Tài liệu Nhân giống cây hoa tiên (Asarum Glabrum Merr.) bằng phương pháp nuôi cấy mô

B ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI H Ọ C D ư ợ c HÀ N Ộ I TRẦN TIẾN DŨNG NHÂN GIỐNG CÂY HOA TIÊN ASARUM GLABRUM MERR. BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI C Y MÔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC KHÓA Người hướng dẫn: ThS. Tạ Như Thục Anh ThS. Vũ Vân Anh Noi thực hiện - Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội. - Xã Ba Vì huyện Ba Vì tỉnh Hà Tây - Bộ môn Thực Vật trường Đại học Dược Hà Nội Thòi gian thực hiện: 5/2006 - 6/2007 HÀ NỘI THÁNG 6 NĂM 2007 je Ờ 3 ^ & À M C ffH íỊuéi Irhtít Ihtửí hiên, khứéi Luúết nàụ. lòi đã- nhăềL đượe, ẳư ạivLfL đõ tậễt tình e¿UL íhàụ. eA aà luỊềv bề Çîèi æUt ụjửi Lài eảnv ờềi tm»v thjcmh, tthul lâi: ^CL Qlhu ÇîhjiJLe, cÂnh, (ĩ)ũ (J)â»t cÂnlt 0 ’S Çît^oit (Vaut Ớit Ệiítững. ihầụ. cồ^¿tí ehi ílẫiv, ụiÚỊLđs tòi tậết tÌẾthtrí^iĩự. ữiệe. hứàếv (hành khécLluâềt noM j^ <ĩ)cL iÂi eủnạ, tưứv ihănh eảnt ổềt lởi íờàiL bẠ lậệt ikỀ eáềt lĩẠ (Bậ mồềt ÇîhUa (V ậ t Ç îrU ônjg. <®ạ/ hjß^ H )ư ổe, 'Jôà, Q lệ i ữ ă < J)kồnjg. ỆUA&i e ẩ ụ . ÇÎÊ^ung. i á j f t Q íạ h iỀ ễt cứu Çîmnjg. ÚỈL & i¿ biến, eojf ihuếe. 'Jôci Qlậi đã giúp. đs^f ÌẨ ỊL Ỡđiều kỉỉềt eỉu^ ỉỗi kjúà*t thành khúă Luậềt iứuậ. 'Tỗà QỉỈẬi^ nụàụ. 15 ihánụ. 4 nủm 2007 Sinh (VỉỀiL ^rầjn. Çîæin. n^ăềvg. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ AA-I Acid Aristolochic I a-NAA a-Naphtylacetic acid BAP Benzylaminopurin BTTN Bảo tồn thiên nhiên ĐHST Điều hoà sinh trưởng K Kinetin MS Môi trường Murashige & Knoog VQG Vườn quốc gia MỤC LỤC PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỂ..........................................................................................3 PHẦN 1 : TỔNG QUAN............................................................................................5 1.1. Cây Hoa tiên..................................................................... ................................... 5 1.1.1. Chi Asamm L. 1753.......... .............................................................................. 5 1.1.2. Đặc điểm thực vật của Hoa tiên (Asarum glabrum Merr).............................. 5 1.1.3. Thành phần hóa học của Hoa tiên.....................................................................6 1.1.5. Công dụng.........................................................................................................8 1.2. VQG Ba Vi và cộng đồng người Dao ở khu vực VQG Ba V ì.............................8 1.2.1. Vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên...........................................................................8 1.2.2. Cộng đồng người Dao ở khu vực VQG Ba V ì....................................................9 1.3. Bảo tồn tài nguyên cây thuốc..........................................................................10 1.3.1. Giá trị của tài nguyên cây thuốc.................... .............................................. 10 1.3.2. Hiện trạng bảo tồn tài nguyên cây thuốc........................................................ 11 1.3.4. Các phương pháp bảo tồn tài nguyên cây thuốc..............................................12 1.4. Các phương pháp nhân giống cây trồng và phương pháp nhân giống nuôi cấy mô (nhân giống In vitro).....................................................................................14 1.4.1. Nhân giống hữu tính.........................................................................................14 1.4.2 Nhân giống vô tính........................................................................................... 15 1.4.3. Nhân giống nuôi cấy mô ị nhân giống In vitro)..............................................17 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ............................... 24 2.1. Nguyên vật liệu.................... ............................................................................24 2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 24 2.2.1 Điều tra tình hình thu hái, chế hiến, mua bán, sử dụng Hoa tiên................... 24 2.2.2. Nuôi cấy In vitro............................................................................................ 24 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................................ 28 3.1 Kết quả điều tra tình hình sử dụng, thu hái, chế biến và mua bán cây Hoa tiên trong (Ả. glabrum Merr.) cộng đồng người Dao ở Ba Vì............................ 28 3.2 Nghiên cứu nhân giống In vitro..................................................................... 32 3.2.1 Nghiên cứu chế độ khử trùng mẫu.................................................................. 32 3.2.2 Ảnh hưởng của BAP và Kinetin tôi tỷ lệ hình thành chồi và hệ số nhân chồi.34 3.2.3 Ảnh hưởng của các tổ hợp BAP và a-NAA tới sự tái sinh chồi và hệ số nhân chồi...........................................................................................................................37 3,2.4.Ảnh hưởng của a-NAA tới sự ra rễ................................................................ 40 3.2.5 Nghỉên cứu đưa cây ra đất............................................................................. 42 3.3 BÀN LUẬN.....................................................................................................45 3.3.1 Điều tra tình hình thu hái, mua bán, sử dụng Hoa tiên trong cộng đồng người Dao ở khu vự VQG Ba V ì............................................................................ 45 3.3.2 Nhân giống nuôi cấy mô................................................................................46 KẾT LUẬN.............................................................................................................48 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................... .............................................49 B ộ CÂU HỎI PHỎNG VẤN ĐlỂU TRA TÌNH HÌNH.................................... 53 PHỤ LỤC 2: CÔNG THỨC MÔI TRƯỜNG M S.............................................. 55 PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC.............................................................57 GIÂY CHỨNG NHẬN Mà s ố TIÊU BẢN....................................................... 58 PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỂ Việt Nam là một nước có nguồn tài nguyên thực vật hết sức đa dạng và phong phú, được đánh giá là một trong 16 trung tâm đa dạng sinh học bậc nhất trên thế giói [4]. Nguồn tài nguyên này đã và đang góp phần tích cực trong việc phát triển kinh tế và chăm sóc sức khoẻ ban đầu cho nhân dân nofi mà điều kiện kinh tế còn gặp nhiều khó khăn. Song, do chịu áp lực của điều kiện kinh tế còn nhiều khó khăn, nhận thức của nhân dân còn chưa đầy đủ thêm vào đó là sự yếu kém trong khâu quản lý nguồn tài nguyên cây thuốc nên tód việc khai thác ồ ạt, thiếu sự kiểm soát đã làm cho nguồn tài nguyên này bị suy giảm nhanh chóng, một số loài cây thuốc quý có nguy cơ biến mất hoàn toàn. Vậy làm sao để khai thác hçfp lý và bền vững là một thách thức không nhỏ. Hoa tiên (Asamm glabrum Merr. hay A. maximum Hemsl.) là một trong các loài cây thuốc quý được sử dụng rộng rãi trong Y học dân tộc Việt Nam cũng như trong một số cộng đồng dân tộc thiểu số ở phía Bắc nước ta. Hoa tiên cũng đang bị xếp vào một trong các loài có nguy cơ tuyệt chủng (cấp độ E) trong danh mục sách Đỏ Việt Nam phần thực vật [12]. Loài này là một trong 7 loài cây thuốc bị ngưòi Dao ở Ba Vì khai thác và sử dụng nhiều nhất để làm thuốc bổ, tăng cường sinh lực cho nên giá trị kinh tế của loài này là khá cao đã làm cho số lượng loài này bị suy giảm một cách mạnh mẽ [20],[21]. Hơn nữa khả năng tái sinh tự nhiên của Hoa tiên là rất thấp. Các nghiên cứu nhân giống Hoa tiên sử dụng các phưoĩig pháp như giâm hom, tái sinh bằng thân rễ đều không thành công do hệ số nhân thấp và gặp phải vấn đề lớn về nguồn nguyên liệu phục vụ cho nghiên cứu [20]. Những điều này dẫn đến nguy cơ Hoa tiên biến mất hẳn khỏi khu vực VQG Ba Vì. Chính vì vậy, chúng tôi chọn thực hiện đề tài "'Nhân giống cây Hoa tiên (Asarum glabrum Merr.) bằng phương pháp nuôi cấy wô” vói mục tiêu đóng góp thêm 1 phương pháp nhân giống Hoa tiên để có thể tìm ra giải pháp bảo tồn và phát triển bền vững loài cây này. Nội dung của khoá luận bao gồm 2 phần: + Điều tra tình hình khai thác, mua bán, sử dụng Hoa tiên của cộng đồng người Dao khu vực VQG Ba Vì Hà Tây. + Nghiên cứu nhân giống Hoa tiên bằng phương pháp nuôi cấy mô. PHẦN 1 : TỔNG QUAN 1.1. Cây Hoa tiên 1.1.1. Chi Asarum L. 1753 Trên thế giói, hiện có khoảng 90 loài thuộc chi Asarum L. tập trung chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á, một vài loài ở khu vực Bắc Mỹ, một loài đặc hữu của châu Âu, 39 loài ở Trung Quốc trong đó có 34 loài đặc hữu [26]. Việt Nam có tất cả 7 loài thuộc chi Asarum L. [11],[15],[23]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật của Hoa tiên (Asarum glabrum Merr) Cây Hoa tiên (Ạsarum glabrum Merr.) thuộc họ Aristolochiaceae (Họ Mộc hưofng) còn gọi là Trầu tiên, Dầu tiên, Trà tiên, Pền Phvả (Ba Vì), Phiu Hỏa Mia’(Sa Pa). Cây cỏ, sống lâu năm, cao 20-30 cm. Thân rễ mảnh, chia nhiều đốt ngắn, mỗi đốt thường ngắn hơn 1 cm. Lá thưòỉng có từ 1-2 lá, hình tim dài 8-12cm, rộng 4-7 cm. Cuống lá dài 10-18 cm. Phiến lá nguyên, 2 mặt nhẩn, đầu lá nhọn, gốc lá hình khiên, mặt trên màu lục sáng, mặt dưói màu lục nhạt, 7 gân tỏa từ gốc lá, Hoa mọc đơn độc ở đầu ngọn, có cuống dài 2-3 cm. Lá bắc dài, hẹp và nhọn. Bao hoa màu xám nâu hoặc tím đậm, trên bao hoa có những vạch sọc xanh, tún xen kẽ, bao hoa hình ống, chia 3 thùy hình tim,. Nhị 12 đều nhau, bao phấn dài hơn chỉ nhị. Nhụy tập hçfp thành cột dày, ngắn hơn bao phấn [1],[12],[15],[26]. Quả được bao bọc bỏi bao hoa tồn tại. Hạt nhỏ màu tun, hoặc nâu đen bóng. Mùa ra hoa, quả từ tháng 3-6. Phân bố: mọc dọc theo các khe đá, bờ suối có độ cao từ 700m-1500m thuộc địa bàn các tỉnh Lào Cai (Sa Pa), Quảng Ninh (Yên Tử), Hà Giang (Mèo Vạc), Hà Tây (Ba Vì), w . .. Hình 1: Cây Hoa tiên 1.1.3. Thành phần hóa học của Hoa tiên Trong chi Asarum, hầu hết tất cả các loài đều chứa tinh dầu, hàm lượng thay đổi từ 1-3% và là hỗn hợp của rất nhiều thành phần trong đó hầu hết đều có chứa methyl eugenol, safrole, [1],[2],[14],[22],[36],[41],[42]. Hiện chưa có nghiên cứu nào đầy đủ và về thành phần hóa học của cây Hoa tiên. Một số nghiên cứu sơ bộ cho thấy trong thân và thân rễ Hoa tiên có chứa 1%3% là tinh dầu, tỷ lệ này thay đổi theo mùa và noi thu hái [1],[2],[14]. Trong một vài nghiên cứu gần đây cho thấy, trong lá Hoa tiên cũng có chứa tinh dầu tinh dầu. Thành phần chủ yếu của tinh dầu bao gồm: methyl eugenol, safrole, và một số thành phần khác. Trong lá và hoa có chứa nhiều sắc tố anthocyanosid, khi ngâm vói rượu cho màu xanh đậm (lá) và màu hồng tươi hoặc hồng tím (hoa) [1],[2],[14],[22]. Một số loài khác trong chi Asarum đã được nghiên cứu tương đối đầy đủ về thành phần hóa học. Phân tích thành phần hóa học trong lá và rễ Asarum forbeii Maxim, bằng phương pháp sắc kí khí, Feng Zhang và cộng sự cho kết quả thành phần tinh dầu ngoài methyl eugenol và asarone, còn có chứa a-asarone, methyl isoeugenol. Tinh dầu lá có chứa 20 hợp chất hữu cơ trong đó methyl isoeugenol chiếm 33,3%, a-asarone chiếm 19,3%- Trong lá có chứa 17 hợp chất trong đó aasarone chiếm 58,8% và methyl eugenol 10,3% [41]. Theo kết quả nghiên cứu Zhang s x và cộng sự khi tiến hành phân tích bằng phưoỉng pháp sắc kí dịch chiết methanol của A. longerhizomatosum tách được 5 hợp chất là: Asarone, 2,4,5-trimethoxybenzaldehyde, ß-sitosterol, 4(2,4,5 trimethoxyphenyl)-3-en-butylone và 3-ß-hydroxylstigmast-en-7-one [42]. Theo từ điển bách khoa dược học thì trong thân và rễ của loài Tế tân A. heterotropoides Fr.Schmidit chứa 2,75% tinh dầu chủ yếu là pinen, methyl eugenol, một số hợp chất ceton, 1 chất có nhóm chức phenol có T„c =110”c , acid hữu cơ và chất nhựa [22]. Loài Tế tân A. sieboldii fMiq.) F. Maekawa chứa 2,75% tinh dầu trong đó có 1,8-cineol, asaricin, methyl eugenol, croweacin, a-pinen, ß-pinen, a-thuyen, myrcen, terpinen -4-ol, a- terpineol, safrole, myristicin [1]. Theo kết quả nghiên cứu được đưa ra bỏd Rostogi và Mehrotra thì thành phẩn hóa học của loài A. europaenum L. có chứa a asarone, triacylglycerid [36]. Rất nhiều loài trong chi Asarum tìm thấy có sự xuất hiện của Acid aristolochic một chất độc với thận và có khả năng gây ung thư đã được cơ quan Quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (FDA) khuyến cáo không nên sử dụng [25]. Acid aristolochic I (AA-I) được tìm thấy không chỉ có trong các cây thuộc chi Asarum mà còn tìm thấy trong nhiều cây thuộc các chi như Arìstolochia spp. , Bragantia spp., Stephanỉa spp., Clematis spp., Akebia spp., Cocculus spp., Diploclisia spp., Menispernum spp., Sinomenium spp. [25],[37]. Các cây trong chi Asarum có hàm lượng AA-I khác nhau và thay đổi khá nhiều giữa các loài khác nhau. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng 9 loài thuộc chi này đã được nghiên cứu có hàm lượng AA-I từ 3,3ng/mg (A. sieboldii) đến 3376,9 ng/mg(A. crispulatum ) [25],[29]. 1.1.4. Tác dụng dược lý a. Tác dung gây tê cuc bổ Dịch chiết bằng cồn của Hoa tiên trên tiêu bản thần kinh cơ đùi ếch có tác dụng phong bế dẫn truyền các xung thần kinh. Khi bôi dạng cồn thuốc nên lưỡi sau nửa phút thì đầu lưỡi có cảm giác cay lạnh, sau 1 phút thì đầu lưỡi tê, rồi cảm giác đau hoàn toàn biến mất, sau một giờ hồi phục dần. Dạng nước sắc không có tác dụng. Tinh dầu Hoa tiên có tác dụng gây tê bề mặt, nhỏ vào mắt làm mất phản xạ giác mạc [36]. b. Tác dung trên tim mach Dịch chiết bằng cồn tỷ lệ (1:2) trên động vật thực nghiệm bằng đường tiêm tĩnh mạch liều 0,4 ml/kg có tác dụng tăng cường co bóp cơ tim, tăng hiệu xuất làm việc tâm thất. Trên chó thí nghiêm, dịch chiết cồn của Hoa tiên tiêm tĩnh mạch liều o.lmg/kg có tác dụng hạ huyết áp, giãn nhẹ mạch ngoại vi [36]. c. Tác dung an thán, chống co giât Tinh dầu Hoa tiên trên chuột nhắt trắng thí nghiệm, tiêm xoang bụng vói liều 0,06ml/kg có tác dụng an thần, giảm hoạt động tự nhiên của chuột, dùng liều lớn hofn có tác dụng gây ngủ, gây mê. Tinh dầu Hoa tiên dùng cùng cloral hydrat có tác dụng tăng cường ức chế thần kinh trung ương, đối kháng với co giật do kích thích điện và Strychnin gây nên [36]. 1.1.5. Công dụng Cây Hoa tiên mới chỉ được sử dụng trong phạm vi dân gian. Nhân dân ở khu vực Ba Vì - Hà Tây dùng hoa ngâm rượu uống nhằm bồi bổ cơ thể và tăng cường thể lực, kích thích ăn ngon, ngủ tốt [3],[14],[20]. Theo một số tài liệu đã công bố cho thấy Hoa tiên được sử dụng khá nhiều vód mục đích dùng làm thuốc bổ [1],[2],[18],[23]. 1.2. VQG Ba Vì và cộng đồng người Dao ở khu vực VQG Ba Vi 1.2.1. Vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên VQG Ba Vì là một trong 22 VQG ở Việt Nam được thành lập năm 1991, với diện tích 6768 ha và vùng đệm có điện tích 14144 ha. VQG Ba Vì phân bố từ độ cao lOOm -1296 m so vói mặt nước biển. Đia hình: VQG Ba Vì nằm trên khu vực núi trung bình, núi thấp tiếp giáp vùng bán S0fn địa. Với 3 đỉnh cao nhất là đỉnh Vua (1296m), Ngọc Hoa (1131m), Tản Viên (1227m). Độ dốc trung bình 25°, khu vực từ 400m trở lên độ dốc 35°. 8 Đất đai, thổ nhưỡng: Khu vực này có rất nhiều loại đất có nguồn gốc từ đá vôi, đá trầm tích. Các loại đất chính bao gồm : Feralit vàng, Feralit vàng nâu phát triển trên thạch sét, phù sa vàng đỏ phát triển trên đá phiến thạch, phù sa cổ. Khí hâu : Do phân bố ở độ cao từ lOOm đến 1296m nên chế độ nhiệt ở đây có sự thay đổi lớn. Nhiệt độ trung bình là 23,l°c. Trên cao lOOOm là 16,l”c. Biên độ nhiệt ngày đêm là 8°c, có thể thay đổi trong các mùa khác nhau. Lượng mưa hàng năm tương đối lớn khoảng 2000mm nhưng phân bố không đều giữa sườn Đông và sườn Tây và giữa các tháng trong năm [19]. Hê thưc vât: Theo điều tra thì ở VQG Ba Vì đã phát hiện được khoảng 812 loài thực vật có hoa (theo dự đoán có thể đạt 1900 loài nếu được thống kê đầy đủ) thuộc 427 chi và 98 họ [19]. Trong đó có một loài đặc hữu của khu vực và 10 loài được xếp vào danh mục các cây có giá trị cần bảo vệ. Thảm thực vật gồm 2 loại chính : + Rừng mưa nhiệt đới có độ cao từ 800m trở xuống vói các cây thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), Dâu tằm (Moraceae), Đậu (Fabaceae), w . .. + Rừng á nhiệt đód có độ cao từ 700m trở lên vói các họ thực vật đại diện là Chè (Theaceae), Long não ( Lauraceae), Dẻ (Fagaceae), w . .. 1.2.2. Cộng đồng người Dao ở khu vực VQG Ba Vì Khu vực VQG Ba Vì và vùng đệm có tổng số 46.547 nhân khẩu thuộc 3 dân tộc Kinh (21.369 người), Mưòĩig (17.502 người), Dao (4636 ngưòi) phân bố tại 7 xã là Ba Vì, Ba Trại, Khánh Thượng, Minh Quang, Tản Lĩnh, Vân Hoà, Yên Bài [19]. Người Dao ở xã Ba Vì với số lưẹmg gần 1700 ngưòd tập trung ở 3 thôn Yên Sofn, Họfp Sơn, Họfp Nhất, là cộng đồng có tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc phong phú nhất, cũng là cộng đồng khai thác, sử dụng cây cỏ làm thuốc lớn nhất và có ảnh hưởng lớn nhất đến sự khai thác, trồng trọt và bảo tồn của cây thuốc tại khu vực VQG Ba Vì [19],[20]. Tri thức sử dụng cây thuốc của người Dao ở Ba Vì là rất phong phú vói khoảng 503 loài cây thuốc đã được kiểm kê thuộc 321 chi và 118 họ thuộc 5 ngành thực vật khác nhau là: Lycopodiophyta, Equiestophyla, Polypodiophyta, Pinophyta, và Magnoliophyta [20]. 1.3. Bảo tồn tài nguyên cây thuốc 1.3.1. Giá trị của tài nguyên cây thuốc Cây thuốc từ lâu đã được sử dụng cho mục đích bảo vệ và chăm sóc sức khoẻ con ngưòi. Có tói hơn 80% dân số thế giới (4,3 tỷ người) sử dụng cây cỏ hay các sản phẩm có nguồn gốc từ cây cỏ cho mục đích chăm sóc sức khoẻ ban đầu, đặc biệt là người dân ở các khu vực vùng sâu, vùng xa và vùng nông thôn. Giá trị kinh tế của nguồn tài nguyên này cũng hết sức to lớn, ước tính nếu khai thác hết tiềm năng thì giá trị kinh tế có thể đạt tód 900 tỷ USD mỗi năm [4],[38]. Việt Nam là đất nước có nguồn tài nguyên về thực vật nói chung và tài nguyên cây thuốc nói riêng hết sức phong phú và đa dạng. Hệ thực vật Việt Nam có khoảng 1000 loài tảo, khoảng 12000 loài thực vật bậc cao thuộc 2046 chi, 395 họ và theo ước đoán Việt Nam có thể có tới 15000 loài [32]. Trong số 12000 loài cây đã được thống kê thì có tới 3850 loài được sử dụng vói mục đích làm thuốc (Viện dược liệu, 2003). Trong bộ sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của GS. Đỗ Tất Lợi xuất bản năm 1999 giói thiệu 800 cây, con, vị thuốc. Bộ sách “Cây thuốc Việt Nam” của lưoíng y Lê Trần Đức đã đề cập tói 830 loài cây thuốc được sử dụng vód mục đích chữa bệnh. Tác giả Võ Văn Chi trong cuốn “Từ điển cây thuốc Việt Nam” cũng đã đề cập tód 3200 loài cây thuốc. Bộ sách “ Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” cũng đã giới thiệu 800 loài cây thuốc được sử dụng ở Việt Nam. Theo dự đoán nếu thống được kê đầy đủ thì ở Việt Nam có thể có tói 6000 loài cây thuốc [1],[2],[3],[23]. Việt Nam là ngôi nhà chung của 54 dân tộc anh em và mỗi dân tộc đều có tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc riêng của mình. Đây là nguồn tri thức có giá trị to lớn mà cần được quan tâm nhiều hofn nữa. Hiện nay, đã có nhiều sản phẩm có nguồn gốc thảo dược đã được nghiên cứu phát triển thành công và đưa ra thị trường dựa trên tri thức sử dụng cây cỏ của cộng đồng, như Ampelop của Traphaco dựa trên tri thức sử dụng cây chè Dây (Ampélopsis cantonensis Hook, et Am.) của ngưòi TàyCao Bằng. Nếu được quan tâm và đầu tư đúng mức chúng ta hoàn toàn có thể phát 10 triển được rất nhiều bài thuốc cổ truyền thành các chế phẩm thuốc có giá trị kinh tế cao, 1.3.2. Hiện trạng bảo tồn tài nguyên cây thuốc Nước ta có nguồn tài nguyên cây thuốc đa dang và phong phú nhưng vì nhiều lý do khách quan cũng như chủ quan đã làm cho nguồn tài nguyên này suy giảm nhanh chóng. Lý do khách quan như chiến tranh tàn phá, gia tăng dân số, nền kinh tế còn gặp nhiều khó khăn, thu nhập bình quân đầu ngưòi thấp,...w. Lý do chủ quan như trình độ dân trí còn thấp, sự khai thác rừng bừa bãi thiếu kiểm soát, trình độ quản lý còn nhiều yếu kém và bất cập . Chính những lý do trên đã làm cho tài nguyên rừng bị khai thác một cách cạn kiệt, làm cho diện tích rừng cũng như chất lượng rừng suy giảm nhanh chóng. Diện tích rừng tự nhiên của Việt Nam đã giảm từ 14.325 nghìn ha năm 1943 xuống 8.252 nghìn ha năm 1995 (Bảng 1). Bảng 1.1 : Diện tích rừng và tỷ lệ che phủ rừng của Việt Nam Năm Diện tích rừng Diện tích Tổng diện Tỷ lệ % diện tự nhiên rừng trồng tích rừng tích che phủ 1943 14.325 0 11.325 43,7 1975 11.076 92.6 11.169 34 1985 9.308 583,6 9.891 30,1 1995 8.252 1.049,7 9.302 28,5 2000 9.444 1.471,4 10.915 33,2 Nguồn: FIPI (1995), State directive Commission of Forest Conventory (2001). Đơn vị: nghìn ha Cùng vód sự mất đi của tài nguyên rừng kéo theo đó là sự suy giảm nhanh chóng về số lượng cũng như chất lưọíig của nguồn dược liệu. Rất nhiều loài cây thuốc trước đây rất sẩn có nhưng hiện nay đã hầu như biến mất như Bảy lá một hoa {P. polyphylla), Hoàng liên chân gà (C. quinquesesta W.T.Wang.), Hoàng đằng (F. 11 tinctorìa Lour.), Ba kích (M. officinalis How.),w.. .Nhiều loài cây thuốc đã biến mất hoàn toàn và còn có rất nhiều loài đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Nguồn tài nguyên cây thuốc bị đe doạ không chỉ ở khía cạnh nguồn dược liệu mà còn ở khía cạnh tri thức sử dụng. Tri thức sử dụng trong dân gian chưa được tư liệu hóa một cách đầy đủ, không được ghi chép trong các tài liệu về Y học dân tộc và trong các cộng đồng để có thể lưu giữ lâu dài. Thêm vào đó cùng với sự phát triển của cơ chế thị trưcmg, tư tưỏng xem nhẹ tri thức Y học cổ truyền đã xuất hiện trong một bộ phận nhân dân nhất là giód trẻ cũng góp phần làm giảm ảnh hưởng của Y học cổ truyền trong việc chăm sóc sức khoẻ nhân dân. 1.3.4, Các phương pháp bảo tồn tài nguyên cây thuốc. a. Bảo tổn nguvẽn vi iỉn situ). Bảo tồn nguyên vị là hình thức bảo vệ cây thuốc ở noi sống tự nhiên của chúng, giữ nguyên trạng các mối quan hệ sinh thái giữa các loài, giữa các loài với môi trường sống và các nền văn hoá. Bảo tồn nguyên vị có thể là xây dựng các khu bảo tồn chính thức của nhà nước như thành lập các vườn quốc gia, khu bảo tồn thiên nhiên,...w, hay là việc thành lập các khu bảo tồn không chính thức của cộng đồng như khu vực hạn chế khai thác, hay có khi chỉ là việc thu hạt về hàng năm để trồng [4],[27]. Hiện nay phương pháp này được áp dụng khá phổ biến không chỉ ở Việt Nam mà còn trên thế giói. Thế mạnh của bảo tồn nguyên vị là duy trì được sự tiến hoá của các loài, nguồn gen cũng như sự tiến hoá trong tri thức sử dụng cây thuốc. Việt Nam đã chính thức thành lập các VQG và khu BTTN từ năm 1991 và có ngày càng nhiều các VQG và khu BTTN được thành lập đã cho thấy rằng tầm quan trọng của phưoíig pháp bảo tồn nguyên vị. Hiện nay công tác kiểm kê đánh giá nguồn tài nguyên sinh vật nói chung và nguồn tài nguyên cây thuốc nói riêng tại các VQG và khu BTTN đã đang được tiến hành một cách có hệ thống hơn nhằm kiểm kê đầy đủ số lượng cũng trữ lượng các loài (bảng 2). Từ đó có thể đưa ra được định hướng cho việc bảo tồn các loài cây thuốc quý hiếm và phát triển những cây dược liệu có giá trị. 12 Bảng 1.2 : Một SỐVQG tại Việt Nam và số loài cây thuốc đã được kiểm kê trong mỗi vườn TT Tên VQG Diện tích ( ha) Số loài cây thuốc 1 Bạch Mã 22.031 432 2 Ba Bể 7.610 432 3 Ba Vì 6.900 510 4 Bến Én 38.153 200 5 Cát Bà 15.200 350 6 Cát Tiên 73.878 310 7 Côn Đảo 19.998 165 8 Cúc Phương 22.000 365 9 Tam Đảo 5.682 375 10 Yok Don 58.200 64 b. Bảo tổn chuyển v i( Ex sitù). Bảo tồn chuyển vị là di chuyển cây ra khỏi nơi trồng tói nơi có điều kiện quản lý tập trung. Bảo tồn chuyển vị có thể được thực hiện ở các vưòíi thực vật, nhà kính, vườn sưu tầm, trong các kho bảo quản lạnh. Bảo tồn chuyển vị bao hàm cả việc trồng trọt không chính thức các loài cây hoang dại trong các vườn ươm, vườn gia đình,w... Nhược điểm trong bảo tồn chuyển vị là các mẫu bảo tồn chuyển vị chỉ là một số dòng gen hẹp trong số rất nhiều dòng gen của mỗi loài cây thuốc. Các cây thuốc được bảo tồn chuyển vị có nguy cơ phụ thuộc vào sự chăm sóc của con ngưòi và xói mòn cả về tri thức sử dụng. Do đó, bảo tồn chuyển vị không thể thay thế cho bảo tồn nguyên vị mà cả hai phải đồng thời được áp dụng và phải bổ sung cho nhau. 13 Cần ưu tiên bảo tồn chuyển vị đối vói cây thuốc mà noi sống đã bị phá huỷ, hay đối với các loài sắp có nguy cơ tuyệt chủng sau đó phải trồng lại thiên nhiên. Một số hình thức bảo tồn chuyển vị - Đưa các cây thuốc vào các vườn thực vật. - Bảo quản trong các ngân hàng gen trong đó có bảo quản lạnh hạt. c. Bảo tổn trẽn đổng ruổng (on farm) Bảo tồn trên trang trại đó là trồng trọt và quản lý liên tục sự đa dạng của các quần thể cây thuốc, được ngưòd nông dân thực hiện tổng thể các hệ sinh thái nông nghiệp nơi cây trồng đã tiến hoá. Bảo tồn trên đồng ruộng quan tâm đến toàn bộ hệ sinh thái nông nghiệp, kể cả các loài có ích trước mắt cũng như các loài liên quan như loài hoang dại, cỏ dại. Để có được hiệu quả trong việc bảo tồn tài nguyên cây thuốc của mỗi quốc gia thì cần tiến hành song song các phưorng pháp trên và phải phối hợp thực hiện giữa các phương pháp [4],[8],[20],[27],[34],[35]. 1.4. Các phương pháp nhân giống cây trồng và phương pháp nhân giống nuôi cấy mô (nhân giống In vitro). Nhân giống cây trồng là quá trình tạo ra và phát triển cá thể mới. Các cá thể này dùng để thiết lập nên mùa vụ mới. Có 2 phương pháp nhân giống chính đó là: nhân giống hữu tính (sexual) dùng hạt và phuofng pháp nhân giống vô tính hay còn gọi là phưofng pháp nhân giống sinh dưỡng (vegetative) dựa và khả năng tái sinh của tất cả các bộ phận sinh dưỡng của cây như thân, lá, rễ, mô, tế bào. 1.4.1.Nhân giống hữu tính Nhân giống hữu tính là thu lấy hạt của cây, tạo điều kiện thích hợp về nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng cho hạt nảy mầm tạo thành cây con. • ư u điểm : + Có hệ số nhân cao. + Dễ bảo quản và vận chuyển. 14 + Có khả năng thu được các biến dị mới, tính trạng tốt hơn so vód dòng cha mẹ xuất hiện. + Chi phí thấp. • Nhược điểm: + Nhân giống gặp khó khăn rất lớn đối vói các loài cây lâu cho ra hoa, quả. Ví dụ Sơn thù, Đỗ trọng {Ẹ. ulmoides Oliv.) là cây thuốc quý nhập nội về trổng ở Sa Pa, phải mất 10 năm cây mói có khả năng cho hạt. Bộ phận làm thuốc của Sofn thù là quả khi còn trẻ cây chỉ cho hoa đực vì vậy không có quả. Đỗ trọng là cây đcfn tính cùng gốc nên khi nhân giống Đỗ trọng bằng hạt không những lâu mà còn không chủ động được hạt do hạt chỉ thu được trên cây cái mà trước khi trồng ta không thể nhận biết đâu là cây đực đâu là cây cái nên rất khó khăn khi nhân giống bằng hạt. + Khó khăn cũng gặp phải trong nhân giống hữu tính đối vói một số loài cây thuốc như Ô đầu (A. carmichaeli Debx.), Bạch thược (P. lactiflora Pall.) do hạt của chúng nảy mầm rất chậm do có sự ngủ nghỉ kéo dài. Một số loài khác như Đan sâm (5. miltirrohiza Bunge.) thì có hạt chín không đều gây ra nhiều khó khăn cho thu hoạch, Khi trồng với diện tích lớn thì thòi gian ươm phải kéo dài tói 2 năm mà cho hiệu quả kinh tế thấp [5],[6], + Nhìn chung thì hạt cây thuốc có thòi gian bảo quản tương đối ngắn, tỷ lệ nảy mầm của hạt cũ thucfng thấp hơn so vói hạt tươi mói. Tỷ lệ này con thấp hơn đi rất nhiều đối vói hạt cũ để cách năm [5],[6]. + Khi nhân giống bằng hạt có thể tạo ra các cây con có tính trạng khác vói bố mẹ và không hoàn toàn đồng nhất cả về hình thái lẫn thành phần hoá học. Đặc biệt với cây thuốc thì hàm lượng hoạt chất có thể không ổn định. 1.4,2 Nhân giống vô tính - Là khái niệm sử dụng khả năng tái sinh của các cơ quan sinh dưỡng khác nhau như cành, thân, rễ, mô, tế bào,... w . Nhân giống vô tính bao gồm nhân giống truyền thống ( giâm, chiết, ghép) và nhân giống In vitro (nuôi cấy mô tế bào, nuôi cấy tế bào,w...). 15 Nhân giống truvền thống bao gồm: Chiết: là phưong pháp tạo cá thể mới, thường là trên thân cây, trước khi tách khỏi cây mẹ (thường chỉ áp dụng với cây gỗ), ư u điểm là cành chiết được cây mẹ nuồi có thể hình thành bộ rễ trước khi tự nuôi sống mình. Ghép: là sự tạo liên kết giữa hai bộ phận cành ghép và gốc ghép của hai cá thể khác nhau. Cây ghép thường có m thế của cả cành ghép và gốc ghép. Hạn chế là chỉ áp dụng được với cây sinh trưởng thứ cấp (cây hạt trần và cây hai lá mầm) thêm vào đó cành ghép và gốc ghép phải có sự gần gũi nhau về mặt phân loại học thì mới có cơ hội thành công. Giâm: là sự tạo cây con từ một nhát cắt của thân, lá, rễ, củ sau khi tách khỏi cơ thể mẹ được nuôi trong điều kiện ẩm từ đó hình thành cá thể mới. Phương pháp này cho hệ số nhân giống cao hơn hai phương pháp trên nhưng cần đảm bảo điều kiện ngoại cảnh khá khắt khe cho quá trình tái sinh và tạo rễ cho cá thể mói. • ư u điểm của nhân giống truyền thống, đó là: + Rút ngắn thòi gian sinh trưởng và phát triển tạo điều kiện tăng vụ tăng sản phẩm, tăng hiệu quả kinh tế. Để thu được năng suất như nhau các loài Dioscorea nếu trồng bằng hạt sẽ kéo dài hơn trồng bằng củ ít nhất 6 tháng. + Áp dụng được vód hầu hết các loài cây kể cả cây lâu cho quả. • Nhược điểm + Sự lây bệnh qua nguyên liệu giống diễn ra phức tạp, phổ biến và khó kiểm soát. Sự lây nhiễm và tích tụ các ký sinh trùng đặc hiệu nhất là virus, vi nấm gây giảm năng suất và chất lượng cây trồng. + Hệ số nhân của phưoíig pháp nhân giống vô tính thường thấp. Ví dụ hệ số nhân của Dioscorea floribunda khi nhân bằng củ đạt 8-10 cây/năm, của Cam thảo là 5-7 của Bạc hà Mentha arvensis là 6-7. + Việc sử dụng chính bộ phận làm thuốc đé nhân giống gây lãng phí và tốn kém. 16 1.4.3. Nhân giống nuôi cấy mô ị nhân giống In vitro) Là phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng để tái sinh thành cây non. Nhân giống In vitro là một trong các phương pháp bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống truyền thống và có nhiều ưu điểm nổi bật, có thể khắc phục được những hạn chế của các phương pháp truyền thống. a. Cơ sở lý luân của phương pháp nuối cây mồ. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào In vitro dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào. Theo Haberlandt G. 1902 thì “Tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, trong điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh”. Thực tế đã chứng minh tính đúng đắn của học thuyết về tính toàn năng của tế bào. Hiện nay đã có hàng nghìn loài cây đã được nhân giống In vitro thành công, hàng trăm loài cây đã trở thành sản phẩm thương mại có giá trị như lan Hồ điệp Cymbidium, các giống hoa Tulip,w... Trong suốt khoảng thòi gian từ đầu thế kỷ 20 đến trước năm 1962 thì phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật không đạt được nhiều thành tựu đáng kể. Nhưng đến năm 1962 khi môi trường nuôi cấy MS (Murashige & Knoog) ra đòd đã mở ra kỷ nguyên mới của nuôi cấy mô tế bào thực vật vói rất nhiều thành tựu to lớn, [38]. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô In vitro tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá. Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tiếp tế bào từ phôi sinh thành các tế bào chuyên hoá để đảm nhiệm các chức năng khác nhau gọi là sự phân hoá tế bào. Còn quá trình ngược lại gọi là sự phản phân hoá, các tế bào chuyên hoá chuyển thành các mô chức năng nhưng chúng khồng hề mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dang |jiối sinh. /ệ ỵ ^ /Ẩ v r ./í’ i^ÌTHƯ-VlỆN 17