Chương 1: TỔNG QUAN VỀ ĐƠN VỊ SẢN XUẤT
1.1. Lịch sử thành lập và phát triển
Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh được thành lập theo Quyết
định số 161/2004/QĐ-UB ngày 2/7/2004 của Ủy ban Nhân dân Thành phố Hồ Chí Minh.
Trụ sở tạm thời đặt tại 176 Hai Bà Trưng, quận 1, Tp. Hồ Chí Minh (trụ sở của Sở Nông
nghiệp – PTNT) (Trung tâm Công nghệ sinh học Tp.HCM,2015).
Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh là một mô hình mới với các
chức năng như nghiên cứu, ứng dụng, chuyển giao công nghệ sinh học phục vụ trong lĩnh
vực nông nghiệp, xử lý môi trường, công nghiệp thực phẩm và y dược học. Tiếp nhận,
triển khai các quy trình, kỹ thuật hiện đại về công nghệ sinh học (công nghệ gene, công
nghệ tế bào động thực vật, công nghệ vi sinh, công nghệ lên men...) phục vụ sản xuất, bảo
quản, chế biến các sản phẩm nông nghiệp và xử lý môi trường. Đào tạo huấn luyện các kỹ
thuật viên về công nghệ sinh học. Sản xuất, thương mại hóa các sản phẩm công nghệ sinh
học. Dự án xây dựng Trung tâm dự kiến bắt đầu vào cuối năm 2005, hoàn thành giai đoạn
I trong 3 năm và hoàn thành giai đoạn II vào năm 2010. Trong giai đoạn đầu, khu nhà
nghiên cứu chính về CNSH hoàn thành sẽ đáp ứng cho 200 cán bộ nghiên cứu làm việc.
Các xưởng sản xuất vaccine và đóng gói các chế phẩm dược sinh học cũng sẽ được xây
dựng theo các dự án đầu tư và chuyển giao công nghệ.
Hình 1.1 Tổng thể quy hoạch Trung tâm Công nghệ Sinh học
1.2 Địa điểm xây dựng
Lúc mới thành lập Trụ sở Trung tâm đặt tại 176 Hai Bà Trưng, quận 1, Tp. Hồ Chí
Minh (trụ sở của Sở Nông nghiệp – PTNT), nay chuyển về địa chỉ số 2374 Quốc lộ 1, khu
phố 2, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, Tp. Hồ Chí Minh (Trung tâm Công nghệ sinh học
Tp.HCM,2015).
1.2.1 Vị trí
Địa điểm xây dựng: Km 1900 Quốc lộ 1A phường Trung Mỹ Tây, quận 12, cách trung
tâm Thành phố Hồ Chí Minh 12km về phía Tây Bắc.
1
1.2.2
Sơ đồ cơ cấu mặt bằng
Hình 1.2 Sơ đồ mặt bằng Trung tâm Công nghệ Sinh học
(Nguồn: Trung tâm Công nghệ sinh học Tp.HCM)
1.2.3 Sơ đồ tổ chức
Hình 1.3 Cơ cấu tổ chức bộ máy nhân sự sau năm 2015
1.3 Phương hướng hoạt động
2
1.3.1 Nghiên cứu ứng dụng
Các hoạt động nghiên cứu ứng dụng trong nước gồm hợp tác với các trường, viện trong
nước để hoàn thiện các đề tài có tiềm năng ứng dụng lớn đã có kết quả tốt ở mức độ
phòng thí nghiệm; tiến tới thử nghiệm ở quy mô sản xuất thử các kết quả nghiên cứu về y
tế, nông nghiệp và môi trường. Hợp tác với các nước trên thế giới gồm hợp tác với các
nước có ưu thế về CNSH, nhất là trong lĩnh vực y học để hoàn thiện các đề tài ở mức độ
thử nghiệm cuối cùng hay tiền lâm sàng. [10]
1.3.2 Đào tạo và hợp tác quốc tế
Nhiệm vụ đào tạo lực lượng đội ngũ có chuyên môn cao về CNSH được đặt lên hàng đầu.
Trung tâm phải là nơi tập trung các chuyên gia, cán bộ khoa học giỏi trong lĩnh vực
CNSH ứng dụng. Việc đào tạo sẽ gắn liền với nghiên cứu ứng dụng, với sản xuất tại chỗ,
phục vụ cho từng công đoạn sản xuất. Mục tiêu đề ra sau năm 2010 trở đi, khi Trung tâm
đã định hình và đi vào hoạt động hiệu quả, hàng năm có thể tiếp nhận sinh viên, học viên
cao học và nghiên cứu sinh đến nghiên cứu. [10]
1.3.3 Sản xuất
Đối với các sản phẩm dược sinh học, Trung tâm sẽ đầu tư xây dựng nhà máy sản xuất và
đóng gói theo tiêu chuẩn GMP, từ công nghệ do Trung tâm nghiên cứu hoặc nhận chuyển
giao từ nước ngoài hay các cơ quan nghiên cứu khác trong nước. Nhà máy sẽ xây dựng
trên tiêu chuẩn GMP với độ an toàn cấp 2. Dây chuyền hoàn chỉnh để sản xuất từ khâu
giữ giống, nhân giống, lên men, chuẩn bị môi trường, thu hoạch, chiết tách, tinh chế các
sản phẩm protein có hoạt tính. Ngoài ra, sẽ xây dựng các xưởng sản xuất các chế phẩm
sinh học phục vụ cho sản xuất nông nghiệp. Về cây trồng, sẽ có một bộ phận trồng thử
nghiệm cây chuyển gene, sản xuất cây giống sạch bệnh ở quy mô lớn. [10]
1.3.4 Kinh doanh
Mô hình phát triển Trung tâm dự kiến sẽ phát triển theo mô hình một công ty đa quốc gia
về CNSH. Do vậy, bộ phận kinh doanh của Trung tâm sẽ là bộ phận mạnh, gồm các
chuyên viên về CNSH, kinh tế, quản trị kinh doanh nhằm đưa nhanh sản phẩm ra thị
trường trong nước và xuất khẩu. Lợi nhuận thu được từ việc kinh doanh sẽ phục vụ cho
việc mở rộng nghiên cứu, chuyển giao công nghệ và sản xuất.
1.4 Định hướng chiếu lược phát triển của Trung tâm
Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh định hướng nghiên cứu từ
cơ bản đến ứng dụng và thương mại hóa sản phẩm công nghệ sinh học trong nhiều lĩnh
vực:
1.4.1 Công nghệ sinh học phục vụ nông nghiệp
Công nghệ Sinh học thực vật: chọn tạo giống cây trồng biến đổi di truyền có các
đặc tính và phẩm chất tốt phục vụ sản xuất nông nghiệp. Nghiên cứu sinh lý bệnh thực
vật, phát triển kit chẩn đoán bệnh ở cây trồng. Nghiên cứu nuôi cấy mô cây dược liệu thu
nhận các hoạt chất thứ cấp.
3
Công nghệ Sinh học thủy sản: phát triển vắc-xin phòng ngừa các bệnh nghiêm
trọng ở thủy sản. Phát triển các bộ kit phát hiện bệnh, các chế phẩm sinh học - probiotic
phục vụ nuôi trồng thủy sản. Cải thiện chất lượng con giống thủy sản bằng công nghệ
gene.
Công nghệ sinh học tế bào động vật: phát triển và ứng dụng công nghệ hỗ trợ sinh
sản kết hợp kỹ thuật di truyền để tạo động vật chuyển gene phục vụ nghiên cứu hay tạo
giống vật nuôi mới.
1.4.2 Công nghệ sinh học phục vụ môi trường và năng lượng sinh học
Phát triển các chế phẩm sinh học phòng trừ dịch bệnh, kích thích tăng trưởng cho
cây trồng. Tuyển chọn, cải biến các chủng vi sinh vật bằng công nghệ gene để xử lý chất
thải gây ô nhiễm môi trường. Nghiên cứu quy trình sản xuất cồn sinh học và các dạng
nhiên liệu sinh học khác từ nguồn phế phụ liệu nông nghiệp.
1.4.3 Công nghệ sinh học phục vụ y dược
Nghiên cứu, thử nghiệm và sản xuất các hoạt chất tự nhiên hay các protein tái tổ
hợp có dược tính ứng dụng trong điều trị bệnh. Nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh, các
phương pháp chẩn đoán và điều trị nhiều bệnh khác nhau ở người và vật nuôi. Phát triển
vắc-xin cho người và vật nuôi phòng ngừa các bệnh phổ biến. Nghiên cứu và ứng dụng tế
bào gốc trong y học tái tạo.
1.5 Một số sản phẩm của Trung tâm
1.5.1 Chế phẩm sinh học BIMA
Hình 1.4 Chế phẩm sinh học BIMA
Chế phẩm sinh học BIMA có tác dụng tốt trong việc ngăn ngừa các bệnh gây hại
như bệnh chết ẻo, héo úa, thối nhũn,...vốn thường gặp trên cây rau họ bầu, bí, trên cây
công nghiệp như chanh, cà phê… giúp giảm một phần thuốc bảo vệ thực vật, giảm ô
4
nhiễm môi trường, giúp cây trồng sinh trưởng khỏe, làm tơi xốp và giữ độ phì nhiêu lâu
dài cho đất,...
1.5.2
Sản phẩm phân bón lá làm từ trùn quế tươi
Loại phân bón có thành phần chủ yếu là dịch chiết từ trùn quế tươi với hàm lượng acid
amine cao bổ sung thêm các khoáng chất đa lượng và vi lượng thiết yếu.
Hình 1.5 Bio trùn quế dùng cho cây rau, cây ăn quả và cây công nghiệp
(Bio trùn quế 01: Kích thích tăng trưởng, Bio trùn quế 02: Kích thích tăng trưởng và ra
hoa, Bio trùn quế 03: Kích thích ra hoa và tăng cường rễ, Bio trùn quế 04: Kích thích ra
hoa và đậu trái)
Đối với bio trùn quế dùng cho hoa lan:
Hình 1.6 Bio trùn quế dùng cho hoa lan
(Bio trùn quế 01: Giai đoạn vườn ươm và tăng trưởng, Bio trùn quế 02: Tăng trưởng và ra
hoa, Bio trùn quế 03: Kích thích ra hoa và tăng cường rễ, Bio trùn quế 04: Ra hoa nhiều
bền và đẹp.)
5
1.5.3 Bộ kít phát hiện virus gây bệnh trên hoa lan
Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ
Chí Minh vừa chế tạo thành công bộ kít phát hiện sớm virus gây bệnh trên hoa lan.
Phương pháp sử dụng ở đây là tách chiết mẫu lá lan nghi bệnh và thu phần dung dịch.
Dịch chiết sẽ được cho chạy trên máy khuếch đại gene, điện di. Sau đó, nhuộm với
chất phát quang và chiếu tia UV để nhận biết. Nếu lan bị nhiễm bệnh thì mẫu thử sẽ cho
một vạch sáng.
Cách thử nghiệm này cho phép phát hiện sớm hai loại bệnh: virus khảm vàng
(Cymbidium mosaic virus) và đốm vòng (Odontoglossum ringspot virus). Đây là hai loại
virus gây bệnh phổ biến trên cây hoa lan, mức độ lây lan nhanh, cây nhiễm bệnh sẽ còi
cọc, hoa bị biến dạng, hiện chưa có thuốc chữa.
1.5.4 Fresh Bud
Hình 1.7 Sản phẩm Fresh bud
Fresh bud – sản phẩm nuôi cấy mô nghệ thuật có thể được trưng bày trên bàn học,
bàn làm việc để mang lại một không gian xanh tươi và tinh khiết, giúp thư giãn sau những
giờ làm việc căng thẳng
1.5.5 Hộp nhựa vuông dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Kích thước:65 x 65 x 95 mm.
Nguyên liệu: nhựa Polycarbonate.
Độ bền: Hộp nhựa trong suốt, thời hạn sử dụng ít nhất 30 lần hấp khử trùng (điều
kiện khử trùng 121oC, áp suất 1 atm trong thời gian 20 phút).
Lĩnh vực ứng dụng: công tác giữ giống, giai đoạn vô mẫu, nhân nhanh cụm chồi,
vươn thân, nuôi cấy hạt…trong nuôi cấy mô thực vật.
6
Hình 1.8 Hộp nhựa vuông dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.6 An toàn lao động và chữa cháy
1.6.1 An toàn lao động
Quy định chung:
- Không hút dung dịch hóa chất vào miệng, không ngửi hay tiếp xúc trực tiếp với
da.
- Không ăn, uống, hú thuốc trong phòng thí nghiệm.Khi sử dụng những hóa chất
có mùi sốc, khó chịu ( erther, esther, ammoniac, acid clohypoclohyrit đậm đặc
…) phải sử dụng tủ hút.
- Khi lấy hóa chất hoặc pha hóa chất phải đeo khẩu trang và găng tay cao su.
- Sản phẩm nhiễm vi sinh, khi không sử dụng nữa thì phải dùng autoclave để hấp
bỏ.
- Sinh vật biến đổi gen phải được nuôi trồng ở khu vực cách ly. Khi kết - thúc thí
nghiệm trên sinh vật biến đổi gen thì cần tiêu hủy chúng.
- Để vật dụng, trang thiết bị PTN (ống nghiệm, hóa chất, sản phẩm…) đúng nơi
qui định.
- Đọc kỹ hướng dẫn sử dụng các thiết bị trước khi sử dụng.
- Kiểm tra thiết bị, dụng cụ và hóa chất trước khi tiến hành thí nghiệm.
- Tiến hành xong thí nghiệm, phải rửa sạch dụng cụ, sắp xếp lại hóa chất, vệ sinh
chỗ làm thí nghiệm, khóa điện nước.
- Công nhân vận hành phải được trang bị đầy đủ kiến thức cần thiết về thiết bị và
an toàn lao động.
1.6.2 Phòng cháy chữa cháy
Quy định chung:
- Không hút thuốc, đốt lửa trong kho, khu vực có chất dễ cháy.
- Không tùy ý mắc điện, thường xuyên kiểm tra, nâng cấp đường dây dẫn và thiết
bị điện.
- Tắt các thiết bị điện, ngắt cầu dao khi không sử dụng.
7
- Các thiết bị có nhiệt độ cao phải đặt xa trường và vật dễ cháy.
- Bình chữa cháy phải đặt ở nơi thuận tiện, nơi dễ phát sinh hỏa hoạn.
- Cần xây dựng lối thoát hiểm, không để vật cồng kềnh chắn lối thoát hiểm.
Chương 2: QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN INVITRO
2.1 Giới thiệu về lan Dendrobium
Lan Dendrobium thuộc:
Ngành:
Angiospermatophya
Lớp:
Liiopsida ( Monocotyledones)
Bộ:
Orchidales
Họ:
Orchidaceae
Giống:
Dendrobium
Loài:
Dendrobium sp.
Dendrobium là loài lan chiếm ưu thế nhất với hơn 1.600 giống nguyên thủy được chia
thành 40 nhóm trong đó có 8 nhóm phổ biến nhất là Phalaenanthe, Ceratobium, Callista,
Eugenanthe, Nigrohirsute, Pedilonum, Crumenata, Latourea. Trong đó, Dendrobium
Sonia thuộc nhóm Phalaenanthe (Hoa Lan Việt Nam, 2015). Dendrobium được Clof
Swart đặt tên vào năm 1799, là chi lớn thứ nhì của họ Lan. Chữ “Dendrobium” có nguồn
gốc từ Hy Lạp, “dendro” nghĩa là cây gỗ lớn và “bio” nghĩa là sống (Võ Văn Chi và
Dương Đức Tiến ,1978).
Hình 2.1. Lan Dendrobium Thongchai Gold
2.1.1 Nguồn gốc sự phân bố
Dendrobium chỉ được tìm thấy ở Đông Bán Cầu, trải dài từ Australia, sang Thái Bình
Dương, Ấn Độ và xuất hiện nhiều nhất ở Đông Nam Á. Các loài trong hệ thống này phân
8
bố rất rộng, vì vậy hình thái và cấu tạo cũng rất đa dạng và phong phú (Nguyễn Thiện
Tịch, 1998).
2.1.2 Đặc điểm hình thái
a. Thân
Lan Dendrobium là lan đa thân, trong đó giả hành gồm một hay nhiều lóng. Giả hành
thường mang một thân với nhiều lá mọc xen kẽ, là một bộ phận cần thiết cho sự phát triển
và sinh trưởng của lan, chứa diệp lục. Kiểu thân Dendrobium được chia thành 2 nhóm:
kiểu thân mềm (thường có ở vùng lạnh như Đà Lạt) và kiểu thân cứng (thường có ở vùng
nóng hơn) (Trần Văn Bảo, 1999).
b. Lá
Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại mọng nước nạc, dai,
có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tuỳ thuộc vào vị trí sống của cây. Phiến lá trải rộng hay
gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V
(Dương Công Kiên, 2006).
c. Rễ
Lan Dendrobium có hệ rễ khí sinh, có một lớp tế bào chết chứa đầy không khí nên rễ
ánh lên màu xanh bạc. Vì vậy rễ hút được nước mưa chảy dọc trên vỏ cây gỗ hay nước lơ
lửng trong không khí, hơi sương và hơi nước, giúp cây hút dinh dưỡng và chất khoáng,
mặt khác giúp cây bám chặt vào giá thể, không bị gió cuốn (Nguyễn Công Nghiệp, 2004).
d. Hoa
Giống Dendrobium khi đủ dinh dưỡng thì cho hoa thành chùm, phát hoa dài và thời
gian ra hoa trung bình 1 - 2 tháng (Nguyễn Công Nghiệp, 2004). Hoa Dendrobium có 6
cánh với 3 đài (sepal) xen kẽ 3 cánh (petal), trong đó có một cánh khác hẳn với các cánh
khác, biến thành môi (líp) và quyết định giá trị thẩm mỹ của hoa (Huỳnh Văn Thới,
2004).
e. Quả và hạt
Sau khi thụ phấn, các cánh hoa héo, cuống hoa hình thành quả. Quả chứa 10.000 –
100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt có kích thước rất nhỏ nên phôi hạt chưa phân hoá. Sau
3 – 5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió (Dương Công Kiên, 2006).
2.1.3 Điều kiện sinh trưởng và phát triển
a. Nhiệt độ
Cây lan Dendrobium có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới, thích hợp trồng ở TP.HCM.
Nhiệt độ ban ngày khoảng 27 - 32 oC, nhiệt độ ban đêm 16 - 18 oC. Nhiệt độ thấp làm cây
rụng lá (Dương Hoa Xô, 2008).
b. Ẩm độ
Độ ẩm thích hợp là 50 - 80%. Đảm bảo độ ẩm của giá thể, của vườn, của vùng trồng
để giúp cây sinh trưởng được tốt (Dương Hoa Xô, 2008).
Ban ngày, cây cần độ ẩm khoảng từ 40 – 60%, ban đêm độ ẩm thích hợp từ 60 – 90%
giúp cây phát triển tốt hơn. Giá thể quá ẩm và úng là điều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng
của giống Dendrobium vì có thể làm toàn bộ rễ bị thối (Huỳnh Văn Thới, 2004).
9
c. Ánh sáng
Dendrobium ưa ánh sáng tán xạ. Dendrobium thích hợp cho sự sinh trưởng và phát
triển trong cường độ ánh sáng từ 15.000 – 30.000 lux. Thiếu ánh sáng sẽ gây ra sự thoái
hóa rõ rệt, số lượng hoa cũng rất ít và cây rất kém phát triển, thừa ánh sáng làm cho cây
xấu đi, nhưng cây sẽ thích nghi dần và ra hoa nhiều và đẹp (Nguyễn Công Nghiệp, 2004).
d. Tưới nước
Tưới thiếu nước, lan sẽ khô héo dần rồi chết, tưới thừa nước lại làm cho bộ rễ ẩm ướt,
thiếu oxy, cây khó hấp thu dưỡng chất, bộ rễ thối và chết (Trần Hợp, 2000). Nước tưới
phải sạch, không nhiễm phèn, mặn. Nguồn nước tưới có thể sử dụng là nước mưa, nước
máy, nước giếng đã được xử lý với độ pH thích hợp từ 6,5 – 7,0 (Dương Hoa Xô, 2008).
e. Sự thông thoáng
Sự thông thoáng của giá thể là yếu tố giúp cây lan sinh trưởng. Giá thể phải có khả
năng giữ ẩm tốt và độ thông thoáng cao. Chậu trồng Dendrobium phải là những chậu có
những lỗ nhỏ để tạo độ thoáng và giúp cho cây không bị úng. Vườn quá thông thoáng thì
sẽ làm lượng nước bốc hơi nhiều, độ ẩm vườn thấp, cây lan sinh trưởng kém. Vườn không
thông thoáng, độ ẩm và nhiệt độ trong vườn cao dễ gây phát sinh bệnh cho lan (Dương
Hoa Xô, 2008).
2.1.4 Sâu bệnh
Các bệnh thường gặp trên lan Dendrobium: bệnh đốm đen thân cây lan, bệnh đốm lá,
bệnh thối mềm vi khuẩn...
Các động vật thường gây hại trên lam Dendrobium: rệp vảy, bọ trĩ, ốc sên, nhện đỏ ...
2.2 Phòng và trang thiết bị cho quy trình sản xuất
2.2.1 Phòng rửa dụng cụ
Phòng rửa dụng cụ được trang bị một số dụng cụ, thiết bị cần thiết để thực hiện
chức năng của mình:
- Các van nước lớn và chậu lớn để phục vụ cho việc rửa dụng cụ, chai lọ.
- Kệ sắt, bàn lớn để chứa dụng cụ, chai lọ.
10
Các dụng cụ cần được chuẩn bị hấp vô trùng (cán dao, đĩa cấy, pence, ống
Hình 2.2 Phòng pha môi trường
nghiệm,…) phải qua các giai đoạn cọ rửa sạch bằng xà phòng và nước sạch, sấy khô dụng
cụ. Chai lọ, ống nghiệm, nút bông, hộp nhựa được rửa sạch, để khô, chuẩn bị cho việc
phân phối môi trường. Các dụng cụ, chai lọ sau khi cấy xong cũng được chuyển đến để
rửa và sử dụng cho lần sau.Phòng pha môi trường
Phòng pha môi trường được trang bị đầy đủ các thiết bị, dụng cụ, hóa chất cần
thiết để pha chế môi trường:
- Bàn ghế, dụng cụ, hóa chất pha môi trường.
- Các dụng cụ: Becher, erlen, bình tia, đũa thủy tinh, ống đong, pipet, micropipet,
ống nhỏ giọt, các dụng cụ chứa môi trường…
- Hóa chất: đa lượng, vi lượng, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng, các chất bổ trợ,
agar, đường, than hoạt tính…
- Tủ lạnh là nơi để các hóa chất cần bảo quản lạnh.
- Máy cất nước 1 lần và 2 lần dùng để cất nước pha môi trường.
- Cân phân tích có thể cân với khối lượng tối đa 210 gram với độ chính xác đến
0.0001 gram để cân hóa chất cần pha chế.
- Cân kỹ thuật có thể cân với khối lượng tối đa 1500 gram với độ chính xác đến
0.01 gram dùng để cân đường, agar, các chất có khối lượng lớn.
- Máy khuấy từ gia nhiệt để khuấy hóa chất.
- Máy đo pH để đo pH môi trường sau khi pha và bổ sung chất ĐHST xong.
11
- Máy xay để xay nhuyễn các chất bổ trợ: chuối, khoai tây
Hình 2.3 Một số thiết bị, máy móc sử dụng trong phòng pha môi trường.
Phòng pha môi trường sẽ nhận các dụng cụ (nút bông, chai, giấy báo, kẹp, dao,
…) đã được rửa sạch từ phòng rửa dụng cụ để tiến hành pha môi trường. Loại môi trường
(MS, B5,…), có hoặc không có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin,
giberyline,…), có hoặc không có bổ sung các chất hữu cơ bổ trợ (nước dừa, dịch chiết
khoai tây, chuối,…) cũng như thể tích môi trường cần pha đều phụ thuộc vào yêu cầu của
các giai đoạn nghiên cứu và sản xuất.
Vì nhu cầu sản xuất cần môi trường với số lượng lớn nên việc pha dung dịch mẹ
(stock) là điều cần thiết để việc pha chế được nhanh chóng và dễ dàng hơn. Tùy vào loại
môi trường và mục đích nuôi cấy mà môi trường có thành phần khác nhau. Tuy nhiên,
môi trường nào cũng có các thành phần cơ bản: đa lượng, vi lượng, FeEDTA, vitamin.
Khi pha môi trường, người pha sử dụng các stock đúng thể tích cần, bổ sung các
thành phần cần thiết khác, định mức đến thể tích cần pha.
Môi trường sau khi pha chế được phân phối vào chai lọ, ống nghiệm, hay hộp
nhựa tùy vào mục đích nuôi cấy.
Yêu cầu đối với phòng pha môi trường:
- Đảm bảo gọn gàng sạch sẽ.
- Công cụ, dụng cụ và máy móc thiết bị phải để đúng nơi quy định.
- Hóa chất phải được xếp vào kệ một cách ngay ngắn, đúng vị trí.
12
- Pha chế môi trường phải tuân thủ các điều kiện: đúng nơi, đúng cách
và đúng
chất lượng.
- Tuân thủ quy trình pha hóa chất để tránh bị kết tủa.
- Phế, phụ liệu phải được bỏ trong túi chứa rác một cách cẩn thận.
2.2.2 Phòng hấp khử trùng
Phòng hấp vô trùng được trang bị các máy móc, thiết bị chuyên dụng cho việc vô
trùng và vận chuyển môi trường, dụng cụ:
- Nồi hấp tiệt trùng để hấp môi trường và dụng cụ cấy.
- Nước cất để châm nồi hấp.
- Xe đẩy chuyên dụng để vận chuyển môi trường và dụng cụ sau khi hấp.
Sau khi nhận môi trường từ phòng pha môi trường sẽ tiến hành phân phối môi
trường vào chai, đóng nút, bịt đầu chai bằng giấy báo và chuyển vào nồi hấp. Sau khi đưa
môi trường và dụng cụ vào nồi hấp thì điều chỉnh nhiệt độ 121 oC, áp suất 1 atm, thời gian
20 phút.
Sau khi hấp xong, dụng cụ sẽ được chuyển vào phòng cấy. Còn môi trường sẽ
được chuyển đến phòng trữ môi trường.
Hình 2.4 Phòng hấp khử trùng
Yêu cầu đối với phòng hấp khử trùng:
- Hấp môi trường phải đúng nhiệt độ, áp suất, thời gian.
- Môi trường, dụng cụ sau khi hấp phải để đúng nơi quy định.
- Dụng cụ và máy móc thiết bị phải để đúng nơi quy định, tắt hết nguồn điện khi
không sử dụng.
2.2.3 Phòng trữ môi trường
13
Hình 2.5 Phòng trữ môi trường
Do đặc tính là nơi chứa môi trường nên phòng trữ môi trường được trang bị nhiều
kệ chứa là nơi đặt môi trường và xe đẩy chuyên dụng để vận chuyển môi trường.
Sau khi môi trường được lấy ra từ nồi hấp sẽ được chuyển đến phòng trữ môi
trường. Tùy vào yêu cầu sử dụng thạch nghiêng hay thạch đứng mà chai môi trương sẽ
được đặt đứng hay nằm. Khi có nhu cầu sử dụng, môi trường được lấy ra và chuyển đến
phòng cấy
2.2.4 Phòng cấy vô trùng
Hình 2.6 Phòng cấy vô trùng
Để đảm bảo điều kiện vô trùng, phòng cấy được thiết kế đặc biệt với 2 lớp cửa
lệch nhau và được trang bị một số thiết bị chuyên dụng:
- Tủ cấy vô trùng có đèn UV để tiệt trùng: là nơi thực hiện các thao tác vô trùng mẫu
cấy và cấy mẫu.
14
- Quạt hút: hút không khí từ trong phòng cấy ra ngoài
- Máy điều hòa nhiệt độ: dùng để điều chỉnh nhiệt độ phù hợp
- Ghế ngồi thao tác cấy
- Bàn để mẫu và môi trường
- Cồn 70o và 96o, bông thấm nước và một số dung cụ cần thiết khác
Đối với phòng cấy thí nghiệm:
Khi bắt đầu nghiên cứu một đối tượng, người nghiên cứu phải tạo được mẫu
cấy vô trùng. Vì vậy, việc đầu tiên là vô trùng mẫu cấy, cấy vào môi trường thử nghiệm.
Nếu thành công thì sẽ cấy chuyền và tiến hành các mục đích thí nghiệm khác từ nguồn
mẫu vô trùng đã tạo được. Tất cả các công việc trên đều được thực hiện trong tủ cấy của
phòng cấy thí nghiệm.
Đối với phòng cấy vô trùng:
Sau khi một đối tượng đã được nghiên cứu thành công về môi trường nuôi cấy
và các yếu tố ảnh hưởng khác thì đối tượng đó sẽ được đưa vào sản xuất với quy mô lớn.
Hoạt động chủ yếu của phòng cấy sản xuất là cấy chuyền lan và một vài đối tượng khác.
Phòng cấy sẽ nhận môi trường, mẫu, dụng cụ và tiến hành thao tác cấy bên
trong tủ cấy vô trùng. Các chai, lọ mẫu đã sử dụng và dụng cụ sau khi cấy xong sẽ được
vận chuyển lại phòng rửa dụng cụ để xử lý. Mẫu cấy xong sẽ được chuyển sang phòng
nuôi cây.
2.2.5 Phòng tăng trưởng
Hình 2.7 Phòng tăng trưởng
Phòng tăng trưởng chứa cây in vitro với số lượng lớn nên được trang bị nhiều
giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang để chiếu sáng, tạo điều kiện về cường độ ánh sáng và
thời gian chiếu sáng thích hợp cho cây sinh trưởng. Phòng còn có máy điều hòa nhiệt độ
để tạo điều kiện nhiệt độ thích hợp, máy đo nhiệt độ và độ ẩm xác định nhiệt độ, độ ẩm
15
trong phòng để kịp thời điều chỉnh khi có sự thay đổi bất thường về nhiệt độ và độ ẩm.
Ngoài ra, trong phòng nuôi cây còn trang bị máy lắc để phục vụ cho việc lắc đều mẫu
trong xà phòng hay nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc.
Yêu cầu đối với Phòng tăng trưởng:
- Phải đảm bảo sạch sẽ, ngăn nắp
- Đảm bảo điều kiện nhiệt độ, ánh sáng ổn định, tránh giao động quá lớn
- Mẫu phải được sắp xếp ngăn nắp, có khoa học để tiện việc kiểm tra, quan sát.
2.2.6 Khu nhà lưới - nhà màng
Khu nhà lưới với diện tích 4.300 m 2 có chức năng bảo tồn nguồn gen, trồng thử
nghiệm, nhân giống hoa trong chậu, công suất thử nghiệm khoảng từ 50.000 đến 60.000
chậu hoa các loại… Hiện nay, nhà lưới đã bảo quản và lưu trữ nhiều giống hoa Lan, trong
đó có nhiều giống Lan rừng Việt Nam, nhiều giống cây dược liệu quý được sưu tầm và
vận chuyển từ bắc chí nam và giống cây kiểng khác.
Hình 2.8
nhà lưới
màng
Khu
- nhà
Sưu tập,
lưu
trữ
nguồn
gen
các
giống
dược
liệu
bao gồm
các
giống
bản
địa
và
các
giống từ
nước
ngoài đã
được
đem về
Việt Nam. Từ đó ta chọn lọc những giống quý có giá trị về mặt y dược và kinh tế để nhân
giống in vitro.
2.3 quy trình sản xuất lan in vitro
16
Chương 3: KẾT QUẢ THỰC TẬP
3.1 Chuẩn bị dụng cụ
Ở phòng rửa dụng cụ, nhóm được hướng dẫn chuẩn bị chai lọ, nút cao su, giấy báo và
dụng cụ để phân phối môi trường.
Các lưu ý:
+ Chai lọ phải sạch sẽ, khô ráo trước khi phân phối môi trường vào.
+ Nút cao su phải được thay bông không thấm nước sau mỗi lần sử dụng.
+ Phân phối môi trường vào chai phải đều để đảm bảo đúng thể tích môi trường và
khối lượng agar, than hoạt tính.
+ Đậy nút cao su cẩn thận
+ Bịch đầu chai lại bằng giấy báo.
+ Ký hiệu từng loại môi trường.
3.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào mô ôt số đối tượng nhất định, vấn đề đă ôt ra là chọn
môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lê ô các chất dinh dưỡng. Hiê nô nay, môi
trường Murashige-Skoog được coi như là mô ôt môi trường thích hợp với nhiều loại cây do
giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng. Để thuận tiện cho việc pha môi trường nuôi cấy,
người ta không cần hoá chất mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dạng dung dịch
mẹ, sau đó pha loãng ra để sử dụng.
3.1.1 Pha dung dịch mẹ
Dung dịch mẹ được pha với nước cất 2 lần. Thường pha các dung dịch mẹ: Khoáng đa
lượng, khoáng vi lượng, Fe-EDTA, vitamin, chất điều hoà sinh trưởng. Dung dịch mẹ pha
đậm đặc từ x 10 – x 200 (10 lần đến 200 lần). Bảo quản trong tủ lạnh và thời gian sử dụng
khoảng nửa tháng.
Khoáng đa lượng MS (x 20 lần), g/l.
Bảng 3.1 Các khoáng đa lượng
Nồng độ môi trường Lượng hóa chất cần pha
Tên hóa chất
(mg/l)
trong dung dịch mẹ
NH4NO3
165
33 g
KNO3
1900
38 g
KH2PO4
170
3,4 g
MgSO4.7H2O
370
7,4 g
CaCl2.2H2O
440
8,8 g
Cân và dùng nước cất hòa tan từng chất trong becher riêng. Trộn từng loại hóa chất
theo thứ tự vào ống đong 1 lít, vừa đổ vừa khuấy và cho thêm nước cất cho đủ 1 lít.
Khoáng vi lượng MS (x100 lần), mg/l.
Bảng 3.2 Các khoáng vi lượng
17
Tên hóa chất
MnSO4.4H2O
H3BO3
ZnSO4.7H2O
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
Nồng độ môi trường
(mg/l)
22,300
6,200
8,600
0,830
0,250
0,025
0,025
Lượng hóa chất cần pha
trong dung dịch mẹ
2230 mg
620 mg
860 mg
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
Cân 3 chất đầu tiên và hòa tan với nước cất trong từng becher riêng. Cho từng
dung dịch theo thứ tự vào ống đong 1 lít. Sau đó hút 1 ml dung dịch của 4 chất tiếp theo
cho vào ống đong, vừa cho vừa khuấy đều và thêm nước cất cho đủ 1000 ml.
- Dung dịch KI: 83 mg/ml: cân 8.300 mg KI hòa tan với nước cất cho đủ 100 ml.
- Dung dịch Na2MoO4.2H2O: 25 mg/ml: cân 2.500 mg Na2MoO4.2H2O hòa tan
với nước cất cho đủ 100 ml.
- Dung dịch CuSO4.5H2O: 2,5 mg/ml: cân 250 mg CuSO4.5H2O hòa tan với nước
cất cho đủ 100 ml.
- Dung dịch CoCl2.6H2O: 2,5 mg/ml: cân 250 mg CoCl2.6H2O hòa tan với nước
cất cho đủ 100 ml.
Vitamin Morel, x 200 lần, mg/l.
Bảng 3.3 Các Vitamin
Vitamin
Nồng độ môi trường Lượng hóa chất cần pha
(mg/l)
trong dung dịch mẹ (mg)
Pirydoxine (B6)
0,1
100
Meso-inositol
100
20000
Nicotinic Acid (P.P.)
0,5
100
Thiamin-HCl (B1)
0,1
20
Các dung dịch vitamin và acid amin:
Cân các lượng hóa chất trên và dùng nước cất hòa tan lần lượt từng chất trong
becher cho tan hoàn toàn. Dùng ống đong 1 lít điều chỉnh cho đủ 1 lít.
Fe-EDTA x 100 lần, mg/l.
Na2EDTA 3,750/100ml đun nóng.
FeSO4.7H2O 2,780/100ml đun nóng.
Hòa hai dung dịch với nhau lên thể tích một lít, dùng 10ml/l môi trường làm việc.
3.1.2
Thành phần chất điều hoà sinh trưởng thực vật
Dung dịch các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: (tính theo mg)
- Dung dịch BAP (1 mg/ml): cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hòa tan trong 5 ml
NaOH.1N. Cho thêm nước cất cho đủ 100 ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg BAP.
18
- Dung dịch IAA (1 mg/ml): cân 100 mg Indoleacetic acid (IAA) hòa tan trong 5 ml
NaOH.1N. Cho thêm nước cất cho đủ 100 ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg IAA.
- Dung dịch IBA (1 mg/ml): cân 100 mg Indolebutyric acid (IBA) hòa tan trong 5 ml
NaOH.1N. Cho thêm nước cất cho đủ 100 ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg IBA.
- Dung dịch Kinetin (1 mg/ml): cân 100 mg Kinetin (KIN) hòa tan trong 5 ml NaOH.1N.
Cho thêm nước cất cho đủ 100 ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg KIN.
- Dung dịch NAA (1 mg/ml): cân 100mg Naphthaleneacetic acid (NAA) hòa tan trong 5
ml NaOH.1N. Cho thêm nước cất cho đủ 100ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg NAA.
- Dung dịch 2,4 - D (1mg/ml): cân 100mg 2,4 - D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) hòa
tan trong 50ml ethanol 50%. Cho thêm nước cất cho đủ 100ml. Mỗi ml dung dịch có chứa
1mg 2,4 - D.
3.2 Quy trình pha môi trường
Pha 20 lít môi trường MS nhân chồi.
- Lấy dung dịch stock đa lượng, vi lượng, vitamin, Fe-EDTA tương ứng với thể tích
cần pha.
- Chuối được bóc vỏ và xay nhuyễn, khoai tây được cắt lát và nấu chín rồi lấy dịch
chiết để hòa trộn vào môi trường.
- Cân và pha 10g peptone (bằng nước nóng), cân và hòa tan 2g myo-inositol.
- Lấy nước của 5 trái dừa khoảng 1000ml.
- Cân và hòa tan 600g đường.
- Bổ sung stock chất điều hòa sinh trưởng thực vật: BAP 20 mL (nồng độ 1mg/l),
NAA 20 mL (nồng độ 1mg/l).
- Cho tất cả các dung dịch trên vào thau lớn, thêm nước cho đủ 20 lít (Có thể sử
dụng nước lọc và xử lý UV để pha môi trường sản xuất nhằm tiết kiê m
ô chi phí).
- Khuấy đều hỗn hợp và chuẩn pH 5,5 – 5.8. Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của
các ion, khả năng hòa tan các chất khoáng. Đối với hầu hết các môi trường nuôi cấy
pH 5,0-6,0 trước khi hấp tiệt trùng được xem là tối ưu. Độ pH cao hơn sẽ làm cho
môi trường rất rắn trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar.
- Cân 10g than hoạt tính và 160g agar cho vào hổn hợp và khuấy đều.
- Dùng máy rót cho môi trường vào chai nuôi cấy loại 500 mL với thể tích cần thiết
của từng loại môi trường khoảng 60 - 64 ml/chai.
- Hấp tiệt trùng (121°C, 1atm, 20 phút).
- Tồn trữ, bảo quản.
3.3 Quy trình cấy chuyền lan
Các bước tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị tủ cấy. Việc chuẩn bị tủ cấy đóng vai trò quan trọng trong việc đảm
bảo đầy đủ dụng cụ cần thiết khi cấy mẫu, tránh việc đi tới đi lui lấy dụng cụ để đảm bảo
điều kiện vô trùng trong quá trình thao tác.
19
Mở đèn UV của tủ cấy 15 - 30 phút để tiê ôt trùng tủ, đây là thao tác chung cho tất cả
các thao tác (cấy chuyền, tách đỉnh sinh trưởng, vô mẫu,…).
Tiến hành vệ sinh tủ cấy sai khi đã xử lý UV.
Bước 2: Dụng cụ, ống nghiê m
ô , đĩa cấy, bình môi trường và bình mẫu cấy được xử lý
bằng cồn 70° rồi đưa vào trong tủ. Phân phối cồn 96° vào ống nghiê m
ô và đèn cồn.
Tiến hành đốt dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn ít nhất 3 lần để tiêu diê ôt vi sinh còn trên
bề mă tô . Việc khử trùng bề mặt là việc cũng rất quan trọng và đảm bảo rằng không tồn tại
vi sinh trên bề mặt làm việc. Dụng cụ được khử trùng với cồn 96°.
Việc khử trùng dụng cụ, chai môi trường, chai mẫu và tay trước khi cấy mẫu nhằm
khử trùng vì trong quá trình di chuyển đến phòng cấy, các dụng cụ, chai môi trường, chai
mẫu từ phòng khử trùng đã tiếp xúc không khí, các vi sinh vật trong không khí đã bám
vào trong thời gian di chuyển.
Bước 3: Hơ khử trùng miệng chai đựng mẫu (nhằm loại bỏ các vi sinh vật bám trên
miệng chai), dùng pence gắp mẫu ra đĩa cấy.
Lưu ý: khi gắp mẫu ra đĩa phải đảm bảo rằng mẫu phải nằm trong đĩa cấy, tránh mẫu
bị rớt ra ngoài hoặc đụng vào mép đĩa tránh cho mẫu bị nhiễm.
Bước 4: Trước khi cấy mẫu vào chai môi trường, nên loại bỏ những phần hoại tử trên
mẫu. Nếu không loại bỏ các phần hoại tử trên mẫu thì trong quá trình nuôi cấy chúng phát
triển chậm, yếu hoặc không phát triển, ảnh hưởng tới kết quả nuôi cấy, đồng thời giúp
phần còn lại của mẫu phát triển tốt hơn.
Bước 5: Dùng dao cắt những đoạn cụm chồi để tạo mẫu ban đầu đồng nhất.
Bước 6: Hơ khử trùng miệng chai môi trường cấy chuyền. Công việc này sẽ đảm bảo
điều kiện vô trùng kỹ hơn khi cấy mẫu vào trong môi trường.
Bước 7: Dùng pence gắp mẫu cắm vào chai môi trường, không cắm quá sâu ảnh
hưởng tới sự phát triển của mẫu.
Bước 8: Sau khi cắm mẫu vào trong bình, hơ khử trùng miệng chai xung quanh lửa
đèn cồn, đậy nắp lại, dùng thun côt kín chai để không khí bên ngoài không lọt vào.
Bước 9: Dùng giấy ghi tên môi trường tên mẫu cấy, ngày cấy chuyền, người cấy và
cột thêm 1 lớp ở miệng chai để tiện theo dõi kết quả và tránh sự nhầm lẫn.
Bước 10: Đem vào nuôi trong phòng tăng trưởng với những điều kiện thích hợp giúp
mẫu cấy phát triển.
Bước 11: Sau khi cấy xong, lau tủ cấy bằng cồn, dọn dẹp sạch sẽ nơi làm việc, giữ
nguyên vị trí các dụng cụ có trong tủ cấy từ trước. Tắt đèn, quạt trong tủ cấy.
Lưu ý: Trong quá trình tiến hành cấy chuyền mọi thao tác cũng như dụng cụ cấy đều
phải đảm bảo vô trùng. Trong khi thao tác tuyệt đối không được nói chuyện đùa giỡn,
không đưa tay qua mẫu, sắp xếp các vật dụng trong tủ cấy thuận tiện trong lúc thao tác để
hạn chế di chuyển các vật dụng trong tủ cấy tránh làm khuấy động không khí xung quanh
mẫu dẫn tới mẫu dễ bị nhiễm. Khi vào phòng cấy phải mặc áo blouse, khi cấy đeo khẩu
trang. Ra vào phòng cấy phải đóng cửa.
20
- Xem thêm -