Tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid từ nguồn curcuminoid chiết xuất trong nước

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƢỢNG NGHIÊN CỨU D NG QU TR NH BÁN TỔNG HỢP TETRAHYDROCURCUMINOID TỪ NGUỒN CURCUMINOID CHIẾT XUẤT TRONG NƢỚC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƢỢNG NGHIÊN CỨU D NG QU TR NH BÁN TỔNG HỢP TETRAHYDROCURCUMINOID TỪ NGUỒN CURCUMINOID CHIẾT XUẤT TRONG NƢỚC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THU C MÃ S : 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trải qua hai năm học cao học đƣợc sự giúp đỡ tận tình của các thầy giáo, cô giáo, gia đình cùng bạn bè, tôi đã hoàn thành khóa học và Luận văn Thạc sỹ Dƣợc học của mình. Với tất cả sự kính trọng, trƣớc tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS. TS. Nguyễn Đình Luyện đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi nghiên cứu và thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Văn Hải, ThS. Nguyễn Văn Giang, DS. Nguyễn Thị Vân và CN. Phan Tiến Thành đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học và thực hiện Luận văn. Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo thuộc bộ môn Công nghiệp Dƣợc, cũng nhƣ các thầy cô trong trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các thầy cô của Phòng Sau Đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này và đã dạy bảo tôi tận tình trong suốt hai năm học. Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, đặc biệt là bố mẹ tôi và lời cảm ơn chân thành đến bạn bè tôi, là nguồn động lực không thể thiếu, luôn bên tôi giúp đỡ tôi suốt thời gian đi học và trong suốt quá trình thực hiện đề tài Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học. Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Phƣợng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN .........................................................................................2 1.1. TỔNG QUAN VỀ CURCUMINOID ..................................................................2 1.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất ............................................................................2 1.1.2. Tác dụng dƣợc lý...............................................................................................6 1.1.3. Phƣơng pháp tách hỗn hợp curcuminoid ........................................................10 1.2. TỔNG QUAN VỀ TETRAHYDROCURCUMINOID .....................................11 1.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất ..........................................................................11 1.2.2. Nguồn gốc tetrahydrocurcumin ......................................................................12 1.2.3. Tác dụng dƣợc lý.............................................................................................12 1.2.4. Tổng quan về các phƣơng pháp bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid ..........14 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................18 2.1. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ ................................................................18 2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu ...............................................................18 2.1.2. Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu ......................................................19 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..............................................................................20 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................20 2.3.1. Phƣơng pháp tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid ....................20 2.3.2. Bán tổng hợp hóa học: ....................................................................................20 2.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết .....................................................................................21 2.3.4. Xác định cấu trúc sản phẩm ............................................................................21 2.3.5. Thử tác dụng chống oxy hóa của các chất bán tổng hợp đƣợc ......................21 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................22 3.1. TÁCH CÁC CURCUMIN I, II, III TỪ HỖN HỢP CURCUMINOID .............22 3.2. KHỬ HÓA TỪNG CURCUMINOID THÀNH PHẦN ....................................26 3.2.1. Khử hóa curcumin I (curcumin) ......................................................................26 3.2.2. Khử hóa curcumin II (DMC) ..........................................................................34 3.3. KHỬ HÓA HỖN HỢP CURCUMINOID .........................................................41 3.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC ...................................................................................46 3.4.1. Xác định cấu trúc curcumin I (curcumin) .......................................................46 3.4.2. Xác định cấu trúc curcumin II (DMC) ............................................................48 3.4.3. Xác định cấu trúc THC I (THC) .....................................................................50 3.4.4. Xác định cấu trúc THC II ................................................................................53 3.5. THỬ TÁC DỤNG CH NG OXY HÓA CỦA CÁC CHẤT BÁN TỔNG HỢP ĐƢỢC .......................................................................................................................54 Chƣơng 4: BÀN LUẬN ...........................................................................................56 4.1. Về phƣơng pháp tách từng thành phần từ hỗn hợp curcuminoid.......................56 4.2.Về phản ứng khử hóa từng curcuminoid thành phần ..........................................56 4.3. Về phản ứng khử hóa curcuminoid hỗn hợp ......................................................58 4.4. Về xác định cấu trúc ..........................................................................................59 4.5. Về tác dụng sinh học ..........................................................................................63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................64 1. Kết luận ………………………………………………………………………. 64 2. Kiến nghị ………………………………………………………………………..64 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AcOH Acid acetic AOM Azoxymethan APPH 2,2-azobis(2-amidinopropan)dihydroclorid BDMC Bisdemethoxycurcumin 13 13 C-NMR C - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13C) CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử DMC Demethoxycurcumin DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl đvC Đơn vị carbon EtOH Ethanol H Giờ HHC Hexahydrocurcumin HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human immunodeficiency virus) 1 H-NMR 1 H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography) Hpƣ Hiệu suất phản ứng EC50 Nồng độ tại đó có tác dụng với 50% đối tƣợng thử (Effective concentration at 50%) IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) KL, m Khối lƣợng LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low – density lipoprotein) MeOH Methanol MS Phổ khối lƣợng (Mass spectrometry) OD Mật độ quang (Optical density) OHC Octahydrocurcumin P Áp suất Rf Hệ số lƣu giữ (Retension factor) SKLM Sắc ký lớp mỏng sp, SP Sản phẩm TBA Acid 2-thiobarbituric THC Tetrahydrocurcumin Tonc Nhiệt độ nóng chảy T Thời gian TLTK Tài liệu tham khảo V Thể tích xt Xúc tác DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số tính chất vật lý của các curcuminoid ..............................................2 Bảng 1.2. Một số tính chất vật lý của các tetrahydrocurcuminoid............................12 Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu.........................................................18 Bảng 2.2. Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu ...............................................19 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của dung môi, nhiệt độ và thời gian kết tinh đến quá trình kết tinh curcuminoid ............................................................23 Bảng 3.2. Kết quả kết tinh curcuminoid 3 lần trong EtOH 96% ..............................24 Bảng 3.3. Kết quả tách các curcuminoid thành phần từ hỗn hợp curcuminoid bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1 ....25 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng bán tổng hơp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C ..27 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C ..28 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là Zn/acid ...........30 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là Zn/HCl ...31 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ mol kẽm/curcumin đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC từ curcumin với tác nhân khử là Zn/HCl ....31 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ DMC với tác nhân khử là H2/Pd/C ............................35 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ DMC với tác nhân khử là H2/Pd/C ....36 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ DMC với tác nhân khử là Zn/acid .....................................38 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ DMC với tác nhân khử là Zn/HCl ......................39 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ mol kẽm/curcumin II đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ Curcumin II với tác nhân khử là Zn/HCl ....................................................................................................................40 Bảng 3.14. Kết quả tách các tetrahydrocurcuminoid từ hỗn hợp sản phẩm bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1 ..........43 Bảng 3.15. Kết quả tách các tetrahydrocurcuminoid từ hỗn hợp sản phẩm bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat.............................45 Bảng 3.16. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của curcumin .........................47 Bảng 3.17. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của curcumin .47 Bảng 3.18. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) của curcumin ...................................................................................................................................48 Bảng 3.19. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của DMC ...............................48 Bảng 3.20. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 & MeOD) của DMC ...................................................................................................................................49 Bảng 3.21. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3 & MeOD) của DMC ...................................................................................................................................49 Bảng 3.22. Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của THC (khử thành phần) .................50 Bảng 3.23. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của THC (khử thành phần) ....51 Bảng 3.24. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của THC (khử thành phần).................................................................................................51 Bảng 3.25. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của THC (tách từ khử hỗn hợp) ...................................................................................................................................52 Bảng 3.26. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của THC (tách từ khử hỗn hợp)..........................................................................................52 Bảng 3.27. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của THC II .............................53 Bảng 3.28. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) của THC II ..........53 Bảng 3.29. Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tƣ do của các mẫu thử theo phƣơng pháp DPPH ................................................................................................55 DANH MỤC CÁC H NH VẼ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của curcuminoid ............................................................2 Hình 1.2. Phản ứng amin hóa β-diceton của curcumin ...............................................3 Hình 1.3. Dạng hỗ biến ceto – enol của curcumin trong dung dịch ...........................3 Hình 1.4. Dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch............................................4 Hình1.5. Sự phân hủy curcumin trong môi trƣờng kiềm ............................................5 Hình 1.6. Công thức cấu tạo của tetrahydrocurcuminoid .........................................11 Hình 1.7. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin tạo thành tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, octahydrocurcumin dùng xt Pd/C ............................15 Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin tạo thành tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, octahydrocurcumin dùng xt Pt/C .............................15 Hình 1.9. Sơ đồ phản ứng khử hóa các curcuminoid tạo thành các tetrahydrocurcuminoid tƣơng ứng dùng xúc tác Zn-NiCl2 sử dụng kĩ thuật siêu âm trong dung môi EtOH-H2O ...........................................................16 Hình 3.1. Sơ đồ tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid ..........................22 Hình 3.2. SKLM của các curcuminoid thành phần ...................................................26 Hình 3.3. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân H2/Pd/C ........................26 Hình 3.4. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân Zn/H+ ............................29 Hình 3.5. SKLM của THC trên hệ dung môi CH2Cl2: MeOH = 20:1 ......................33 Hình 3.6. SKLM của THC trên hệ dung môi AcOEt: n-hexan = 7:3 .......................33 Hình 3.7. Sơ đồ phản ứng khử hóa DMC với tác nhân H2/Pd/C ..............................34 Hình 3.8. Sơ đồ phản ứng khử hóa DMC với tác nhân Zn/H+ ..................................37 Hình 3.9. SKLM của THC II trên hệ dung môi CH2Cl2: MeOH = 20:1 ..................41 Hình 3.10. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcuminoid với tác nhân H2/Pd/C ................42 Hình 3.11. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcuminoid với tác nhân Zn/H+.....................43 Hình 3.12. SKLM của THC trên hệ dung môi CH2Cl2: MeOH = 20:1 ....................46 Hình 3.13. SKLM của THC II trên hệ dung môiCH2Cl2: MeOH = 20:1..................46 Hình 3.14. Cấu trúc enol và liên kết hydro của phân tử curcumin I .........................60 Hình 3.15. Dạng hỗ biến ceto-enol của tetrahydrocurcumin ....................................61 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ xa xƣa, củ nghệ đã đƣợc sử dụng phổ biến ở một số nƣớc châu Á nhƣ một thứ gia vị chính giúp điều hƣơng, tạo mùi vị và màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm. Không những thế, nghệ còn đƣợc biết đến nhƣ một loại thuốc quý dùng để trị mụn nhọt, làm liền sẹo, làm lành vết thƣơng,… và đặc biệt dùng để chữa các bệnh có liên quan đến dạ dày. Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, ngƣời ta đã phát hiện ra nhóm chất màu curcuminoid – tuy chỉ chiếm tỉ lệ nhỏ nhƣng là nhóm hoạt chất chính tạo nên các tác dụng sinh học quan trọng của củ nghệ. Bên cạnh đó, khi xu hƣớng của thế giới ngày càng ƣa chuộng những sản phẩm từ thiên nhiên, việc phát triển những hoạt chất có nguồn gốc thảo dƣợc ngày càng trở thành mối quan tâm lớn đối với ngành Dƣợc Việt Nam, trong đó có nhóm chất màu curcuminoid. Curcuminoid là tên gọi chung của các chất mang khung diarylheptadien đƣợc phân lập từ thân rễ cây Nghệ vàng (Curcuma longa, họ Gừng - Zingiberaceae), bao gồm curcumin I (curcumin), curcumin II (demethoxycurcumin), curcumin III (bisdemethoxycurcumin) và một số chất khác. Các curcuminoid đƣợc nghiên cứu và chứng minh với các tác dụng dƣợc lý nhƣ: chống lại quá trình đông máu, chống viêm, chống oxy hóa và chống ung thƣ...[2][8][9][27]. Tuy nhiên, các curcuminoid có màu vàng và rất khó rửa sạch, nên nhu cầu sử dụng của các curcuminoid bị hạn chế, đặc biệt trong mỹ phẩm. Sản phẩm khử hóa của curcuminoid là tetrahydrocurcuminoid có những ƣu điểm là không màu nên đƣợc sử dụng rộng rãi hơn trong mỹ phẩm. Mặt khác tetrahydrocurcumin còn đƣợc chứng minh có hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa tốt hơn curcumin [18][19][22][24][25]. Chính vì thế, việc nghiên cứu khử hóa curcuminoid thành tetrahydrocurcuminoid là một hƣớng có triển vọng trong mỹ phẩm và dƣợc phẩm. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid từ nguồn curcuminoid chiết xuất trong nước” Với những mục tiêu sau:  án tổng hợp tetrahydrocurcuminoid ở quy mô phòng thí nghiệm;  Thử tác dụng chống oxy hóa của các chất bán tổng hợp đƣợc. 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CURCUMINOID 1.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất Cấu trúc hóa học: Nhóm chất màu curcuminoid là hỗn hợp của 3 chất - thành phần quan trọng nhất của củ nghệ vàng (Curcuma longa, họ Gừng - Zingiberaceae), có công thức cấu tạo nhƣ hình 1.1. Hình 1.1. Công thức cấu tạo của curcuminoid Tính chất vật lý: Một số tính chất vật lý của 3 chất có trong curcuminoid thể hiện ở bảng 1.1. [4] Bảng 1.1. Một số tính chất vật lý của các curcuminoid Curcumin II Curcumin III Curcumin I (Desmethoxy-curcumin) (Bisdesmethoxy(Curcumin) (1) (2) curcumin) (3) 1,7-Bis-(4-hydroxy 1-(4-hydroxyphenyl)-71,7-Bis-(4-3-methoxyphenyl)(4-hydroxy-3hydroxyphenyl) -heptahepta-1,6-dien-3,51,6-dien-3,5-dion methoxyphenyl)heptadion 1,6-dien-3,5-dion CTPT C21H20O 6 C20H18O5 C19H16O4 PTL 368 338 308 Dạng thù hình Điểm chảy (oC) Tinh thể hình kim, Tinh thể hình kim, màu Tinh thể hình kim, màu màu vàng. vàng cam. vàng cam tím. 183 172 Điểm chảy của curcuminoid: 172 – 178 2 222 Tính chất hóa học:  Tính chất của nhóm polyphenol: - Tan trong dung dịch kiềm. - Tác dụng với các tác nhân oxy hóa: nhóm –OH hoạt hóa nhân thơm, làm nhân thơm nhạy cảm đối với các tác nhân oxy hóa, nên curcumin rất dễ bị oxy hóa [1]. - Tác dụng với dung dịch muối kim loại tạo phức chất có màu: với Fe3+ tạo phức màu xanh đen, với thiếc (Sn), kẽm (Zn), đồng (Cu), canxi (Ca), magnesi (Mg) tạo hợp chất có màu từ vàng cam đến nâu đen.  Tính chất của nhóm diceton: Trong môi trƣờng acid acetic, curcumin dễ phản ứng với các hợp chất có cấu trúc kiềm (Y-NH2) nhƣ hydroxylamin (Y = -OH), hoặc phenylhydrazin (Y = C6H5NH-) tạo sản phẩm lần lƣợt là 3,5-bis(3-methoxy-4-hydroxylstiryl)isoxazol và 3,5bis(3-methoxy-4-hydroxylstiryl)-1-phenylpirazol. Các sản phẩm này đều có hoạt tính kháng nấm và chống oxy hóa tốt [3]. Hình 1.2. Phản ứng amin hóa β-diceton của curcumin  Hiện tƣợng hỗ biến: Curcumin và các dẫn chất tồn tại trong dung dịch ở dạng cân bằng hỗ biến của dạng diceton đối xứng và dạng ceto – enol đƣợc ổn định bằng liên kết hydro nội phân tử. (Hình 1.4) [13]. Hình 1.3. Dạng hỗ biến ceto – enol của curcumin trong dung dịch 3 Trong dung dịch nƣớc, ở pH acid và trung tính, curcumin tồn tại chủ yếu dƣới dạng diceton; ngƣợc lại, ở pH > 8, dạng enol chiếm ƣu thế hơn 27. Tùy theo từng dung môi thích hợp, có thể có trên 95% curcumin tồn tại ở dạng enol [13].  Ảnh hƣởng của pH tới dạng tồn tại của curcuminoid trong dung dịch nƣớc (Hình 1.4) [13]. Động học của phản ứng thủy phân curcumin trong dung dịch nƣớc trong khoảng pH = 1 – 11 đã đƣợc nghiên cứu bằng phƣơng pháp HPLC. - Ở pH < 1, dung dịch nƣớc của curcumin có màu đỏ và tồn tại ở dạng ion H4A+. - Ở khoảng pH = 1 – 7, curcumin rất ít tan trong nƣớc. Ở khoảng pH này, dung dịch nƣớc của curcumin có màu vàng và tồn tại chủ yếu ở dạng trung tính H3A. - Ở pH > 7,5, dung dịch có màu đỏ, curcumin tồn tại ở các dạng ion H2A-, HA2- và A3- lần lƣợt tƣơng ứng với các giá trị pka là 7,8; 8,5 và 9,0. Hình 1.4. Dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch 4  Độ ổn định: Curcumin tƣơng đối ổn định ở pH acid, nhƣng nhanh chóng bị phân hủy ở pH>7. Các sản phẩm phân hủy curcumin ở pH = 7 – 10 đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HPLC. Các sản phẩm tạo thành ban đầu là acid ferulic và feruloylmethan, ngoài ra còn có các sản phẩm ngƣng tụ. Sau đó feruloylmethan nhanh chóng bị chuyển màu (chủ yếu là từ vàng đến vàng nâu) rồi bị phân hủy thành vanillin và aceton (Hình 1.5) [13]. Sản phẩm ngƣng tụ Hình1.5. Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm Đặc biệt, curcumin không bền dƣới tác dụng của ánh sáng, nhất là trong dung dịch. Sau khi chiếu bức xạ quang học, các sản phẩm đƣợc xác định giống nhƣ các sản phẩm phân hủy là acid ferulic, acid vanillic và vanillin [13]. 5 1.1.2. Tác dụng dƣợc lý Curcuminoid có rất nhiều tác dụng đã đƣợc chứng minh, có lợi cho việc phòng và điều trị bệnh. Một số tác dụng nổi bật là: - Tác dụng chống oxy hóa: Peroxynitrit (ONOO-) là chất trung gian có tính độc tế bào đƣợc tạo ra bởi phản ứng giữa anion superoxid (O2-) và oxyd nitric (NO). Các diarylheptanoid, curcumin I, curcumin II, curcumin III là những hoạt chất đƣợc phân lập từ Curcuma longa, có tác dụng quét peroxynitrit. Các hợp chất trên đã thể hiện hoạt tính quét peroxynitrit với IC50 lần lƣợt là 4,0; 6,4 và 29,7 μm [2]. Trong các nghiên cứu về sự bảo vệ quá trình peroxy hóa lipid, curcumin đã thể hiện sự ức chế mạnh (18 – 80%). Tùy thuộc liều dùng mà quá trình peroxy hóa lipid bị ức chế. Quá trình này gây bởi Fe-NTA (ferric nitrilotriacetat) và H2O2 đƣợc đo bằng sự hình thành malonyl dialdehyd (MDA) là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng sinh học trong các vi thể thận [2]. Theo nghiên cứu của Khopde và các cộng sự, tác dụng chống oxi hóa của curcuminoid gấp ít nhất 10 lần các chất chống oxy hóa khác thậm chí cả vitamin E [16]. - Bảo vệ tế bào thần kinh: Bệnh Alzheimer (sa sút trí tuệ, giảm trí nhớ, rối loạn chức năng ở tuổi già) bắt nguồn từ sự tích tụ tinh bột (Abeta), tổn thƣơng do chứng viêm và sự oxy hóa protein ở vỏ não, đƣợc chữa trị bằng việc sử dụng chất chống viêm và chống oxy hóa. Curcumin trong nghệ vàng có hoạt tính chống viêm và chống oxy hóa mạnh có thể ngăn chặn những tổn thƣơng nói trên gây ra ở vùng chất xám trên vỏ não. In vitro, curcumin ức chế sự tích tụ Abeta 42 tốt hơn Ibuprofen và Naproxen, ngăn chặn sự hình thành chất oligomer Abeta 42. Khi nuôi chuột nhắt trƣởng thành Tg2576, sự tích tụ tinh bột đã hoàn chỉnh, ở các mảnh đánh dấu curcumin thấy giảm mức độ tích tụ tinh bột làm giảm gánh nặng cho mảnh. Nhƣ vậy curcumin đã trực tiếp liên kết những loại s-amyloid nhỏ để bao vây sự tích tụ và hình thành xơ in vitro và in vivo. Cơ chế tác dụng của curcumin là làm giảm sự tích tụ tinh bột và chống oxy hóa protein tế bào não. Curcumin có thể dễ dàng liên kết với các kim loại oxy hóa- khử sắt và đồng, các 6 kim loại này tập trung trên vỏ não, có khả năng gây ngƣng kết tinh bột và oxy hóa protein. Ngoài ra có thể ngăn chặn tổn thƣơng viêm bằng cách ngăn ngừa sự cảm ứng kim loại của NF- kappaB. Những dữ liệu trên cho thấy curcumin đã phá vỡ sự kết tụ các thành phần của mảng có hiệu quả, đồng thời ngăn chặn đƣợc tổn thƣơng do viêm và oxy hóa-khử protein trên vỏ não. Vì thế curcumin từ nghệ vàng hoàn toàn có thể sử dụng trên lâm sàng để dự phòng và điều trị bệnh Alzheimer [2]. - Tác dụng chống viêm Curcuminoid có hoạt tính chống viêm cao. Curcuminoid làm bất hoạt các enzym tham gia vào phản ứng viêm, thông qua cơ chế chủ yếu là ức chế receptor NF-κ [2]. Jayaraj Ravindran và đồng nghiệp (2010) đã chứng minh Bisdesmethoxycurcumin có tác dụng chống viêm mạnh hơn curcumin (ức chế receptor NF-κ ). Khi cho tiến hành so sánh tác dụng chống viêm với curcumin, hispolon, hispolon methyl ether, dehydroxy hispolon, hydroxy hispolon, methoxy hispolon methyl ether, và methoxy hispolon, (hispolon có cấu trúc tƣơng tự curcumin nhƣng thiếu một nhân thơm, có tác dụng chống viêm) nhận thấy tác dụng chống viêm nhƣ sau: Bisdesmethoxycurcumin = Hispolon > hispolon methyl ether > hydroxy hispolon > Curcumin > methoxy hispolon methyl ether > methoxy hispolon > dehydroxy hispolon. Điều này cho thấy việc thay thế 1 nhóm methoxy cho 1 nhóm hydroxy tại vị trí metha ở vòng phenyl của curcumin tăng cƣờng đáng kể tác dụng chống viêm [14][31]. - Bảo vệ dạ dày, chống viêm loét dạ dày- tá tràng Cao nƣớc hoặc cao methanol nghệ vàng cho thỏ uống, làm giảm tiết dịch vị và tăng lƣợng chất nhầy. Cho chuột cống trắng uống cao nghệ, làm giảm tiết dịch vị và bảo vệ niêm mạc dạ dày, tá tràng. Nghệ kích thích sản sinh chất nhầy ở thành ruột của chuột. Cho bệnh nhân uống bột nghệ ngày 4 lần, trong 7 ngày thấy có hiệu quả tốt với rối loạn tiêu hóa do acid, do đầy hơi và do mất trƣơng lực cơ. Các proteinase kim loại cơ bản (MMP - matrix metalloproteinase) đóng vai trò quan trọng trong điều tiết dịch vị và làm lành vết thƣơng sau viêm. Curcumin đẩy nhanh quá trình làm lành vết loét và bảo vệ vết loét thông qua việc ức chế hoạt tính 7 MMP- 9 và kích thích hoạt tính MMP- 2. Nhóm S. Swarnakar đã nghiên cứu tác dụng của curcumin từ nghệ vàng trên mô hình loét dạ dày gây bởi indomethacin. Kết quả cho thấy curcumin chống loét mạnh với loét dạ dày cấp tính bằng cách dự phòng sự suy kiệt glutathion, chống peroxy hóa lipid, tái tạo lớp biểu mô nhằm chống lại sự bào mòn bề mặt thành dạ dày do các tổn thƣơng gây ra trong khoang dạ dày. Sử dụng curcumin tùy theo liều qua đƣờng uống hay đƣờng tiêm phúc mạc đều có thể ngăn chặn viêm loét dạ dày tá tràng [2][29]. Helicobacter pylori là vi khuẩn gây viêm loét trên tế bào biểu mô thành dạ dày. Tế bào biểu mô nhiễm vi khuẩn này dẫn tới sự hoạt hóa yếu tố sao chép NF- kappaB gây cảm ứng gen cytokin/chemokin- là gen kích thích gây viêm, đáp ứng gen động tế bào (sự phát tán tế bào). Curcumin ức chế sự hoạt hóa NF- kappaB và sự phát tán tế bào, do đó hạn chế quá trình tạo kháng nguyên gây viêm và ngăn chặn đƣợc sự phát triển của vi khuẩn. Vì vậy, curumin rất có tiềm năng trong điều trị viêm loét dạ dày khởi phát từ Helicobacter pylori [2]. - Phòng và điều trị ung thư Curcuminoid ngăn chặn biến đổi, khởi phát u, phát triển u, xâm lấn, hình thành mạch và di căn. Nghiên cứu in vivo cho thấy curcumin ức chế chất gây ung thƣ da, ruột già, ruột kết, gan ở chuột, động vật có vú, ức chế sinh sôi tế bào u gồm tế bào bạch cầu ,T, ung thƣ biểu mô ruột kết, biểu bì, vú. Có những báo cáo về sự tác động của curcuminoid đối với sự tăng sinh tế bào MCF7 (dòng tế bào gây ung thƣ tuyến vú của con ngƣời). Theo đó desmethoxycurcunin là chất ức chế mạnh nhất MCF-7, tiếp theo đó là curcumin và bisdesmethoxycurcumin [28]. Curcumin là chất gây độc tế bào theo cơ chế diệt các tế bào ác tính, vô hiệu hóa tế bào ung thƣ và ngăn chặn hình thành tế bào ung thƣ mới mà không làm ảnh hƣởng đến các tế bào lành tính. Trong khi đó, nhiều thuốc khi diệt tế bào ác tính cũng diệt luôn tế bào lành tính, làm cơ thể suy kiệt. Những thử nghiệm trên lâm sàng cho thấy không có giới hạn liều dùng độc tính khi dùng những liều tới 10 gam/ngày. Do đó, curcumin hiện nay đƣợc nghiên cứu sử dụng phổ biến trong các chế phẩm ngăn chặn sự khởi phát, phát triển và di căn của khối u [21]. 8 Curcumin có khả năng loại bỏ gốc tự do, ức chế các loại men và hoạt tính của một số chất gây đột biến tế bào có khả năng dẫn đến ung thƣ trong đồ uống hay thức ăn đƣợc chế biến và bảo quản không đảm bảo chất lƣợng, giúp cơ thể ngăn ngừa ung thƣ một cách tích cực. Một số thử nghiệm in vitro và in vivo phát hiện thấy curcumin có khả năng ức chế hoạt tính gây ung thƣ của các chất này [2][6][21]. - Dùng ngoài: kháng khuẩn, chống nấm, chóng lành vết thương và liền sẹo Trong điều trị bỏng, kem nghệ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, loại trừ tổ chức hoại tử bỏng, có tác dụng tái tạo tổ chức và liền sẹo. Cao nghệ chiết với cloroform 10% đƣợc dùng tại chỗ vùng bệnh nấm, tốt với các bệnh nấm da. Nghệ có tác dụng kháng khuẩn nhờ một số thành phần hóa học nhƣ: Curcumin I có tác dụng ức chế in vitro sự phát triển một số loài vi khuẩn mà trong đó điển hình là trực khuẩn lao Salmonella paratyphi. Chất ar- tumeron từ tinh dầu và dịch chiết nhexan từ lá nghệ diệt ấu trùng muỗi Aedesaegyti [2]. Trong quá trình làm lành vết thƣơng có vai trò quan trọng của sự giải phóng chậm các chất chống oxy hóa và sự hỗ trợ tái tạo mô của collagen. Một số nghiên cứu tạo liên kết giữa curcumin và collagen cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của curcumin có hiệu quả trong việc quét sạch các gốc tự do gây viêm loét, kết hợp với khả năng kích thích tăng sinh tế bào của collagen đã hỗ trợ đáng kể trong quá trình điều trị vết thƣơng ở mô [2]. - Hỗ trợ chức năng gan, mật Curcumin cho chuột cống trắng ăn, có tác dụng kích thích hoạt tính men arylhydroxylase là men phụ thuộc vào cytocrom P450 của ty lạp thể trong tế bào gan, giúp giải độc và bảo vệ tế bào gan, chống viêm nhiễm, hoại tử, giúp tế bào gan hồi phục. A. Raysid đã chứng minh, curcumin tạo ra tác dụng động học đối với mật. Với 20mg curcumin có khả năng làm co ngắn túi mật 29% khi quan sát trong 2 giờ. Do đó curcumin có tiềm năng trong điều trị dự phòng sự hình thành sỏi trong túi mật, có thể dùng trên lâm sàng để thúc đẩy dòng mật hoặc đẩy dạng bùn mật trong túi mật ra ngoài. Ngoài việc làm tăng lƣu lƣợng mật, curcumin còn làm tăng lƣợng cholesterol và acid mật do mật tiết ra [26]. - Các tác dụng khác: 9 Curcumin từ nghệ vàng có tác dụng kháng virus, có triển vọng lớn trong điều trị viêm gan , C. Đặc biệt, curcumin đã đƣợc nghiên cứu về tác dụng ức chế integrase HIV- 1, ức chế protease HIV- 1 và HIV- 2 để triển khai các chất chống HIV, “chặt đứt” một trong tám mắt xích của quá trình nhiễm HIV [26]. Curcumin chiết từ nghệ có tác dụng ức chế sự tan hồng cầu gây bởi hydrogen peroxyd ở nồng độ thấp nhƣng không ức chế ở nồng độ cao, không có tác dụng làm giảm số lƣợng bạch cầu đa nhân trung tính với nồng độ thử nghiệm [7. 1.1.3. Phƣơng pháp tách hỗn hợp curcuminoid: Năm 2002, Guaddadarangavvanahally K. Jayaprakasha và cộng sự đã tách ba thành phần trong hỗn hợp curcuminoid bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, hệ dung môi sử dụng là benzene và ethyl acetat với độ phân cực tăng dần. Curcumin thu đƣợc với hệ dung môi benzene : EtOAc (82:18 tt/tt), trong khi DMC và DMC thu đƣợc tƣơng ứng với hệ dung môi benzene : EtOAc (70:30 tt/tt) và (58:42 tt/tt). Các phân đoạn thu đƣợc từ cột sắc ký đƣợc cô chân không và kết tinh lại. Hiệu suất tách tƣơng ứng của các chất curcumin, DMC và BDMC là 2,2; 4,46 và 3,4% [11. Năm 2003, Vajragupta O. và cộng sự đã tách hỗn hợp curcuminoid thu các thành phần đơn lẻ bằng phƣơng pháp sắc kí cột silica gel với hệ dung môi CHCl3 : MeOH : AcOH (98 : 5 : 2), bột curcumin đƣợc hòa tan trong aceton. Theo phƣơng pháp này, curcumin đƣợc rửa giải trƣớc, sau đó là hỗn hợp curcumin với DMC, tiếp theo là BDMC tinh khiết. DMC tiếp tục đƣợc tách lần thứ hai bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 : MeOH (95:5) [33]. Năm 2005, L. Pe´ret-Almeida và cộng sự đã cải tiến phƣơng pháp tách các curcuminoid. Trong một vài nghiên cứu trƣớc đây, các tác giả thực hiện tách các curcuminoid bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột. Pha tĩnh đƣợc sử dụng hầu hết là silica gel 60G với các hệ dung môi khác nhau bao gồm benzen, ethyl acetat, ethanol, cloroform, acid acetic, n-hexan và methanol trong sắc ký lớp mỏng và benzen, nƣớc, toluen, và ethyl acetate trong sắc ký cột. Tuy nhiên, do độ phân giải kém chỉ thu đƣợc curcumin có hàm lƣợng 80%. Hơn nữa không tách đƣợc demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin. 10