng tốt. thời gian sinh trưởng 90-120 ngày. Nhược điểm là cánh hoa mềm, tuổi thọ hoa ngắn nên giống này hiện nay ít trồng. (3) Cúc chi Đà Lạt: Cây cao 40-50cm, cây bụi, thân nhỏ cong, phiến lá to mỏng, màu xanh nhạt. Hoa đơn nhỏ, đường kính 2,0-2,5cm cánh màu trắng ở viền ngoài và hơi vàng ở giữa. Cây chịu lạnh, thời gian sinh trưởng 120-150 ngày. (4) Cúc chi trắng Đà Lạt: Cây nhỏ, dạng thân bò, phân cành nhiều, lá nhỏ màu xanh đậm. Hoa nhỏ đường kính 1-1,5cm có màu trắng, mùi thơm nhẹ. Trồng đẻ ướp chè, phơi khô làm thuốc nam. (5) Cúc chi vàng Đà Lạt: Cây giống như chi trắng, hoa màu vàng mùi thơm hắc. Trước kia người ta trồng để tạo thành cây hình cầu, trồng vào chậu chơi tết, hoặc để trồng trong các bồn hoa công viên. (6) Cúc gấm: Dạng cây bụi cao khoảng 30-40cm, khả năng phân cành rất mạnh do đó cũng dùng để tạo tán hình cầu trông giống mâm xôi. Hoa màu vàng nhạt đường kính 1,5-2,5cm. Thời gian sinh trưởng dài 120-150 ngày, khả năng chịu rét kém. (7) Cúc họa mi: Cây cao 45-50cm khả năng phân cành mạnh. Hoa đơn nhỏ, đường kính hoa 3-4cm, cánh dài, chiều rộng cánh nhỏ, màu trắng nhạt. Thời gian sinh trưởng dài 5-6 tháng. Khả năng chịu rét kém (8) Cúc kim tử nhung: Cây cao 55-60cm, thân cứng lá to, dài, răng cưa sâu, có màu xanh đậm. Hoa màu vàng nghệ pha đỏ nâu, đường kính hoa to 8-10cm. Thời gian sinh trưởng dài, chịu rét tốt. (9) Cúc tím hoa cà: Cây cao 50-60cm, thân cứng. Hoa to 8-10cm, cánh xếp chồng lên nhau cuốn cong vào phần giữa, hoa màu hoa cà, chịu rét tốt. Thời gian sinh trưởng dài 110-130 ngày. 11 (10) Cúc đỏ tiết dê: Cây cao 50-60cm, thân cứng. Hoa to đường kính 8-12cm, màu đỏ tiết dê cánh hẹp dài uốn cong vào phía giữa hoa. 2.1.5.2. Nhóm giống mới nhập nội (11) Cúc vàng Đài Loan: Được chọn lọc từ tập đoàn Cúc nhập nội của Đài Loan năm 1994. Cây cao 70-80cm, lá xanh đậm, phiến lá dày, thân mập thẳng, cứng. Hoa kép to có nhiều tầng xếp rất chặt, đường kính hoa 10-12cm, hoa màu vàng nghệ, rất bền (10-12 ngày ). Thời gian sinh trưởng 120-150 ngày, thích hợp với vụ mùa thu đông. (12) Cúc CN 93: Được nhập nội từ Nhật Bản về Việt Nam năm 1993, nhiều năm liền được thị trường ưa chuộng. Cây cao trung bình 60-70cm, cứng, mập thẳng, lá xanh to. Hoa kép, màu vàng, đường kính 10-12cm, cánh dày xếp sít chặt nhau, hoa bền, thời gian cắm lọ 10-15 ngày. Thời gian sinh trưởng ngắn 90-110 ngày, chịu nhiệt tốt có thể trồng nhiều thời vụ trong năm, nhưng thích hợp nhất là vụ xuân hè và hè thu (tháng 4-tháng 11). (13) Cúc CN 97: Được nhập nội từ Nhật Bản. Cây cao từ 55-65cm, cây to mập, lá xanh dày. Hoa kép màu trắng sữa, cánh dày đều xếp chặt vào nhau, đường kính hoa 10-12cm, Thời gian sinh trưởng 90-110 ngày, chịu rét. (14) Cúc CN 98: Được nhập nội từ Nhật Bản.Cây cao thẳng từ 60-70cm, lá xanh đậm. Hoa to, đường kính trung bình 8-10cm, màu vàng chanh. Thời gian sinh trưởng 80-90 ngày, chịu nóng, là một trong những giống chủ lực của mùa hè hiện nay. (15) Cúc CN 42: Được Viện Di Truyền Nông Nghiệp nhập từ Hà Lan về năm 2001. Giống có đặc điểm cây cứng, lá xanh bóng, chiều cao trung bình 70-80cm. Hoa màu trắng trong. Thời gian sinh trưởng 90-95 ngày, phù hợp với thời vụ đông. (16) Cúc CN 45: Được nhập cùng giống CN 42, cây cao trung bình 70-80cm. Cánh hoa bên ngoài màu trắng, cánh bên trong hơi vàng, đường kính hoa 7-10cm. Thời gian sinh trưởng 90-100 ngày, thích hợp với vụ đông. (17) Cúc CN 44: được nhập cùng giống CN 42, CN 45, cây cao 85-90cm, lá hình lông chim hẹp, hoa màu vàng đậm, đường kính 9-11cm. thời gian sinh trưởng 90-95 ngày, thích hợp trồng trong vụ đông. Ngoài các giống chính trên còn có rất nhiều giống khác đang được trồng ở Hà Nội và các tỉnh phía Bắc. Tên gọi của chúng được mô tả theo đặc điểm hoa, màu sắc, 12 nguồn gốc hoặc do các tác giả đặt tên. Ví dụ như: cánh sen, vàng nhị nâu, đỏ cờ, da hồng, tím Huế, tím lồi to, tím lồi con, trắng xanh, lồi xanh, vàng Tầu, chi trắng Hà Lan, chi vàng Hà Lan, tím sen, tím xoáy, tím hè, ánh vàng, ánh bạc, đầu đỏ, đầu vàng, CN40, Cn41, HL1…Bộ giống phong phú này luôn đáp ứng thị hiếu của người chơi hoa và những người muốn sưu tập về hoa Cúc. Hình 2.1. một số loài hoa Cúc 2.1.6. Các phƣơng pháp nhân giống cây hoa Cúc 2.1.6.1. Phƣơng pháp nhân giống cổ điển a) Mầm giá Mầm giá là những mầm non mọc lên từ rễ, phát sinh chung quanh gốc cây mẹ. mầm giá phát sinh nhiều hay ít tùy giống, đất đai và điều kiện chăm sóc. Mầm giá thường đảm bảo tính chất của cây mẹ, cho hoa to nhưng không đều. 13 Mầm giá thường to khỏe nên khả năng sinh trưởng, phát triển mạnh, cho hoa tốt nhưng thời gian cho hoa lâu hơn so với giâm cành. Trong thực tế sản xuất quy mô nhỏ, ta có thể tăng số lượng bằng cách tách mầm từ những cây Cúc có nhiều mầm chồi phát sinh quanh gốc. b) Giâm cành Đây là biện pháp kỹ thuật đơn giản đang được sử dụng phổ biến. Muốn có cành giâm tốt phải chuẩn bị vườn cây nguyên liệu (cây mẹ). Hệ số nhân Cúc theo phương pháp này đạt từ 15 – 20 lần tức là để trồng từ 15 – 20 ha cần phải có 1 ha vườn cây mẹ. 2.1.6.2. Nhân giống Cúc bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô Đây là phương pháp khoa học và hiện đại, phục vụ cho sản xuất với quy mô công nghiệp lớn. Ưu điểm của phương pháp này là hệ số nhân giống rất cao, từ một bộ phận của cây hoa Cúc sau 1 năm có thể cho ra đời từ 40 – 60 tỷ cây (Đặng Văn Đông, 2003). Các cây này đều sạch bệnh, chất lượng tương đối đồng đều và đồng nhất về mặt di truyền. Nuôi cấy mô hoa Cúc đã được thực hiện từ cuối những năm 1960 với mục đích làm tăng nhanh tốc độ nhân giống hơn với cách giâm cành cổ điển, tạo được dòng sạch bệnh vi rút, gây giống đột biến và dự trữ giống. 2.2. Phƣơng pháp nhân giống vô tính in vitro 2.2.1. Khái niệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ sinh học. Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quí hiếm để phục tráng giống cây trồng. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật vô trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. 14 2.2.2. Lịch sử phát triển Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đề xướng học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi sinh vật phức tạp đều gồm nhiều sinh vật nhỏ, các tế bào hợp thành, các tế bào phân chia mang thông tin di truyền chứa trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh và là những đơn vị độc lập từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể. Năm 1902, Haberlandt đề xướng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào, nghĩa là mỗi tế bào đều mang đầy đủ thông tin di truyền của cá thể. Ông tiến hành trên cây họ hòa thảo (cây một lá mầm) một loại cây khó thực hiện và ông bị thất bại. Năm 1922, Kote (học trò Haberlandt) và Robbins (nhà khoa học người Mỹ) đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn, mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới. Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum esculentum). Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch cứng. Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà. Trong thời gian này chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. Và năm 1948 Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin. Sau đó các chất cytokinine khác như BAP, 2 IP, Zeatin cũng được phát hiện. Năm 1957, SKoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về tỷ lệ giữa kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá. Từ năm 1954, đến năm1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh. Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Năm 1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá. 15 2.2.3. Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô ở Việt Nam Sau ngày đất nước hoàn toàn giải phóng, chính phủ ta đã đầu tư về tài chính và con người nhằm phát triển các ngành khoa học nói chung và ngành sinh học nói riêng, trong đó có nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật được xây dựng tại Viện Công Nghệ Sinh Học (Viện Khoa Học Việt Nam), Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh, Phân Viện Sinh Học tại Đà Lạt, Viện Khoa Học Nông Ngiệp, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Đại Học Nông Nghiệp I, Viện Lâm Nghiệp, Ở một số tỉnh, thành phố cũng bắt đầu xây dựng phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhiệm vụ của các phòng thí nghiệm này là xây dựng và phát triển các phương pháp nghiên cứu, đồng thời tổ chức những hướng nghiên cứu ứng dụng phù hợp với điều kiện trang thiết bị ở Việt Nam và đã thu được những kết quả quan trọng như: vi nhân giống dứa, khoai tây, hoa hồng, cúc, cẩm chướng (Viện Công Nghệ Sinh Học), nhân giống chuối, hoa lan (Phân Viện Sinh Học tại Đà Lạt, Đại Học Nông Nghiệp I), nhân giống bạch đàn (Viện lâm Nghiệp) …. Đặc biệt là các kết quả nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá, nuôi cấy tế bào trần của thuốc lá và khoai tây ở Viện Sinh Học và Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh. Bằng Việc ứng dụng kỹ thuật lai hữu tính và nuôi cấy túi phấn trên cây lúa, các tác giả Đoàn Thị Ái Thuyên, Phan Xuân Thanh, Lê Đình Hùng đã tạo được 15 dòng lúa đơn bội kép. Trong đó có một số dòng kết hợp được nhiều tính trạng mong muốn như: chín sớm, năng suất cao, kháng rầy nâu, chịu phèn, chịu mặn,…Các dòng lúa này đều được trồng ở xã Thanh Lộc (ngoại thành phố Hồ Chí Minh) và được theo dõi nhân lên ở một số địa phương khác phục vụ cho công tác nhân giống trên diện rộng. 2.2.4. Ứng dụng của lĩnh vực nuôi cấy mô Trước kia, người ta dùng phương pháp nuôi cấy mô tế bào để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền, và tác dụng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy. Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô thực vật đã hướng về những ứng dụng thực tiễn. Các nhà thực vật học đã áp dụng phương pháp này với mục đích sau:  Tạo một quần thể cây trồng lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn, với diện tích thí nghiệm nhỏ, có điều kiện hóa lý kiểm soát. 16  Tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện được.  Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh.  Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học.  Bảo quản nguồn gen quý. 2.3. Phƣơng pháp nuôi cấy mô truyền thống 2.3.1. Các nhân tố môi trƣờng in vitro 2.3.1.1. Nhân tố môi trƣờng trên không Nhân tố môi trường trên không gồm những nhân tố sau: - Nhiệt độ: cao, thấp, trung bình, khác nhau giữa giai đoạn tối và giai đoạn sáng và thay đổi trong suốt thời gian nuôi cấy. - Ánh sáng: quang phổ, thời gian chiếu sáng/tối, PPF và hướng chiếu sáng. - Không khí: CO2, O2, ethylene, hơi nước và các khí khác. 2.3.1.2. Nhân tố môi trƣờng vùng rễ  Nhân tố vật lý Nhân tố vật lý bao gồm những nhân tố sau: nhiệt độ, nước, thế thẩm thấu, khả năng khuyết tán của chất khí và chất lỏng, độ rắn, dày hay tính chắc của môi trường, chất liệu làm giá thể và thể tích vùng rễ.  Nhân tố hóa học Nhân tố hóa học gồm những nhân tố sau: - Chất khoáng: nồng độ, tỷ lệ hiện diện và mất đi, tỷ lệ tương đối và tính tan của các ion. - Các thành phần hữu cơ: đường, chất điều hòa tăng trưởng, chất tạo gel, vitamin và những chất khác. - pH. - Oxi hòa tan và các khí khác. - Tính khuyết tán và tiêu hao ion.  Nhân tố sinh học Nhân tố sinh học gồm: sinh vật cạnh tranh và xâm nhiễm, vi sinh vật cộng sinh và chất thải từ đối tượng nuôi cấy (thành phần tế bào và enzyme). 17 Những nhân tố môi trường trên khoảng không và môi trường vùng rễ là môi trường in vitro trên và dưới mặt thạch. Cơ chế của sự thay đổi môi trường in vitro giống như sự thay đổi môi trường trong vườn ươm cây. Nên môi trường in vitro là môi trường của vườn ươm cây thu nhỏ (Read, 1990). 2.3.2. Đặc tính môi trƣờng in vitro Bảng 2.3. Những đặc tính của môi trƣờng in vitro Nhân tố môi trƣờng in vitro Môi trƣờng Trạng thái thay đổi Mức độ thay đổi - Độ ẩm cao. - Mức độ hô hấp thấp. - Nhiệt độ không khí ổn định - Mức độ quang hợp thấp. - Nồng độ CO2 thấp khi có - Mức độ hô hấp trong tối cao. không khí - ánh sáng và cao trong tối. - Điện tử trong quang hợp thấp. Nồng độ C2H4 cao. - Năng lượng chiếu sáng thấp. - Không có sự cân bằng CO2. - Nồng độ đường cao. - Mức độ hấp thu nước thấp. - Nồng độ muối cao. - Mức độ hấp thu ion thấp. Môi trƣờng - Hàm lượng O2 hòa tan thấp. - Mức độ hấp thu đường thấp. vùng rễ - Hàm lượng phenol, độc tố cao. - Mức độ vận chuyển các - Mật độ vi sinh vật thấp. chất thành phần môi trường - Hàm lượng chất sinh trưởng thấp. cao. (Theo Trần Văn Minh, 2003) Điều được ghi nhận ở đặc tính môi trường in vitro là: hàm lượng dinh dưỡng và năng lượng thấp hơn môi trường bán kính, có nhiệt độ và ẩm độ ổn định, có sự thay đổi về hàm lượng CO2, nồng độ đường cao và không có vi sinh vật gây hại. Những đặc tính này ít thấy trong tự nhiên, nông nghiệp và lâm nghiệp. 2.3.3. Những vấn đề trong kiểm soát môi trƣờng in vitro Cây sống ở môi trường in vitro có sự khác biệt rất lớn so với cây sống ngoài môi trường tự nhiên. Môi trường in vitro truyền thống đã được Kozai và cộng sự (1992) mô tả như sau: độ ẩm tương đối cao, nhiệt độ ổn định, sự chênh lệch lớn của nồng độ CO2 giữa thời gian tối và thời gian sáng, sự hiện diện của đường, muối và chất điều hòa tăng trưởng trong môi trường ở nồng độ cao, sự tích lũy khí ethylene và 18 những chất độc khác, không có sự hiện diện của vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy. Những điều kiện trên thường ngăn sự thoát hơi nước, sự quang hợp, sự hấp thu nước, chất khoáng, CO2 và thúc đẩy sự hô hấp trong tối. Kết quả dẫn đến sự sinh trưởng nghèo nàn của mẫu cấy. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng nuôi cấy mô theo phương pháp truyền thống (bình nuôi cấy được đậy nắp kín cùng với việc sử dụng đường, vitamin, và các chất điều hòa sinh trưởng) có ảnh hưởng không tốt đến sự sinh trưởng và phát triển của cây cấy mô trong giai đoạn in vitro cũng như ngoài vườn ươm. Điển hình như cây con in vitro sinh trưởng chậm, xuất hiện biến dị hình thái và chất lượng, mẫn cảm với stress ở giai đoạn thuần hóa sau ống nghiệm. Trong nuôi cấy mô truyền thống thì đường được xem như nguồn carbon duy nhất cho sự phát triển của cây con in vitro. Đường hiện diện trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng không tốt đến tốc độ quang hợp của cây. Các nghiên cứu sinh hóa đã chứng minh rằng đường kìm hãm hoạt động của enzyme rubisco. Sự kém hoạt động của rubisco cũng có nghĩa là cường độ quang hợp của cây in vitro thấp (Hdider và Desjarding, 1994). Ngoài ra việc sử dụng đường trong môi trường của cây invtro rất hạn chế. Theo kết quả nghiên cứu của Kozai và Iwanami (1988) thì lượng đường được cây hấp thụ chỉ ở vào khoảng 2 – 8% lượng đường có trong môi trường, điều này gây sự lãng phí trong sản xuất. Sự có mặt của đường ở nồng độ cao là nguyên nhân của sự gia tăng áp suất thẩm thấu của môi trường, làm trở ngại quá trình hấp thu nước và muối khoáng của rễ. Đường và vitamin còn là chất hữu cơ thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật. Các nghiên cứu và trong thực tế đã chứng minh rằng sự hiện diện của đường và vitamin trong môi trường nuôi cấy làm tỷ lệ nhiễm nấm và khuẩn cao, dẫn đến chi phí sản xuất và giá thành sản phẩm tăng. Ngoài ra việc sử dụng các loại hộp kín, các bình tam giác đậy bằng nút cao su hay giấy bạc đã làm cho độ ẩm trong bình nuôi cấy thường cao hơn 95% (Fujiwara và Kozai, 1995). Độ ẩm cao làm cho tốc độ thoát hơi nước của các khí khổng kém. Độ ẩm cao làm giảm tích lũy chất khô và gây nên mất trật tự về sinh lý và cấu trúc hình thái (hiện tượng thủy tinh thể). Các cây này sẽ bị mất nước nhanh chóng khi đưa ra khỏi ống nghiệm, kết quả là tỷ lệ cây chết cao trong giai đoạn thuần hóa sau ống nghiệm. 19 Trong khi đó cây nuôi cấy in vitro trong điều kiện ẩm độ thấp giảm được sự mất nước quá độ từ lá và chống lại stress do mất nước khi chuyển trực tiếp từ ống nghiệm ra vườn ươm hay đồng ruộng (Tanaka và các cộng sự, 1992). Sự kém thông thoáng của hộp nuôi cấy còn ảnh hưởng đến thành phần không khí trong hộp. Ngay sau khi bật đèn, nồng độ CO2 trong ống nghiệm giảm xuống rất nhanh do hoạt động quang hợp của cây cấy mô. Vì vậy trong suốt thời gian chiếu sáng, cây trong ống nghiệm ở trạng thái đói CO2 trầm trọng, nên chúng phải sử dụng đường của môi trường (Nguyễn Văn Uyển, 1996). Cùng với sự giảm nồng độ CO2 là sự gia tăng tích tụ khí ethylen (C2H4). Ethylen được biết đến như là một chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Tuy nhiên ở nồng độ cao ethylen là một chất độc đối với cây. Nồng độ ethylen trong hộp nuôi cấy tăng dần theo thời gian đến nồng độ 2 μmol mol -1 từ 21 đến 60 ngày sau khi cấy (Nguyễn và Kozai, 1998). Nồng độ ethylen thường tăng cao trong các hộp nuôi cấy kém thông thoáng (De Proft và các cộng sự, 1985). Thông thường ánh sáng được sử dụng trong phòng nuôi cấy mô chỉ ở vào khoảng 30 – 50 μmol m-2 s-1. Cường độ ánh sáng này thấp hơn nhiều so với điều kiện tự nhiên. Việc sử dụng cường độ ánh sáng thấp đã làm giảm khả năng quang hợp, dẫn đến việc cây không sử dụng có hiệu quả nguồn carbon từ CO 2 mà phải tăng cường dị dưỡng bằng cách hấp thu carbon từ đường trong môi trường nuôi cấy. Trong nuôi cấy mô truyền thống, agar được sử dụng rất phổ biến như là một giá thể để cố định mẫu cấy. Hệ rễ có thể phát triển được trong môi trường agar, tuy nhiên chúng rất mỏng manh, dễ gãy và hư hại khi chuyển ra bầu đất (Roberts và Smith, 1990; Robert và các cộng sự, 1994). Sự phát triển kém của hệ rễ một phần bởi sự kém thông thoáng và sự kém oxygen hòa tan trong môi trường thạch (Fujiwara và Kozai, 1995). Các nghiên cứu đã chứng minh việc thay thế agar trong môi trường nuôi cấy bằng các giá thể xốp như vermiculite, perlite, Florialite đã tạo điều kiện thông thoáng hơn cho sự phát triển hệ rễ (Kozai và các cộng sự, 1996; Nguyễn và Kozai, 1998; Nguyễn và các cộng sự, 1999). Vì vậy mặc dù ứng dụng của vi nhân giống trong các lĩnh vực làm vườn, nông nghiệp, lâm nghiệp đang rộng khắp thế giới, nhưng tính chất thương mại hóa của nó vẫn còn hạn chế bởi chi phí sản xuất cao và lợi nhuận thấp (Niu và Kozai, 1998). 20 2.4. Giới thiệu về các hệ thống nuôi cấy trên thế giới Hệ thống nuôi cấy được cải tiến không ngừng để thuận tiện cho việc sử dụng và nâng cao chất lượng của cây cấy mô. Năm 1897, lần đầu tiên Loed đã sử dụng hệ thống nuôi cấy bằng ống nghiệm. Tuy nhiên hệ thống nuôi cấy này có rất nhiều nhược điểm. Kỹ thuật nuôi cấy trong bình tam giác đã được Carrel phát triển vào năm 1923. Sau thành công này, nhiều hệ thống nuôi cấy đã được thử nghiệm như: bình ống, Erlenmeyer, bình Roux hay đĩa petri (Willmer, 1966). Hiện nay những loại bình này vẫn còn được sử dụng trong vi nhân giống. Ngoài các cải tiến về kiểu dáng, vật liệu dùng thiết kế hệ thống cũng không ngừng thay đổi: thủy tinh, polypropylene, polyvinylglycine và polycarbonate (Zobayed và cộng sự, 2000). Hiện nay những cải tiến của bình Magenta, được thiết kế đặc biệt để tăng cường sự thoáng khí của không gian trong bình. Song song với sự phát triển các loại bình nuôi cấy, khoa học kỹ thuật ngày càng tiến bộ đã tạo ra được nhiều vật liệu khác nhau phục vụ cho việc cải tiến các hệ thống nuôi cấy như màng thoáng khí Milliseal. Hệ thống film thoáng khí chứng tỏ có nhiều ưu điểm vượt trội so với các hệ thống cũ. tuy nhiên, giá thành của hệ thống này còn quá cao do sử dụng vật liệu đắt tiền (Tetrafluoroethylene perfluoroalkyl vinyl ether copolymer hoặc Tetrafluoroethylene hexafluoropropylene copolymer ). Do đó, khó có thể ứng dụng thương mại trong điều kiện ở Việt Nam. Hầu hết các phòng nuôi cấy mô ở Việt Nam thường sử dụng bình thủy tinh trong nuôi cấy in vitro. Gần đây, những nghiên cứu trong việc sử dụng túi nylon đã chứng tỏ được tính ưu Việt trong việc tiết kiệm chi phí trong nhân giống cây in vitro. Hệ thống túi nylon đang ngày càng được sử dụng rộng rãi, và dần thay thế bình thủy tinh trong các phòng nuôi cấy mô ở nước ta. 2.5. Phƣơng pháp vi nhân giống quang tự dƣỡng Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation) đã được giáo sư Kozai và các cộng sự đẩy mạnh nghiên cứu trong thập niên 90. Từ đó đến nay có rất nhiều nghiên cứu thành công trong việc ứng dụng phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng vào sản xuất giống cây trồng.
- Xem thêm -