Tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến hắc phụ, bạch phụ và bào chế cao phụ tử ở quy mô pilot

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI HỖ TRỢ KINH PHÍ NHÀ NƯỚC THEO NGHỊ ĐỊNH 119/1999/NĐ-CP CỦA CHÍNH PHỦ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẾ BIẾN HẮC PHỤ, BẠCH PHỤ VÀ BÀO CHẾ CAO PHỤ TỬ Ở QUY MÔ PILOT Chủ nhiệm đề tài: TS. Bùi Hồng Cường Đơn vị chủ trì đề tài: Công ty CP TRAPHACO 7410 17/6/2009 Hà Nội - 2009 5 B. BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI ĐẶT VẤN ĐỀ Ô đầu, Phụ tử là những vị thuốc quý, được sử dụng khá phổ biến trong y - dược học cổ truyền phương Đông, nhất là ở Trung Quốc. Những vị thuốc này được lấy từ củ mẹ (củ cái, Ô đầu) và củ con (củ nhánh, Phụ tử) của một số loài thuộc chi Aconitum L. (chi Ô đầu). Loài A. carmichaelii Debx. (Xuyên ô) đã được đưa vào Dược điển Trung Quốc (2005), Dược điển Hàn Quốc (2002) và trong nhiều tài liệu khác. Ô đầu và Phụ tử đều rất độc, Ô đầu chỉ dùng ngoài, Phụ tử được y học cổ truyền dùng trong nhưng nhất thiết phải chế biến nhằm giảm độc tính. Phụ tử chế có tác dụng bổ dương, bổ hoả để trị dương hư, hoả hư; tác dụng hồi dương cứu nghịch để trị thoát dương, vong dương. Hải Thượng Lãn Ông coi vị thuốc Phụ tử là “thánh dược để hồi sinh”. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy phương pháp chế biến khác nhau thì tác dụng và độc tính khác nhau. Ở Việt Nam, ngay từ những năm đầu của thập kỷ 70 thế kỷ trước, cây Ô đầu đã được nhập trồng tại vùng Sa Pa, Bắc Hà (tỉnh Lào Cai), Sìn Hồ (tỉnh Lai Châu) và Quản Bạ, Đồng Văn (tỉnh Hà Giang). Trong chiến tranh biên giới phía Bắc (1979), cây thuốc này đã bị phá hủy nhiều. Từ năm 1990 trở lại đây, Ô đầu đã được người dân ở xung quanh thị trấn Sa Pa (Lào Cai) khôi phục và phát triển trồng trở lại. Song, phần lớn dược liệu Ô đầu và Phụ tử được sử dụng ở Việt Nam hiện nay vẫn là do nhập khẩu không chính thức từ Trung Quốc, không có tiêu chuẩn chất lượng nên không đảm bảo an toàn, gây tâm lý lo ngại trong giới thầy thuốc và nhân dân. Nhân dân Sa Pa và một số vùng trồng cây Ô đầu đã thu hoạch Phụ tử để chế biến làm thuốc theo kinh nghiệm, và coi đây là một vị thuốc quý, sử dụng để bồi bổ cơ thể, tăng cường thể lực và chữa đau lưng, đau nhức xương, khớp.... Tuy nhiên, quy trình chế biến không thống nhất và không kiểm tra độc tính nên sản phẩm không đảm bảo an toàn, thực tế đã có nhiều vụ ngộ độc 6 xảy ra. Các doanh nghiệp dược cũng gặp khó khăn khi đề cập đến việc sản xuất các thuốc có Phụ tử vì chưa có những công trình nghiên cứu đầy đủ về chế biến, tác dụng sinh học và độc tính của Phụ tử chế. Hơn nữa, quy trình chế biến được nêu trong các tài liệu y dược học cổ truyền sử dụng nguyên liệu là củ tươi ngay sau thu hoạch sẽ khó thực hiện nếu sản xuất ở quy mô lớn. Vậy, từ nguồn nguyên liệu quý trong nước, nghiên cứu chế biến như thế nào để có thể áp dụng được ở quy mô công nghiệp, thu được sản phẩm an toàn, hiệu quả làm nguyên liệu bào chế thuốc nhằm ứng dụng rộng rãi trong phòng và chữa bệnh là vấn đề cấp thiết cần được giải đáp. Từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến Hắc phụ, Bạch phụ và bào chế cao Phụ tử ở quy mô pilot” được tiến hành nghiên cứu với 2 mục tiêu sau: - Xây dựng được quy trình chế biến Hắc phụ, Bạch phụ và bào chế cao Phụ tử ổn định ở quy mô pilot an toàn làm nguyên liệu sản xuất thuốc. - Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở của Hắc phụ, Bạch phụ và cao Phụ tử. Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài đã thực hiện các nội dung sau: 1. Xây dựng quy trình chế biến Hắc phụ, Bạch phụ và bào chế cao Phụ tử an toàn. - Nghiên cứu chế biến Hắc phụ, Bạch phụ, bào chế cao Phụ tử. - Nghiên cứu hàm lượng alcaloid trong các mẫu nghiên cứu. 2. Nghiên cứu tác dụng sinh học: - Thử độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của Hắc phụ, Bạch phụ và cao Phụ tử. - Nghiên cứu tác dụng trên tim cô lập của Hắc phụ, Bạch phụ và cao Phụ tử. 3. Xây dựng Tiêu chuẩn cơ sở của Phụ tử, Hắc phụ, Bạch phụ và cao Phụ tử. 7 Chương I. TỔNG QUAN 1.1. THỰC VẬT HỌC CHI ACONITUM L. VÀ NGUỒN GỐC CÂY Ô ĐẦU TRỒNG Ở SA PA 1.1.1. Phân loại chi Aconitum L. Chi Ô đầu (Aconitum L.) là một chi cây thuốc nổi tiếng, lần đầu tiên được nhà thực vật học Carl Linnaeus xác lập năm 1753. Theo các nhà hệ thống học thực vật gần đây như Takhtajan (1987), Cronquist (1981), Young (1982), chi Aconitum L. thuộc họ Hoàng liên (Ranunculaceae), bộ Hoàng liên (Ranunculales), phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae), lớp Mộc lan (Magnoliopsida), ngành Mộc lan (Magnoliophyta) [1], [4], [43]. Đề cập về phân loại chi Aconitum L. trên thế giới, dường như đã đạt được sự đồng thuận trong việc sắp xếp chi này thành 3 phân chi (subgenera) [41], [81], [130], [142] như sau: - Phân chi Aconitum L.: Cây thảo, sống hai năm [41], giả một năm [81], có rễ củ [41], [81]. Đài hoa không hoặc gần như không có móc; lá đài trên hình mũ, hình thuyền hoặc cong hình lưỡi liềm, hiếm khi hình trụ. Phiến cánh hoa có mô tiết ở đỉnh hoặc rìa; môi rõ hoặc không; cựa ngắn hoặc dài, hiếm khi vắng mặt. Lá noãn 3-5(-9) [81]. - Phân chi Lycoctonum (de Candolle) Petermann: Cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ [41], [81]. Đài hoa không có móc; lá đài trên hình trụ hoặc hình mũ cao, hiếm khi hình thuyền. Phiến cánh hoa có mô tiết ở đỉnh, có cựa hình túi hoặc uốn cong; môi thường thẳng hoặc rất ngắn. Lá noãn 3(-8) [81]. - Phân chi Gymnaconitum (Stapf) Rapaics: Cây thảo, sống một năm [41], [81]. Lá chia 3 phần hình chân vịt. Đài hoa có móc, lá đài trên hình thuyền. Cánh hoa không có cựa; môi rộng, hình quạt, rìa có răng. Lá noãn 613 [81]. 8 Gần đây, Kadota (2001) bổ sung thêm phân chi thứ 4 là Tangutica (W.T.Wang) Kadota và loài mới A. qinghaiense Kadota [74]. Tuy nhiên, sau đó, một số tác giả khác đã xếp phân chi này là một nhóm (series) thuộc phân chi Aconitum L. [142]. 1.1.2. Tính đa dạng của chi Aconitum L. Aconitum L. là một chi lớn, những năm gần đây không ngừng được bổ sung những loài mới [73], [74], [75], [142]. Trong cuốn “Trung Quốc cao đẳng thực vật đồ giám” (1972) [146], các nhà thực vật học đã mô tả 27 loài có ở Trung Quốc; Nhưng đến năm 1979, trong “Thực vật chí Trung Quốc” đã mô tả ở Trung Quốc có tới 162 loài [140]. “Thực vật chí Đài Loan” (1996) đã đề cập chi Aconitum L. trên toàn thế giới có khoảng 300 loài, trong đó, ở Trung Quốc có 167 loài [126]. Trong khi đó “Thực vật chí Quảng Tây” (1991) ghi trên thế giới có 350 loài, Trung Quốc có 170 loài và ở Quảng Tây chỉ có 2 loài (A. sinomontanum Nakai và A. carmichaelii Debx.) [137]. Năm 2000, “Thực vật chí Vân Nam” lại ghi ở Trung Quốc có 208 loài, ở Vân Nam có 66 loài và trong đó cũng có loài A. carmichaelii Debx. [147]. Gần đây nhất (2001), bộ “Thực vật chí Trung Quốc” đã cho biết trên thế giới có 400 loài, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới Bắc Bán cầu và riêng ở Trung Quốc có tới 211 loài (trong đó có 166 loài đặc hữu) [81]. Nếu kể cả những taxon dưới loài thì ở Trung Quốc có tới 365 taxon khác nhau [66] và trên thế giới có 845 taxon [67]. Song, loài đặc hữu A. fletcheranum G. Taylor ở Himalaya hiện đã trở nên hiếm gặp, có nguy cơ bị tuyệt chủng [99]. Tuy nhiên, có một vài loài có thể do tác động của điều kiện môi trường (khí hậu, thổ nhưỡng…) có đặc điểm hình thái bên ngoài hơi khác nhau, nhưng qua nghiên cứu về mặt di truyền học, các nhà khoa học đã xếp gộp lại với nhau. Ví dụ như A. delavayi Franch. và A. stapfianum Hand.-Mazz. [130]; A. noveboracense A. Gray và A. columbianum Nutt. [49]; A. acutiusculum 9 H.R. Fletcher & Lauener và A. acutiusculum var. aureopilosum W.T. Wang [125]. 1.1.3. Nguồn gốc cây Ô đầu trồng ở Sa Pa – Lào Cai hiện nay Cây Ô đầu trồng ở Việt Nam hiện nay có xuất xứ nhập nội từ hai nguồn: Nguồn thứ nhất do ngành y tế chính thức nhập giống từ Trung Quốc [2], được trồng đầu tiên ở Sa Pa từ những năm đầu của thập kỷ 70 của thế kỷ trước, còn được trồng ở Bắc Hà (tỉnh Lào Cai), Sìn Hồ (tỉnh Lai Châu). Nguồn thứ hai do cộng đồng người Hoa ở huyện Quản Bạ và Đồng Văn (tỉnh Hà Giang) tự động nhập giống Ô đầu từ bên kia biên giới về trồng ở vườn gia đình và nương rẫy [2]. Có tài liệu cho rằng cây Ô đầu Việt Nam mọc hoang ở vùng cao tỉnh Lào Cai, Hà Giang, Nghĩa Lộ [8], [9], [19]. Tuy nhiên, một số tác giả khác cho rằng chỉ có ở thung lũng Tà Cố Y thuộc xã Chế Cu Nha, huyện Mù Cang Chải, tỉnh Nghĩa Lộ (cũ) có cây Ô đầu mọc trong trạng thái hoang dại. Thực chất những cây này trước đó vốn được nhân dân trồng, khi người dân bỏ đi, cây trở nên hoang dại hoá [2]. Về tên khoa học của cây Ô đầu ở Việt Nam, theo một số tài liệu hiện có, cây được ghi nhận bởi hai tên là A. fortunei Hemsl. [2], [3], [8], [10], [11], [15], [16], [17], [19], [29], [135] và A. carmichaelii Debx. [9], [14], [20], [25], [28]. Dược điển Việt Nam III nêu cả hai loài trên trong hai chuyên luận “Ô đầu” (A. fortunei Hemsl.) và “Phụ tử” (A. carmichaelii Debx.) [7], [13]. 1.2. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CHI ACONITUM L. VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH ALCALOID CỦA CHI NÀY 1.2.1. Thành phần hoá học chi Aconitum L. Đến nay, đã có tới hàng trăm công trình nghiên cứu về thành phần hoá học của trên 96 loài thuộc chi Aconitum L. [133]. Thành phần hoá học chính 10 trong chi Aconitum L. là alcaloid, flavonoid, polysaccharid, ngoài ra còn có một số chất thuộc nhóm glycosid, sterol, acid hữu cơ,… [41], [42], [139]. 1.2.1.1. Alcaloid Các nhà nghiên cứu trên thế giới đã xác định được thành phần có hoạt tính sinh học mạnh nhưng độc tính cao thuộc nhóm alcaloid, trong đó được quan tâm nhiều nhất là các alcaloid diterpenoid. Một số tác giả đã phân lập được một số alcaloid thuộc các nhóm khác, đặc biệt là 1-benzyltetrahydroisoquinolin và aporphin là những alcaloid có hoạt tính sinh học mạnh [41]. a. Alcaloid diterpenoid Alcaloid diterpenoid là các alcaloid có độc tính cao và đặc trưng của chi Aconitum L. Căn cứ vào cấu trúc của khung diterpenoid, nhiều tác giả đã chia các alcaloid này thành 2 khung chính: Khung C19-diterpenoid alcaloid và C20-diterpenoid alcaloid [32], [38], [41], [149]. Gần đây, một số tác giả bổ sung thêm 2 khung ít gặp hơn: Khung C18-diterpenoid alcaloid [83], [136] (gồm 2 nhóm: Lappaconin và Ranaconin [142]) và khung Bisditerpenoid alcaloid [53], [142]. Cấu trúc chung của khung C18-, C19- và C20-diterpenoid alcaloid được nêu ở Hình 1.1 12 13 17 14 1 R 2 10 N 3 11 6 H 9 16 15 R 2 3 7 19 18 C18-diterpenoid [83] 13 17 10 11 N 6 H 9 16 11 12 13 16 20 1 15 8 5 4 17 14 1 8 5 4 12 R 7 18 C19-diterpenoid [136] 9 2 N 3 8 5 7 H 4 19 14 10 H 15 6 18 C20-diterpenoid [136] Hình 1.1. Khung diterpenoid alcaloid Aconitum Nếu căn cứ vào số liên kết ester vào khung diterpenoid, các alcaloid này lại được chia thành 3 nhóm [32]: 11 - Nhóm diester alcaloid: Trong phân tử có 2 nhóm ester liên kết vào khung diterpenoid, nhóm này có độc tính cao và có tác dụng giảm đau mạnh (aconitin, mesaconitin,...) [32], [115]. - Nhóm monoester alcaloid: Có 1 nhóm ester liên kết vào khung diterpenoid, có độc tính thấp hơn, có tác dụng giảm đau, chống viêm và chống động kinh mạnh (benzoylaconin, benzoylmesaconin,...) [32], [115]. - Nhóm alkamin: Không có dây nối ester trong phân tử, độc tính thấp hơn rõ rệt so với 2 nhóm trên, không ảnh hưởng đến hoạt động thần kinh nhưng có tác dụng chống loạn nhịp tim (aconin, mesaconin,...) [32], [115]. + C19-diterpenoid alcaloid Các alcaloid C19-diterpenoid được tìm thấy trong nhiều loài Aconitum spp. Theo Da-Yuan Zhu và cộng sự (1993), đã có trên 250 hợp chất đã được công bố [133]. Các tác giả đã chia C19-diterpenoid alcaloid thành 4 nhóm [136], [142]: Nhóm Aconitin (vị trí C7 không có nhóm OR), nhóm Lycoctonin (vị trí C7 có nhóm OR), nhóm Heteratisin (nhóm Lacton) và nhóm Pyrodelphinin (nhóm Pyro) (Hình 1.2). OR R OR OR N OR R OR N OR H R R Nhóm Aconitin OR Nhóm Lycoctonin O OR OR OR O R R N N OR R Nhóm Heteratisin (Lacton) R Nhóm Pyrodelphinin (Pyro) Hình 1.2. Cấu trúc hoá học chung các alcaloid C19-diterpenoid 12 - Nhóm Aconitin Nhóm này có thể chia thành 5 phân nhóm, các nhóm thế khác nhau sẽ cho các alcaloid khác nhau [136]. Công thức chung và một số alcaloid điển hình được trình bày ở Hình 1.3 và Bảng 1.1. R5 R1 12 17 1 R8 3 R2 N 4 19 H3CO 9 11 6 18 15 8 5 7 2' 3' 1' R6 14 10 2 16 13 R1' OCH3 4' O R2' R7 Vr = Veratroyl- (R1’ = R2’ = OCH3) R4 Ac = Acetyl- As = Anisoyl- (R1’ = H, R2’ = OCH3) Et = Ethyl- R3 Bz = Benzoyl- (R1’ = R2’ = H) Me = Methyl- Hình 1.3. Alcaloid nhóm Aconitin [38], [61], [136] Bảng 1.1. Một số alcaloid điển hình nhóm Aconitin Alcaloid R1 R2 R3 C(1) C(3) C(6) I. Phân nhóm Aconitin Aconitin OCH3 OH OCH3 Mesaconitin OCH3 OH OCH3 Hypaconitin OCH3 H OCH3 II. Phân nhóm Pseudaconitin Pseudaconitin OCH3 OH OCH3 Yunaconitin OCH3 OH OCH3 Indaconitin OCH3 OH OCH3 Faleoconitin OCH3 OH OCH3 Ludaconitin OCH3 OH OCH3 III. Phân nhóm Bikhaconitin Bikhaconitin OCH3 H OCH3 Crassicaulin A OCH3 H OCH3 Chasmaconitin OCH3 H OCH3 IV. Phân nhóm Neolin Falconericin OCH3 H OCH3 Falconerin OCH3 OH OCH3 Falconeridin OCH3 H OCH3 Neolin OH H OCH3 Senbusin OH H OH V. Phân nhóm Isotalatizidin Isotalatizidin OH H H R4 R5 R6 R7 C(8) C(13) C(14) C(15) R8 N OAc OH OAc OH OAc OH OBz OBz OBz OH OH OH Et Me Me OAc OAc OAc OAc OH OH OH OH OH OH OVr OAs OBz OVr OBz H H H H H Et Et Et CHO Et OAc OH OAc OH OAc OH OVr OAs OBz H H H Et Et Et OAc OH OH OH OH H H H H H OVr OVr OVr OH OH H H H H OH Et Et Et Et Et OH H OH H Et 13 - Nhóm Lycoctonin Cấu trúc hoá học một số chất điển hình được trình bày ở Hình 1.4. OCH3 Lycoctonin: R=H Anthranoyllycoctonin: R= -CO-C6H4-o-NH2 H3CO OCH3 Ajacin: R= -CO-C6H4-o-NHAc N H RO CO CH2 OH Lycaconitin: R= CO C6H4 o N OH OCH3 CO CH2 Avadharidin: R= -CO-C6H4-o-NH.CO.(CH2)2.CO.NH2 Hình 1.4. Alcaloid nhóm Lycoctonin [38], [41] - Nhóm Heteratisin (Lacton) và Pyrodelphinin (Pyro) Cấu trúc hoá học một số chất điển hình được trình bày ở Hình 1.5 và Hình 1.6. OH O OMe OMe O N OCH3 OR N OH HO H OR CH3O OCH3 Heteratisin: R = H Falaconitin: R = Vr Benzoylheteratisin: R = Bz Mithaconitin: R = Bz Hình 1.5. Alcaloid nhóm Heteratisin Hình 1.6. Alcaloid nhóm Pyrodelphinin (Lacton) [38], [96] (Pyro) [38], [136] + C20-diterpenoid alcaloid Các alcaloid C20-diterpenoid cũng được tìm thấy trong nhiều loài thuộc chi Aconitum L. Nhiều tác giả đã chia C20-diterpenoid thành 2 nhóm: Veatchin và Atisin [41], [97], [149]. Một số tác giả khác chia thành 7 nhóm: Atisin, Denudatin, Hetidin, Hetisin, Veatchin, Nappelin và Anopterin [142]. 14 - Nhóm Veatchin Cấu trúc hoá học một số chất điển hình được trình bày ở Hình 1.7. R1 OH 1 R3 2 3 19 12 11 17 20 9 10 5 N 8 14 16 15 6 H 4 13 7 OR2 18 Alcaloid R3 R1 R2 Norsongorin H O H Songorin C2H5 O H 15-Acetylsongorin C2H5 O Ac Napellin (luciculin) C2H5 H, α-OH H 12-Acetylnapellin C2H5 H, α-OAc H Lucidusculin C2H5 H, α-OH Ac Hình 1.7. Alcaloid nhóm Veatchin [41] - Nhóm Atisin Cấu trúc hoá học một số chất điển hình được trình bày ở Hình 1.8. 13 12 20 11 1 2 14 10 N 5 3 4 19 9 H 16 17 15 8 H N 7 6 HO CH2 O OH Công thức chung [149] Atisin [96] OH N H H 18 CH2 R Kobusin: R=H và Pseudokobusin: R=OH [149] Hình 1.8. Alcaloid nhóm Atisin [149] b. Alcaloid thuộc các nhóm khác Một số tác giả đã nghiên cứu tác dụng dược lý của các phân đoạn chiết từ Phụ tử và nhận thấy các phân đoạn này có những tác dụng rất khác nhau: tác dụng giống aconitin, tác dụng ức chế tim và tác dụng trợ tim. Khi Phụ tử được chế biến đun sôi với nước thì các alcaloid như aconitin giảm xuống và phần trung tính, không tan trong cloroform tăng lên, phần này có tác dụng trợ 15 tim. Tiếp tục nghiên cứu theo hướng này, các tác giả đã thu được chất có tác dụng lên hệ tim mạch từ Phụ tử hấp hơi nước ở 100-1300C trong 40 phút. Chất này không tan trong ether, cloroform, tan trong nước. Một thử nghiệm khác cũng phân lập được những chất có hoạt tính lên tim từ cao chiết nước của Phụ tử [41]. Các chất này không có cấu trúc diterpenoid đặc trưng của các loài Ô đầu, chúng bao gồm các isoquinolin và các amin. + Isoquinolin alcaloid - Nhóm Higenamin Higenamin, một alcaloid thuộc nhóm 1-benzyl-tetrahydroisoquinolin được phân lập từ A. japonicum Thunb. với lượng rất nhỏ (0,00007%) nhưng có tác dụng cường tim mạnh [41]. N-demethylcolletin và O-methylarmepavin, những alcaloid tương tự higenamin cũng được phân lập từ phần trên mặt đất của A. wardii H.R. Fletcher & Lauener var. wardii [41]. Một số chất điển hình thuộc nhóm này được trình bày ở Hình 1.9. R2O R1 R2 R3 R4 H H H H N-demethylcolletin CH3 H O-methylarmepavin CH3 Alcaloid R1O NR4 Higenamin CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 R3O Hình 1.9. Alcaloid nhóm Higenamin [41] - Nhóm Corydin Những alcaloid tương tự aporphin được phân lập từ một số loài Aconitum spp.: isoboldin từ phần trên mặt đất của A. karakolicum Rapaics, corydin và glaunidin từ phần trên mặt đất của A. wardii H.R. Fletcher & Lauener var. wardii; magnoflorin từ rễ củ của A. carmichaelii Debx., A. napellus L. và A. vulparia Reichb. [41]. Một số chất điển hình được trình bày ở Hình 1.10. 16 H3CO NR3 HO H3CO R1 N+CH3 HO H3CO O H3CO R2 Alcaloid R1 Isoboldin H Corydin OCH3 Magnoflorin OH H3CO R2 NR3 OH H H NCH3 NCH3 N+(CH3)2 Glaunidin Hình 1.10. Alcaloid nhóm Corydin [41] + Amin Trong khi nghiên cứu các thành phần có tác dụng lên hệ tim mạch, các tác giả nhận thấy cao methanol từ Phụ tử A. carmichaelii Debx. sau khi loại alcaloid bằng cloroform, phân đoạn tan trong nuớc có tác dụng tăng huyết áp mạnh. Các tác giả đã phân lập được dopamin metoclorid. Một số amin khác cũng được phân lập từ một số loài Aconitum spp. như: N-methyladrenalin từ rễ củ A. nasutum Fisch. ex Reichb.; noradrenalin, dopamin và tyramin từ rễ củ A. napellus L. và A. paniculatum Lam.; N-phenyl-β-naphthylamin từ phần trên mặt đất của A. karakolicum Rapaics [41]. Một số chất điển hình được trình bày ở Hình 1.11 CH2CH2NH2 R OH OH OH Tyramin NHPh N-phenyl-β-naphthylamin Dopamin R=CH2CH2NH2 Dopamin metoclorid (corynein clorid) Noradrenalin R=CH2CH2N+(CH3)3.ClR=CH(OH)CH2NH2 N-methyladrenalin R=CH(OH)CH2N(CH3)2 Hình 1.11. Cấu trúc hoá học một số amin [41] 17 c. Hàm lượng alcaloid trong một số loài thuộc chi Aconitum L. Hàm lượng alcaloid toàn phần, nhóm diester alcaloid cũng như các alcaloid trong Ô đầu, Phụ tử khác nhau, tuỳ thuộc vào loài, thời kỳ thu hái, bộ phận dùng cũng như vùng trồng. Đối với cây A. carmichaelii Debx. trồng ở Hokkaido và Ibaraki (Nhật Bản), vào thời kỳ ra hoa, hàm lượng alcaloid trong Ô đầu giảm dần, trong khi đó hàm lượng của aconitin và mesaconitin trong Phụ tử tăng dần [110]. Nhiệt độ môi trường trồng cây cũng ảnh hưởng đến hàm lượng alcaloid, ở nhiệt độ 150C hàm lượng aconitin tăng cao nhất trong khi mesaconitin và hypaconitin cho hàm lượng ở 200C cao hơn ở 10 và 150C [101]. Hàm lượng alcaloid toàn phần trong Phụ tử trồng cao hơn trong Phụ tử mọc tự nhiên, trong Phụ tử chế Trung Quốc thấp hơn trong Phụ tử chế Nhật Bản, trong khi đó, hàm lượng hypaconitin trong Phụ tử chế Trung Quốc cao hơn trong Phụ tử chế Nhật Bản [112]. Hàm lượng alcaloid toàn phần, diester alcaloid và một số alcaloid chính trong một số loài thuộc chi Aconitum L. được trình bày ở Bảng 1.2. Bảng 1.2. Hàm lượng alcaloid trong một số loài thuộc chi Aconitum L. Tài liệu Tên, bộ AlcTP Diester Địa phương Một số alcaloid chính tham phận (%) alc (%) khảo (1) (2) (3) (4) (5) (6) A. carmichaelii Debx. [41], Hypaconitin (0,179%), [119], 0,82- 0,07mesaconitin (0,027%), Trung Quốc 1,56 0,17 deoxyaconitin (0,013%), [139], Phụ tử [141] aconitin (0,003%) Mesaconitin (0,4%), Tứ Xuyên 0,77 [41] hypaconitin, aconitin Hypaconitin (0,1%), Shensi 0,32 aconitin, talatisamin, [41] Xuyên chuanwu base A, B ô Aconitin, mesaconitin, Đài Loan 0,58 0,27 [41] hypaconitin 18 (1) Ô đầu Thảo ô (2) Nhật Bản (Hokkaido) Nhật Bản, (Honshu) (3) 1,041,1 1.091.32 Đài Loan 0,41 (4) 0,2 (5) Mesaconitin, aconitin, hypaconitin Mesaconitin, aconitin, hypaconitin Aconitin, mesaconitin, hypaconitin (6) [41] [41] [41] A. kusnezoffii Reichb. Bắc Ô đầu 0,7Trung Quốc 1,3 Bắc Thảo ô Nội Mông Cổ 0,3 Mesaconitin, hypaconitin, aconitin, yunaconitin, jesaconitin Mesaconitin (0,051%), aconitin (0,017%), beiwutin, hypaconitin, deoxyaconitin [41] [41] A. brachypodum Diels Củ Vân Nam 1,25 Bullatin A, neolin, aconitin [41] 1,3 Bullatin A và D, neolin, 14-acetylneolin, aconitin [41] A. nagarum Stapf Củ Vân Nam A. coreanum (H. Lév.) Rapaics 0,8Quan Trung Quốc 2,13 Bạch phụ Liêu Ninh 0,97 A. episcopale H. Lév. Củ Vân Nam 2,2 Thân, Vân Nam 0,58 lá A. forrestii Stapf Củ Vân Nam 0,42 A. vilmorinianum Kom. Củ Vân Nam 0,43 A. pterocaule Koidz. var. pterocaule Thân rễ Kiangsi 4 [41] Guanfu base A (0,17%), guanfu base B, C, D, E [41] Delavaconitin (1,54%) [41] Delavaconitin (0,43%) [41] Foresaconitin (0,2%) [41] Vilmorinianin A và B [41] Delsolin (0,21%), avadcharidin, lycoctonin [41] 19 (1) (2) (3) A. karakolicum Rapaics Củ Kungey (Kirgiz) 1,23 Terskey (Kirgiz) 1,64 (4) A. wardii H.R. Fletcher et Lauener Kazakh 2,52 Talasskiy 4,9 Thân rễ (Kirgiz) Tyan’ Shan’ 3 (Kirgiz) A. chasmanthum Stapf Củ Ấn Độ 4,5 (5) Karacolin (0,27%), songorin, napellin, karakolidin Songorin (0,49%), aconitin (0,44%), sogoramin (0,03%) (6) [41] [41] [41] Mesaconitin [41] Lappaconitin (1,6%) [41] [44] 1.2.1.2. Flavonoid Các công trình nghiên cứu về flavonoid trong chi Aconitum L. không nhiều. Các tác giả đã phân lập được một số flavonoid glycosid từ phần trên mặt đất và hoa của một số loài: A. noveboracense A. Gray và A. columbianum Nutt. [127], A. chiisanense Nakai [71], A. paniculatum Lam. [56], A. napellus L. subsp. neomontanum (Wulfen) Gáyer [57] và một số loài Aconitum spp. khác [52], [58], [102], [109]. Các flavonoid trên đều là những dẫn chất của kaempferol và quercetin, một số chất có tác dụng chống oxy hoá và quét gốc tự do [42]. 1.2.1.3. Polysaccharid Những năm gần đây, một số tác giả đã quan tâm tới nhóm hoạt chất polysaccharid của Phụ tử. Tomoda và cộng sự (1986) đã phân lập được 4 polysaccharid là aconitan A, B, C, D từ Phụ tử sống A. carmichaelii Debx. có tác dụng hạ glucose huyết. Cấu trúc của hoạt chất chính aconitan A đã được 20 xác định là α-(1→6)-D-glucopyranose, có trọng lượng phân tử 8700, [α]D = +1900 [114], [139]. Zhao và cộng sự (2006) cũng phân lập được một polysaccharid tan trong nuớc từ loài này đặt tên là FPS-1 có tác dụng kích thích miễn dịch. FPS1 có cấu trúc α-(1→6)-D-glucan, có trọng lượng phân tử 14000 [132]. 1.2.1.4. Một số thành phần khác - Glycosid: Fuzinosid (glycerol-2-O-β-D-galactofuranosy 1→3 β-Dgalactofuranosid) có tác dụng cường tim, được phân lập từ cao chiết nước của Phụ tử (A. carmichaelii Debx.) [143]; yokonosid glucosid [41]. - Acid coumaric glycosid [88] - Sterol: β-sitosterol, 24-ethylcholesterol [139]. - Acid hữu cơ: acid oleic, acid linoleic, acid palmitic, và acid trans-phydroxycinnamic, acid ferulic, acid aconitic, acid caffeic, acid chronogenic, acid citric, acid isocitric, acid itaconic, acid malic, acid quinic v.v... [139]. 1.2.2. Kiểm định alcaloid của chi Aconitum L. 1.2.2.1. Định tính alcaloid + Định tính bằng phản ứng hoá học: Bằng các thuốc thử chung của alcaloid: TT Mayer, TT Bouchardat, TT Dragendorff [7], [17]. + Định tính bằng sắc ký lớp mỏng: Định tính alcaloid trong Ô đầu, Phụ tử và kiểm tra giới hạn aconitin [7], [17]. + Định tính bằng quang phổ tử ngoại: Dược điển Việt Nam, Trung Quốc, Hàn Quốc và nhiều tài liệu quy định phương pháp định tính alcaloid trong Ô đầu, Phụ tử bằng phương pháp quang phổ tử ngoại: Kiềm hoá dược liệu, chiết xuất alcaloid bằng ether, chiết lại alcaloid bằng dung dịch H2S04 0,5N, quét phổ UV trong khoảng bước sóng 200-300nm. Phổ UV alcaloid trong Ô đầu và Phụ tử sống cho hấp thụ cực đại ở bước sóng λmax = 231nm [113], phổ UV alcaloid trong Phụ tử chế cho hấp thụ cực đại ở hai bước sóng λmax1 = 231nm và λmax2 = 274nm [7], [50], [113]. 21 1.2.2.2. Định lượng a. Định lượng alcaloid toàn phần: Theo phương pháp acid-base [7], [113]. b. Định lượng diester alcaloid: Diester alcaloid là nhóm chất có độc tính cao nhất của chi Aconitum L., các phương pháp chế biến đều làm giảm đáng kể hàm lượng diester alcaloid. Nhóm này dễ hoà tan trong ether, vì vậy, trước đây người ta đã định lượng alcaloid hoà tan trong ether để biểu thị độc tính của Ô đầu [141]. DĐTQ (2005) quy định giới hạn diester alcaloid trong Xuyên ô chế, Thảo ô chế được định lượng bằng phương pháp đo độ hấp thụ, không được vượt quá 0,15% tính theo aconitin [113]. c. Định lượng aconitin và một số alcaloid khác * Giới hạn aconitin trong Phụ tử chế: Xác định bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Giới hạn aconitin trong Phụ tử chế không được vượt quá 0,017% [7], [113]; 0,02% [50]. * Định lượng aconitin và một số thành phần alcaloid khác: Một số phương pháp đã được xây dựng để định lượng aconitin và các alcaloid trong Ô đầu, Phụ tử và các sản phẩm như: - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [47], [64] [69], [82], [121], [138]. - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) [72], [80]. - Phương pháp điện di mao quản - khối phổ (CE-MS) [55]. - Phương pháp sắc ký khí - khối phổ (GC-MS) [70] … 1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ ĐỘC TÍNH Phụ tử rất độc nhưng đã được nhân dân chế biến để sử dụng làm thuốc từ lâu đời. Các nhà khoa học đã công bố nhiều tác dụng của Phụ tử chế có giá trị để vận dụng điều trị nhiều chứng bệnh và làm sáng tỏ kinh nghiệm chữa bệnh của nhân dân. 22 1.3.1. Tác dụng lên hệ tim mạch 1.3.1.1. Tác dụng lên lực co bóp cơ tim Phụ tử chế là vị thuốc “hồi dương cứu nghịch”, được sử dụng để cấp cứu suy tuần hoàn cấp, suy tim, do đó đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng cường tim của vị thuốc này [143], [145]. Kết quả nghiên cứu trên thực nghiệm cho thấy nước sắc Phụ tử có tác dụng tăng lực co cơ tim đối với tim cô lập bình thường hoặc trên mô hình gây suy tim ở động vật máu lạnh (ếch, cóc) và động vật máu nóng (chuột cống trắng, thỏ) [18], [68], [139], [141], [144]. Bằng đường tiêm tĩnh mạch, nước sắc Phụ tử cũng gây tăng biên độ co của tim ở chó và mèo, đặc biệt ở mèo bị suy tim thì nước sắc Phụ tử có tác dụng tăng co bóp tim mạnh hơn [141]. Theo một số tác giả, thành phần có hoạt tính tăng co bóp tim của Phụ tử là phân đoạn hòa tan trong nước [18], [139]. Kéo dài thời gian sắc không làm giảm tác dụng tăng co bóp tim, mà chỉ làm giảm hoặc mất tác dụng phụ gây loạn nhịp tim của thuốc. Tác dụng tăng co bóp tim có thể do tác động trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua sự kích thích β-adrenergic [139]. Nước sắc sản phẩm Xuyên ô (A. carmichaelii Debx.) sống và chế, Thảo ô (A. kusnezoffii Reichb.) chế đều có tác dụng tăng co bóp đối với tim ếch cô lập. Liều cao gây loạn nhịp tim, ức chế tim [139], [141]. Theo một số tác giả, thành phần có tác dụng tăng co bóp tim của Phụ tử gồm chủ yếu các chất higenamin (demethylcoclaurin), corynein clorid, salsolinol, uracil … [94], [139], [143], [144]. Higenamin ở nồng độ 0,001-1µg/ml gây tăng rõ rệt lực co bóp và tăng cung lượng tim cóc, thỏ, chuột và tim chó cô lập… [41], [139], [148]. Tiêm tĩnh mạch chó đã được gây mê, higenamin gây tăng lực co bóp tâm thất trái, giảm sức cản của động mạch não, động mạch vành và động mạch ngoại vi. Higenamin có tác dụng càng rõ rệt đối với tim suy [139], tăng tưới máu cho cơ tim thiếu máu [144]. Đối với chó và mèo bị suy tim, higenamin tiêm tĩnh 23 mạch có tác dụng tăng cung lượng tim và khôi phục áp lực của thất trái về gần mức bình thường. Đối với chó bị sốc do nội độc tố, thuốc này cũng cải thiện được rõ rệt sự giảm của cung lượng tim và tần số tim v.v… Đối với những tế bào cơ tim nuôi cấy, higenamin có thể làm tăng biên độ của sự co tế bào và tăng nhanh tần số co [139]. Tác dụng tăng lực co cơ tim ếch của dạng đồng phân tả tuyền (-)-higenamin mạnh hơn đồng phân hữu tuyền (+)-higenamin [41]. Theo một số tác giả, tác dụng của higenamin lên tim thông qua kích thích thụ thể β-adrenergic, tương tự cơ chế tác dụng của dobutamin, cả hai đều làm tăng tần số tim, tăng dẫn truyền nhĩ thất, tăng lực co cơ tim. Tuy nhiên, higenamin còn thông qua kích thích thụ thể β2-adrenergic ở mạch máu làm giãn mạch và giảm huyết áp nhẹ, còn dobutamin chủ yếu kích thích β1adrenergic [148]. Corynein clorid ở nồng độ 3µg/ml có tác dụng làm tăng tần số và biên độ co bóp tim chuột lang cô lập [78]. Salsolinol cũng có tác dụng cường tim thông qua kích thích thụ thể β-adrenergic [144]. Gần đây, Xu và cộng sự (2004) đã phân lập từ Phụ tử (A. carmichaelii Debx.) ở Tứ Xuyên, Trung Quốc thành phần mới fuzinosid có tác dụng cường tim rõ rệt khi thử nghiệm trên tim cô lập hay tại chỗ [143]. 1.3.1.2. Tác dụng chữa tim thiếu máu, thiếu oxy Nước sắc và dịch tiêm Phụ tử có tác dụng kéo dài thời gian chịu đựng thiếu oxy của chuột nhắt trắng, bảo vệ cơ tim thiếu oxy cấp. Đối với chuột cống trắng ở trạng thái bị kích ứng dưới nước lạnh, nước sắc Phụ tử có tác dụng bảo vệ cơ tim khỏi bị tổn thương do sự kết tập tiểu cầu khi catecholamin nội sinh tiết ra nhiều [139]. Guanfu base A có thể nâng cao khả năng chịu đựng sự thiếu dưỡng khí, kéo dài thời gian sống của động vật thực nghiệm [139]. 1.3.1.3. Tác dụng lên nhịp tim + Tác dụng gây loạn nhịp