Tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm

A. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1.Tính cấp thiết của luận án Từ xa xưa con người đã có nhu cầu làm đẹp, đã biết làm đẹp. Ngày nay, khi xã hội phát triển, kinh tế phát triển, nhu cầu làm đẹp ngày càng tăng cao. Những sản phẩm “làm đẹp” cho con người chính là mỹ phẩm. Chất lượng mỹ phẩm là một vấn đề cần phải được quan tâm bởi vì mỹ phẩm được sử dụng tiếp xúc trực tiếp với những bộ phận bên ngoài của cơ thể, mỹ phẩm là loại sản phẩm không có qui định về liều lượng và thời gian sử dụng, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe và vẻ đẹp của cơ thể. Trong phân loại sản phẩm, hàng hóa theo tính an toàn, mỹ phẩm thuộc nhóm 2 - cần có sự quản lý của nhà nước về tính an toàn của sản phẩm. Đánh giá, giám sát chất lượng mỹ phẩm là một trong những nhiệm vụ quan trọng của hệ thống kiểm nghiệm. Nhiệm vụ chính của công tác kiểm tra chất lượng mỹ phẩm là giám sát các chỉ tiêu ảnh hưởng tới sự an toàn của mỹ phẩm, trong đó quan trọng nhất là việc kiểm soát sự có mặt của các chất bị cấm, hoặc bị giới hạn về nồng độ, hàm lượng được phép sử dụng, có mặt trong các sản phẩm mỹ phẩm lưu hành trên thị trường Việt Nam. Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm, trong bản bổ sung mới nhất vào năm 2013 có quy định danh sách 1373 chất và nhóm chất không được phép có mặt trong các sản phẩm mỹ phẩm (Annex II, Part 1) cũng như 285 chất và nhóm chất không được phép sử dụng trừ những trường hợp ngoại lệ nhưng phải tuân theo các giới hạn và điều kiện quy định kèm theo (Annex III, Part 1). Không giống như lĩnh vực quản lý dược phẩm đã có hệ thống Dược điển được xây dựng chặt chẽ từ nhiều năm, hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa có hệ thống phương pháp chuẩn để kiểm tra các chất cấm, chất cần kiểm soát giới hạn hàm lượng trong mỹ phẩm theo yêu cầu của Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN. Bản thân ASEAN cho đến nay cũng chỉ mới ban hành được 8 phương pháp hòa hợp chung. Trong số đó có 6 phương pháp hóa lý để xác định hay định tính và định lượng một số kim loại nặng, tretinoin, 2-phenoxy ethanol và một số alkyl 4-hydroxybenzoat, hydroquinon, một số chất màu cấm và một số glucocorticoid trong mỹ phẩm. Những phương pháp này mới chỉ đáp ứng một phần rất nhỏ yêu cầu về mặt kỹ thuật để kiểm tra, giám sát các đối tượng chất cấm trong mỹ phẩm, hơn nữa bản thân những phương pháp này, nếu muốn triển khai trên thực tế tại Việt Nam, cũng cần được đánh giá thực nghiệm về sự phù hợp khi áp dụng trên các mẫu mỹ phẩm đang có mặt tại Việt Nam cũng như thực tế điều kiện trang thiết bị của nước ta (đánh giá chuyển giao phương pháp). Để đáp ứng kịp thời cho công tác kiểm nghiệm, kiểm soát an toàn mỹ phẩm trong nền kinh tế mở và xu hướng hội nhập quốc tế, luận án “ Nghiên cứu xây dựng qui trình phát hiênê và xác định hàm lượng mô êt số chất bị cấm dùng trong mỹ phẩm” đã được thực hiện. 2. Mục tiêu của luận án: 1) Thẩm định chuyển giao các phương pháp phân tích hòa hợp của ASEAN trong quản lý mỹ phẩm 2) Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích xác định một số chất bị cấm trong mỹ phẩm. 3) Kiểm tra, phát hiện các chất bị cấm và chất có giới hạn hàm lượng sử dụng đã được nghiên cứu trong một số dạng mẫu mỹ phẩm trên thị trường. 3. Những đóng góp mới của luận án: 3.1.Về việc triển khai, thẩm định chuyển giao các phương pháp của ASEAN Đã thẩm định chuyển giao thành công 3 phương pháp hòa hợp của ASEAN để phát hiện Tretinoin và định lượng chì, arsen. Đã đưa ra được các thông số phân tích cụ thể về điều kiện xử lý mẫu, thông số thiết bị phân tích. Kết quả cũng chỉ ra rằng các phương pháp hòa hợp này hoàn toàn phù hợp và triển khai được tại Việt Nam với các trang thiết bị sẵn có và các cán bộ được đào tạo về phương pháp phân tích HPLC và quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS. 3.2.Về thiết lập và đánh giá quy trình phân tích mới: -1-  Đã xây dựng được 10 quy trình phân tích, trong đó có 3 quy trình phân tích đồng thời và 7 quy trình phân tích từng chất riêng biệt, cụ thể như sau: 3.2.1. Quy trình phân tích đồng thời 4 chất màu cấm trong son môi  Về điều kiện phân tích sắc ký: Dựa trên qui trình phân tích đồng thời của ASEAN (ACM SIN 02) để phát hiện 3 chất màu cấm: MY, PO, RB, sử dụng pha động: nước - dd TBA 0,005M (25 : 75). Thực nghiệm cho thấy: Pha động có tủa lại kể cả sau khi lọc. Thời gian để tủa trước khi lọc không được nêu rõ, chỉ nêu “để yên vài giờ” mà thực tế để 6 ngày vẫn còn tủa lại. Vì vậy đã nghiên cứu cụ thể thời gian, cách thức để pha động tủa hoàn toàn (để lạnh ở 14-15 oC trong 72 giờ hoặc để yên ở nhiệt độ phòng 7 ngày) rồi lọc trước khi đưa vào hệ thống sắc ký. Đã đưa thêm Pigment red 53 cùng được phân tích đồng thời với 3 chất màu MY, PO và RB.  Về đánh giá qui trình: Đã đánh giá khá đầy đủ các chỉ tiêu: độ thích hợp hệ thống (các pic cân đối, Rs nhỏ nhất cũng bằng 2,2, số đĩa lý thuyết thấp nhất là 2592), độ lặp lại tốt cho cả 4 chất màu cấm (RSD của thời gian lưu đều nhỏ hơn 1%, RSD của diện tích pic đều nhỏ hơn 2%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi từ 94,0% đến 101,5%). Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) thấp hơn ASEAN nhiều lần (MY là 100 lần, RB là 200 lần; PO là 2000 lần và PR là 0,003 µg/ml) Qui trình vừa để định tính (phát hiện) thông qua các chỉ số: độ tinh khiết píc, so sánh thời gian lưu và chồng phổ của píc nghi ngờ với píc của chất chuẩn. Qui trình cũng có thể định lượng bằng cách so sánh diện tích píc của píc thu được từ mẫu thử với píc thu được từ mẫu chuẩn. Như vậy, ngoài việc phát hiện còn đánh giá được mức độ lạm dụng nguy hiểm, thể hiện sự thành công trong việc triển khai và cải tiến các qui trình sẵn có của ASEAN. 3.2.2.Quy trình phát hiện, định lượng đồng thời 4 chất Sudan  Về xử lý mẫu và điều kiện sắc ký: Sau khi khảo sát, hỗn hợp methanol – ethyl acetat (1:1) đã được lựa chọn làm dung môi chiết mẫu. Với hệ dung môi này, nhóm chất Sudan tan rất tốt, dung dịch mẫu thử sạch không bị lẫn nhiều tạp chất, qui trình chiết đơn giản, dễ dàng. Đây cũng là dung môi mà tác giả Nguyễn Văn Yên và cộng sự nghiên cứu 3 năm sau dùng lại (năm 2010) để hòa tan các sudan trong cắn thu được sau khi chiết mẫu mỹ phẩm và thực phẩm bằng aceton. Điều kiện phân tích bao gồm: cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) (Phenomenex hoặc Apollo), pha động: methanol - nước (95:5), tốc độ dòng: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm: 20 µl, điều kiện detector PDA: quét phổ trong dải 300-900 nm, lấy sắc đồ tại 488 nm. Về đánh giá quy trình phân tích: Cho kết quả tốt về độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, LOD, LOQ và độ ổn định của dung dịch các chất màu Sudan. LOQ thấp: Sudan I là 0,23 µg/ml, Sudan II là 0,24 µg/ml, Sudan III là 0,25 µg/ml, Sudan IV là 0,24 µg/ml cho phép phát hiện các chất bị cấm Sudan trong son, sơn móng, phấn trang điểm ở nồng độ rất nhỏ (ppm). 3.2.3.Quy trình phát hiện đồng thời 12 chất steroid trong kem bôi da Về qui trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký: Phương pháp hòa hợp ASEAN (ACM/MAL 07) để định tính 5 chất thuộc nhóm steroid đã dùng methanol làm dung môi chiết các chất phân tích từ các mẫu kem bôi da. Tuy nhiên, qua khảo sát một số chất thuộc 12 steroid nghiên cứu cho pic không cân đối, một số nền mẫu có nhiều tạp khi phân tích sắc ký. Vì vậy, chúng tôi đã chọn hỗn hợp dung môi dicloromethan-methanol (9 : 1) để chiết mẫu phối hợp làm nóng bằng cách thủy. Tiếp theo, thay vì ly tâm, hỗn hợp được để lạnh trong nước đá 1 giờ để tủa các tá dược, lọc và bốc hơi trên cách thủy tới cắn rồi hòa tan cắn trong acetonitril - methanol - nước (20 : 30 : 30), lọc. Với cách xử lý mẫu này, các pic thu được rất cân đối, nền mẫu phân tích sạch (hầu như không thấy xuất hiện các píc phụ). Giữ nguyên điều kiện về cột sắc ký của ASEAN (ODS 250 x 4,6 mm, 5µm). Pha động là ACN - nước (48:52) chế độ đẳng dòng thay cho gradient dung môi trong phương pháp ASEAN. Đã xây dựng được qui trình định tính đồng thời 12 chất steroid trong đó có bao gồm 4 chất trong phương pháp của ASEAN. Về đánh giá qui trình phân tích: -2- Kết quả đánh giá về độ thích hợp của hệ thống (độ lặp lại của thời gian lưu, diện tích pic, hệ số phân giải Rs, số đĩa lý thuyết), độ đặc hiệu và độ ổn định của dung dịch đảm bảo yêu cầu để phân tích phát hiện đồng thời 12 chất steroid trong mỹ phẩm dạng kem bôi da. Qui trình có thể áp dụng được trên máy phân tích chỉ có một bơm, một kênh dung môi. 3.2.4. Quy trình phân tích thủy ngân trong mỹ phẩm dạng kem và phấn bôi da Quy trình phân tích thủy ngân của phương pháp hòa hợp được xây dựng cho thiết bị đo dòng liên tục (không sẵn có trong điều kiện của cơ sở nghiên cứu), do đó đã tiến hành khảo sát, thiết lập quy trình phân tích mới phù hợp với thiết bị đo gián đoạn tổng lượng thủy ngân cho 2 đối tượng là kem và phấn bôi da. - Với các mẫu phấn bôi da, đã khảo sát và lựa chọn được hỗn hợp H2SO4 – HNO3 (1:1), vô cơ hóa triệt để các nền mẫu phấn, đã cụ thể hóa các thông số của thiết bị vô cơ hóa mẫu bằng vi sóng, cũng như bổ sung thêm một giai đoạn xử lý mẫu (giai đoạn thêm dung dịch KMnO 4) để phù hợp với điều kiện thiết bị của đơn vị nghiên cứu. Kết quả thẩm định quy trình sau khi xây dựng cho thấy quy trình mới thiết lập đảm bảo về độ đặc hiệu, độ đúng, độ lặp lại, có khoảng tuyến tính phù hợp với đối tượng áp dụng, đồng thời có LOD và LOQ hoàn toàn đáp ứng được yêu cầu trong phương pháp ASEAN cũng như yêu cầu quản lý qui định tại Thông tư 06/2011/TT-BYT ngày 25/1/2011 của Bộ Y tế Việt Nam (Giới hạn thủy ngân trong mẫu mỹ phẩm cho phép là ≤ 1 ppm, phương pháp xây dựng có LOD là 30 ng, LOQ là 100 ng thủy ngân trong mẫu phân tích tương ứng với 0,15 ppm và 0,5 ppm trong mẫu mỹ phẩm). 3.2.5. Về qui trình định tính, định lượng Hydroquinon  Về xử lý mẫu và điều kiện sắc ký: Hỗn hợp methanol - đệm phosphat pH 5,5 (50 : 50) là dung môi tốt nhất để chiết mẫu, dung dịch mẫu thử sạch không bị lẫn nhiều tạp chất và cho pic Hydroquinon cân đối. Hơn nữa, đây chính là pha động trong chương trình sắc ký để phân tích Hydroquinon đã khảo sát và lựa chọn được. Phương pháp hòa hợp ACM INO 03 dùng ethanol 96% để chiết mẫu. Áp dụng điều kiện sắc ký do phương pháp ACM INO 03 đưa ra với một số đối tượng mẫu trên thực tế, kết quả là pic Hydroquinon không tách được khỏi píc của chất chưa biết có sẵn trong nền mẫu. Thực tế cho thấy, pha động của phương pháp ASEAN chỉ có ACN và nước (45 : 55) nên khả năng rửa giải, phân tách các chất hạn chế kể cả khi thay đổi các tỷ lệ khác nhau của 2 dung môi này. Thay pha động bằng hỗn hợp ACN-đệm phosphat pH 5,5 (50 : 50) đã giải quyết được yêu cầu. Sự có mặt của dung dịch đệm đã làm thay đổi rõ rệt tính phân cực của pha động, sự tương tác của chất phân tích với pha động, píc Hydroquinon đã được rửa giải tách biệt hoàn toàn.  Về đánh giá qui trình phân tích: Những kết quả thẩm định về độ đặc hiệu cao, độ lặp lại, độ đúng tốt, LOD và LOQ (thấp hơn so với phương pháp của ASEAN) đã cho thấy quy trình xây dựng mới thích hợp cho việc phát hiện, định lượng Hydroquinon trong đối tượng mỹ phẩm dạng kem bôi da ngay cả khi trong nền mẫu có chất có thể được rửa giải rất gần với Hydroquinon mà khi dùng chương trình sắc ký của phương pháp hòa hợp ASEAN không tách được hoàn toàn. 3.2.6. Về 5 quy trình phân tích từng chất màu riêng biệt còn lại (MY, PO, PR, RB, CV) Về xử lý mẫu: Lựa chọn dung môi chiết mẫu: chỉ có MY và PO là dùng hỗn hợp dung môi chiết giống phương pháp của ASEAN (Dimethylformamid - acid phosphoric (95:5)). Các chất màu còn lại phải khảo sát thực nghiệm để lựa chọn. Cụ thể như sau: RB là ACN - nước (1:1), PR là dimethylsulfoxid, CV là ACN - THF - dd đệm amoniac pH 9,5 -10,0 (2 : 3 : 5). Các dung môi chọn lựa được đều hòa tan tốt chất cần phân tích, dịch chiết mẫu thử sạch, pic thu được cân đối. Với các mẫu son thỏi, sơn móng (dạng sáp, thể chất rất quánh), dùng một lượng nhỏ tetrahydrofuran hay dimethylformamid để phân tán mẫu rồi chiết thay cho chiết 2 pha lỏng - lỏng (n-hexan và dung môi chiết mẫu như ASEAN) cũng cho kết quả tương ứng nhưng cách làm đơn giản và nhanh hơn (vì không cần chuyển vào bình gạn và chờ phân lớp). Về điều kiện sắc ký: -3- Các qui trình để phân tích riêng MY, PO, PR đều dùng một loại cột sắc ký C18, cùng một thành phần pha động là hỗn hợp methanol - dd đệm pH 6,2, chỉ khác về tỷ lệ thành phần pha động và bước sóng lấy sắc ký đồ. Đây là một thuận lợi trong thực tế vì chỉ thay đổi nhỏ là có thể phân tích được cả 3 chất màu với cột sắc ký thông dụng, các dung môi dễ kiếm, cách chuẩn bị pha động đơn giản. Tương tự, chỉ thay đổi về bước sóng phân tích có thể phân tích được 2 chất RB (550nm) và CV (590nm) với cùng pha động là hỗn hợp: ACN-THF-dd đệm pH 9,0 (2:3:5) bằng cột C18. Đã đánh giá các phương pháp phân tích này về độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng, độ lặp lại, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ. Kết quả đánh giá cho thấy các phương pháp có độ đặc hiệu cao, độ chính xác và độ đúng đạt yêu cầu, đảm bảo phù hợp với việc áp dụng kiểm tra chất cấm, chất cần kiểm soát hàm lượng trong mỹ phẩm ở mức nồng độ nhỏ, nền mẫu phức tạp. LOD của các quy trình đã thiết lập đều đáp ứng được yêu cầu đưa ra trong các phương pháp hòa hợp hiện có của ASEAN. Một số phương pháp phân tích có độ nhạy tốt hơn nhiều lần so với phương pháp phân tích chất cấm tương ứng mà ASEAN đã đưa ra.  Đã có 11/13 quy trình phân tích được phê duyệt và áp dụng thực tế để kiểm tra các chất cấm một cách kịp thời, phục vụ cho công tác quản lý chất lượng mỹ phẩm, 2 quy trình còn lại đang chờ phê duyệt. 3.3. Về áp dụng các quy trình để kiểm tra các chất cấm trong các mẫu mỹ phẩm: Lần đầu tiên một khảo sát thực tế được tiến hành để đánh giá sự có mặt của nhiều đối tượng chất cấm (bao gồm: 6 chất màu và nhóm chất màu (Metanil yellow, Rhodamin B, Pigment red 53, Pigment orange 5, Crystal violet và các Sudan), 3 chất và nhóm chất có tác dụng dược lý bị cấm hay có giới hạn về hàm lượng sử dụng (Tretinoin, các Steroid, Hydroquinon) và các kim loại nặng (As, Pb, Hg) với hơn 230 mẫu mỹ phẩm thuộc 6 nhóm sản phẩm khác nhau (son, sơn móng, phấn, kem bôi da, sữa rửa mặt, và dầu gội đầu). Kết quả là có tới 30 mẫu phát hiện thấy có chất bị cấm hoặc vượt quá giới hạn cho phép (chiếm khoảng 13%). 4. Ý nghĩa của luận án: - Đánh giá chuyển giao các phương pháp của ASEAN nhằm khẳng định tính khả thi, phù hợp khi áp dụng tại Việt Nam với các trang thiết bị sẵn có và các cán bộ được đào tạo về phương pháp phân tích HPLC và AAS, sẵn sàng cho sự hòa hợp về quản lý mỹ phẩm với các nước ASEAN theo ”Hiệp định hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm”. - Các quy trình phân tích mới xây dựng đã được thẩm định chặt chẽ trong điều kiện trang thiết bị của Việt Nam, là những tài liệu tham khảo quan trọng về mặt chuyên môn, bổ sung cho các phương pháp hòa hợp ASEAN đã công bố. Các quy trình phân tích (kể các các quy trình chuyển giao) là những tài liệu kỹ thuật có tính khoa học cao, rất thiết thực, kịp thời đáp ứng cho công tác kiểm tra các chất cấm trong mỹ phẩm, một công tác còn khá mới mẻ ở Việt Nam. Những quy trình này có thể áp dụng rộng rãi tại các trung tâm kiểm nghiệm mỹ phẩm thuộc hệ thống quản lý cũng như doanh nghiệp sản xuất, kinh doanh mỹ phẩm để góp phần kiểm tra mức độ an toàn của các sản phẩm. Năm 2012, đã đào tạo cho 76 học viên từ 30 trung tâm kiểm nghiệm phía Bắc về phát hiện các chất màu cấm và phương pháp xác định giới hạn chì, arsen. Năm 2013 đã đào tạo cho 30 học viên từ 16 trung tâm kiểm nghiệm và cán bộ của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương về quy trình phân tích phát hiện các corticoid trong kem bôi da mỹ phẩm. - Bước đầu đánh giá thực trạng tình hình chất lượng mỹ phẩm trên thị trường Việt Nam có nhiều điểm bất cập nhất là các chỉ tiêu an toàn, cần được quan tâm quản lý một cách sát sao hơn nữa, tăng cường công tác kiểm tra hậu mại để đảm bảo an toàn cho người sử dụng. 5. Bố cục của luận án Luận án gồm 150 trang. Đặt vấn đề (2 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (40 trang), Chương 2: Đối tượng, nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang), Chương 3: Kết quả (78 trang), Chương 4: Bàn luận (16 trang), Chương 5: kết luận và kiến nghị (2 trang), 125 tài liệu tham khảo với 46 tài liệu tiếng Việt, 79 tài liệu tiếng Anh. Phần nội dung có: 79 bảng, 32 hình, 5 phụ lục. -4- B. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương I. TỔNG QUAN Đã tập hợp và trình bày có hệ thống về nội dung cơ bản của công tác quản lý và kiểm tra chất lượng mỹ phẩm trên thế giới và Việt Nam. Giới thiệu về tính chất hóa, lý, ứng dụng, độc tính và các phương pháp phân tích của các tác giả trong và ngoài nước về 3 nhóm chất bị cấm và chất có giới hạn hàm lượng sử dụng: nhóm các chất màu: Metanil yellow (MY), Rhodamin B (RB), Pigment orange 5 (PO), Pigment red 53 (PR) , Crystal violet (CV), các chất Sudan; nhóm chất có tác dụng dược lý mà bị cấm hay có giới hạn hàm lượng sử dụng: Tretinoin, hydroquinon, các corticoid; nhóm các kim loại nặng: As, Pb, Hg. Trình bày cụ thể các phương pháp hòa hợp của ASEAN liên quan đến các đối tượng chất cấm mà luận án nghiên cứu. Chương II. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng mẫu nghiên cứu: 06 nhóm mẫu mỹ phẩm mua trên thị trường: Son môi (son thỏi, son nước), sơn móng, phấn trang điểm (phấn má, phấn mắt), kem bôi da mỹ phẩm, sữa rửa mặt, dầu gội đầu. 2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị: - Chất đối chiếu: có nguồn gốc, lô, hạn sử dụng rõ ràng (Phần lớn là của hãng Merck, Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương, của Hàn quốc). - Dung môi hóa chất: các dung môi sử dụng đều đạt tinh khiết cho phân tích HPLC, hóa chất đạt mức độ tinh khiết phân tích và tinh khiết dùng cho AAS (superpure) - Thiết bị: Các thiết bị, máy phân tích tại Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương được hiệu chuẩn theo qui định của ISO/IEC 17025 gồm: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu có trang bị detector PDA; máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Z-5000 (Hitachi, Nhật Bản) được trang bị bộ dụng cụ phân tích thuỷ ngân chuyên dụng "A.A-Mercury Reduction Unit" và bộ phân tích hóa hơi hydrid chuyên dụng; cân phân tích Mettler Toledo AB204S chính xác đến 0,1mg; thiết bị vô cơ hóa mẫu bằng vi sóng Milestone Start-D (Mỹ); hệ thống lọc nước trao đổi ion (Easypure UV/UF, Barnsted, Mỹ); bộ cốc teflon chuyên dụng cho AAS.... 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp HPLC 2.3.1.1. Khảo sát, lựa chọn qui trình phân tích: Khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu: chọn dung môi và phương pháp chiết sao cho chiết được hoàn toàn chất phân tích từ nền mẫu, loại bỏ tối đa ảnh hưởng của nền mẫu, chất phân tích bền trong môi trường pha mẫu (dựa vào 3 yếu tố: tính tan của chất phân tích, đặc điểm nền mẫu, phương pháp phân tích). Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp: cột sắc ký, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, bước sóng phân tích với detector PDA, thể tích tiêm mẫu. Định tính bằng so sánh thời gian lưu, độ tinh khiết pic và chồng phổ UV-VIS, so sánh hệ số tương đương của píc nghi ngờ thu được từ mẫu thử với pic thu được từ mẫu chuẩn. Định lượng bằng cách so sánh diện tích hoặc chiều cao píc thu được từ mẫu thử với mẫu chuẩn. 2.3.1.2. Đánh giá phương pháp phân tích: Với đối tượng nghiên cứu là các chất cấm nên trong thẩm định đánh giá phương pháp phân tích coi như phép thẩm định đánh giá các tạp chất (thường có nồng độ nhỏ trong mẫu). Tham khảo dự thảo hướng dẫn của ASEAN về đánh giá phương pháp phân tích mỹ phẩm, hướng dẫn của ICH, Dược điển Mỹ (USP 34), Dược điển Anh BP 2010, thông tư 22/TT-BYT, tài liệu đào tạo của VKNTTW và của các chuyên gia, qui định về các chỉ số cần đánh giá:  Với qui trình phân tích định tính: đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện.  Với qui trình phân tích xác định giới hạn tạp (Hg, Pb, As): độ thích hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (theo ICH), USP yêu cầu thêm: độ đúng và khoảng xác định. -5-  Với qui trình phân tích định lượng: độ phù hợp của hệ thống sắc ký, tính đặc hiệu, độ chính xác, khoảng tuyến tính, độ đúng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ít nhất đạt được yêu cầu như các qui trình ASEAN đã đưa ra. - Tính thích hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký với các dung dịch chuẩn, tự tạo hay mẫu thử (ít nhất 6 lần tiêm). Yêu cầu: Độ phân giải giữa pic liền kề với píc của chất cần phân tích phải ≥ 1,5. Số đĩa lý thuyết ≥ 2000. Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 1,0% và của diện tích píc phải ≤ 2,0% . Trường hợp giá trị RSD > 2%, phải có sự giải thích phù hợp. Các thông số khác của píc phải đáp ứng yêu cầu chung của phương pháp HPLC. - Độ đặc hiệu: Tiến hành sắc ký các loại mẫu: mẫu trắng (dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu); mẫu nền (mẫu mỹ phẩm không có chất cần phân tích); mẫu chuẩn; mẫu tự tạo (mẫu mỹ phẩm không có chất cần phân tích đã được cho thêm chất chuẩn cần phân tích và được chuẩn bị theo quy trình) và mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình. Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu thử/mẫu tự tạo: píc của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các píc khác (nếu có trong nền mẫu), píc của chất cần phân tích có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn thu được từ mẫu chuẩn. Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện píc ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng píc phải ≤ 1,0% so với đáp ứng píc của mẫu chuẩn. Píc của chất cần phân tích trong sắc ký đồ dung dịch thử phải tinh khiết. Hệ số chồng phổ UV-VIS của píc hoạt chất cần phân tích thu được trong sắc ký đồ của dung dịch thử/tự tạo với píc tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn ≥ 0,99. - Khoảng nồng độ tuyến tính: Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (5 dung dịch). Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng píc thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995). Trường hợp r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp. Hệ số y-intercept tại nồng độ 100% (Y): Y ≤ 5,0% cho Hydroquinon (kem chứa Hydroquinon có hàm lượng tối đa cho phép ≤ 2%); Y ≤ 10% cho các chất màu cấm, Tretinoin, các nguyên tố độc với: Y = (Hệ số chắn x 100)/ Spic ở nồng độ 100%. - Độ đúng: Xác định trên các mẫu tự tạo. Cách 1: Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào các nền mẫu không có chất này. Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 80%, 100% và 120% so với nồng độ phân tích. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập. Tính kết quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính. Cách 2: chuẩn bị và phân tích 6 mẫu thử độc lập với lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với mức nồng độ 100% của qui trình phân tích. Tính lượng thu hồi theo công thức: Tỷ lệ thu hồi (%) = (Lượng chất phân tích tìm lại x 100)/ Lượng chất chuẩn thêm vào. Tham khảo hướng dẫn của ICH, ASEAN và AOAC, yêu cầu với phép thử định lượng: Tỷ lệ thu hồi 98,0-102,0% cho qui trình phân tích định lượng Hydroquinon và RSD của tỷ lệ thu hồi ≤ 2,0% ở mỗi mức nồng độ . Tỷ lệ thu hồi (80,0 – 110,0%) cho qui trình phân tích các chất màu cấm, Tretinoin và Hg (nồng độ chất phân tích nhỏ 100 ppb 10 ppm). Tỷ lệ thu hồi (60,0-115,0%) cho qui trình phân tích bằng phương pháp AAS đối với Pb, Cd, As bằng kỹ thuật lò và kỹ thuật hydrid (nồng độ phân tích 10 -8). Trường hợp nằm ngoài khoảng này, phải có sự giải thích phù hợp. - Khoảng xác định: Được suy ra từ kết quả độ đúng (từ giá trị nhỏ nhất đến giá trị lớn nhất của độ đúng). - Độ chính xác: Bao gồm độ lặp lại (định lượng 06 mẫu thử độc lập trong cùng ngày) và độ chính xác trung gian (tiến hành như độ lặp lại nhưng khác ngày/khác kiểm nghiệm viên/khác hệ thống HPLC). Tham khảo hướng dẫn của AOAC, giới hạn chấp nhận phù hợp cho mẫu phân tích ở nồng độ nhỏ (100 ppm): Giá trị RSD kết quả định lượng của mỗi kiểm nghiệm viên/mỗi ngày (n=6) ≤ 3,0% và của cả hai kiểm nghiệm viên/khác ngày (n=12) phải ≤ 5,0%. - Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ): Có thể tiến hành theo cách pha loãng hoặc dựa vào đường tuyến tính và độ lệch chuẩn của đáp ứng. Giá trị LOD = (3,3 x δ)/a, trong đó: -6- δ: Độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu nền (placebo), a: Hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính (y = ax +b) giữa nồng độ và đáp ứng píc của chất cần phân tích. LOQ = 3,3 x LOD (kl/tt) 2.3.2. Phương pháp AAS: Áp dụng định lượng thủy ngân (và các kim loại độc) trong kem và phấn bôi da mỹ phẩm.  Thiết lập qui trình phân tích thủy ngân: Qui trình phải phù hợp với thiết bị hóa hơi lạnh sẵn có, phương pháp đo toàn lượng gián đoạn (khác với ASEAN thiết bị đo dòng liên tục) trong mỹ phẩm dạng kem bôi da và phấn trang điểm (phấn má, phấn mắt). Nghiên cứu thiết lập điều kiện cụ thể cho 2 giai đoạn chính của phương pháp phân tích thủy ngân: Khảo sát, lựa chọn qui trình xử lý mẫu (tác nhân vô cơ hóa, lượng mẫu đem phân tích, lượng tác nhân sử dụng). Xác định các thông số làm viê êc của máy quang phổ (vạch phổ đo, cường độ dòng làm việc của đèn cathod rỗng, độ rộng khe (slit width), thời gian lấy tín hiệu, chế độ đo...). Thông số hoạt động của bộ phân tích thủy ngân (nhất là tốc độ quay của bơm nhu động). Thao tác đo.  Đánh giá qui trình phân tích: Các chỉ tiêu cần đánh giá: độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, khoảng xác định, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng (tương tự như phương pháp HPLC). Yêu cầu: Độ tuyến tính: r ≥ 0,997, y-intercept ≤ 10%; Độ chính xác: RSD ≤ 10% (n=6), RSD ≤ 11(n=12); Độ đúng: đánh giá qua tỷ lệ thu hồi. 2.3.3. Thẩm định chuyển giao các phương pháp, tính khả thi của qui trình ASEAN trong điều kiện Việt Nam: Thẩm định tính khả thi, chuyển giao phương pháp và biên soạn lại qui trình phân tích Tretinoin, chì, arsen theo qui trình ASEAN đã đưa ra gồm: Độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ chính xác, khoảng tuyến tính, độ đúng, LOD, LOQ theo yêu cầu như các qui trình ASEAN đã đưa ra. 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu phân tích: Các kết quả thực nghiê m ê được xử lý và tính các giá trị thống kê trên Microsoft Excell để rút ra nhâ nê xét kết luâ nê . Chương III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả xây dựng qui trình phân tích một số hợp chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm 3.1.1. Metanil yellow 3.1.1.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu: Đối tượng mẫu mỹ phẩm nghiên cứu áp dụng với Metanil yellow (MY) là son môi, sơn móng. Qua khảo sát chọn được dung môi chiết mẫu là hỗn hợp DMF và acid phosphoric (95:5). Mẫu thử được chuẩn bị từ khoảng 2g mỹ phẩm. 3.1.1.2. Lựa chọn điều kiện phân tích Metanil yellow: Sau quá trình khảo sát bằng thực nghiệm, điều kiện sắc ký được lựa chọn: Cột Apollo C18 (250x 4,6mm; 5m) hoặc cột sắc ký có tính năng tương đương; detector PDA đặt trong dải bước sóng từ 200-900nm, lấy sắc đồ ở 424 nm; pha động methanol-dung dịch đệm pH 6,2 (55: 45); 1,0 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 20 l; nhiệt độ phòng. 3.1.1.3.Thẩm định quy trình  Tính thích hợp của hệ sắc ký: Kết quả sau 6 lần phân tích một mẫu cho thấy: thời gian lưu có RSD < 1% và diện tích píc có RSD < 2%, số đĩa lý thuyết trung bình là 5468. Độ đặc hiệu: Đối với dung dịch chuẩn, trên sắc ký đồ chỉ xuất hiện một pic rõ ràng của MY tại thời gian lưu khoảng 16,3 phút. Đối với mẫu trắng (mẫu mỹ phẩm không chứa MY: mẫu MY01), trên sắc ký đồ không có pic nào xuất hiện tương ứng với thời gian lưu của MY. Đối với mẫu tự tạo (mẫu MY01 được trộn thêm một lượng chính xác MY chuẩn), sắc ký đồ (SKĐ) cho một pic tương ứng với pic của MY trên SKĐ của dung dịch chuẩn về t R và phổ UV-VIS (hệ số chồng phổ là 0,9997), đồng thời pic MY được tách riêng khỏi các pic khác.  Độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ 0,4-20,0g/ml, có sự tương quan tuyến giữa diện tích pic và nồng độ MY, hệ số tương quan r là 0,9999 và hệ số intercept tại nồng độ 100%: Y= 4,15% -7-  Độ chính xác (gồm độ lặp lại trong ngày và khác ngày): Qua 6 lần phân tích độc lập trên mẫu tự tạo dựa trên nền son môi (mẫu MY01) cho RSD ngày 1 là 1,31% và ngày 2 là 0,80%, mẫu dựa trên nền sơn móng tay (mẫu MY02) cho RSD lần lượt là 1,43% và 2,00%.  Độ đúng: Được đánh giá trên nền son môi cho tỷ lệ thu hồi tốt hơn là 97,5% (từ 95,1% đến 98,4%, trên mẫu tự tạo có nền sơn móng tay là 86,0% (từ 84,8% đến 88,0%).  Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: LOD cho MY là 0,12 g/ml (tương đương 1,2g/g mẫu) và LOQ là 0,4 g/ml (tương đương 4,0 g/g mẫu). Giới hạn phát hiện này thấp hơn tới 25 lần so với phương pháp ASEAN ACM SIN 02 đưa ra là 3,0 g/ml. 3.1.2. Rhodamin B 3.1.2.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu : Đối tượng mỹ phẩm nghiên cứu áp dụng với Rhodamin B (RB) là phấn mắt, phấn má, sơn móng, son nước, son thỏi. Thêm chính xác một lượng chuẩn RB vào nền mẫu (đã xác định sơ bộ không chứa RB), để được mẫu tự tạo có chứa RB với hàm lượng khoảng 20µg/g, chiết mẫu bằng hỗn hợp acetonitril nước (1:1). Đối với các mẫu son và sơn móng phân tán mẫu trong n-hexan trước khi chiết. 3.1.2.2. Lựa chọn điều kiện phân tích Rhodamin B Đã chọn được điều kiện sắc ký tương đối phù hợp: Cột Alltech, Grace RP18 (250x 4,6 mm; 5 m) ở nhiệt độ phòng; detector PDA: quét phổ từ 300-900 nm, lấy sắc ký đồ ở 550 nm; pha động: ACN - THF - Dung dịch đệm pH 9,0 (2:3:5); 1,0ml/phút; tiêm mẫu 100 l. 3.1.2.3. Thẩm định phương pháp  Độ đặc hiệu: Trên sắc ký đồ: mẫu chuẩn chỉ xuất hiện một pic rõ ràng của RB với thời gian lưu khoảng 8,9 phút; mẫu trắng không có pic nào xuất hiện tương ứng với thời gian lưu của RB; mẫu tự tạo cho một pic tương ứng với pic của RB trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn về thời gian lưu, đồng thời được tách riêng khỏi các pic khác. Với mẫu phát hiện có RB (RB14), sắc ký đồ của dung dịch thử cho pic có cùng thời gian lưu với pic của dung dịch chuẩn RB và phổ UV-VIS trùng với phổ UV-VIS của dung dịch chuẩn RB, hệ số chồng phổ là 0,994 9. a) b) c) Hình 3.2. Sắc ký đồ của mẫu RB chuẩn (a), mẫu placebo với nền mẫu N2 (b) và mẫu tự tạo nền N2 có thêm chuẩn (c). Khoảng nồng độ tuyến tính: Kết quả đáp ứng trên sắc ký đồ (thông qua chiều cao pic H) cho thấy phương pháp phân tích đã xây dựng cho đáp ứng tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ phân tích của RB từ 50 đến 1150 ng/ml với hệ số tương quan r = 1 và y-intercept là 1,32%.  Độ chính xác: Độ lặp lại trong ngày của RB trên nền mẫu tự tạo N1 có RSD là 1,38% và 1,06% (n=6), trên nền mẫu RB14 (có RB) giá trị RSD lần lượt là 1,77% và 1,50%. Độ lặp lại khác ngày có RSD là 1,65% trên nền mẫu tự tạo N1 và RSD là 1,2% trên nền mẫu RB14  Độ đúng: Thực nghiệm trên 3 mẫu thêm chuẩn và mẫu RB14 cho thấy phương pháp cho độ đúng tương đối tốt, thể hiện qua tỷ lệ tìm lại đạt được khoảng 86,0 - 99,8%.  Giới hạn phát hiện: LOD đối với RB là 0,04g/ml ở dung dịch tiêm sắc ký (lượng cân mẫu khoảng 0,5g, thể tích pha loãng 25ml) thì LOD trên mẫu là khoảng 2,0g/g chế phẩm. 3.1.3. Pigment red 53 3.1.3.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu : Đối tượng nghiên cứu với Pigment red 53 (RR) là 20 mẫu mỹ -8- phẩm (được ký hiệu PR01-PR20) gồm: 7 mẫu son nước, 7 mẫu son rắn và 6 mẫu phấn má. Sau khi khảo sát, dimethylsulfoxid được chọn làm dung môi chiết mẫu vì nó hoà tan được PR và loại được nhiều thành phần khác trong các nền mẫu với qui trình xử lý mẫu đơn giản. 3.1.3.2. Lựa chọn điều kiện phân tích Pigment red 53 bằng HPLC Triển khai thử nghiê m ê , điều kiê ên sắc ký được chọn như sau:Cột Apollo C18 (250 x 4,6 mm; 5 m); detector PDA lấy sắc ký đồ ở bước sóng 490 nm; pha động methanol - đê êm pH 6,2 (65:35), thay đổi tỷ lệ nếu cần; 1,0 ml/phút; thể tích mẫu tiêm 20 l; nhiệt độ cột 30 oC. 3.1.3.3. Thẩm định phương pháp  Độ đặc hiệu: Trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn chỉ xuất hiện một pic rõ ràng của PR; mẫu trắng không có pic nào xuất hiện tương ứng với thời gian lưu của PR; với mẫu tự tạo, sắc ký đồ cho ta một pic tương ứng với pic của PR trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn về thời gian lưu, độ tương thích khi so sánh phổ UV-VIS, píc có độ tinh khiết cao (> 99%).  Khoảng tuyến tính: Trong khoảng nồng độ 1,2 – 7,7g/ml có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ PR với hệ số tương quan r là 0,9997 và hệ số y-intercept là 1,4%.  Độ lặp lại - Độ đúng: Việc đánh giá độ lặp lại và độ đúng được thực hiện đồng thời trên 3 mẫu tự tạo: trên nền son nước (PR07), nền son rắn (PR10), nền phấn má (PR17). Kết quả thực nghiệm cho thấy, phương pháp có độ lặp lại tốt qua 6 lần phân tích độc lập (đều có RSD thấp, từ 0,65% đến 1,39%). Tỷ lệ thu hồi PR trên cả 3 loại nền mẫu đều cao (99,43% đến 101,09%).  LOD và LOQ: LOD với PR xác định được là 0,4 g/ml (tương ứng với 80g/g mẫu mỹ phẩm). LOQ với PR xác định được là 1,2 g/ml (tương ứng với 240 g/g mẫu mỹ phẩm). 3.1.4. Pigment orange 5 3.1.4.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu: Đối tượng mẫu mỹ phẩm nghiên cứu áp dụng với Pigment orange 5 (PO) là son môi, sơn móng. Qua khảo sát một số dung môi chiết thì hỗn hợp dung môi N,Ndimethyl formamid và acid phosphoric (95:5) là hệ dung môi phù hợp vì hoà tan được hoạt chất cần phân tích (hiệu suất chiết cao) và loại được nhiều thành phần khác có trong các nền mẫu. Tuy nhiên, với mẫu son dạng thỏi, cần dùng dicloromethan để phân tán mẫu trước khi chiết. 3.1.4.2. Lựa chọn điều kiện phân tích Pigment orange 5 Đã tiến hành khảo sát và chọn lựa được điều kiện sắc ký phù hợp hơn như sau: Cột Apollo C18 (2504,6 mm; 5 m); pha động methanol – dung dịch đệm pH 6,2 (85:15); 1,0 ml/phút; bước sóng lấy sắc đồ 490 nm; thể tích mẫu tiêm 20 l; nhiệt độ phân tích 30 oC. 3.1.4.3. Thẩm định phương pháp  Độ đặc hiệu: Kết quả cho thấy, trên sắc ký đồ mẫu chuẩn xuất hiện rõ ràng một pic của PO (t R khoảng 10,5 phút); trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic nào tương ứng với thời gian lưu của PO; trên sắc ký đồ mẫu tự tạo xuất hiện rõ ràng 1 pic có thời gian lưu tương ứng của PO được tách riêng khỏi các pic khác trong nền mẫu. So sánh phổ UV- VIS của pic này với pic thu được từ mẫu chuẩn, hệ số tương đương là 0,9953. Phương pháp có tính đặc hiệu đối với PO.  Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ 1,1- 86g/ml có sự tương quan tuyến tính gữa diện tích pic và nồng độ với hệ số tương quan r là 1 và hệ số y- intercept là 2,28%.  Đánh giá độ lặp lại: Giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) từ kết quả hàm lượng PO tìm được trong 3 mẫu tự tạo (sau 6 lần phân tích cho mỗi mẫu) dao động trong khoảng 1,26-1,64%. Như vậy phương pháp phân tích có độ lặp lại tốt ở vùng giới hạn định lượng (2,1 g/ml).  Độ đúng: Kết quả cho thấy khả năng tìm lại nằm trong khoảng từ 97,6- 104,1% với độ lệch chuẩn tương đối nhỏ hơn 2% (RSD từ 1,04 đến 1,92%) là phương pháp có độ đúng tốt đối với chất có hàm lượng nhỏ trong mẫu và ở ngay giới hạn định lượng.  Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: LOD xác định được là 0,65 g/ml (26 µg/g mẫu mỹ phẩm), so với công bố trong phương pháp ASEAN ACM SIN 02 là 16 g/ml, LOD của qui trình này thấp hơn gần 25 lần. LOQ xác định được là 2,15g/ml. -9- 3.1.5. Crystal violet 3.1.5.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu: Đối tượng mẫu mỹ phẩm nghiên cứu áp dụng với Crystal violet (CV) là son môi, sơn móng, phấn mắt. Qua khảo sát chọn được dung môi chiết mẫu: cho son môi và sơn móng là hỗn hợp ACN : THF : dung dịch đệm amoniac pH 9,5-10,0 (2:3:5); cho phấn mắt là hỗn hợp acetonitril : dung dịch đệm amoniac pH 9,5-10,0 (2:5) 3.1.5.2. Lựa chọn điều kiện phân tích CV: Qua khảo sát đã chọn lựa được điều kiện phân tích sau: Cột Alltech, Grace RP18 (250x 4,6 mm; 5 m), nhiệt độ phòng; detector PDA lấy sắc ký đồ ở 590 nm; pha động: ACN-THF-dung dịch đệm pH 9,0 (20:30:50);1,0 ml/phút; thể tích mẫu tiêm100 l. 3.1.5.3. Thẩm định phương pháp phân tích: Sử dụng 4 mẫu mỹ phẩm được kiểm tra sơ bộ không chứa CV là son nước Starshine 08 (CV13, nền N1), son thỏi Essance RD201(CV15, nền N2), sơn móng Melia tím (CV11 nền N3) và phấn mắt Belove tím (CV03, nền N4) trong thẩm định phương pháp và các mẫu này được đặt tên là mẫu trắng.  Độ đặc hiệu: Các sắc ký đồ thu được cho thấy: với dung dịch chuẩn chỉ xuất hiện một pic rõ ràng của CV (tR khoảng 8,6 phút); với mẫu trắng không có pic nào xuất hiện tương ứng với thời gian lưu của CV; với mẫu tự tạo, sắc ký đồ cho ta một pic tương ứng với pic của CV trên sắc k ý đồ của dung dịch chuẩn về thời gian lưu và độ tương thích khi so sánh phổ UV-VIS.  Độ lặp lại và độ đúng: Trên cả 4 nền mẫu, phương pháp có độ lặp lại, độ đúng tốt, thể hiện qua giá trị RSD thấp (0,73-2,03%) sau 6 lần phân tích độc lập, tỷ lệ thu hồi tốt (94,0- 101,3%)  Giới hạn phát hiện: LOD đối với CV là 0,04 g/ml (khoảng 2,0g/g mẫu mỹ phẩm). 3.1.6. Các chất Sudan 3.1.6.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu: Đối tượng nghiên cứu về các hợp chất Sudan là các mẫu son (son gió và son môi dạng thỏi) thu thập được trên thị trường. Sau khi khảo sát trên một số hệ dung môi, hệ dung môi methanol - ethyl acetat (1:1) được nhận thấy là hệ mà nhóm chất Sudan tan rất tốt, dung dịch mẫu thử sạch không bị lẫn nhiều tạp chất nên được chọn làm dung môi chiết mẫu. 3.1.6.2. Lựa chọn điều kiện phân tích các Sudan: Khảo sát trên hệ thống máy HPLC Shimadzu, điều kiện phân tích được chọn lựa: Cột Apollo C18 hay Phenomenex C18 (4,6 x 250 nm; 5m); pha động: MeOH-nước (93:7);1,0 ml/phút; bước sóng lấy SKĐ 488 nm; thể tích tiêm mẫu 20 l. 3.1.6.3. Đánh giá phương pháp  Độ thích hợp hệ thống: Kết quả cho thấy, hệ sắc ký ổn định, đạt yêu cầu phân tích đồng thời 4 chất Sudan: RSD của thời gian lưu nhỏ hơn 1% và RSD của diện tích pic nhỏ hơn 2%, độ phân giải lần lượt là 6,28; 3,98 và 9,12 và hệ số đối xứng pic lần lượt là 1,05; 1,02; 1,04 và 1,05.  Độ đặc hiệu: Mẫu nền không có pic nào có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của các pic Sudan, các pic Sudan trong mẫu tự tạo tách ra khỏi các píc trong nền mẫu, đồng thời tách hoàn toàn khỏi nhau và có thời gian lưu và phổ tương đương với các píc Sudan thu được từ dung dịch chuẩn (hệ số chồng phổ từ Sudan I đến Sudan IV lần lượt là: 0,9984; 0,9996; 0,9999 và 0,9999).  Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ 0,45-5,63g/ml (Sudan I) 0,48-5,96 g/ml (Sudan II); 0,51-6,36g/ml (Sudan III) và 0,47-5,92g/ml (Sudan IV) có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ các Sudan.  Độ lặp lại:. Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp tại tốt trên cả 2 nền mẫu khảo sát là SD03 và SD05 (RSD từ 0,59% đến 2,73%).  Độ đúng: Được đánh giá trên 9 mẫu tự tạo ở 3 mức nồng độ 50%; 100% và 120%. Phương pháp có độ thu hồi cao trên cả hai nền mẫu khảo sát ở các nồng độ phân tích nhỏ (0,45µg/ml). Sudan I: 94-102,1%; Sudan II: 98,9-106,1%; Sudan III: 86,5-95,7% và Sudan IV: 86,7-100,0%.  LOD và LOQ: LOD xác định được với Sudan I; II; II và IV lần lượt là: 0,23; 0,24; 0,25 và 0,24 µg/ml. LOQ với Sudan I; II; II và IV lần lượt là: 0,75; 0,77; 0,76 và 0,76 µg/ml. 3.1.7. Định tính, định lượng đồng thời 4 chất mầu bị cấm (MY, PO, PR và RB) 3.1.7.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu: - 10 - Đối tượng nghiên cứu về các chất Metanil yellow (MY), Pigment orange 5 (PO), Pigment red 53 (PR) và Rhodamin B (RB) là các mẫu son (son nước, son gió, son môi dạng thỏi) được thu thập trên thị trường. Dung môi pha mẫu là N-N dimethyl formamid- acid phosphoric (95:5) 3.1.7.2. Lựa chọn điều kiện phân tích các chất màu: Phương pháp ASEAN mã số ACM SIN 02 định tính 3 chất màu MY, PO, RB có pha động là hỗn hợp: nước- dung dịch TBA 0,005M (25:75). Dung dịch TBA 0,005M được chuẩn bị như sau: 65ml tetrabutylamonium hydroxyd (TBA) 20%, thêm nước vừa đủ 100 ml, thêm 2,8 g kali hydroxyd vào hỗn hợp trên, khuấy kỹ cho tan, điều chỉnh đến pH 7,0 với acid phosphoric để được dung dịch TBA 0,5M. Thêm 10 ml dung dịch TBA 0,5M vào 1000 ml methanol, lắc đều, để yên vài giờ, lọc. Tuy nhiên, pha động này rất dễ bị tủa lại (kể cả sau khi lọc), đã khắc phục bằng cách: Sau khi thêm 10 ml dung dịch TBA 0,5M vào 1000 ml methanol, lắc đều, để yên 72 giờ trong tủ lạnh 14-15 oC hoặc 7 ngày ở nhiệt độ phòng để tạo tủa hoàn toàn, lọc qua màng lọc 0,45µm. Điều kiện sắc ký: cột Phenomenex C18 (4,6 x 250 nm; 5µm); phân tích ở nhiệt độ phòng; pha động nước- dung dịch TBA 0,005M (30:70); 1ml/phút; vùng quét phổ 275 – 760 nm; bước sóng lấy sắc ký đồ 435 nm (MY, PR, PO) và 535 nm (RB); thể tích tiêm mẫu 20 l. 3.2.1.3. Thẩm định phương pháp phân tích:  Độ thích hợp hệ thống: Đạt yêu cầu với RSD của diện tích pic MY, RB, PR, PO lần lượt là 0,6%, 0,85%, 1,28% và 0,54%, RSD của thời gian lưu lần lượt là 0,75%, 0,72%, 0,85%, 0,78% đều nhỏ hơn 1% và hệ số phân giải của các píc lần lượt là 8,6, 7,6, 17,9 tại bước sóng 435 nm và 3,7, 7,6, 17,9 tại bước sóng 535 nm, đáp ứng yêu cầu xác định các chất màu MY, RB, PR, PO.  Đánh giá độ đặc hiệu: Trên sắc ký đồ của mẫu tự tạo xuất hiện 3 pic tách biệt rõ ràng có thời gian lưu tương ứng của MY, PR và PO với thời gian lưu khoảng 7,5 phút, 17,3 phút và 31,2 phút, pic RB rất nhỏ (12 phút), các píc này cũng tách biệt với píc có trong nền mẫu (mẫu trắng). Khi so sánh phổ UV- VIS có độ tương thích tốt (hệ số similarity là 0,9997; 0,9999; 0,9995 và 0,9919). Tại bước sóng 535nm píc thu được từ mẫu tự tạo cho đáp ứng lớn nhất là pic RB (t R khoảng 12 phút), được tách biệt rõ khỏi các píc khác (các pic chuẩn và pic trong nền mẫu), có độ tương thích cao (hệ số similarity là 0,9953) khi so sánh phổ UV- VIS với pic thu được từ mẫu chuẩn.  Đánh giá độ tuyến tính: Pha các dãy dung dịch của các chất chuẩn MY, PR, PO, RB trong dung môi pha mẫu, kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.29. Bảng 3.29 . Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của hỗn hợp các chất màu cấm STT 1 2 3 4 5 6 Phương trình hồi qui r Y(%) Metanil yellow Nồng độ S pic (mAU.s) (g/ml) 0,86 30748 1,73 62407 4,32 158323 6,91 254161 8,64 254161 10,37 382929 Rhodamin B Nồng độ S pic (mAU.s) (g/ml) 0,82 75536 1,63 152158 4,08 386129 6,53 619756 8,16 773960 9,79 930822 Pigment red 53 Nồng độ S pic (mAU.s) (g/ml) 2,34 34985 4,68 71328 11,70 181858 18,72 293610 23,40 367429 28,08 442756 Pigment orange 5 Nồng độ S pic (mAU.s) (g/ml) 2,04 52854 4,08 111263 10,20 300977 16,32 482294 20,40 608220 24,48 739349 y = 37029x - 1528 y = 95291x - 2737 y = 15839x - 2733 y = 30511x - 11710 1,0000 0,97 1,0000 0,71 1,0000 1,50 0,9999 3,89  Độ chính xác của phương pháp: Kết quả cho thấy phương pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại trong ngày có giá trị RSD với MY, RB, PR, PO lần lượt là 0,18% và 0,26%; 0,15% và 0,27%; 0,28% và 0,45%; 0,97% và 1,10%; (với n = 6) và khác ngày là 0,35%; 0,55%; 1,00%; 0,27% (với n=12). Hàm lượng chất trung bình xác định được trong mẫu tự tạo (n = 12) với MY là 86,90 µg (RSD = 0,35%); với RB là 95,83 µg (RSD = 0,27%); với PR là 232,11 µg (RSD = 0,55%) và với PO là 171,28 µg (RSD = 1,02%). - 11 -  Độ đúng: Tiến hành trên 3 nhóm mẫu tự tạo ở 3 mức nồng độ khác nhau, mỗi nhóm 3 mẫu thử. Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng tương đối tốt đối với nền mẫu mỹ phẩm phức tạp và giới hạn chất cấm nhỏ cụ thể: tỷ lệ thu hồi với MY là 100,70% (100,20-101,52), RB là 98,09% (97,64-98,61), PR là 97,68% (97,02-98,82) và PO là 95,27% (94,02-96,83).  Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng: LOD và LOQ đối với MY, PR, PO, RB lần lượt là 0,022 và 0,073; 0,079 và 0,259; 0,0061 và 0,0202; 0,0012 và 0,0040 µg/ml. 3.2. Kết quả xây dựng qui trình phân tích một số hợp chất có tác dụng dược lý bị cấm hoặc có giới hạn sử dụng trong mỹ phẩm 3.2.1. Hydroquinon 3.2.1.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu: Đối tượng mẫu mỹ phẩm nghiên cứu áp dụng là kem bôi da. Sau khi khảo sát, hỗn hợp methanol - đệm phosphat pH 5,5 (50:50) là hệ dung môi phù hợp nhất để chiết mẫu, dung dịch mẫu thử sạch không bị lẫn nhiều tạp chất và cho pic Hydroquinon cân đối. 3.2.1.2. Lựa chọn điều kiện phân tích Hydroquinon: ASEAN đã ban hành phương pháp ACM INO 03 để định lượng Hydroquinon. Tuy nhiên với các điều kiện sắc ký đã nêu, khi tiến hành khảo sát với dung dịch nền mẫu mỹ phẩm có thêm Hydroquinon, thời gian lưu của Hydroquinon chỉ là 4,1 phút, không tách được hoàn toàn khỏi các thành phần của nền mẫu. Tham khảo tài liệu và khảo sát thực nghiệm, điều kiện phân tích sau đã được chọn lựa: Cột Apollo C8 (2504,6 mm; 5 m) ở nhiệt độ phòng; pha động: methanol- dd đệm phosphat pH 5,5 (5 : 95); 1,0 ml/phút; bước sóng lấy sắc đồ 285 nm; thể tích tiêm mẫu 20 l. 3.2.1.3. Thẩm định phương pháp phân tích  Độ đặc hiệu: Trên sắc ký đồ mẫu tự tạo xuất hiện một pic rõ ràng có thời gian lưu tương ứng với pic Hydroquinon trong mẫu chuẩn, có độ tương thích (hệ số similarity là 0,9953) khi so sánh phổ UV- VIS, đồng thời được tách riêng khỏi các pic khác trong nền mẫu.  Độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ từ 3,0 - 102,0 g/ml có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ với hệ số tương quan r = 0,9999, hệ số y-intercept Y = 2,4%.  Độ lặp lại - Độ đúng: Kết quả cho thấy RSD xác định được qua 6 lần phân tích trên 3 nền mẫu khác nhau có đều có giá trị dưới 1% (0,56-0,82%), khả năng tìm lại nằm trong khoảng từ 94,199,0% và giá trị RSD từ 0,36% đến 1,23%. Như vậy phương pháp phân tích có độ lặp lại tốt, độ đúng chấp nhận được ở vùng giới hạn định lượng với mẫu mỹ phẩm có nền phức tạp.  LOD và LOQ: LOD và LOQ xác định được là 0,3 g/ml và 1,0 g/ml. 3.2.2. Tretinoin 3.2.2.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu: Đối tượng mẫu mỹ phẩm nghiên cứu áp dụng là kem bôi da. Cân chính xác khoảng 2g mẫu kem, xử lý mẫu với methanol. 3.2.2.2. Điều kiện sắc ký: Theo phương pháp của ASEAN mã số ACM SIN 01 điều kiện sắc ký như sau: Cột Apollo C18 (4,6 x 250 mm; 5m); nhiệt độ phòng; bước sóng lấy sắc ký đồ 353nm; pha động methanol-acid acetic 5% (90:10);1,2 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 20 l. 3.2.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích  Độ đặc hiệu: được đánh giá dựa vào các thông số thời gian lưu (khoảng 12,5 phút) và so sánh phổ UV-VIS của píc thu được từ mẫu tự tạo và mẫu chuẩn (hệ số similarity là 0,9988).  Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ 3,0 - 64,0g/ml, có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic với nồng độ của Tretinoin với hệ số r = 1 và hệ số y-intercept Y=1,03%.  Độ lặp lại - Độ đúng : RSD sau 6 lần phân tích là 3,17%. Khả năng tìm lại từ 89,7%- 94,4% là chấp nhận được với chất có hàm lượng nhỏ trong mẫu và ở vùng gần giới hạn định lượng.  LOD và LOQ: LOD xác định được là 1,0g/ml. LOQ xác định được là 3,3g/ml. 3.2.3. Các steroid: Glucocorticiod là nhóm chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm. Nhóm này gồm nhiều chất khác nhau, để tiết kiệm thời gian và công sức, cần nghiên cứu xây dựng một ph ương pháp cho phép phân tích được đồng thời 12 corticoid thông thường trong mỹ phẩm (Phương pháp của ASEAN phân tích đồng thời 5 chất). - 12 - 3.2.3.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu: Cân khoảng 0,2g chế phẩm, thêm 50ml hỗn hợp dicloromethan methanol (9:1), khuấy kỹ và đặt trên cách thủy ấm, làm nguội trong nước đá 1h, lọc qua giấy lọc và bốc hơi trên cách thủy tới khô. Hòa lại cắn trong 25ml hỗn hợp acetonitril-methanol-nước (20:30:30), lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi tiêm sắc ký. 3.2.3.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký: Toàn bộ quá trình phân tích được tiến hành trên hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao có trang bị detector PDA. Sau khi đã thực hiện khảo sát, tối ưu hoá để tách riêng các corticoid, điều kiện sắc ký đã được lựa chọn như sau: Cột Phenomenex Luna C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm); pha động: acetonitril : nước (48:52); 1,0 ml/phút; bước sóng phát hiện 240 nm; thể tích tiêm 5µl. 3.2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích  Tính thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp của 12 steroid trong pha động có nồng độ khoảng 10 µg/ml vào hệ thống sắc ký. Kết quả cho thấy hệ thống sắc ký có: Độ lặp lại tốt với RSD của thời gian lưu dưới 0,4% và diện tích pic dưới 1,4 %; số đĩa lý thuyết trên 8000; hệ số bất đối dưới 1,4 và độ phân giải trên 1,6. Do vậy đáp ứng yêu cầu phân tích cho cả 12 hợp chất.  Độ đặc hiệu:Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn các mẫu: mẫu placebo; mẫu thử và dung dịch chuẩn. Kết quả thu được cho thấy: Trên sắc ký đồ mẫu placebo không xuất hiện pic ở thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu bất kỳ chất nào trong số 12 corticoid nghiên cứu. Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu tự tạo cho 12 pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của 12 pic chính thu được từ sắc ký đồ của dung dịch hỗn hợp chuẩn.  Khoảng nồng độ tuyến tính: Pha một dẫy dung dịch hỗn hợp 12 chuẩn trong pha động có nồng độ như trong bảng , tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Xác định phương trình hồi qui và hệ số tương quan r. Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ các chất phân tích trong khoảng nồng độ khảo sát với hệ số tương quan r đều rất gần 1.  Độ chính xác: Độ chính xác được tiến hành thử nghiệm trên 6 mẫu tự tạo. Kết quả cho thấy với cả 12 steroid đều có RSD dưới 1% (0,3-0,9%).  Độ đúng: Thêm chính xác một lượng chất chuẩn corticoid vào nền mẫu placebo, sao cho sau khi xử lý theo qui trình phân tích nồng độ dung dịch cuối cùng đem sắc ký phải nằm trong khoảng 50 - 150% so với nồng độ định lượng. Tiến hành ở 3 mức nồng độ khác nhau: mức 50% (A), mức 100% (B) và mức 150% (C); mỗi nồng độ thực hiện 3 lần. Kết quả cho thấy tỷ lệ thu hồi trung bình của các steroid từ 97,99% (Betamethason propionat) đến 102,31% (Dexamethason)  LOD và LOQ: LOD đối với từng corticoid nằm trong khoảng 0,1 µg/ml (Prednison) đến 2,0 µg/ml (Betamethason propionat). Giá trị LOQ nằm trong khoảng 0,3-6,0 µg/ml. 3.3. Kết quả xây dựng qui trình phân tích các kim loại nặng 3.3.1. Thủy ngân 3.3.3.1. Xác định các điều kiê ên vô cơ hóa mẫu: Để xây dựng quy trình xử lý mỹ phẩm trước khi phân tích thuỷ ngân, các yếu tố sau được tiến hành khảo sát: tác nhân vô cơ hóa, lượng mẫu đem phân tích, lượng tác nhân oxy hóa sử dụng. Để vô cơ hóa triệt để nền mẫu mỹ phẩm ở điều kiện phản ứng không quá mạnh, thích hợp với việc áp dụng trên thiết bị vô cơ hóa mẫu bằng vi sóng (tiến hành trong điều kiện kín hoàn toàn, quá trình vô cơ hóa mẫu phải khống chế được về áp suất và nhiệt độ). Sau khi vô cơ hóa mẫu trong thiết bị xử lý mẫu bằng lò vi sóng, thêm dung dịch kali permanganat 5% để ổn định toàn lượng thủy ngân có trong mẫu về dạng Hg 2+, sau đó lượng kali permanganat dư sẽ được loại bỏ bằng dung dịch hydroxylamin để chuẩn bị sẵn sàng cho quá trình khử hóa Hg2+ về Hg0 ở dạng hơi để phân tích bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử. Chương trình nhiê êt đô ê cho thiết bị vô cơ hóa mẫu bằng vi sóng đã được xác lâ pê . Khối lượng mỹ phẩm sử dụng cho mỗi lần phân tích quyết định lượng tác nhân oxy hoá cần sử dụng khi vô cơ hoá mẫu. Thiết bị phân tích thuỷ ngân tại cơ sở cho phép xác định trong dải khối lượng thuỷ ngân từ 100 ng đến 1000 ng trong mẫu phân tích . Kết quả thực nghiệm thu được - 13 - cho thấy trên các đối tượng mẫu mỹ phẩm đã phân tích, lượng mẫu tối ưu cần thiết cho một lần đo là khoảng 0,2 g mỹ phẩm. Lượng tác nhân vô cơ hoá sử dụng với lượng mẫu phân tích khoảng 0,2g xác định được là thích hợp là: 3ml acid nitric 65% và 1ml hydroperoxid 30% cho quá trình vô cơ hoá mẫu là thích hợp nhất cho các mẫu mỹ phẩm dạng kem bôi da; đồng thể tích 3ml acid nitric 65% và 3ml acid sulfuric 98% với mỹ phẩm dạng phấn bôi da. 3.2.2.2. Chuẩn bị mẫu đo: Cân chính xác khoảng 0,2000g mẫu mỹ phẩm cần xác định thủy ngân vào cốc teflon của thiết bị vô cơ hóa mẫu bằng vi sóng. Nếu lượng thủy ngân trong mẫu quá lớn có thể điều chỉnh giảm lượng cân mẫu xuống, nhưng lượng cân mẫu đem vô cơ hóa phải đảm bảo không dưới 50mg. Thêm vào từng cốc lượng tác nhân vô cơ hóa tương ứng. Đậy kín cốc, cho vào trong thiết bị vô cơ hóa mẫu bằng vi sóng. Vận hành thiết bị sử dụng chương trình nhiệt độ, áp suất đã xác định. Sau khi quá trình vô cơ hóa kết thúc, để cho nhiệt độ, áp suất trong các cốc teflon trở về cân bằng với môi trường phòng thí nghiệm. Lấy cốc teflon ra khỏi thiết bị. Chuyển dung dịch trong cốc teflon vào cốc đo thủy ngân. Tráng cốc teflon bằng 20ml dung dịch acid sulfuric 5%, chuyển dịch tráng cốc sang cốc đo thủy ngân. Cho thêm vào cốc đo thủy ngân nước trao đổi ion đến khoảng 100ml. Thêm vào cốc từng giọt dung dịch kali permanganat 5% trong acid sulfuric 5% cho đến khi dung dịch trong cốc có màu hồng bền trong 15 phút. Trước khi tiến hành đo thủy ngân, loại bỏ lượng dư kali permaganat bằng dung dịch hydroxylamin 10% trong nước trao đổi ion đến khi mất màu hồng và xử lý thêm để loại bỏ một số tạp chất có trong phấn bôi da không bị phân hủy hết trong quá trình vô cơ hóa. 3.2.2.3. Xác định các thông số làm viêcê của máy quang phổ:  Thông số của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử: vạch phổ đo: 253,7nm; cường độ dòng làm việc của đèn cathod rỗng 7,5mA; độ rộng khe (slit width) 1,3nm; thời gian lấy tín hiệu 20 giây; tốc độ bơm nhu động của thiết bị phân tích thủy ngân 300 vòng/phút.  Thao tác đo:Chuyển dung dịch cần đo thủy ngân vào bình đo của bộ phân tích thủy ngân, thêm 10ml dung dịch SnCl2 10%, đậy ngay nắp bình đo lại lắc đều 10 giây. Chuyển thiết bị về chế độ tuần hoàn (CIRCULATE), bật bơm nhu động. Khi tín hiệu hấp thụ cao nhất và ổn định tiến hành đo để ghi lại độ hấp thụ. Sau khi thực hiện phép đo, chuyển sang chế độ mở (OPEN). Khi độ hấp thụ đo được trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử trở về 0 có nghĩa là hệ thống đã được làm sạch thuỷ ngân và có thể lặp lại quá trình đo trên một mẫu khác. Thực hiện đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn thủy ngân trước để thiết lập đường chuẩn thực nghiệm. Sau đó đo độ hấp thụ của các dung dịch thử, dựa vào đường chuẩn thực nghiệm để tính ra lượng thủy ngân trong mẫu thử. 3.2.2.4. Thẩm định qui trình  Tính đặc hiệu: Tiến hành vô cơ hóa cả ba mẫu trên trong thiết bị vô cơ hóa trong lò vi sóng với các tác nhân và điều kiện vô cơ hóa đã xác định. Kết quả thu được độ hấp thụ tại 253,7nm với mẫu nền là 0, mẫu tự tạo là 0,0420 và mẫu chuẩn là 0,0398.  Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng tổng lượng thủy ngân 100-1000ng có sự tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ và lượng thủy ngân với hệ số tương quan r là 0,9987.  Độ lặp lại: tiến hành 6 lần phân tích độc lập theo các điều kiện và cách tiến hành đã được xác định. Kết quả cho thấy sau 6 lần định lượng độc lập với mẫu mỹ phẩm dạng kem bôi da (HG01) có RSD ở mức 5,8%. Kết quả tương tự với dạng phấn bôi da (HG02) có RSD ở mức 6,4%. Mức lặp lại này là chấp nhận được với phương pháp phân tích dùng để kiểm tra phát hiện thủy ngân trong mẫu mỹ phẩm dạng kem bôi da và phấn bôi da.  Độ đúng: Tỷ lệ tìm lại trung bình với mẫu dạng kem bôi da là 102,26% (dao động từ 88,82% đến 116,55%). Tỷ lệ tìm lại trung bình với mẫu dạng phấn bôi da là 100,69% (dao động từ - 14 - 92,43% đến 107,49%). Kết quả này chấp nhận được với lượng thủy ngân cho vào nền mẫu rất nhỏ.  Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):LOD của phương pháp xác định được là 30ng tính theo tổng lượng thủy ngân có trong phần mẫu đem phân tích. Còn LOQ là 100ng thủy ngân. Với lượng mẫu mỹ phẩm lấy đem phân tích là 0,2g thì LOD và LOQ tương ứng với hàm lượng thủy ngân trong mẫu lần lượt là 150 ppb và 500 ppb. 3.3.2. Chì (Pb): Theo phương pháp của ASEAN 3.3.2.1. Xử lý mẫu : Cân chính xác khoảng 0,2 g mẫu vào cốc teflon dung tích 100 ml, thêm 3 ml acid nitric 65%, 1 ml nước oxy già 30%, để yên 1 giờ. Lắp cốc teflon vào lò vi sóng rồi tiến hành vô cơ hóa theo chương trình đã xác định. 3.3.2.2. Qui trình phân tích  Các thông số máy: Đèn cathod rỗng chì; cường độ đèn 9 mA; bước sóng 283,3nm; độ rộng khe sáng 1,3 nm; cuvet graphit: tube A; tốc độ khí mang (Argon) tại giai đoạn nguyên tử hoá 30 ml/phút; thể tích mẫu 20l; thể tích dung dịch nền 10l.  Cách tiến hành: Với các thông số đã được chọn, tiến hành đo độ hấp thụ của chì trong dung dịch chuẩn, dung dịch thử bằng thiết bị quang phổ hấp thụ nguyên tử, kỹ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa, sử dụng cuvet graphit (pha loãng dung dịch thử nếu cần). Mẫu trắng là dung dịch acid nitric 1 %. Tính toán nồng độ chì trong dung dịch thử dựa vào đường chuẩn. 3.3.2.3.Thẩm định qui trình:  Tính đặc hiệu: dung dịch mẫu thử, mẫu trắng cho đô ê hấp thụ không đáng kể (nhỏ hơn 30% giới hạn định lượng). Mẫu thử thêm chuẩn và mẫu chuẩn chì cho đô ê hấp thụ lớn hơn 0,05 tại bước sóng đặc trưng của chì 283,3 nm. Kết quả cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao  Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ 5- 40 ng/ml có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ chì và độ hấp thụ, hệ số tương quan r = 0,9995 và hệ số y-intercept = 9,1%.  Độ lặp lại, độ đúng: RSD đều nhỏ hơn 9,5%, khả năng thu hồi của các mẫu đã khảo sát nằm trong khoảng 86,2 - 96,1%.  LOD và LOQ: LOD là 0,8 ng/ml (200 ng/g mẫu thử) và LOQ là 2,6 ng/ml (660 ng/g mẫu thử). 3.3.3. Arsen (As): Theo phương pháp của ASEAN 3.3.3.1. Chuẩn bị mẫu thử nghiệm: Cân chính xác khoảng 0,15 đến 0,2 g mẫu vào cốc teflon dung tích 100 ml, thêm 3 ml acid nitric 65%, 1 ml nước oxy già 30%, để yên 1 giờ. Tiến hành vô cơ hóa trong lò vi sóng theo chương trình nhiệt độ, công suất và áp suất đã xác định. Khi quá trình vô cơ hóa mẫu kết thúc, để nguội, chuyển cốc phá mẫu ra khỏi lò vi sóng, mở nắp để khói trong cốc bay hết. Thêm 10 ml nước trao đổi ion vào cốc, lắc đều, lọc vào bình định mức 50 ml. Tráng rửa cốc phá mẫu, giấy lọc 2 lần, mỗi lần 10 ml nước trao đổi ion, gộp dịch rửa vào bình định mức trên, vừa đủ bằng nước trao đổi ion đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 10 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm 10 ml acid hydrocloric 37%, thêm 5 ml dung dịch kali iodid 20%, thêm vừa đủ bằng nước trao đổi ion đến vạch, lắc đều. 3.3.3.2. Qui trình phân tích  Các thông số máy: đèn cathod rỗng arsen; cường độ đèn12mA; bước sóng 193,7nm; độ rộng khe sáng 0,4nm; tốc độ dẫn dung dịch natri borohydrid 0,5% 8ml/phút; dẫn dung dịch acid hydrocloric 4N 8ml/phút; dẫn mẫu 12ml/phút; khí acetylen 2,1lít/phút; áp suất không khí nén 160kPa; khí mang (Argon) 300ml/phút.  Cách tiến hành:Trước khi tiến hành phân tích, để các dung dịch chuẩn, thử và trắng vào nước nóng tại 70 oC trong 30 phút, để nguội. Với các thông số đã chọn, tiến hành đo mẫu trắng, autozero để đưa độ hấp thụ nền về 0, lần lượt đo độ hấp thụ arsen của các dung dịch chuẩn, dung dịch thử trên thiết bị quang phổ hấp thụ nguyên tử, kỹ thuật hoá hơi hydrid (pha loãng dung dich thử nếu cần). Tính toán nồng độ arsen trong dung dịch thử dựa vào đường chuẩn. 3.3.3.3. Đánh giá quy trình - 15 -  Độ đặc hiệu: do sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử, trang bị đèn cathod rỗng arsen là đặc hiệu để phân tích arsen tại vạch phát xạ của arsen 193,7 nm.  Khoảng nồng độ tuyến tính: trong khoảng nồng độ 1-8 ng/ml có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ arsen trong dung dịch chuẩn và độ hấp thụ với hệ số tương quan r là 0,9990.  Độ lặp lại, độ đúng: Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại, độ đúng chấp nhận được đối với mẫu có nền mẫu phức tạp và hàm lượng arsen thấp. Độ lặp lại của phương pháp trên các mẫu khảo sát là đều có RSD dưới 6,2%, khả năng thu hồi trong khoảng từ 80,3% đến 105,0%.  LOD và LOQ: LOD là 0,3 ng/ml (75ng/g mẫu) và LOQ là 0,99 ng/ml (247,5ng/g mẫu) 3.4. Kết quả kiểm tra một số hợp chất bị cấm và có giới hạn sử dụng trong mỹ phẩm lưu hành trên thị trường 3.4.1. Metanil yellow Quy trình phân tích để phát hiện MY đã được áp dụng để kiểm tra 6 mẫu son môi và 8 mẫu sơn móng mua trên thị trường. Kết quả đã phát hiện thấy 1 mẫu sơn móng tay không có nhãn mác, địa chỉ nhà sản xuất (mẫu MY07) cho pic có cùng thời gian lưu và phổ UV-VIS (với hệ số tương đồng khi so sánh phổ bằng 0,9913) như pic MY chuẩn. Những kết quả định tính trên cho phép kết luận mẫu chứa MY (hình 3.22). Hàm lượng MY trong mẫu xác định được là 28,33 g/g. 3.4.2. Rhodamin B: Qui trình xây dựng đã được áp dụng để kiểm tra 7 mẫu son môi, 5 mẫu sơn móng, 5 mẫu phấn mắt và 1mẫu phấn má mua trên thị trường. Trong 18 mẫu đã kiểm tra có 2 mẫu sơn móng (mẫu số RB09 và RB10) và 1 mẫu son nước (mẫu RB14) cho pic có thời gian lưu và phổ UV-VIS tương ứng với pic của chuẩn Rhodamin B, chứng tỏ 3 mẫu trên có Rhodamin B, trong đó kết quả định lượng trên mẫu RB14 cho hàm lượng Rhodamin B là 20,0 g/g 3.4.3. Pigment red 53 Áp dụng phương pháp phát hiện Pigment red 53 vừa xây dựng để kiểm tra 14 mẫu son môi, 6 mẫu phấn má mua trên thị trường. Đã phát hiê ên được 6 mẫu có chứa PR, trong số đó có 4 mẫu son (PR01, PR11, PR12 và PR14) và 2 mẫu phấn má (PR15 và PR20). Thời gian lưu của các pic nghi ngờ trùng với thời gian lưu của pic PR chuẩn. So phổ UV-VIS của các pic này với píc PR chuẩn đều thu được hê ê số tương thích phổ (Similarity) rất cao. Tiến hành định lượng PR trong 6 mẫu này, kết quả cho thấy hàm lượng PR trong các mẫu son là tương đối nhỏ nhưng tỷ lê ê ở 2 mẫu phấn má là khá cao, Tuy số mẫu được kiểm tra chưa nhiều nhưng tỷ lê ê có chứa PR đáng lo ngại (30%), chứng tỏ nguy cơ lạm dụng PR trong mỹ phẩm là rất cao. Do vâ yê cần mở rô nê g thêm viê êc kiểm tra PR trong mỹ phẩm để có kết luâ nê chính xác hơn. 3.4.4. Pigment orange 5 Quy trình phân tích để phát hiện Pigment orange 5 đã được áp dụng để kiểm tra trên 13 mẫu son môi, 10 mẫu sơn móng mua trên thị trường, không phát hiện thấy mẫu nào có Pigment orange 5. 3.4.5. Crystal violet (Tím tinh thể) Áp dụng để kiểm tra 7 mẫu son môi, 5 mẫu sơn móng, 5 mẫu phấn mắt và 1 mẫu phấn má mua trên thị trường. Kết quả có 1 mẫu phấn mắt (CV05) có chứa Crystal violet. 3.4.6. Sudan: Tiến hành kiểm tra các Sudan trên 25 mẫu son, kết quả cho thấy: có 8 mẫu son có chứa Sudan I và 4 mẫu son có chứa Sudan IV, trong số đó có 3 mẫu son có chứa cả 2 loại Sudan này. 3.4.7. Kiểm tra đồng thời 4 chất mầu bị cấm (MY, PR, PO và RB) Kiểm tra trên 15 mẫu son thu mua từ chợ Đồng Xuân (12 mẫu son thỏi ký hiệu là SR và 3 mẫu dạng gel ký hiệu là SN). Kết quả: phát hiện được 3 mẫu có chất cấm Pigment red 53. 3.4.8. Hydroquinon : Quy trình thao tác chuẩn để phát hiện Hydroquinon đã được chúng tôi áp dụng để kiểm tra 10 mẫu kem bôi da mua trên thị trường. Kết quả không có mẫu nào có chứa Hydroquinon. 3.4.9. Tretinoin : Đã tiến hành kiểm tra trên 18 mẫu kem được mã số từ TR01 đến TR18, có 2 mẫu phát hiện có Tretinoin là TR04 và TR05. Hai mẫu TR04 và TR05 ở 2 dạng đóng gói không - 16 - có lô sản xuất, cùng hạn sử dụng, cùng nơi sản xuất (7 67 đường Trường Chinh, Kiến An, Hải Phòng) có chứa Tretinoin. Cách ký hiệu SĐK của các mẫu kem trên đều khác với những mẫu khác: số viết trước ký hiệu QLD-CL trong khi các mẫu khác QLD-CL viết trước, số viết sau và không có tên nhà sản xuất chỉ có tên địa chỉ sản xuất. 3.4.10. Các glucocorticoid : Kiểm tra 11 mẫu kem mỹ phẩm, phát hiện được 3 mẫu GC01, GC05 và GC06 có pic có thời gian lưu tương ứng với pic clobetason dipropionat, chồng phổ với phổ chuẩn clobetason dipropionat cho hệ số chồng phổ xấp xỉ 1 (lần lượt là 0,9933; 0,9954; 0,9968). 3.4.11. Thủy ngân: Quy trình thao tác chuẩn để phát hiện thủy ngân đã được chúng tôi áp dụng để kiểm tra 6 mẫu kem bôi da, 5 mẫu sữa rửa mặt và 3 mẫu dầu gội đầu mua trên thị trường. Trong đó có 5 mẫu có thủy ngân: HG02 (29,96ppm); HG03 (1,36ppm); HG20 (0,88ppm); HG22 (0,64ppm) và HG23 (0,58ppm). 3.4.12. Chì : Áp dụng phương pháp hòa hợp ASEAN để kiểm tra chì trong 35 mẫu mỹ phẩm có đến 32 mẫu có chứa chì tuy nhiên không có mẫu nào vượt quá giới hạn Pb theo qui định tại thông tư 06/2011/TT-BYT của Bộ Y tế. Chương IV. BÀN LUẬN 4.1. Về việc triển khai các phương pháp của ASEAN  Về phương pháp ACM THA 05: xác định kim loại nặng (arsen, cadmium, chì và thủy ngân) trong mỹ phẩm Phương pháp hòa hợp ASEAN mã số ACM THA 05 được áp dụng để xác định hàm lượng Pb, As bằng thiết bị phân tích AAS tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã được đánh giá chuyển giao đạt yêu cầu. Quá trình thực nghiệm đã đưa ra các thông số cụ thể cho điều kiện phân tích các nguyên tố này. Đã viết được 2 qui trình phân tích cụ thể cho 2 nguyên tố As, Pb là tài liệu chuyên môn phục vụ cho công tác kiểm tra chất lượng mỹ phẩm (Mã số tài liệu của Pb: VKN/TQKTMP/19; của As: VKN/TQKT-MP/21). Đã áp dụng quy trình để kiểm tra Pb trong 40 mẫu mỹ phẩm và một vài mẫu kiểm tra arsen (không báo cáo trong luận án), chưa có mẫu nào vượt quá giới hạn qui định khá cao đối với chì (≤ 20 ppm) và arsen (≤ 5ppm). Hơn nữa, với phương pháp hóa học theo các Dược điển vẫn cho độ nhạy ở 10 ppm (đối với tổng kim loại nặng) và ở 1ppm cho arsen. Một câu hỏi được đặt ra là tại sao ASEAN lại chọn phương pháp AAS, một kỹ thuật có độ nhạy rất cao, thiết bị đắt tiền, điều kiện phòng thí nghiệm đạt độ sạch cao và cần phải có cán bộ được đào tạo. Phải chăng do nền mẫu mỹ phẩm rất phong phú, phức tạp, khó xử lý, dùng vô cơ hóa bằng lò vi sóng mới thực hiện được hoàn toàn, bảo toàn được lượng chì và arsen, tránh nhiễm bẩn, phương pháp đo AAS đặc hiệu, độ nhạy rất cao (ppb) và chính xác. Kết quả thực nghiệm đã chỉ ra, có nhiều mẫu mỹ phẩm khi vô cơ hóa bằng đốt trên bếp điện mất rất nhiều thời gian và dung dịch thu được vẫn có màu, khi làm phép thử so màu cho kết quả không chính xác, hơn nữa lại còn phụ thuộc vào đánh giá chủ quan của người làm phân tích. Vì vậy phương pháp AAS, kỹ thuật nguyên tử hóa bằng lò graphit để phân tích chì và kỹ thuật hydrid để phân tích arsen cho kết quả chính xác và tin cậy, độ nhạy rất cao đã được chọn làm phương pháp hòa hợp chung của các nước ASEAN. Riêng quy trình phân tích thủy ngân của phương pháp hòa hợp được xây dựng cho thiết bị không sẵn có trong điều kiện cơ sở vật chất của Viện, nên đã phải tiến hành khảo sát, thiết lập quy trình phân tích mới.  Phương pháp ACM SIN 01: định tính Tretinoin trong mỹ phẩm bằng TLC và HPLC. Tiến hành thẩm định chuyển giao trên thiết bị HPLC tại Viện cũng hoàn toàn phù hợp và khả thi. Qui trình định tính, định lượng Tretinoin trong mỹ phẩm bằng HPLC đã được biên soạn thành qui trình thao tác chuẩn (SOP) và áp dụng để kiểm tra chất cấm này tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (Mã số tài liệu VKN/TQKT-MP/09).  Phương pháp ACM INO 03: định tính, định lượng Hydroquinon trong mỹ phẩm bằng TLC và HPLC - 17 - Khi triển khai phương pháp HPLC trên nền mẫu mỹ phẩm nghiên cứu, không tách được Hydroquinon ra khỏi píc có trong nền mẫu. Vì vậy một qui trình phân tích mới đã được nghiên cứu xây dựng và thẩm định nhằm tách hoàn toàn Hydroquinon ra khỏi các pic có trong nền mẫu.  Phương pháp ACM SIN 02: định tính một số chất màu cấm trong mỹ phẩm bằng TLC và HPLC Phương pháp này cho phép định tính đồng thời 3 chất màu cấm: Metanil yellow (MY), Pigment orange 5 (PO), Rhodamin B (RB) là một lợi thế lớn, tuy nhiên quá trình triển khai cho thấy pha động không ổn định, có hiện tượng tủa lại một cách từ từ (ngay cả khi đã lọc qua màng lọc 0,45µm). Điều này rất nguy hại cho hệ thống sắc ký nếu không loại bỏ được, gây ra áp suất không ổn định trong quá trình phân tích và về lâu dài gây tắc cột. Vì vậy, các qui trình mới phân tích những chất màu này đã được nghiên cứu thiết lập. Trong thực tế rất hiếm gặp sự lạm dụng nhiều chất màu cấm trong cùng một sản phẩm nên những qui trình phân tích riêng lẻ vẫn có tác dụng để kiểm tra sự có mặt của các chất màu bị cấm. Hơn nữa, thực tế các mẫu mỹ phẩm nghiên cứu lại cho thấy xuất hiện với tỷ lệ khá cao một chất màu mới. Kiểm tra phát hiện được chất màu này là Pigment Red 53 (PR) và một qui trình phân tích phát hiện và định lượng PR đã được nghiên cứu xây dựng.  Phương pháp ACM MAL 07: định tính hydrocortison acetat, dexamethason, betamethason, betamethason 17-valerat, và triamcinolon acetonid trong mỹ phẩm bằng TLC và HPLC Phương pháp này cho phép định tính đồng thời 5 chất thuộc nhóm chất bị cấm Glucocorticoid một cách dễ dàng với các thiết bị TLC và HPLC thông thường. Tuy nhiên để có thể định tính, định lượng đồng thời nhiều hơn các chất thuộc nhóm steroid, một nghiên cứu đã được thực hiện nhằm phát hiện và định lượng đồng thời 12 chất steroid bằng HPLC. 4.2. Về các qui trình phân tích mới thiết lập Quá trình nghiên cứu thiết lập các qui trình phân tích xác định các chất cấm và chất có giới hạn hàm lượng sử dụng trong mỹ phẩm luôn hướng tới hòa hợp về mặt kỹ thuật với toàn khối ASEAN, nên luận án đã luôn bám sát các phương pháp hòa hợp sẵn có của ASEAN. Một số trường hợp, do chưa có phương pháp hòa hợp hay các điều kiện của phương pháp hòa hợp tỏ ra chưa phù hợp sau quá trình khảo sát sơ bộ, phải tiến hành thiết lập mới hoặc thay đổi các điều kiện phân tích cho phù hợp với đối tượng mẫu mỹ phẩm cần kiểm tra cũng như điều kiện trang thiết bị hiện có, đặc biệt kịp thời cho công tác kiểm tra chất cấm tại những thời điểm cần thiết theo yêu cầu của Bộ Y tế vì thực tế chưa có các qui trình phân tích sẵn có (ví dụ Sudan, Pigment red 53, Crystal violet…) 4.2.1. Về các qui trình phát hiện các chất màu cấm: Đối tượng mẫu áp dụng là mỹ phẩm dạng son (son thỏi dạng sáp, "son nước" dạng gel...), sơn móng và phấn trang điểm cho các chất mầu cấm như: MY, PO, PR, CV, các Sudan… 4.2.1.1. Các chất màu đã có phương pháp hòa hợp: Phương pháp hòa hợp ACM SIN 02 đưa ra quy trình định tính đồng thời 3 chất màu cấm: PO, MY và RB bằng phương pháp TLC và HPLC. Tuy nhiên, tại thời điểm nghiên cứu triển khai (2009-2010), thực nghiệm cho thấy có hiện tượng tủa lại từ từ thành phần trong pha động. Vì vậy, đã nghiên cứu các qui trình định tính, định lượng riêng từng chất màu với điều kiện phân tích mới (như đã nói ở trên) nhằm đáp ứng kịp thời cho công tác kiểm nghiệm đồng thời không chỉ phát hiện mà còn đánh giá được mức độ nhiễm các chất cấm này. Về quy trình xử lý mẫu mỹ phẩm: Phương pháp hòa hợp sử dụng dung môi chiết mẫu là hỗn hợp DMF-acid phosphoric (95:5). Dung môi này cho kết quả xử lý mẫu rất tốt khi tiến hành phân tích MY và PO, do đó vẫn giữ nguyên trong quy trình phân tích hai chất màu này. Riêng trường hợp RB, khi chiết mẫu bằng dung môi trên kết quả thu hồi không tốt nên đã phải khảo sát lại và chuyển sang dùng hỗn hợp acetonitril - nước (1:1). Hệ dung môi này cho kết quả khá cao (tỷ lệ thu hồi từ 83,7% đến 109,7% tùy theo nền mẫu). Hơn nữa, với các mẫu son thỏi (dạng sáp, thể chất rất quánh) thay vì chiết 2 pha lỏng - lỏng (n-hexan và dung môi chiết mẫu như ASEAN), - 18 - dùng một lượng nhỏ tetrahydrofuran hay dimethylformamid để phân tán mẫu rồi chiết cho kết quả tốt như phương pháp ASEAN nhưng cách làm đơn giản và nhanh hơn, không cần chuyển vào bình gạn và chờ phân lớp. Về qui trình phân tích sắc ký: Đã khảo sát và lựa chọn được điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích các chất cả định tính và định lượng. Định tính bằng xét thời gian lưu, độ tinh khiết pic và so sánh phổ (chồng phổ và tính hệ số tương đồng similary index) của píc nghi ngờ trong mẫu thử với píc thu được từ mẫu chuẩn. Định lượng bằng so sánh diện tích (hoặc chiều cao) píc thu được từ mẫu thử với píc thu được từ mẫu chuẩn. Về cách đọc kết quả: Sử dụng detector PDA đọc phổ và độ tinh khiết pic của píc nghi ngờ có cùng thời gian lưu với píc chuẩn (ASEAN không nêu rõ mà chỉ nói đến thời gian lưu). Như vậy tính đặc hiệu của phương pháp càng được khẳng định. Về đánh giá qui trình phân tích: Các qui trình đã được xây dựng và thẩm định các chỉ tiêu về độ thích hợp của hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, LOD và LOQ trên mẫu tự tạo với nền mẫu mỹ phẩm không có các chất cấm. Qua thẩm định bằng thực nghiệm, các quy trình phân tích này đều đáp ứng được yêu cầu khi kiểm tra chất màu cấm tương ứng. Hơn nữa, các quy trình thiết lập đều có giới hạn phát hiện tốt hơn so với công bố của phương pháp hòa hợp ACM SIN 02 với những đối tượng chất màu mà phương pháp này đưa ra giới hạn phát hiện (ví dụ với MY và PO giới hạn phát hiện nhỏ hơn 25 lần, với RB giới hạn phát hiện nhỏ hơn 1000 lần so với công bố của ASEAN). 4.2.1.2. Các chất màu chưa có phương pháp hòa hợp: Pigment red 53 (PR), Crystal violet (CV) và 4 chất thuộc nhóm Sudan chưa có phương pháp hòa hợp của ASEAN, phải xây dựng hoàn toàn quy trình phân tích mới cho các chất màu này. Về quy trình xử lý mẫu mỹ phẩm: Tùy theo từng chất mà lựa chọn dung môi chiết mẫu phù hợp, với các mẫu son thỏi (dạng sáp) hay sơn móng, dùng một lượng nhỏ tetrahydrofuran hay dimethylformamid vừa đủ phân tán mẫu rồi chiết cho kết quả tốt (tỷ lệ thu hồi đều cao trong quá trình thẩm định từ 83,7% đến 109,7% ), cách làm đơn giản, tránh thất thoát do không phải qua nhiều bước xử lý. Với Pigment red 53 là chất khó tan trong nước, dùng dimethylsulfoxid hòa tan và chiết được hoàn toàn chất này, nền mẫu sạch. Với Crystal violet (CV), hỗn hợp acetonitril dung dịch đệm amoniac pH 9,5 - 10,0 (2 : 5) là dung môi chiết mẫu tốt nhất đã lựa chọn được. Khi khảo sát đã thử với môi trường acid hay kiềm mạnh (NaOH 0,01M) đều cho píc không cân đối và không ổn định. Hơn nữa, dung môi chiết mẫu này có thành phần rất giống với pha động (ACN - THF - đệm pH 9,0 (20:30:50)) nên pic sắc ký thu được cân đối, ổn định, cho kết quả lặp lại, độ đúng tốt là điều phù hợp. Đây cũng là một trong những nguyên tắc lựa chọn dung môi pha mẫu. Với các Sudan, hệ dung môi methanol – ethyl acetat (1:1) là hệ mà nhóm chất Sudan tan rất tốt, dung dịch mẫu thử sạch không bị lẫn nhiều tạp chất, qui trình chiết đơn giản, dễ dàng. Hệ dung môi này có ethyl acetat nên không cần dùng chất THF để phân tán mẫu son dạng sáp hay sơn móng. Đây cũng là dung môi mà tác giả Nguyễn Văn Yên và cộng sự lựa chọn (năm 2010, sau kết quả nghiên cứu của chúng tôi 3 năm) để hòa tan các sudan trong cắn thu được sau khi chiết mẫu mỹ phẩm và thực phẩm bằng aceton sau đó tiêm vào hệ sắc ký. Về điều kiện phân tích sắc ký: Để phân tích PR, chỉ cần thay đổi tỷ lệ thành phần pha động của điều kiện phân tích PO là hỗn hợp methanol-dung dịch đệm pH 6,2 từ tỷ lệ 85:15 thành 65:35. Kết quả này chỉ ra một thuận lợi cho người làm phân tích: gần như với cùng một điều kiện phân tích về cột sắc ký, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, chỉ cần thay đổi tỷ lệ thành phần pha động và bước sóng lấy sắc ký đồ có thể định tính, định lượng được cả 3 chất màu: MY, PO và PR. Kết quả khảo sát cũng cho thấy, các thành phần dung môi thông thường, dễ kiếm: methanol và dung dịch đệm pH 6,2 (chuẩn bị dung dịch triethylamin 3mM trong nước, chỉnh pH về 6,2 bằng acid acetic 30%), trong khi pha động của ASEAN chuẩn bị phức tạp, dùng chất tạo cặp ion khá đắt tiền (TBA). Với Crystal violet (CV): lựa chọn cột Alltech RP18 (250x 4,6 mm, 5 m) hoặc cột C18 của Phenomenex ở nhiệt độ phòng, detector PDA đặt trong dải 300 - 900 nm (lấy sắc đồ ở 590 - 19 - nm), pha động: là hỗn hợp của acetonitril – tetrahydrofuran – dung dịch đệm pH 9,0 (20:30:50), tốc độ dòng: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 100 l. Điều kiện phân tích này cho thấy pha động có thành phần gần như là dung môi pha mẫu, píc thu được cân đối, có độ lặp lại và độ đúng cao, hệ sắc ký rất ổn định. Qui trình phân tích đồng thời 4 chất Sudan với các điều kiện phân tích đơn giản, dễ thực hiện, dung môi hóa chất dễ kiếm, dễ dàng áp dụng ở các đơn vị có máy HPLC với detector PDA. Điều kiện phân tích bao gồm: cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) (Phenomenex hoặc Apollo), pha động: methanol – nước (95:5), tốc độ dòng: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm: 20 µl, lấy sắc đồ tại 488 nm.  Về đánh giá quy trình phân tích: Các quy trình phân tích này đã được thẩm định chặt chẽ và cho kết quả tốt về độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, LOD, LOQ (và độ ổn định của dung dịch các chất màu Sudan), đáp ứng được yêu cầu khi kiểm tra chất màu cấm tương ứng. Hơn nữa, các quy trình thiết lập phân tích 6 chất màu cấm chưa có phương pháp hòa hợp (PR, CV và 4 chất Sudan) đều có giới hạn phát hiện thấp: PR là 0,4µg/ml (tương ứng 80µg/g mẫu); CV là 0,04 µg/ml (tương ứng 2µg/g mẫu), các Sudan (µg/ml): Sudan I: 0,23, Sudan II: 0,24, Sudan III: 0,25 và Sudan IV: 0,24 cho phép phát hiện các chất bị cấm trong son, sơn móng, phấn trang điểm ở nồng độ rất nhỏ (ppm). 4.2.1.3. Về qui trình phân tích phát hiện và định lượng đồng thời 4 chất màu: Qui trình này được cải tiến từ qui trình phân tích đồng thời MY, PO, RB của ASEAN và đã đưa thêm được PR phân tích đồng thời với 3 chất màu MY, PO và RB.  Về xử lý mẫu mỹ phẩm: Dùng phương pháp chiết lỏng-lỏng giữa dung môi pha mẫu với nhexan như qui trình ASEAN đã đưa ra khi phát hiện 3 chất màu MY, PO và RB.  Về điều kiện phân tích sắc ký: Đây là qui trình phân tích dựa trên qui trình phân tích đồng thời MY, PO, RB của ASEAN, tuy nhiên, đã nghiên cứu cụ thể thời gian, cách thức để pha động tủa hoàn toàn (để lạnh ở 14-15 oC trong 72 giờ mà ASEAN chỉ nêu để yên vài giờ ) rồi lọc trước khi đưa vào hệ thống sắc ký, đảm bảo sự ổn định của toàn hệ thống trong quá trình sắc ký và không hại cột. Hơn nữa, đã đưa thêm được Pigment red 53 cùng được phân tích đồng thời với 3 chất màu trong qui trình của ASEAN.  Về đánh giá qui trình: Qui trình đã được đánh giá khá đầy đủ các chỉ tiêu về độ thích hợp hệ thống (các pic cân đối, tách rời hoàn toàn với R s nhỏ nhất cũng bằng 2,2, số đĩa lý thuyết thấp nhất là 2592). Kết quả đã chỉ ra qui trình phân tích có độ lặp lại tốt cho cả 4 chất màu cấm (RSD của thời gian lưu đều nhỏ hơn 1%, RSD của diện tích pic đều nhỏ hơn 2%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi từ 94,0% đến 101,5%). LOD và LOQ thấp hơn ASEAN nhiều lần (MY là 100 lần, PR là 200 lần; PO là 2000 lần ...) nên phương pháp có độ nhạy tốt. Qui trình vừa để định tính (phát hiện) thông qua các chỉ số: độ tinh khiết píc, so sánh thời gian lưu và chồng phổ của píc nghi ngờ với píc của chất chuẩn. Qui trình cũng dùng để định lượng bằng cách so sánh diện tích píc của píc thu được từ mẫu thử với píc thu được từ mẫu chuẩn. Đây là một lợi thế lớn trong phân tích, ngoài việc phát hiện còn đánh giá được mức độ lạm dụng nguy hiểm, thể hiện sự thành công trong việc triển khai và cải tiến các qui trình sẵn có của ASEAN. 4.2.2. Về qui trình định tính, định lượng Hydroquinon  Về xử lý mẫu: Sau khi khảo sát trên một số dung môi hoà tan mẫu, chúng tôi đã lựa chọn được hỗn hợp methanol - đệm phosphat pH 5,5 (50:50) là dung môi tốt nhất để chiết mẫu, dung dịch mẫu thử sạch không bị lẫn nhiều tạp chất và cho pic Hydroquinon cân đối. Hơn nữa, đây chính là pha động trong chương trình sắc ký để phân tích Hydroquinon đã khảo sát và lựa chọn được. (Phương pháp hòa hợp ACM INO 03 dùng ethanol 96% để chiết mẫu)  Về điều kiện phân tích sắc ký: Đã tiến hành khảo sát thực nghiệm các điều kiện sắc ký do phương pháp hòa hợp ACM INO 03 đưa ra. Tuy nhiên, kết quả thu được cho thấy với những đối tượng mẫu đã khảo sát sơ bộ, các điều kiện của phương pháp hòa hợp chưa đáp ứng được yêu cầu cho phép phát hiện chọn lọc Hydroquinon (do pic của chất này không tách được khỏi nền mẫu). Thực tế cho thấy, pha động của phương pháp hòa hợp ASEAN chỉ có ACN và nước (45 : 55) khả - 20 -