Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch Streptonkinase tái tổ hợp từ chủng Streptococus pyogenes trong Echerichia coli

  • Số trang: 61 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 192 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------------------- NGUYỄN THỊ THƯƠNG NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH STREPTOKINASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG Streptococcus pyogenes TRONG Escherichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------------------- NGUYỄN THỊ THƯƠNG NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH STREPTOKINASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG Streptococcus pyogenes TRONG Escherichia coli Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. QUYỀN ĐÌNH THI LUẬN VĂN ĐƢỢC THỰC HIỆN TẠI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2011 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................2 1.1 Chứng tắc nghẽn mạch máu ....................................................................2 1.1.1 Quá trình đông máu .............................................................................2 1.1.2 Cơ chế tan máu đông ...........................................................................6 1.1.3 Bệnh tắc nghẽn mạch máu ..................................................................7 1.2 Streptokinase ...........................................................................................9 1.2.1 Giới thiệu chung ..................................................................................9 1.2.2 Cấu trúc không gian ..........................................................................10 1.2.3 Cơ chế hoạt động...............................................................................11 1.2.4 SK tái tổ hợp .....................................................................................13 1.2.5 Tình hình nghiên cứu điều trị tan huyết khối của SK ......................17 1.3 Streptococcus pyogenes ........................................................................18 1.3.1 Phân loại khoa học ............................................................................18 1.3.2 Lịch sử nghiên cứu ............................................................................19 1.3.3 Đặc điểm sinh học .............................................................................19 1.3.4 Đặc điểm gây bệnh ............................................................................21 2 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................22 2.1 Nguyên liệu và thiết bị ..........................................................................22 2.1.1 Tế bào và plasmid .............................................................................22 2.1.2 Hóa chất ............................................................................................22 2.1.3 Dung dịch và đệm .............................................................................23 2.1.4 Môi trường nuôi cấy ..........................................................................24 2.1.5 Thiết bị thí nghiệm ............................................................................24 2.2 Phương pháp nghiên cứu.......................................................................25 2.2.1 Các phương pháp vi sinh vật .............................................................25 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử ...................................................25 2.2.3 Các phương pháp hóa sinh ................................................................29 1 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ 3 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................35 3.1 Nhân dòng gene mã hóa mSK-nonhis...................................................35 3.2 3.3 Thiết kế plasmid biểu hiện mSK ...........................................................36 Biểu hiện streptokinase nonhis .............................................................39 3.4 3.5 Tinh sạch streptokinase nonhis .............................................................41 Hoạt hóa SK ..........................................................................................43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 45 PHỤ LỤC .............................................................................................................. 52 CÁC TỪ VIẾT TẮT AMI Acute myocardial infarction BLAST Basic local alignment search tool bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid DNase Deoxyribonuclease dNTP 2-Deoxynucleoside 5-triphosphate EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide kb Kilo base kDa Kilo Dalton KP Kali phosphate M Marker MI Myocardial infarction mSK Streptokinase mSK-nonhis Streptokinase không mang đuôi 6x-histidine OD Optical density PCR Polymerase chain reaction 2 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ Pr Protein rSK Recombinant streptokinase SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Taq Thermus aquaticus TBE Tris boric acid EDTA TE Tris EDTA TEMED N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine v/v Volume/volume w/v Weight/volume DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cơ chế đông máu. .......................................................................................5 Hình 1.2. Sơ đồ tiêu sợi huyết. ...................................................................................6 Hình 1.3. Huyết khối trong mạch. ..............................................................................8 Hình 1.4. Cấu trúc không gian 3 chiều của streptokinase. .......................................11 Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của streptokinase. .............................................................12 Hình 1.6. Streptococcus dưới kính hiển vi điện tử. ..................................................20 Hình 1.7. Khuẩn lạc S. pyogenges trên môi trường thạch máu. ...............................20 Hình 2.1. Đường chuẩn SK. .....................................................................................33 Hình 2.2. Đường chuẩn Bradford. ............................................................................34 Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm nhân gene msk-nonhis. ...........................................35 Hình 3.2. Điện di đồ DNA thiết kế vector biểu hiện pEmSK. .................................36 Hình 3.3. Peak trình tự pEmSK-nonhis. ...................................................................37 Hình 3.4. Cấu trúc biểu hiện của pEmSK-nonhis. ...................................................38 Hình 3.5. Điện di đồ protein tổng số của mẫu biểu hiện. .........................................39 Hình 3.6. Phân tích năng suất protein biểu hiện tính bằng phần mềm Dolphin 1D. 39 Hình 3.7. Điện di đồ protein dịch nổi và cặn. ..........................................................40 Hình 3.8. Điện di đồ protein tinh sạch. ....................................................................41 Hình 3.9. Phân tích độ sạch của mSK-nonhis bằng phần mềm Dolphin 1D. ..........42 Hình 3.10. Phản ứng lai Western..............................................................................43 3 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các yếu tố đông máu. .................................................................................3 Bảng 2.1. Plasmid nhân dòng và biểu hiện...............................................................22 Bảng 2.2. Thành phần các loại đệm và dung dịch. ...................................................23 Bảng 2.3. Các thiết bị thí nghiệm. ............................................................................24 Bảng 2.4. Thành phần PCR. .....................................................................................26 Bảng 2.5. Thành phần gel co và gel tách. .................................................................29 Bảng 3.1. Hiệu suất tinh sạch mSK-nonhis tái tổ hợp. .............................................42 Bảng 3.2. Độ sạch của mSK-nonhis qua các lần phá siêu âm ..................................43 Bảng 3.3. Hoạt tính mSK-nonhis sau hoạt hóa.........................................................44 Các bảng phụ lục Bảng 1. Hàm lượng protein các mẫu tinh sạch. ........................................................52 Bảng 2. Hoạt tính mSK-nonhis của các mẫu tinh sạch. ...........................................52 Bảng 3. Khả năng hoạt hóa mSK-nonhis xử lý bằng guanidine của các chất hoạt hóa .............................................................................................................................53 Bảng 4. Đường chuẩn SK. ........................................................................................53 Bảng 5. Hàm lượng của các băng protein trong dịch tế bào JMpEmSK ..................54 Bảng 6. Độ sạch của mSK-nonhis sau các lần tinh sạch ..........................................55 4 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ MỞ ĐẦU Trong xã hội hiện đại, khi nền kinh tế ngày một phát triển cộng với áp lực về công việc và thời gian khiến cho chế độ ăn của con người trở nên mất cân đối là một trong những nguyên nhân lớn dẫn đến bệnh tim mạch. Bệnh tim mạch đang là nguyên nhân gây tử vong số một trên thế giới (www.who.int/2011). Bệnh tim mạch làm chết 7 triệu người mỗi năm và chiếm 12,2% các ca tử vong trên toàn thế giới [41]. Xu hướng này sẽ tiếp tục gia tăng trong hai thập kỷ tiếp theo và gây ra những tác động lớn hơn ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, nơi chiếm tới 3/4 số ca tử vong do tim mạch vào năm 2001 [13, 55]. Bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các nước Mỹ Latinh, Caribe, các nước Trung Đông và cả Châu Phi. Tử vong do tim mạch dự kiến sẽ tăng gấp 3 lần trong 20 năm tới [55]. Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến các bệnh tim mạch là do chứng tắc nghẽn mạch máu. Do đó để hạn chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng do bệnh tim mạch gây ra, các nhà khoa học đi theo hướng phòng ngừa và xử lý các huyết khối hình thành trong mạch. Trên thị trường hiện nay có một số thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu như Durakinase, Streptase, Alteplase, Tenecteplase Tuy nhiên, đây hầu hết là các sản phẩm của nước ngoài với giá thành rất đắt. Nghiên cứu so sánh không thấy sự khác biệt về ưu thế của các loại thuốc trên [21]. Sự khác biệt lớn nhất là giá cả, thuốc có bản chất r-tPA có giá gấp gần 10 lần streptokinase. Do đó, streptokinase thường được sử dụng hơn ở các nước đang phát triển. Ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về các thuốc tan huyết. Đề tài KC10 (2009-2010) có thể coi là công trình nghiên cứu cấp nhà nước đầu tiên về lĩnh vực này. Trong đề tài này các nhà nghiên cứu đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch thành công streptokinase. Streptokinase được biểu hiện cả ở dạng có tín hiệu và không có tín hiệu (mSK), trong đó mSK với hoạt tính cao hơn. Streptokinase tái tổ hợp bước đầu được thử nghiệm trên đối tượng thỏ thí nghiệm cho kết quả tốt. 1 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ Để hạn chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng của chứng tắc nghẽn mạch máu thì thời gian xử lý huyết khối trong mạch là một yếu tố vô cùng quan trọng. Thuốc tan huyết khối dạng tiêm được sử dụng rộng rãi hơn. Tuy nhiên, thuốc dạng tiêm đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao, trong khi các enzyme tái tổ hợp thông thường thường dung hợp đuôi 6xhistidine (6xhis) để thuận tiện cho quá trình tinh sạch và việc dung hợp đuôi 6xhis được xem là có thể gây tác dụng phụ cho con người. Trên cơ sở đó, trong khuôn khổ đề tài KC10 “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng trong điều trị” chúng tôi thực hiện đề tài luận văn “Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch streptokinase tái tổ hợp trong E. coli” với dạng streptokinase tái tổ hợp không dung hợp đuôi 6xhistidine để tiến tới sản xuất dược phẩm sinh học điều trị chứng tắc nghẽn mạch máu, có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn cao. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chứng tắc nghẽn mạch máu 1.1.1 Quá trình đông máu Đông máu là quá trình máu chuyển từ thể lỏng sang thể đặc. Bình thường đây là một cơ chế quan trọng giúp cơ thể sửa chữa những mạch máu bị tổn thương và chống mất máu do bị tổn thương thành mạch. Quá trình đông máu phụ thuộc vào các yếu tố đông máu (bảng 1.1) và gồm ba giai đoạn. Giai đoạn tạo thành prothrombinase Quá trình này xảy ra khi có chấn thương thành mạch, khi có sự tiếp xúc với collagen của thành mạch, với các mô khác ngoài nội mạc hoặc bất cứ vật lạ nào. Sự tạo thành prothrombinase được thực hiện theo hai cơ chế nội sinh và ngoại sinh (hình 1.1). Hai cơ chế này chỉ khác nhau ở giai đoạn hình thành yếu tố X hoạt hóa (Xa). 2 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ Cơ chế ngoại sinh: Khi máu tiếp xúc với mạch máu bị tổn thương, mô ở vị trí tổn thương giải phóng ra yếu tố III (thromboplastin mô) và phospholipid. Yếu tố III hoạt hóa yếu tố X thành yếu tố Xa. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xa có sự tham gia của yếu tố Va, ion Ca2+ và phospholipid. Yếu tố Va làm tăng hoạt tính của yếu tố Xa. Phospholipid đóng vai trò là chất nền còn ion Ca2+ làm cầu nối giữa các yếu tố. Thrombin trong trường hợp này có tác dụng điều hòa. Cơ chế nội sinh: Khi máu tiếp xúc với collagen của thành mạch bị tổn thương hoặc bề mặt vật lạ sẽ làm hoạt hóa yếu tố XII thành yếu tố XIIa và giải phóng phospholipid tiểu cầu. Yếu tố XIIa chuyển yếu tố XI thành yếu tố XIa (có sự tham gia của yếu tố Fletcher và Fitzgerald). Yếu tố XIa chuyển yếu tố IX thành yếu tố IXa (có sự tham gia của yếu tố tiểu cầu). Yếu tố X được hoạt hóa có sự tham gia của yếu tố VIIIa (yếu tố VIII được hoạt hóa nhờ thrombin), yếu tố IXa, ion Ca2+ và phospholipid. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xa có sự tham gia của phospholipid, yếu tố Va (yếu tố V được hoạt hóa nhờ thrombin) và ion Ca 2+. Prothrombinase được hình thành từ cơ chế nội sinh hoặc ngoại sinh hoặc đồng thời cả hai cơ chế nội sinh và ngoại sinh. Điều này chứng tỏ hoạt tính của prothrombinase là phụ thuộc vào sự hoạt hóa của các yếu tố tham gia vào quá trình này. Bảng 1.1. Các yếu tố đông máu. Các yếu tố Tên gọi và vai trò I Fibrinogen, là một loại globulin, do gan tổng hợp đưa vào máu. II Prothrombin, là một protein huyết tương do gan sinh ra. Sự tổng hợp prothrombin liên quan chặt chẽ đến sự hấp thụ vitamin K. Nếu rối loạn hấp thụ vitamin K ở đường tiêu hóa sẽ dẫn đến giảm prothrombin. III Thromboplastin, enzyme tạo ra khi tiểu cầu bị vỡ, hoặc mô bị tổn thương. IV Ion Ca2+ có trong huyết tương, có tác dụng hoạt hóa prothrombin. V Proaccelerin, một loại globulin, do gan sinh ra, làm tăng tốc độ đông máu. VI Dạng hoạt hoá của yếu tố V. VII Proconvectin, yếu tố xúc tiến tạo Thrombin. 3 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ VIII Yếu tố chống chảy máu A, có trong huyết tương, có vai trò quan trọng trong sự tạo thành thromboplastin nội sinh. Nếu thiếu yếu tố này, máu vẫn đông nhưng cục máu mềm, dễ di động. IX Yếu tố chống chảy máu B, cũng là một protein huyết tương, cần cho sự tạo thành thromboplastin. X Yếu tố stuart, có trong huyết tương, do gan sinh ra tương đối bền vững có tác dụng trong sự tạo thành thromboplastin và chuyển prothrombin thành thrombin. XI Prothromboplastin - có sẵn trong huyết tương, có vai trò tập trung tiểu cầu. XII Yếu tố hageman, có trong huyết tương, có tác dụng hoạt hoá sự đông máu. XIII Yếu tố ổn định fibrin, có sẵn trong huyết tương, có tác dụng củng cố sợi fibrin thêm vững chắc. Con đƣờng ngoại sinh Mô tổn thương Yếu tố mô Ca2+ Yếu tố VII Ca2+, phospholipid Con đƣờng nội sinh Thành mạch tổn thương Yếu tố XII Yếu tố XIIa Yếu tố XI Yếu tố XIa Yếu tố VIIa Ca2+ Yếu tố IXa Yếu tố IX Ca2+, yếu tố VIII phospholipid Yếu tố X 4 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ Yếu tố X Yếu tố Xa Ca2+, yếu tố VIII phospholipid Yếu tố VII Yếu tố Va, VIIIa Prothrombin (yếu tố II ) Thrombin Sợi fibrin Ca2+ Yếu tố XIII Yếu tố XIIIa Cục máu đông Hình 1.1. Cơ chế đông máu. Giai đoạn tạo thành thrombin Prothrombinase tạo ra theo cơ chế nội sinh và (hoặc) ngoại sinh cùng với Ca2+ xúc tác cho phản ứng chuyển prothrombin thành thrombin. Sự hình thành thrombin từ prothrombin là rất nhanh, được tính bằng vài giây. Giai đoạn tạo thành fibrin và cục máu đông Fibrinogen là một protein do gan sản xuất, nồng độ trong máu bình thường là 100-700 mg/100 ml máu. Bình thường fibrinogen rất khó vào dịch kẽ. Khi thành mạch tăng tính thấm (mô bị viêm) thì fibrinogen vào dịch kẽ và bị đông lại do các yếu tố gây đông máu cùng vào dịch kẽ. Dưới tác dụng của thrombin, fibrinogen dạng hòa tan chuyển thành fibrin đơn phân dạng không hòa tan. Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin ở dạng sợi nhờ yếu tố XIII. Giai đoạn này cũng có sự tham gia của ion Ca2+. Các tế bào máu được giữ lại trên lưới fibrin và tạo nên cục máu 5 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ đông. Như vậy bản chất của quá trình đông máu là hình thành lưới fibrin từ fibrinogen nhờ thrombin. 1.1.2 Cơ chế tan máu đông Cục máu đông có thể tan trở lại nhờ quá trình tiêu fibrin (fibrinolysis). Đây là một quá trình ngược với đông máu (hình 1.2). Tiêu fibrin là một quá trình sinh lý, nhằm làm tan cục máu đông được tạo thành ở giai đoạn trước đó, tái lưu thông tuần hoàn máu. Các yếu tố tham gia gồm có plasminogen, plasmin và các chất hoạt hóa. Plasminogen: Là tiền tố của plasmin, ở dạng bất hoạt. Hàm lượng trong huyết tương là 0,2 µg/ml. Plasminogen là một chuỗi polypeptide 791 amino acid, bình thường tồn tại ở dạng Glu-plasminogen (dạng nguyên vẹn), khi có tác động của plasmin, Glu-plasminogen tách ra một số peptide nhỏ, phần còn lại là Lys-plasminogen. Plasmin: Các chất hoạt hóa sẽ chuyển plasminogen thành plasmin. Plasmin gồm hai chuỗi polypeptide, nối với nhau bằng một cầu nối disulfide: chuỗi nhẹ gắn với serine-protease, chuỗi nặng có vị trí gắn với fibrin. Khi fibrin xuất hiện, lập tức xảy ra hiện tượng hoạt hóa plasminogen thành plasmin. Plasmin xúc tác phản ứng cắt fibrin thành các sản phẩm bị phân hủy và do đó làm tan cục máu đông. Plasminogen Các chất hoạt hóa Plasmin Fibrin PDF (các sản phẩm bị phân hủy) Hình 1.2. Sơ đồ tiêu sợi huyết. 6 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương 1.1.3 Bệnh tắc nghẽn mạch máu Đông máu là một trong những cơ chế phòng vệ tự nhiên của cơ thể khi chấn thương xảy ra. Tuy nhiên, khi thành mạch bị xơ vữa, bị tổn thương làm xuất hiện huyết khối làm tắc nghẽn động mạch, tĩnh mạch gây nên bệnh tắc nghẽn mạch máu. Nguyên nhân gây tắc nghẽn mạch máu Tắc nghẽn mạch do yếu tố V: Yếu tố V Leiden là một biến thể của yếu tố V trong quá trình đông máu. Yếu tố này bị bất hoạt chậm nên tồn tại lâu hơn trong máu gây ra tình trạng đông máu. Tỷ lệ đột biến gene của yếu tố V Leiden chiếm 2040% các bệnh tắc nghẽn mạch máu và tần suất bệnh là 5% trong quần thể dân cư [59]. Tắc nghẽn mạch do thiếu antithrombin: Antithrombin ức chế hoạt động của một số yếu tố đông máu như thrombin, IXa, Xa. Do đó thiếu antithrombin là một nguyên nhân gây tắc nghẽn mạch máu. Đây là bệnh mang di truyền thể trội trên nhiễm sắc thể thường. Bệnh thường gặp là tắc nghẽn mạch phổi và tĩnh mạch, ít thấy tắc nghẽn động mạch. Chứng tắc nghẽn mạch máu này có thể xảy ra một cách tự phát hoặc do chấn thương, thai nghén và phẫu thuật [59]. Tắc nghẽn động mạch: Thường gặp ở người lớn tuổi. Mỡ và calci lắng đọng gây biến dạng bề mặt thành mạch làm kích hoạt con đường đông máu nội sinh (hình 1.3). Đây là nguyên nhân của tắc nghẽn mạch máu do tăng mỡ máu và tiến triển thành xơ vữa động mạch. Nghẽn động mạch có thể gây ra nhồi máu cơ tim hoặc đột quỵ. 7 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ Hình 1.3. Huyết khối trong mạch. (http://about.com) Tắc nghẽn mạch máu là nguyên nhân dẫn đến các bệnh tim mạch, là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu tại các nước phát triển. Các phƣơng pháp điều trị tắc nghẽn mạch máu Các thuốc hóa học Trước đây, điều trị tắc nghẽn mạch máu thường tập trung vào việc kìm hãm sự tạo thành fibrin. Các thuốc kháng đông có bản chất hóa học thường được sử dụng là Heparin và Coumarin. Đầu những năm 1950, Aspirin được sử dụng trong việc ngăn ngừa nhồi máu cơ tim [14], tuy nhiên vai trò của nó trong việc điều trị cấp tính không được chứng minh. Các thuốc Atropine, Papaverine và Nitroglycerin cũng thường xuyên được sử dụng để ngăn ngừa hoặc làm giảm co thắt mạch vành [42]. Như vậy, cho đến những năm 1950, các phương pháp điều trị chỉ là làm giảm nhẹ chứ không phải điều trị. Do đó bệnh tắc nghẽn mạch vẫn là nguyên nhân gây tử vong lớn ở người cao tuổi. Các thuốc có bản chất enzyme Hiện nay, khi nhận ra sự phân giải fibrin có thể được thực hiện trong cơ thể sống bằng quá trình chuyển hóa plasminogen không hoạt động thành plasmin hoạt động, người ta hướng đến phương pháp điều trị mới là sử dụng các chất hoạt hóa plasminogen. Các nghiên cứu lâm sàng chỉ ra rằng cách tốt nhất để hòa tan khối huyết là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch một enzyme có khả năng hoạt hóa plasminogen thành plasmin. Streptokinase (SK): streptokinase là một protein có khối lượng phân tử 47 kDa, do liên cầu khuẩn tan huyết β nhóm A sinh ra. Nó tác động theo một cơ chế phức tạp với cả plasminogen liên kết và không liên kết với fibrin trong tuần hoàn để tạo thành một phức hợp hoạt hóa. Phức hợp này biến đổi plasminogen còn dư thành plasmin là enzym thủy phân protein, có tác dụng tiêu fibrin và có thể làm tan các cục máu đông trong lòng mạch. SK được sử dụng để điều trị thuyên tắc mạch phổi và tĩnh mạch sâu [37]. 8 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương tPA: là yếu tố hoạt hóa mô, có thể sản xuất bằng con đường tái tổ hợp nhưng giá thành cao. Do là yếu tố hoạt hóa của tổ chức nên tPA không có vấn đề về miễn dịch. Đầu tiên tPA gắn với fibrin, phức này sau đó gắn vào plasminogen tạo thành phức hợp hoạt hóa plasminogen để thủy phân fibrin [29]. Urokinase: thường được dùng để tiêu hủy huyết khối tại chỗ, ngoài ra còn sử dụng để điều trị tắc nghẽn phổi, huyết khối tĩnh mạch sâu (http://www.lrchueuni.edu.vn/dongy2009). Urokinase được phân lập từ nuôi cấy tế bào thận người do đó an toàn hơn streptokinase nhưng giá thành cao. Alteplase: một chất hoạt hóa plasminogen mô của người (t-PA) sản xuất bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. Alteplase làm tan huyết khối bằng cách gắn vào fibrin và khởi đầu sự chuyển plasminogen thành plasmin. Tác dụng phụ của alteplase là gây phân hủy toàn thân [52]. Tenecteplase (TNKase): được sử dụng trong trường hợp bị nhồi máu cơ tim cấp. Phần lớn tác dụng của TNKase phụ thuộc vào sự có mặt của fibrin, chúng chỉ chuyển hóa một lượng rất ít plasminogen thành plasmin khi không có fibrin, do đó làm tăng tính đặc hiệu với fibrin. Nattokinase: là một loại enzyme tự nhiên được chiết xuất từ môi trường lên men của vi khuẩn Nattobacillus. Nattokinase làm tan fibrin mạnh gấp 4 lần plasmin nội sinh trong cơ thể (http://nattokinase.asia/2011). Nattokinase được sử dụng như một chế độ bổ sung dinh dưỡng giúp duy trì và tăng cường khả năng phân hủy fibrin bình thường của cơ thể nhằm hỗ trợ điều trị và phòng ngừa bệnh huyết khối như viêm động mạch tĩnh mạch, tim thiếu máu, đau thắt ngực, suy giảm trí nhớ ở người già, đột quỵ [24, 54]. 1.2 Streptokinase 1.2.1 Giới thiệu chung Streptokinase (SK) (EC 3.4.99.22) là một protein ngoại bào do các chủng Streptococcus nhóm A, C và G sinh ra. SK là một loại độc tố nguy hiểm của Streptococcus do nó giúp cho liên cầu khuẩn thâm nhập một cách dễ dàng vào tế bào vật chủ và tránh được hiện tượng thực bào. 9 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Streptokinase tự nhiên gồm 440 amino acid, trong đó 26 amino acid đầu N là peptide tín hiệu sẽ bị cắt bỏ trong quá trình tiết protein ra ngoài môi trường. Protein trưởng thành có 414 amino acid, không có cầu nối disulfide. Phân tử SK trưởng thành là một chuỗi đơn, khối lượng phân tử khoảng 47 kDa với điểm đẳng điện tại 4,7 và pH tối ưu là 7,3-7,6 [38]. 1.2.2 Cấu trúc không gian SK được chia thành 3 vùng: vùng α (từ amino acid 1 đến 150), vùng β (từ amino acid 151 đến 287) và vùng γ (từ amino acid 288 đến 414) [39] (hình 1.4). Mỗi vùng đều liên kết với plasminogen nhưng không vùng nào có thể hoạt hóa plasminogen một cách độc lập. Trong đó, cấu trúc dạng xoắn α chiếm 17%, dạng gấp nếp β chiếm 28%, dạng vòng chiếm 21% và các cấu trúc ngẫu nhiên chiếm khoảng 34% (hình 1.4). Vùng α và γ có tính bảo thủ cao, có độ tương đồng trên 85%, chiếm hầu hết các vị trí tiếp xúc với plasmin và cùng có vai trò trong hoạt hóa plasminogen. Vùng α nằm ở đầu N, chứa một vòng di động duy nhất do các gốc từ 45-70 tạo thành. Vòng di động này được cho là không xuất hiện ở vị trí tương ứng của các chất hoạt hóa plasminogen khác. Vòng này không có chức năng hình thành trung tâm hoạt động trong phức hợp chất hoạt hóa-cơ chất mà có tác dụng nhận biết plasminogen và gây ra sự biến đổi trung tâm hoạt động trong plasminogen [62]. Vùng β không tiếp xúc trực tiếp với vị trí hoạt động của plasmin nhưng hỗ trợ việc cắt ngắn phân tử plasmin thông qua vòng kẹp tóc lộ trên mặt (vòng 250) được tạo thành giữa các gốc 251 và 262 [65]. 10 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ Hình 1.4. Cấu trúc không gian 3 chiều của streptokinase. (DrugBank.com, mã số DB00086) Vòng thứ 2 (vòng 170) được tạo thành giữa amino acid 144 và 218, không đồng nhất về trình tự. Các chuỗi bên của các amino acid không bảo thủ nằm trong vòng 170 được định vị trên bề mặt, nằm cách xa nửa tiếp xúc với plasmin của SK, không ảnh hưởng đến việc hoạt hóa plasminogen. Như vậy tính đa hình của SK không liên quan đến hoạt hóa plasminogen mà có thể quyết định đặc điểm sinh học liên quan đến khả năng gây bệnh của chủng vi sinh vật [65]. Quá trình phát sinh đột biến tại vùng đa hình này không làm thay đổi khả năng hoạt hóa plasminogen của protein này mà có thể coi như biến đổi chức năng đối với bệnh do Streptococcus gây nên [50]. Streptokinase có khả năng liên kết và hoạt hóa plasminogen của người. Đồng thời nó cũng là một enzyme quan trọng của Streptococcus do enzyme này tạo ra hoạt tính phân giải protein trên bề mặt tế bào vi khuẩn và giúp cho việc xâm nhập các tổ chức của vật chủ dễ dàng hơn [39]. 1.2.3 Cơ chế hoạt động Năm 1933, Tillett và Garner đã tình cờ khám phá ra khả năng phân hủy huyết khối của SK [57]. Năm 1941, Milestone đã phát hiện một chất thông thường tồn tại trong huyết tương, cần thiết để ly giải cục máu đông, gọi là “yếu tố lytic” [51]. Christensen độc lập xác định rằng yếu tố lytic là một enzyme thủy phân protein bình 11 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ thường có mặt trong huyết tương như là một tiền chất không hoạt động. Các cơ chất của liên cầu khuẩn kích hoạt tiền chất này sang một loại enzyme hoạt động, enzyme hoạt động làm tan cục máu đông. Năm 1945, Christensen và MacLeod đề xuất thuật ngữ “streptokinase” thay thế cho thành phần của cầu khuẩn được đề cập, “plasminogen” thay cho protesae không hoạt động trong huyết tương và “plasmin” thay cho enzyme hoạt động [12]. Phân hủy Hoạt hóa Vùng liên kết chất ức chế Vùng liên kết chất hoạt hóa Chất ức chế Không phân hủy Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của streptokinase. Cơ chế hoạt hóa và ức chế plasminogen trong quá trình phân hủy fibrin được mô tả như trong hình (hình 1.5) [17, 27]. Phân tử plasminogen có một vị trí liên kết với chất ức chế và một vị trí liên kết với chất hoạt hóa. Khi chất hoạt hóa (SK, staphylokinase, tPA) liên kết với plasminogen tại vị trí liên kết tạo thành phức hợp plasminogen-chất hoạt hóa. Phức hợp này cắt phân tử plasminnogen và chuyển thành phức plasmin-chất hoạt hóa, sau đó liên kết với fibrin và phân hủy nó. Còn khi chất ức chế (các chất có bản chất lysine) liên kết với plasminogen tại vị trí chất ức chế tạo thành phức plasminogen-chất ức chế thì phức này không thể liên kết với fibrin do đó không có khả năng phân hủy fibrin. Các chất có bản chất lysine này thường được sử dụng để điều trị chảy máu sau phẫu thuật. Streptokinase hoạt hóa plasminogen theo con đường gián tiếp như một chất hoạt hóa. Đầu tiên SK liên kết với plasminogen theo tỉ lệ đồng phân tử 1:1, tạo thành phức hợp chất hoạt hóa [8]. Phức hợp này bị biến dạng và trở thành một enzyme với trung tâm hoạt động nằm trên nửa plasminogen. Sau đó enzyme này có khả năng cắt liên kết peptide L-arginyl-L-valyl trên các phân tử plasminogen khác (giữa gốc 560 12 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương và 561) để tạo ra plasmin. Plasmin được tạo thành có khả năng phân hủy fibrin thành các sản phẩm bị phân hủy dạng hòa tan [8, 45]. 1.2.4 SK tái tổ hợp Trên thế giới SK được sử dụng rộng rãi trên thế giới trong điều trị chứng tắc nghẽn mạch máu. Tuy nhiên các chủng tổng hợp SK tự nhiên là những chủng gây độc cho con người và hiệu suất tổng hợp thấp. Do đó việc nghiên cứu SK trên thế giới chủ yếu đi theo hướng nghiên cứu sản xuất SK tái tổ hợp Năm 1984, Malke et al. đã nhân dòng và biểu hiện thành công gene mã hóa SK từ chủng S. equisimilis H46A trong E. coli và S. sanguis sử dụng vector pACYC184 và pBR322 thu được SK có hoạt tính đạt từ 8 đến 100 U/ml dịch nuôi cấy [40]. Một năm sau, Dao và Ferretti sử dụng vector pSA3 (kháng erythromycin, chlorpheniramine, tetracyline) để biểu hiện SK trong S. sanguis thu được protein có khối lượng phân tử 42 kDa nhưng có hoạt tính sinh học như SK tự nhiên. Kích thước protein thấp hơn có thể là do kết quả của quá trình sau dịch mã [15]. Đến năm 1986, Klessen et al. biểu hiện sk trong Bacillus subtilis, hoạt tính SK bị giảm ở cuối pha sinh trưởng do các protease của chính B. subtilis tiết ra làm bất hoạt [33]. Năm 1989, Walter et al. đã nhân dòng thành công gene mã hóa SK từ chủng S. pyogenes type 1 [64]. Sau đó đến năm 1992, Esrtrada et al. đã biểu hiện gene này trong E. coli W3110 cho SK có hoạt tính như chủng tự nhiên với năng suất biểu hiện đạt 25% protein tổng số [16]. Cũng trong năm 1989, Hagenson et al. sử dụng promoter của alcohol oxidase từ P. pastoris để biểu hiện sk trong nấm men cho năng suất đạt 77 mg/l và hoạt tính đạt 3000 U/ml [23]. Đến năm 1994, Wong et al. sử dụng gene nhân dòng sẵn có để biểu hiện trong B. subtilis WB600 (đã gây đột biến mất 6 protease ngoại bào). Kết quả cho thấy 10-20% SK tiết ra ngoài môi trường bị thoái hóa từ dạng 47 kDa thành 44 kDa, làm giảm hoạt tính sinh học của SK. Sự thoái hóa này là do một số gốc amino acid kị nước trong phân tử SK là đích của chymotrypsin (protease do tế bào tiết ra). Do đó 13 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương các tác giả đã tạo chủng đột biến pSKC-27 có glutamate tại vị trí 29 được thay bằng lysine, SK thu được có hoạt tính tăng 2,5 lần [66]. Năm 1995, Ko et al. đã nhân dòng sk từ chủng S. equisimilis. Tác giả thay thế trình tự peptide tín hiệu của sk bằng tín hiệu ompA, sử dụng vector pKK223-3 biểu hiện trong E. coli JM109. Hoạt tính thu được đạt 5000 U/ml dịch nuôi cấy sau 12 giờ cảm ứng bằng IPTG [34]. Cũng năm 1995, Kubo et al. đã nghiên cứu hoạt hóa SK tái tổ hợp từ E. coli. Các tác giả xử lý bằng nhiệt độ để tái cuộn xoắn cấu trúc SK bị biến tính bởi guanidine hydrochloride. Hoạt hóa ở 50°C làm tăng 10% hoạt tính enzyme và 25% hoạt tính riêng, cao hơn xử lý ở 20°C [35]. Năm 1997, Avilan et al. đã nhân dòng sk từ chủng S. equisimilis và biểu hiện trong E. coli JM105. SK thu được giống với dạng tự nhiên. Ba sản phẩm SK thu được có khối lượng phân tử lần lượt là 47,5, 45 và 33 kDa [6]. Năm 1999, Johnsen et al. đã nhân dòng gene mã hóa SK từ chủng S. uberis NCTC 3858 và đọc trình tự cho thấy SK này tương đồng khoảng 26% với SK của S. pyogenes và S. equisimilis. Protein suy diễn có 286 amino acid, trong đó peptide tín hiệu dài 25 amino acid. Trình tự amino acid của SK này bị thiếu các amino acid đầu C so với trình tự amino acid của SK từ chủng S. pyogenes và S. equisimillis [30]. Caballero et al. sử dụng vector pQE30 để biểu hiện SK trong E. coli cho hoạt tính tương đương với SK tự nhiên [11]. Đồng thời Pupo et al. đã biểu hiện nội bào đối với sk từ S. equisimilis sử dụng vector biểu hiện pTrp. Hiệu suất biểu hiện đạt 15% protein tổng số (thấp hơn của Estrada). Tuy nhiên SK tái tổ hợp ở dạng hòa tan nên tinh sạch dễ dàng hơn [44]. Pratap et al. năm 2000 đã nhân dòng sk từ S. equisimilis và biểu hiện trong P. pastoris. SK thu được có khối lượng phân tử là 55 kDa, cao hơn SK gốc nhưng có hoạt tính tương đương. Các tác giả chỉ ra rằng SK có khối lượng cao hơn là do hiện tượng glycosyl hóa. Hoạt tính SK đạt 3200 U/ml dịch nuôi cấy [43]. Năm 2004, Kumar và Singh biểu hiện SK trong nấm men S. pombe đã bị đột biến mất protease ngoại bào. Kết quả thu được SK biểu hiện ở dạng ngoại bào với năng suất 50-100%, đạt 2450 U/ml dịch nuôi cấy. Hiệu suất biểu hiện đạt 24,5 mg/l và hoạt tính riêng đạt 1581 U/mg protein [36]. Sau đó, năm 2006, Sriraman et al. 14
- Xem thêm -