Tài liệu Nhân giống in vitro cây cỏ ngọt (stevia rebaudiana)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM -----oOo----- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA) NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD:Ths. NGUYỄN THÀNH SUM SVTH: MSSV PHẠM TRỌNG 10261191 MAI ĐỨC DŨNG 10251691 NGUYỄN ĐỨC THIỆN 10149321 TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 6/ 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM -----oOo----- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA) NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD:Ths. NGUYỄN THÀNH SUM SVTH: MSSV PHẠM TRỌNG 10261191 MAI ĐỨC DŨNG 10251691 NGUYỄN ĐỨC THIỆN 10 149321 TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 6/ 2013 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập tại trường ĐH công nghệp Tp.HCM , chúng em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của Quý Thầy, Cô, Gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, chúng em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Viện Công Nghệ Sinh Học & Thực Phẩm– Trường Đại Học Công Nghệp Thành phố Hồ Chí Minh lời cảm ơn chân thành . Với tri thức và tâm huyết của mình, các thầy, cô đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường. Chúng em xin chân thành cảm ơn Ths.Nguyễn Thành Sum đã tận tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp cũng như những buổi nói chuyện, thảo luận về lĩnh vực trong nghiên cứu khoa học. Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của thầy thì đồ án của chúng em rất khó có thể hoàn thành. Bài báo cáo này không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của Quý Thầy Cô để bài báo cáo được hoàn thiện hơn. Trang i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... MỤC LỤC ..............................................................................................................ii DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................... v DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. vi CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................... viii PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................... 1 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................... 2 2.1. Giới thiệu cây Cỏ ngọt ................................................................................... 2 2.1.1. Vị trí phân loại ..................................................................................... 2 2.1.2. Nguồn gốc cây cỏ ngọt ........................................................................ 2 2.1.3. Phân bố ................................................................................................ 3 2.1.4. Đặc điểm hình thái .............................................................................. 3 2.1.5. Đặc điểm sinh trưởng: ......................................................................... 4 2.1.6. Điều kiện sinh trưởng .......................................................................... 5 2.2. Nhân giống cây trồng in vitro ........................................................................ 6 2.2.1. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật .............................................. 6 2.2.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................... 6 2.2.3. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật. ................. 8 2.2.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro ....................................................... 8 2.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro ................................. 10 2.2.6. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................. 12 2.2.7. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy................................................. 12 2.2.8. Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) ................................ 13 Trang ii i 2.2.9. Những thành tựu về nuôi cấy cây cỏ ngọt trên thế giới và Việt Nam ...........................................................................................................15 PHẦN 3: 3.1. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 16 Vật liệu ........................................................................................................ 16 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 16 3.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ ................................................................... 16 3.1.3. Môi trường nuôi cấy .......................................................................... 18 3.1.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro ................................................................ 18 3.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 19 3.2.1. Phương pháp khử trùng ..................................................................... 19 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm ................................................................... 19 3.2.3. Phân tích thống kê ............................................................................. 25 3.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................... 25 PHẦN 4: 4.1. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 26 Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của mẫu cấy cây Cỏ Ngọt in vitro. ................................................................... 26 4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát tìm môi trường cơ bản phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển cây Cỏ ngọt in vitro ............................................................................. 27 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. .............................................................. 29 4.3.1. Thí nghiệm 3a: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung Ki kết hợp với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. ....................... 30 4.3.2. Thí nghiệm 3b: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung Ki kết hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. ............... 32 4.3.1. Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA kết hợp với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. ................. 33 Trang iii Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA 4.3.1. kết hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. ............... 34 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA , NAA và IAA đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. ............................................................................. 35 4.4.1. Thí nghiệm 4a: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. ....................................................................................... 36 4.4.2. Thí nghiệm 4b: Khảo sát ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. ............................................. 37 4.4.3. Thí nghiệm 4c: Khảo sát ảnh hưởng của IAA đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. ....................................................................................... 39 PHẦN 5: KẾT LUẬN ....................................................................................... 42 KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Trang iv DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana) ............................................................ 2 Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt............................................................................................. 2 Hình 2.2 Các bộ phận của cây cỏ ngọt. ................................................................... 4 Hình 4.1 Các dạng mẫu trong thí nghiệm khử trùng mẫu: a. mẫu sống và mọc chồi; ....................................................................................................................... 27 Hình 4.2 Kết quả nghiệm thức tìm môi trường cơ bản cho cỏ ngọt in vitro......... 29 Hình 4.3 Chiều cao và số chồi ở các nghiệm thức nhân nhanh chồi trong môi trường có sự kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l IBA .................................................... 31 Hình 4.4 Nghiệm thức nhân nhanh chồi kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l NAA ........ 33 Hình 4.5 Chiều cao và hình thái chồi trong các nghiệm thức kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l IBA.......................................................................................................... 34 Hình 4.6 Hình thái cây trong các nghiệm thức nhân nhanh chồi có kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l NAA ............................................................................................ 35 Hình 4.7 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung IBA ..................................... 37 Hình 4.8 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung NAA. .................................. 39 Hình 4.9 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bố sung IAA ..................................... 41 Trang v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số chất khử trùng và khoảng thời gian khử trùng thường dùng trong nhân giống in vitro .................................................................................................. 9 Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong thí nghiệm tạo mẫu Cỏ Ngọt in vitro sạch bệnh ............................................................................................................................... 20 Bảng 3.2 Các nghiệm thức thí nghiệm tìm môi trường cơ bản cho cây Cỏ Ngọt in vitro. ...................................................................................................................... 21 Bảng 3.3 Các nghiệm trong thí nghiệm nhân nhanh chồi thức nhân nhanh chồi . 22 Bảng 3.4 các nghiệm thức trong thí nghệm tìm môi trường ra rễ cho cây Cỏ Ngọt in vitro ................................................................................................................... 24 Bảng 4.1 Kết quả nghiệm thức khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng mẫu Cỏ ngọt bằng chất khử trùng TCCA ........................................................................... 26 Bảng 4.2 Kết quả của thí nghiệm tìm môi trường cơ bản tối ưu cho cây Cỏ ngọt in vitro ....................................................................................................................... 28 Bảng 4.3 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có sự bổ sung kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l IBA.......................................................................................................... 30 Bảng 4.4 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có bổ sung kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l NAA .............................................................................................................. 32 Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l IBA ............................................................................................................................... 33 Bảng 4.6 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l NAA ............................................................................................................................... 34 Bảng 4.7 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IBA ................ 36 Bảng 4.8 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung NAA .............. 37 Bảng 4.9 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IAA ............... 39 Trang vi Trang vii CÁC TỪ VIẾT TẮT MS : Murashige và Skoog IBA : Indol butyric acid NAA : Napthlacetic acid IAA : Indol acetic acid Ki : Kinetin BA : Benzyl adenin ĐC : Nghiệm thức đối chứng Trang viii Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thông kê gần đây, tỉ lệ mắc bệnh đái tháo đường, thường được gọi là bệnh tiểu đường đang gia tăng nhanh tại Việt Nam. Năm 1990 tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường chỉ ở mức từ 0,9%( Huế) cho đến 2,52%( thành phố Hồ Chí Minh), nhưng chỉ sau 10 năm, năm 2001 tỷ lệ này ở các thành phố lớn đã là 4,1%, năm 2002 tăng lên 4,4%- với mức tính ở cả cộng đồng là 2,7% dân số; nếu tính ở nhóm người có yếu tố nguy cơ mắc bệnh cao thì tỷ lệ bệnh đã tăng trên 10%-. Theo thống kê năm 2008, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường trong cả nước là trên 5% (khoảng 4,5 triệu người), tại các thành phố lớn và khu công nghiệp có tỷ lệ từ 7,0 đến 10% . Theo dự đoán, con số người mắc bệnh tiểu đường tại Việt Nam sẽ còn tăng hơn nữa khi kinh tế tiếp tục tăng trưởng và càng ngày càng nhiều người tại Việt Nam chuyển sang lối sống thành thị hiện đại. “Chúng ta sẽ chứng kiến một đại dịch thực sự tại Việt Nam trong những năm tới,” ông Jessper Hoiland được Tờ The New York Times trích thuật. “Ngày nay nhiều người chết vì ăn quá nhiều hơn là vì đói” ( Hoiland ). Các con số chính thức ở Việt Nam cho thấy bệnh tiểu đường túyp 2 gia tăng với chỉ 1% người trưởng thành trong dân số vào năm 1991, năm đầu tiên có khảo sát toàn quốc, lên 6% vào năm ngoái, theo trích dẫn của tờ The New York Times. Trước tình hình đó, dựa trên đường Steviozit có trong cây cỏ ngọt có công thức là C38H60O18 có độ ngọt gấp 300 lần so với đường saccharose, ít năng lượng, ngon, không lên men, không bị phân huỷ, bởi vậy rất có triển vọng dùng để thay đường trong chế độ ăn kiêng và hỗ trợ trong căn bệnh tiểu đường. Hiện nay ở nước ta, Cây cỏ ngọt là một trong những cây trong nhóm được chú ý phát triển. Cây cỏ ngọt đã đang được nhân giống bằng phương pháp truyền thống như giâm cành, gieo hạt nên khó đảm bảo được về chất lượng, tính đồng nhất của giống và có thể gây thoái hóa giống. Vì vậy, chúng tôi thực hiên đề tài: “NHÂN GIỐNG CÂY CỎ NGỌT IN VITRO (STEVIA REBAUDIANA)”. Nhằm mục đích góp một phần nhỏ vào việc tạo nguồn cây con đồng nhất cho sản xuất. Trang 1 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu cây Cỏ ngọt Tên thường gọi: Cỏ ngọt, Cỏ mật, cỏ cúc... Tên khoa học: Stevia rebaudiana 2.1.1. Vị trí phân loại Giới: Plantae Bộ: Asterales Tông: Eupatorieae Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt (Stevia Họ: cúc Asteraceae (Compositae) rebaudiana) Chi: Stevia Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt Loài: Stevia rebaudiana Cỏ ngọt có khoảng 240 loài có nguồn gốc từ vùng Nam Mỹ, Trung Mỹ, Mexico và một vài tiểu bang miền namHoa Kỳ. Một số loài cỏ ngọt tiêu biểu sau :  Stevia eupatoria  Stevia rebaudiana  Stevia ovata  Stevia salicifolia  Stevia plummerae  Stevia serrata Tuy nhiên các nhà khoa học đã khảo sát trên 184 loài cỏ ngọt thì có khoảng 18 loài cho chất ngọt nhưng trong 18 loài này Stevia ribaudiana là loài cho chất ngọt nhiều nhất. 2.1.2. Nguồn gốc cây cỏ ngọt Có nguồn gốc từ thung lũng Rio Monday nằm ở đông bắc Panama Trung Mỹ. Vào thế kỉ 16, các thủy thủ người Tây Ban Nha đã từng đề cập đến loại thảo mộc này rồi nhưng đến năm 1888 các nhà thực vật học người Paraguay là Mises Santiago Bertoni mới phân loại và chính thức đặt tên gọi nó là Stevia rebaudianoa Trang 2 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Bertoni. Từ ngàn năm nay thổ dân Guarani người Paraguay đã dùng loại thảo mộc này để làm dịu ngọt các loại thức ăn, nước uống có tính đắng và cũng dùng để trị một số bệnh béo phì, tim mạch, cao huyết áp. 2.1.3. Phân bố Cỏ ngọt được trồng và sử dụng hầu hết các Châu lục, đặc biệt ở các nước Nhật Bản, Inđônêxia, Braxin, Paraguay, Mỹ, Thái Lan… Ngày nay cỏ ngọt được trồng khá phổ biến ở Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Hàn Quốc, Inđônêxia và một số nước khác. Cỏ ngọt được nhập vào nước ta từ năm 1988 trồng thử nghệm. Hiện nay cỏ ngọt đã thích ứng với nhiều vùng khí hậu khác nhau ở nước ta như, sinh trưởng tốt tại Sông Bé, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Yên bái. 2.1.4. a. Đặc điểm hình thái Thân, cành Cỏ ngọt là dạng thân bụi thân tròn có nhiều lông, mọc thẳng. Chiều cao thu hoạch là 50-60 cm, tốt đạt 80-120 cm, thân chính có đường kính đạt 2.5 –8 mm. Cỏ ngọt phân cành nhiều, khi ra hoa mới phân cành cấp 2, 3. cành cấp 1 thường xuất hiện từ các đốt lá cách mặt đất 10 cm. Thông thường cây cỏ ngọt cho 25– 30 cành. Tổng số cành trên cây có thể đạt 140. Thân non màu xanh, già màu tím nâu, có hệ thân mầm phát triển mạnh. b. Lá Mọc đối thành từng cặp hình thập tự, mép lá có từ 12-16 răng cưa. Lá hình trứng ngược. Cây con gieo từ hạt có 2 lá mầm tròn tới cặp lá thứ tư mới có răng cưa ở mép lá. Lá trưởng thành dài khoảng 50 – 70mm, rộng 17-20mm có 3 gân song song, lá màu xanh lục,trên thân có70-90 lá. c. Hoa Hoa tự, nhóm họp dày đặc trên đế hoa, trong đó có 4-7 hoa đơn lưỡng tính. Mỗi hoa đơn hình ống có cấu trúc gồm một đế hoa với 5 đài màu xanh, 5 cánh tràng màu trắng khoảng 5 mm, các lá bắc tiêu giảm, nhị 4-5 dính trên tràng có Trang 3 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum màu vàng sáng, cá chỉ nhị rời còn bao phấn dính mép với nhau. Bầu hạ 1 ô, 1 noãn, vòi nhụy mảnh chẻ đôi, các nhánh hình chỉ cao hơn bao phấn do đó mà khả năng tự thụ phấn thấp hoặc không có. d. Quả và hạt Quả và hạt của cây cỏ ngọt nhỏ, thuộc loại quả bế, khi chín màu nâu thẫm, 5 cạnh dài từ 2- 2,5mm. Hạt có 2 vỏ hạt, có phôi, nhưng nội nhũ trần do vậy tỉ lệ này mầm thấp. e. Rễ Rễ của cây gieo từ hạt ít phát triển hơn so với cành giâm. Hệ rễ chùm lan rộng ở đường kính 40 cm và có độ sâu từ 20– 30 cm, hệ rễ phát triển tốt trong điều kiện đất tơi xốp, đủ ẩm. Là cây lâu năm có thân rễ khỏe, mọc nông từ 0–30 cm tùy thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nước ngầm của đất. Hình 2.3 Các bộ phận của cây cỏ ngọt. 2.1.5. Đặc điểm sinh trưởng: Cỏ ngọt là cây lâu năm, nó có thể sống từ 5-10 năm. Tuy nhiên, khi năng suất Trang 4 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum của cỏ ngọt đã xuống thấp thì nên nhổ bỏ và trồng lại cây mới. Là cây bán nhiệt đới ưa ẩm, ưa sáng nhưng sợ úng và chết khi ngập nước. Sinh sản hữu tính (gieo hạt) hoặc vô tính (giâm cành). 2.1.6. Điều kiện sinh trưởng a. Nhiệt độ Cỏ ngọt là cây trồng nhiệt đới, sinh trưởng trong điều kiện mát mẻ. Có thể sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ từ 15-30℃, nhiệt độ thích hợp nhất là 20-22℃. Nhiệt độ tối thích hợp cho sự nảy mầm của hạt là 20℃. Nhiệt độ cao làm tăng hàm lượng steviozit. Từ 15-30℃ cây sinh trưởng khoẻ, cho năng suất thu hoạch cao. Nhiệt độ > 35℃. cây sinh trưởng kém. b. Ẩm độ Môi trường sống tự nhiên của cây cỏ ngọt thích hợp nhất là khí hậu cận nhiệt đới, ưa ẩm ướt, với lượng mưa trung bình hàng năm từ 1400-1600mm. Độ ẩm thích hợp nhất cho sinh trưởng, phát triển là 70-85%. Cỏ ngọt thường mọc tự nhiện trên các đầm lầy. c. Ánh sáng Cỏ ngọt là cây tương đối mẫn cảm với độ chiếu sáng. Cường độ ánh sáng mạnh làm tăng hàm lượng steviozit. d. Đất và dinh dưỡng khoáng Cỏ ngọt có thể sinh trưởng và phát triển trên nhiều loại đất khác nhau, nhưng thích hợp nhất là đất tơi xốp, thông thoáng, nhiều mùn. Trên những đất như thế cỏ ngọt cho thu hoạch cao, hàm lượng các chất ngọt tăng. Đất sét không thích hơp cho sự sinh trưởng của cỏ ngọt. Cỏ ngọt là cây thu hoạch lá do vậy nó yêu cầu chế độ dinh dưỡng cao, vì thế bón phân là biện pháp tích cực để tăng năng suất cỏ ngọt. Cỏ ngọt ưa đất trung tính, PH trong đất khoảng từ 6,5 đến 7 là tốt nhất. Trang 5 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum 2.2. Nhân giống cây trồng in vitro 2.2.1. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất. Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây trồng quý hiếm. Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phương pháp nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất. Năm 1939, nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi (White, 1939) và rễ (Nobercourt, 1939). Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan (Thorpe, 1980, 1988). Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy có 3 nhân tố ảnh hưởng trực tiếp: Môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu được sử dụng trong nuôi cấy. Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tương hỗ của các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quá trình hình thành chồi và rễ (Brown & Thorpe, 1986). 2.2.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lý thực vật. Ở nước ta ngành này mới được chú ý và phát triển khoảng 15 - 20 năm trở lại đây. Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã Trang 6 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum được phát triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học như Nguyễn Văn Uyển (1993) và một số nhà nuôi cấy mô nước ngoài đã nhận định: Đó là tính toàn thế của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời. Đây là một điểm rất quan trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng. Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cây đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính. Vấn đề này được các nhà khoa học khai thác để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (cam, quýt). Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lương thực (khoai tây), cây cảnh (phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn, tếch,...). Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng trao đổi Quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm. Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo. Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen. Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó khả năng ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống. Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai. Khả năng sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai xa. Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp không mất tính toàn thế của tế bào. Đồng thời nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu di truyền thực vật, vai trò chất điều hoà sinh trưởng thực vật. Trang 7 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần quan trọng không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh tế. Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nước ta từ nay tới năm 2010 là: Tạo ra các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1995). 2.2.3. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật. Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợi điểm sau: Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ. Phần này giống như nhân giống vô tính. Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống qua hạt. So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn. Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh. Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất. Việc trao đổi giống được dễ dàng. 2.2.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ đạt được khi trải qua các giai đoạn: a. Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa Trang 8 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum vào nuôi cấy in vitro. Theo tài liệu của Street (1974) các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô nuôi cấy như sau: Bảng 2.1 Một số chất khử trùng và khoảng thời gian khử trùng thường dùng trong nhân giống in vitro Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử Hiệu quả lý (phút) Hypochlorit Natri hypochlorit Calcium 9-10 2 5-30 5-3 Rất tốt Rất tốt Hydroperoxid 10-12 5-15 Tốt Nước brom 1 -2 2 - 10 Rất tốt HgCl2 0,1 -1 2 - 10 TB Chất kháng sinh 4 - 50mg/l 30 - 60 Khá tốt Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả. b. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hoá sâu. Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi. c. Giai đoạn 3: Nhân nhanh Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà Trang 9 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum sinh trưởng (Auxin, Cytokynin, Gibberellin,...), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,. kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính. d. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. e. Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt dộ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,.) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất. 2.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro a. Mẫu nuôi cấy Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Điều quan trọng cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn lọc, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn mẫu. b. Kiểu gen Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài thuốc lá được sử Trang 10