Tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào vero ở quy mô phòng thí nghiệm

C«ng ty V¾cxin vµ Sinh phÈm sè 1 B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi: Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin d¹i trªn nu«i cÊy tÕ bµo Vero ë quy m« phßng ThÝ nghiÖm Cn®t: §ç TuÊn §¹t 8514 Hµ néi – 2010 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABLV Lyssavirus dơi Úc (Australian Bat Lyssavirus) BPL Β-propiolactone CVS Chủng virút thử thách (Challenge Virus Standard) EBLV Lyssavirus dơi châu Âu (European Bat Lyssavirus) EP Dược điển châu Âu (European Pharmacopoeia) IU Đơn vị quốc tế (International unit) LAL Thử nghiệm xác định nội độc tố theo phương pháp LAL (Limulus amoebocyte lysate) LD50 Liều lượng gây chết 50% (Lethal Dose) MEM Môi trường dinh dưỡng tối thiểu (Minimum Essential medium) MNA Tế bào nguyên bào thần kinh chuột (Murine Neuroblastoma cell) MOI Multiplicity of Infection MSV Chủng vi rút giống gốc (Master seed virus) NIH Viện Sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ (National Institute of Health) NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) PM Chủng Pitman-Moore PPLO Pleuropneumonia - like organism PV Chủng Pasteur Virus RFFIT Thử nghiệm ức chế điểm huỳnh quang nhanh (Rapid fluorescent focus inhibition test) SDS-PAGE Điện di trên gel acrylamide (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) TCYTTG Tổ chức Y tế thế giới (WHO) VABIOTECH Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 VVSDT Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương WCB Ngân hàng tế bào sản xuất (Working cell bank) WSV Chủng vi rút giống sản xuất (Working seed virus) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng số Tên bảng Trang 1.1. Các loại vắcxin dại thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người và thú y 14 1.2. Các loại vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào và quy trình sản xuất 21 2.1. Số lượng tế bào Vero thu được qua các đời cấy chuyển trong quá trình nhân nuôi trên chai nuôi cấy một lớp 49 2.2. Kết quả nuôi cấy virút dại với các liều gây nhiễm khác nhau 51 2.3. Kết quả nuôi cấy virút dại theo ngày sau gây nhiễm virút vào tế bào 66 2.4. Kết quả nuôi cấy virút dại theo thời điểm thay môi trường duy trì tế bào khác nhau 69 2.5. Kết quả nuôi cấy virút dại trên các dạng chai nuôi cấy khác nhau 72 2.6. Kết quả tinh sạch hỗn dịch virút bằng các loại màng lọc khác nhau 75 2.7. Kết quả bất hoạt virút dại bằng các phương pháp bất hoạt khác nhau 76 2.8. Kết quả cô đặc hỗn dịch virút dại theo các tỷ lệ khác nhau 78 2.9. Kết quả kiểm tra chất gây sốt trong bán thành phẩm vắcxin dại 91 3.1. Kết quả nhân nuôi tế bào Vero của các loạt sản xuất thử nghiệm 95 3.2. Kết quả gây nhiễm virút dại của các loạt sản xuất thử nghiệm 96 3.3. Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0109 97 3.4. Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0209 98 3.5. Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0309 99 3.6. Kết quả tinh sạch hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử nghiệm 100 3.7. Kết quả bất hoạt virút của các loạt sản xuất thử nghiệm 101 3.8. Kết quả cô đặc hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử nghiệm 101 3.9. Kết quả tinh chế virút của các loạt sản xuất thử nghiệm 102 3.10. Kết quả pha bán thành phẩm cuối cùng của các loạt sản xuất thử nghiệm 105 3.11. Kết quả sản xuất vắcxin thành phẩm của các loạt sản xuất thử nghiệm 105 3.12. Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ sở của các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng đông khô (VERAPVAX) 106 3.13. Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ sở của các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng (VERALVAX) 107 4.1. Tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero (dạng lỏng hấp phụ nhôm) 141 4.2. Tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero (dạng đông khô) 142 5.1. Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 153 5.2. Kết quả kiểm tra tính an toàn chung của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 153 5.3. Kết quả kiểm tra chất gây sốt của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng (VERALVAX) 154 5.4. So sánh đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero do VABIOTECH sản xuất với vắcxin Verorab 155 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình số Tên hình 1.1. Cấu trúc hạt virút dại Trang 6 1.2. Nguồn gốc của các chủng dại cố định được sử dụng trong sản xuất vắcxin trên nuôi cấy tế bào 18 2.1. Tóm tắt quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 39 2.2. Hình ảnh tế bào Vero qua các đời cấy chuyển 41 2.3. Hình ảnh chuột liệt do chủng virút dại cố định PV 56 2.4. Hình ảnh nhiễm virút dại vào tế bào Vero dưới kính hiển vi huỳnh quang 60 2.5. Kết quả siêu ly tâm phân vùng bằng rotor zonal tinh chế virút dại 85 2.6. Hình ảnh điện di sản phẩm sau khi tinh chế virút dại theo phương pháp siêu ly tâm phân cùng bằng rotor zonal 86 2.7. Hình ảnh siêu ly tâm phân vùng bằng rotor góc cố định tinh chế virút dại 86 2.8. Hình ảnh điện di các phân đoạn sau khi tinh chế virút dại theo phương pháp siêu ly tâm phân cùng bằng rotor góc cố định 87 2.9. Phương pháp lai điểm xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắcxin dại 88 3.1. Xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm của loạt sản xuất vắcxin dại 0209 102 3.2. Xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm của loạt sản xuất vắcxin dại 0109 và 0309 103 3.3. Hình ảnh chạy điện di trên gel SDS-PAGE các sản phẩm của loạt sản xuất vắcxin dại 0109 103 3.4. Hình ảnh chạy điện di trên gel SDS-PAGE các sản phẩm của loạt sản xuất vắcxin dại 0209 và 0309 104 5.1. Sơ đồ gây miễn dịch và lấy máu chuột 146 MỤC LỤC NỘI DUNG Trang MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN 5 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH DẠI 5 1.1.1. Tác nhân gây bệnh và đặc điểm bệnh lý 5 1.1.2. Đáp ứng miễn dịch với virút dại 7 1.1.3. Tác động của bệnh dại đối với sức khỏe cộng đồng 8 1.1.4. Các khuyến cáo về tiêm phòng bệnh dại hiện nay 9 1.2. TỔNG QUAN VỀ VẮCXIN DẠI 13 1.2.1. Các vắcxin thế hệ thứ nhất 13 1.2.2. Các vắcxin thế hệ thứ hai 17 1.3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO 20 1.3.1. Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào 20 1.3.2. Kiểm tra chất lƣợng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào 24 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC, TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT VẮCXIN DẠI TẠI VIỆT NAM 31 CHƯƠNG 2-XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 36 2.1. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO 39 1.4. 2.1.1. Các thử nghiệm kiểm tra nƣớc nổi nuôi cấy tế bào 43 2.1.2. Thử nghiệm kiểm tra các virút hấp phụ hồng cầu 47 2.1.3. Kết quả quy trình nuôi cấy tế bào Vero trên chai tế bào một lớp 48 2.2. QUY TRÌNH GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO 49 2.3. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƢỚC NỔI 53 2.3.1. Các phƣơng pháp xác định hiệu giá virút dại 54 2.3.2. Kết quả nuôi cấy virút dại theo các điều kiện nhân nuôi khác nhau 65 2.4. QUY TRÌNH TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT 74 2.5. QUY TRÌNH BẤT HOẠT VIRÚT 76 2.6. QUY TRÌNH CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT 77 2.7. QUY TRÌNH TINH CHẾ VIRÚT 79 2.7.1. Thử nghiệm phát hiện ADN tế bào Vero tồn dƣ trong các sản phẩm của quy trình tinh chế vắcxin dại bằng phƣơng pháp lai điểm 79 2.7.2. Các phƣơng pháp tinh chế virút dại 84 2.8. QUY TRÌNH PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG 89 2.9. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM 92 CHƯƠNG 3-SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮCXIN DẠI Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 94 3.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO 94 3.2. KẾT QUẢ GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO 95 3.3. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƢỚC NỔI 96 3.4. KẾT QUẢ TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT 100 3.5. KẾT QUẢ BẤT HOẠT VIRÚT 100 3.6. KẾT QUẢ CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT 101 3.7. KẾT QUẢ TINH CHẾ VIRÚT 101 3.8. KẾT QUẢ PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG 104 3.9. KẾT QUẢ SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM 105 3.10. KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VẮCXIN THÀNH PHẨM TẠI CƠ SỞ 105 CHƯƠNG 4 - XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG VÀ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO 109 4.1. CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA SINH HỌC 110 4.1.1. Phƣơng pháp kiểm tra vô khuẩn 110 4.1.2. Phƣơng pháp kiểm tra an toàn chung 113 4.1.3. Phƣơng pháp kiểm tra chất gây sốt 116 4.1.4. Phƣơng pháp kiểm tra an toàn đặc hiệu 119 4.1.5. Phƣơng pháp kiểm tra công hiệu 121 4.1.6. Thử nghiệm nhận dạng 4.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA HÓA LÝ 125 126 4.2.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein tổng số 126 4.2.2. Xác định pH trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 130 4.2.3. Định lƣợng thimerosal trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 131 4.2.4. Định lƣợng nhôm trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng 134 4.2.5. Xác định độ ẩm tồn dƣ trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng đông khô 136 4.2.6. Kiểm tra tính chất vật lý vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 139 5.3. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO 140 CHƯƠNG 5- ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 143 5.1. CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 144 5.1.1. Các phƣơng pháp đánh giá tính an toàn của vắcxin trên động vật thí nghiệm 144 5.1.2. Các phƣơng pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin trên chuột 144 5.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC CỦA VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 152 5.2.1. Tính an toàn của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào trên động vật thí nghiệm 152 5.2.2. Đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero trên động vật thí nghiệm 154 KẾT LUẬN 157 KIẾN NGHỊ 160 TÀI LIỆU THAM KHẢO 161 PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Tại trên 100 nước và vùng lãnh thổ, dại là một bệnh gây dịch trên động vật. Bệnh dại ở chó là nguồn lây nhiễm chiếm đến 99% sang cho người và là nguy cơ đe dọa tính mạng trên 3,3 tỷ người, chủ yếu tại các nước châu Á và châu Phi. Cùng với chó nuôi tại nhà, nhiều giống thú ăn thịt và dơi cũng có thể làm lây truyền bệnh dại sang cho người. Khi đã có biểu hiện trên lâm sàng, phần lớn các ca bệnh dại đều tử vong do vậy việc tiêm phòng là biện pháp phòng bệnh cũng như điều trị bệnh dại cho hiệu quả cao nhất. Gần 10 triệu người được tiêm phòng sau khi phơi nhiễm hàng năm chủ yếu tại các nước châu Á. Tiêm phòng dại sau khi phơi nhiễm đã tránh được trên 300.000 ca tử vong hàng năm tại châu Á và châu Phi. Chi phí toàn cầu hàng năm cho phòng bệnh dại ước tính khoảng trên 1 tỷ đô la Mỹ. Chi phí này cũng như tỷ lệ đi tiêm phòng sau khi phơi nhiễm dự tính sẽ tăng lên một cách đáng kể khi tất cả các nước thay thế vắcxin sản xuất từ mô thần kinh bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào. Trên 100 năm trước đây, Louis Pasteur và cộng sự đã phát triển vắcxin dại thô đầu tiên để tiêm phòng sau khi phơi nhiễm dựa trên việc bất hoạt virút trên mô thần kinh. Từ đó trở đi một số loại vắcxin đã được phát triển và sử dụng trên thế giới. Các vắcxin thế hệ thứ nhất đều sử dụng mô động vật để có được hỗn dịch chứa virút. Các vắcxin này đã được sử dụng rộng rãi để phòng bệnh cho cả người và động vật. Tuy nhiên, các vắcxin này có rất nhiều nhược điểm như còn virút sống tồn dư, hay gặp các phản ứng não tủy sau khi tiêm vắcxin và hàm lượng kháng nguyên cho một liều tiêm thấp đòi hỏi phải có một liệu trình điều trị kéo dài với một số lượng lớn các mũi tiêm. Dù đã có những cải tiến bằng cách nhân nuôi virút trên não các động vật sơ sinh trước 1 khi myelin phát triển, các vắcxin bất hoạt sản xuất trên não động vật chưa dứt sữa vẫn có thể gây ra các phản ứng thần kinh không mong muốn. Do vậy, các vắcxin thế hệ thứ hai sản xuất trên nuôi cấy tế bào đã ra đời nhằm khắc phục các nhược điểm của các dạng vắcxin cổ điển. Vắcxin này có tính an toàn và công hiệu cao do đó được các nước phát triển lựa chọn để tiêm phòng cho người trước và sau khi phơi nhiễm với virút. Đáp ứng miễn dịch và hiệu lực của vắcxin trên nuôi cấy tế bào đã được chứng minh trên động vật thí nghiệm và thực địa lâm sàng trên người. Ở cả phương pháp tiêm phòng trước và sau khi phơi nhiễm, các vắcxin này đều tạo được đáp ứng kháng thể ở trên 99% người được tiêm. Sử dụng các vắcxin thế hệ mới kết hợp với xử lý vết cắn đúng cách và tiêm phòng globulin miễn dịch kháng dại đã tạo ra hiệu quả phòng bệnh dại là 100% thậm chí cả với những trường hợp bị cắn có nguy cơ mắc bệnh cao. Do vậy việc nghiên cứu, phát triển, sản xuất và tiến tới đưa ra sử dụng rộng rãi vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào là cần thiết. Các quốc gia trên thế giới cần sớm có các chiến lược để sử dụng và triển khai rộng khắp loại vắcxin tiên tiến và cho hiệu quả cao này. Tại Việt Nam, trong những năm 1991-1995, bệnh dại là vấn đề y tế nghiêm trọng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, tính mạng và kinh tế của người dân. Bệnh xảy ra quanh năm, lưu hành ở hầu hết các tỉnh, thành phố trên cả nước. Nếu tính một người tiêm vắcxin dại phí tổn 300.000 đồng (gồm tiền thuốc, công lao động, tiền đi lại…) thì trong năm 1995 cả nước tốn gần 100 tỷ đồng. Thêm vào đó, mỗi năm có trên dưới 500 người thiệt mạng do bệnh dại. Trước tình hình nghiêm trọng của bệnh dại, năm 1996, Chính phủ đã ban hành chỉ thị về việc tăng cường phòng chống bệnh dại và Bộ Y tế đã thành lập ban chỉ đạo Phòng chống bệnh dại Quốc gia. Thành công của Chương trình là đến năm 2006 số ca tử vong do bệnh dại đã giảm 81% so với năm 1995. Tuy nhiên, trong năm 2007, số ca tử vong do bệnh dại đã lại tăng 2 lên đến trên 100 trường hợp. Nguyên nhân có thể là do việc kiểm soát nguồn gây bệnh mà chủ yếu là chó - nguồn gây bệnh chính tại Việt Nam còn nhiều hạn chế. Bên cạnh đó, việc thay đổi chính sách sử dụng vắcxin, ngừng sử dụng vắcxin thế hệ cũ rẻ tiền thay thế bằng vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào đắt tiền hơn, làm giảm khả năng được tiếp cận với vắcxin phòng bệnh của các bệnh nhân nghèo, đặc biệt tại các vùng nông thôn, vùng sâu, vùng xa. Ở Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ yếu là vắcxin sản xuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple). Các vắcxin này có chứa một lượng virút chưa bất hoạt và tính sinh miễn dịch thấp nên phải tiêm nhiều mũi cùng với liều tiêm lớn. Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch tễ học Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất vắcxin dại trên não chuột ổ theo phương pháp của Fuenzalida-Palacios được chuyển giao kỹ thuật từ Viện Pasteur Paris (Pháp). Ưu điểm chính của vắcxin này là không chứa hoặc chứa rất ít myelin của não nên ít gây các tai biến thần kinh hơn. Hiệu giá virút thu hoạch từ não chuột ổ cao hơn do đó tính sinh miễn dịch tốt hơn do vậy làm giảm số liều tiêm. Việc sử dụng vắcxin dại trên não chuột ổ trong hơn 30 năm qua đã góp phần hạn chế nguy cơ tử vong do bệnh dại. Theo kết quả báo cáo từ các Trung tâm Y tế Dự phòng trên cả nước, trên 80% các trường hợp sau khi tiêm vắcxin Fuenzalida có các phản ứng không mong muốn, các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng như viêm não tủy gây liệt vĩnh viễn và tử vong gặp với tỷ lệ 1-2 trường hợp/10.000 mũi tiêm. Do các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng này, nên từ năm 2007, Bộ Y tế đã ra quyết định ngừng việc sử dụng vắcxin dại Fuenzalida trên toàn quốc thay thế bằng các vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào trong đó chủ yếu là vắcxin Verorab của Hãng Aventis Pasteur. Tỷ lệ bệnh nhân được tiêm phòng bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào được nhập ngoại trước đây chỉ chiếm 15% số người được tiêm 3 vắcxin dại và giá thành cho một liệu trình tiêm loại vắcxin này rất đắt (gần 800.000 đồng) do đó cơ hội để các bệnh nhân nghèo, vùng sâu, vùng xa được tiêm loại vắcxin này là rất hạn chế. Đứng trước yêu cầu cần sớm có được vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào được sản xuất trong nước nhằm làm giảm chi phí tiêm phòng cho bệnh nhân, để nhiều người có cơ hội được tiêm phòng vắcxin dại từ đó giảm tỷ lệ tử vong do bệnh dại, từ năm 2005 nhóm nghiên cứu của Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã hướng đến việc nghiên cứu và phát triển vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero tại Việt Nam. Nhận được sự hợp tác và giúp đỡ của của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và Dự phòng Hoa kỳ (CDC) trong việc cung cấp các chủng giống sản xuất vắcxin dại, nhóm nghiên cứu đã tiến hành các nghiên cứu ở cấp cơ sở và lựa chọn ra được chủng virút PV (Pasteur Virus) và môi trường nuôi cấy không huyết thanh đạt các yêu cầu cho sản xuất vắcxin. Từ những thành công này, nhóm nghiên cứu bắt đầu tiến hành xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở quy mô phòng thí nghiệm. Với kinh nghiệm trên 30 năm sản xuất và kiểm định chất lượng vắcxin dại sản xuất trên não chuột ổ, cùng với những kinh nghiệm và thành công trong việc phát triển các vắcxin mới, VABIOTECH đưa ra các mục tiêu và nội dung trong Đề tài nghiên cứu này với mong muốn sớm có được sản phẩm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào đạt tiêu chuẩn được sản xuất tại Việt Nam. Các mục tiêu nghiên cứu của Đề tài 1. Xây dựng được qui trình công nghệ ổn định sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở qui mô phòng thí nghiệm. 2. Sản xuất được các loạt vắcxin dại có chất lượng đạt yêu cầu của Tổ chức Y tế thế giới và tương đương với các vắcxin cùng loại của nước ngoài như vắcxin Verorab của Aventis Pasteur. 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH DẠI 1.1.1. Tác nhân gây bệnh và đặc điểm bệnh lý Virút dại thuộc nhóm Rhabdoviridae, họ Lyssavirus. Trong họ Lyssavirus, virút dại cổ điển (các chủng virút hoang dại ở chó, mèo… và các chủng virút dại cố định) thuộc genotype đầu tiên trong 7 genotype của nhóm. Các virút thuộc các genotype còn lại thường gây bệnh ở động vật, tuy nhiên đã có những trường hợp tử vong do nhiễm các virút này ở người như nhiễm Lyssavirus dơi Úc (ABLV) hay nhiễm Lyssavirus dơi châu Âu (EBLV). Hạt virút dại có hình viên đạn với chiều dài trung bình là 180 nm và đường kính là 75nm. Mỗi hạt virút có chứa nucleocapsid xoắn bao quanh bởi lớp một vỏ lipid kép (Hình 1.1). Hệ gen là một ARN chuỗi đơn âm không phân đoạn có chiều dài 11,9 kb. Bề mặt ngoài bao phủ bởi các gai có chiều dài khoảng 10 nm gắn vào lớp lipid. Virút dại có 5 protein cấu trúc chính. Phức hợp ribonucleoprotein hạt nhân xoắn chứa ARN hệ gen liên kết với 3 protein bên ngoài là enzyme ARN polymerase phụ thuộc ARN (L) (190kd), nucleoprotein (N) (55 Kd) và phosphoprotein (NS) (38 KD). Các protein này cùng với ARN tạo thành phức hợp ARN hoạt động kiểm soát cả quá trình phiên mã và nhân lên của virút. Các protein cấu trúc khác là protein phức hợp (M) (26 kD) nằm ở mặt trong vỏ của virút tạo thành cấu trúc ống và glycoprotein (G) (67K) tạo thành các gai trên bề mặt virút [46], [52]. Bệnh dại bản chất là bệnh thú y và lây nhiễm sang người qua vết cắn và vết cào xuyên da của động vật nhiễm. Lây truyền cũng có thể xảy ra khi chất lây nhiễm thường là nước bọt xâm nhập trực tiếp vào niêm mạc hoặc tổn 5 thương da mới của nạn nhân. Bệnh dại rất hiếm xảy ra do hít phải các chất tiết có chứa virút hoặc cấy ghép phủ tạng nhiễm bệnh. Vỏ bao ngoài Protein phức hợp Hệ gen ARN cuộn xoắn Màng lipid từ vật chủ Nucleoprotein Phosphoprotein Phức hợp ribonucleoprotein hoặc nucleocapsid Glycoprotein ARN polymerase Hình 1.1. Cấu trúc hạt virút dại Đối với các ca bệnh ở người, giai đoạn ủ bệnh thường từ vài tuần đến vài tháng nhưng cũng có thể thay đổi từ dưới 1 tuần đến trên 1 năm. Thời gian ủ bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng virút lây nhiễm, mức độ tổn thương và vị trí gần với thần kinh trung ương không của nơi virút xâm nhập [13], [55]. Virút lây nhiễm di chuyển vào hệ thống thần kinh trung ương qua các dây thần kinh ngoại vi, khi đến não bộ vi rút nhân lên và phát tán ngược trở ra hệ thống thần kinh và nhiều phủ tạng khác nhau như tuyến nước bọt. Virút dại lan truyền đến toàn bộ cơ thể thì bắt đầu các triệu chứng khởi phát tuy nhiên lúc đó cơ thể không có được đáp ứng miễn dịch với vi rút [52]. Hiện chưa có thử nghiệm nào được sử dụng để chẩn đoán bệnh dại ở người trước khi bệnh khởi phát trên lâm sàng. Do vậy, chẩn đoán bệnh sẽ chỉ dựa trên tiền sử bệnh, các biểu hiện và triệu chứng có liên quan đến tình hình 6 dịch tễ của bệnh trên động vật. Biểu hiện đầu tiên của bệnh dại thường là sốt nhẹ, đau và dị cảm tại vết thương. Khi virút lan truyền vào hệ thần kinh trung ương, viêm não tiến triển sẽ xuất hiện có các đặc trưng là sợ nước hoặc sợ gió, tăng động và mất ngủ, co giật toàn thân, sau đó một vài ngày sẽ ngừng thở ngừng tim. Bệnh dại gây liệt có thể xảy ra ở 30% ca bệnh ở người, tiến triển ít trầm trọng hơn tuy nhiên kết cục cuối cùng cũng là tử vong. Dạng bệnh dại này thường bị chẩn đoán nhầm là bệnh lý khác [55]. Các chất kháng virút, interferon và liều lượng cao huyết thanh kháng dại được sử dụng trong điều trị các ca bệnh ở người nhưng thường không tránh được nguy cơ tử vong. Cho dù hiện đã có 1 trường hợp bệnh dại lây truyền từ dơi được cứu sống sau khi dùng các thuốc gây ức chế thần kinh và thuốc kháng virút nhưng liệu trình điều trị tích cực này lại gặp thất bại khi áp dụng trên một số bệnh nhân khác cũng bị nhiễm dại do dơi [52]. 1.1.2. Đáp ứng miễn dịch với vi rút dại Sau khi nhiễm, virút dại chủ yếu xâm nhập vào hệ thần kinh do dó kháng nguyên thường bị tách biệt ra khỏi hệ thống miễn dịch. Đáp ứng kháng thể thường không được phát hiện ở người nhiễm trước 2 tuần đầu tiên của bệnh. Các vắcxin trên nuôi cấy tế bào hiện nay cho kháng thể trung hòa virút với protein G cao và sớm [46]. Với vắcxin dại, không thể tiến hành các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có nhóm chứng và theo dõi dọc ở các nhóm so sánh không điều trị. Do vậy, thông tin về hiệu quả vắcxin sẽ chủ yếu dựa trên các kết quả thực địa tiêm phòng sau phơi nhiễm ở người đã bị phơi nhiễm với chó có chẩn đoán chắc chắn mắc dại trong phòng thí nghiệm. Đánh giá gián tiếp hiệu quả vắcxin có thể được tiến hành qua các nghiên cứu về tính sinh miễn dịch so sánh giữa hiệu giá kháng thể trung hòa virút sau khi tiêm vắcxin thử nghiệm 7 với kháng thể có được khi tiêm vắcxin đối chứng đã biết hiệu quả bảo vệ. Thêm vào đó, mô hình động vật sẽ được sử dụng để chứng minh lợi ích của tiêm phòng vắcxin. Tuy hiệu giá kháng thể trung hòa virút bảo vệ ở người chưa được thiết lập nhưng nồng độ tối thiểu là 0,5 IU/ml được coi là tương đương với khả năng bảo vệ. Ở người khỏe mạnh sau khi tiêm vắcxin, nồng độ kháng thể có thể đạt được vào ngày thứ 14 của liệu trình tiêm sau phơi nhiễm không phụ thuộc vào độ tuổi [46], [55]. 1.1.3. Tác động của bệnh dại đối với sức khỏe cộng đồng Tại trên 100 nước và vùng lãnh thổ, dại là một bệnh gây dịch trên động vật. Bệnh dại ở chó là nguồn lây nhiễm chiếm đến 99% sang cho người và là nguy cơ đe dọa tính mạng trên 3,3 tỷ người, chủ yếu tại các nước châu Á và châu Phi. Cùng với chó nuôi tại nhà, nhiều giống thú ăn thịt và dơi cũng có thể làm lây truyền bệnh dại sang cho người [55]. Khi đã có biểu hiện trên lâm sàng, phần lớn các ca bệnh dại đều tử vong. Tuy nhiên, các ca tử vong do bệnh dại còn ít được báo cáo tại một số nước có bệnh dại lưu hành đặc biệt ở nhóm tuổi nhỏ. Số ca tử vong hàng năm ước tính là 55.000 có thể là thấp hơn so với con số thực. Châu Á và châu Phi chiếm phần lớn các ca tử vong do bệnh dại. Tính riêng tại Ấn Độ, ước tính có khoảng 20.000 ca chết mỗi năm với tỷ lệ là 2 /100.000 dân; tại châu Phi con số này cũng tương đương là 24.000 ca (hoặc 4 ca /100.000 dân). Cho dù tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc bệnh nhưng trẻ dưới 15 tuổi là đối tượng thường mắc nhất với 30-50% số trường hợp được tiêm phòng sau khi bị cắn là trẻ từ 5-14 tuổi và phần lớn là con trai [55]. Khoảng 98% trường hợp bệnh dại ở người xảy ra tại những vùng nuôi nhiều chó mà đa phần được thả rông. Bệnh dại ở người là một bệnh hiếm gặp tại các nước công nghiệp phát triển và ở phần lớn các nước Mỹ La tinh nơi 8 bệnh dại trên chó đã gần được loại trừ do giảm thiểu số lượng chó thả rông và tiêm phòng cho chó nuôi tại nhà. Tại các nước như Thái Lan, việc triển khai tiêm phòng rộng rãi cho chó và tăng cường tiêm phòng sau khi bị cắn đã làm giảm đáng kể số ca chết do bệnh dại ở người. Gần 10 triệu người được tiêm phòng sau khi bị cắn hàng năm chủ yếu là tại Trung Quốc và Ấn Độ. Tiêm phòng dại sau khi bị cắn đã tránh được 330.304 ca tử vong hàng năm tại châu Á và châu Phi. Chi phí toàn cầu hàng năm cho phòng bệnh dại ước tính khoảng trên 1 tỷ đô la Mỹ. Chi phí này cũng như tỷ lệ đi tiêm phòng sau khi bị cắn dự tính sẽ tăng lên một cách đáng kể khi tất cả các nước thay thế vắcxin sản xuất từ mô thần kinh bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào hiện đại, an toàn và có hiệu lực cao [55]. 1.1.4. Các khuyến cáo về tiêm phòng bệnh dại hiện nay 1.1.4.1. Tiêm phòng trước khi phơi nhiễm Tiêm phòng trước phơi nhiễm được chỉ định cho những người có nguy cơ phơi nhiễm cao với virút dại. Những đối tượng này bao gồm nhân viên phòng thí nghiệm, nhân viên thú y, người nuôi giữ động vật, nhân viên bảo vệ động vật hoang dại thường xuyên phải tiếp xúc với những động vật có khả năng lây nhiễm cao cũng như các khách du lịch đến các khu vực có nguy cơ mắc bệnh dại cao. Tuy nhiên, theo các nghiên cứu về độ tuổi mắc bệnh, nguy cơ nhiễm bệnh cao nhất là trẻ em sống trong vùng động vật nhiễm bệnh dại tại các nước đang phát triển [13], [55]. Chỉ định tiêm bắp Tiêm phòng vắcxin dại trước phơi nhiễm cần liều tiêm bắp 1 ml hoặc 0,5 ml tùy thuộc vào loại vắcxin, tiêm theo lịch 0, 7, 28 ngày (ngày thứ 28 được lựa chọn nhưng có thể tiêm sớm hơn vào ngày 21 nếu có giới hạn về 9 mặt thời gian). Chỉ định tiêm trong da Tiêm trong da 0,1 ml vào ngày 0, 7, 28 (ngày thứ 28 được lựa chọn nhưng có thể tiêm sớm hơn vào ngày 21 nếu có giới hạn về mặt thời gian) là một liệu pháp được lựa chọn thay thể đường tiêm bắp. Tuy nhiên, tiêm trong da đòi hỏi phải thực hành đúng kỹ thuật, cán bộ tiêm cần được đào tạo và đượcgiám sát tốt. Tiêm nhắc lại Tiêm nhắc lại định kỳ chỉ dành cho các đối tượng thường xuyên và liên tục tiếp xúc với virút dại. Trong các trường hợp này, liều nhắc cần được tiêm với khoảng cách phù hợp được dự tính tùy theo kết quả xét nghiệm kháng thể. Các nhân viên phòng thí nghiệm có nguy cơ lây nhiễm vỉ rút dại cao cần được xét nghiệm 6 tháng một lần. Hiệu giá kháng thể trung hòa virút ít nhất là 0,5 IU/ml được cho là có khả năng bảo vệ. Ở những nơi không có điều kiện xét nghiệm huyết thanh học, tiêm phòng nhắc lại được tiến hành 5 năm một lần. 1.1.4.2. Tiêm phòng sau khi phơi nhiễm Chỉ định tiêm phòng sau phơi nhiễm kết hợp hoặc không kết hợp với huyết thanh kháng dại tùy thuộc vào mức độ tiếp xúc với động vật nghi dại: Độ I - Sờ hoặc cho động vật ăn, liếm trên bề mặt da (không tiếp xúc) Độ II - Ngậm, cắn trên da không tổn thương, các vết sây xướt hoặc trợt nhẹ không gây chảy máu. Độ III - Một hoặc nhiều vết cắn hoặc vết cào trên da, liếm trên da tổn thương, lây nhiễm niêm mạc với nước bọt, tiếp xúc với dơi. 10 Đối với độ I không cần tiêm phòng, độ II tiêm vắcxin ngay lập tức, độ II tiêm vắcxin kết hợp với huyết thanh. Đối với độ II và độ III, rửa và sát xà phòng (trong khoảng 15 phút) toàn bộ vết thương và vết cắn ngay lập tức hoặc càng sớm càng tốt. Không tiếp tục tiêm phòng sau phơi nhiễm nữa nếu động vật nghi dại đã được khằng định bằng các xét nghiệm là không nhiễm dại hoặc chó hoặc mèo nuôi vẫn khỏe mạnh sau 10 ngày theo dõi. Các yếu tố để quyết định xem có bắt đầu tiêm phòng sau phơi nhiễm hay không là mức độ nghi ngờ động vật mắc dại, mức độ tiếp xúc (độ I-III), đặc điểm lâm sàng của động vật cũng như khả năng xét nghiệm của phòng thí nghiệm. Trong phần lớn các trường hợp tại các nước đang phát triển, tình trạng tiêm phòng vắcxin của động vật cũng là một trong những yếu tố cần được quan tâm đến [55]. Chỉ định tiêm bắp Lịch tiêm phòng sau phơi nhiễm với liều tiêm bắp là 1 hoặc 0,5 ml tùy thuộc vào nhà sản xuất. Liệu trình tiêm khuyến cáo bao gồm 4 hoặc 5 liều tiêm. - Liệu trình tiêm 5 liều là tiêm bắp 1 liều vào các ngày 0, 3, 7, 14, 28. - Liệu trình tiêm 4 liều là tiêm bắp 2 liều vào ngày 0 tiếp theo tiêm 1 liều vào ngày 7 và 21 Chỉ định tiêm trong da Có thể tiêm theo liệu trình 2 vị trí hoặc 8 vị trí tùy thuộc theo khuyến cáo của nhà sản xuất 11 - Liệu trình tiêm trong da 8 vị trí là vào ngày 0, tiêm 8 vị trí (1 mũi vào mỗi bên cánh tay, 1 mũi vào mỗi bên đùi, 1 mũi vào mỗi bên vùng thượng đòn và 1 mũi vào mỗi bên vùng bụng dưới); vào ngày thứ 7, tiêm 1 mũi vào mỗi bên cánh tay và mỗi bên đùi và vào ngày 30 và 90, tiêm 1 mũi vào một bên cánh tay. Một liều tiêm vào ngày 90 có thể thay thế bằng 2 liều tiêm ngày thứ 30. - Liệu trình tiêm trong da 2 vị trí là tiêm 1 mũi 0,1 ml tại 2 vị trí vào ngày 0, 3, 7 và 28. Đối với những đối tượng đã tiêm phòng đầy đủ trước phơi nhiễm hoặc đã từng tiêm phòng sau phơi nhiễm với vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào hoặc hiện có hiệu giá kháng thể trung hòa virút ít nhất là 0,5 IU/ml, chỉ cần tiêm 2 liều tiêm bắp hoặc dưới da vào ngày 0 và 3 là đủ. 1.1.4.3. Tiêm kháng huyết thanh phòng dại Huyết thanh phòng dại được chỉ định cho phơi nhiễm độ III và phơi nhiễm độ II ở người suy giảm miễn dịch. Do mức độ thải trừ tương đối chậm, globulin miễn dịch kháng dại ở người (HRIG) thường được lựa chọn đặc biệt trong trường hợp bị phơi nhiễm nghiêm trọng và đa vị trí. Tuy nhiên, dạng HRIG rất hiếm, chỉ đủ sử dụng tại các nước công nghiệp phát triển. Globulin miễn dịch ngựa tinh chế (ERIG) hoặc sản phẩm F(ab’) của ERIG cũng có thể được sử dụng. Phần lớn các chế phẩm ERIG mới đều tốt, có độ tinh khiết cao, an toàn và rẻ hơn so với HRIG. Tuy nhiên, do có nguồn gốc khác loài nên khi tiêm ERIG sẽ có nguy cơ gặp phải các phản ứng quá mẫn. Huyết thanh kháng dại không được tiêm muộn quá 7 ngày sau khi bắt đầu tiêm phòng sau phơi nhiễm. Liều lượng của HRIG là 20IU/kg cân nặng còn đối với ERIG và sản phẩn F(ab’) là 40IU/kg cân nặng. Toàn bộ các sản 12