Nghiên cứu về sâm ngọc linh và hàm lượng các chất trong sâm ngọc linh

  • Số trang: 24 |
  • Loại file: DOC |
  • Lượt xem: 81 |
  • Lượt tải: 0
tailieuonline

Đã đăng 27609 tài liệu

Mô tả:

MỤC LỤC *** MỞ ĐẦU………………………………………………………………………2 TỔNG QUAN…………………………………………………………………3 1. 2. 3. 4. 5. Phân loại:………………………………………………………………..3 Đặc điểm hình thái:……………………………………………………..3 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của sâm Ngọc Linh:……………...4 Đặc điểm thích nghi:…………………………………………………….5 Giá trị dược liệu và công dụng:…………………………………………6 5.1. Giá trị dược liệu:……………………………………………………6 6. 7. 8. 9. 5.2.Công dụng:…………………………………………………………..8 Giá trị kinh tế:…………………………………………………………...9 Các phương pháp để kiểm nghiệm dược liệu chứa saponin:…………..10 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nhân giống sâm Ngọc Linh:…….17 Giới thiệu một số phương pháp tách chiết Saponin:………………….19 KẾT LUẬN…………………………………………………………………….22 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………..23 MỞ ĐẦU *** 1 - Việt Nam là một quốc gia có nguồn cây thuốc dồi dào và truyền thống sử dụng dược liệu có nguồn gốc từ lâu đời. Trong số đó, sâm Ngọc Linh là một loài cây dược liệu đang được quan tâm và nghiên cứu bởi vì tính thần dược của nó. Sâm Ngọc Linh được nghiên cứu từ năm 1973 cho đến nay. Đặc biệt là những nghiên cứu liên quan đến Saponin và tính dược lý của sâm Ngọc Linh. Theo truyền thống, sâm Ngọc Linh là một trong những cây thuốc có nhiều công dụng: chống stress vật lý, chống stress tâm lý và trầm cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống oxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan. - Ginsenosides (saponin) được đánh giá nhưng một thành phần quan trọng trong rễ nhân sâm. Ngoài ra, nhân sâm còn chứa rất nhiều thành phần khác như: chất chống oxi hóa, peptide, polysaccharide, acid béo và vitamin (Lee và ctv, 1995). Vì vậy mà ngày nay, những ứng dụng của công nghệ chiết xuất dược liệu cung rất được quan tâm. Bên cạnh đó, ứng dụng của ngành công nghệ sinh học trong nhân giống sâm Ngọc Linh cũng được quan tâm không kém. Trong tiểu luận này, chúng tôi muốn đề cập đến việc làm sao để thu được một lượng saponin cao. Đó là việc sử dụng dung môi CO 2 siêu tới hạn trong việc chiết xuất saponin, và ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy sinh khối rễ bất định sâm Ngọc Linh để tạo một số lượng lớn hoạt chất dược liệu phục vụ cho sức khỏe cộng đồng. TỔNG QUAN *** 1. Phân loại: 2 Tên khoa học: Tên hai phần: (1985) Tên gọi khác: Giới: Bộ: Họ: Phân họ: Chi: Nhánh: Loài: Panax Vietnamensis Panax articulatus KL Dao (1973) ex Ha et Gruskv sâm Việt Nam, sâm Khu Năm (sâm K5), sâm trúc (sâm đốt trúc, trúc tiết nhân sâm) củ ngải rọm con hay cây thuốc giấu Plantae Apiales họ Cam tùng (Araliaceae) Aralioideae Panax Panax P. vietnamensis 2. Đặc điểm hình thái: - Sâm Ngọc Linh có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ, có đường kính thân độ 4-8mm, thường tàn lụi hàng năm tuy thỉnh thoảng cũng tồn tại một vài thân trong vài năm. Thân rễ có đường kính 1-2cm, mọc bò ngang như củ hoàng tinh trên hoặc dưới mặt đất độ 1-3cm, mang nhiều rễ nhánh và củ. Các thân mang lá và tương ứng với mỗi thân mang lá là một đốt dài khoảng 0,5-0,7cm, tuy sâm chỉ có một lá duy nhất không rụng suốt từ năm thứ 1 đến năm thứ 3 và chỉ từ năm thứ 4 trở đi mới có thêm 2 đến 3 lá. Trên đỉnh của thân mang lá là lá kép hình chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá. Cuống lá kép dài 6-12mm, mang 5 lá chét, lá chét ở chính giữa lớn hơn cả với độ dài 12-15 cm, rộng 3-4 cm. Lá chét phiến hình bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, lá có lông ở cả hai mặt. Cây 4-5 năm tuổi có hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân, cuống tán hoa dài 10-20 cm có thể kèm 1-4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Mỗi tán có 60-100 hoa, cuống hoa ngắn 1-1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, màu vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy. Quả mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8cm-1cm và rộng khoảng 0,5cm3 0,6cm, sau hai tháng bắt đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm, vàng lục, khi chín ngả màu đỏ cam với một chấm đen không đều ở đỉnh quả. Mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả. 3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của sâm ngọc linh: - Đây là một loại cây thân thảo sống lâu năm, cao 40cm đến 100cm, thoạt nhìn rất giống nhân sâm Triều Tiên, nhưng nhìn kỹ sẽ thấy thân rễ có sẹo và các đốt như đốt trúc do thân khí sinh rụng hàng năm để lại. - Sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm. Vào đầu tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông hết tháng 12. - Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức trên củ có một sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm. 4. Đặc điểm thích nghi: - Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2.578m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng, nên được gọi là sâm Ngọc Linh. 4 - Cây sâm được phát hiện ở độ cao từ 1.200m trở lên (có tài liệu cho biết cao độ tìm thấy sâm Ngọc Linh là khoảng 1.500m), đạt mật độ cao nhất ở khoảng từ 1.700-2.000m dưới tán rừng già. - Những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy sâm còn mọc cả ở núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc Kontum, núi Langbian ở Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng cũng rất có thể có loại sâm này. - Sâm ngọc linh thường mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20°C-25°C, ban đêm 15°C-18°C. Chúng sinh trưởng ở độ cao từ 1.200 – 2.100m so với mặt biển, mọc dày thành những đám dưới tán rừng dọc theo các suối ẩm trên những mảnh đất nhiều mùn. 5. Giá trị dược liệu và công dụng: 5.1. Giá trị dược liệu: - Trong hai năm 1974 và 1975, Viện Dược liệu thuộc Bộ Y tế nghiên cứu thấy thành phần saponin triterpen của tam thất, nhân sâm và sâm Ngọc Linh có 9 hoặc 11 chất có Rf ngang nhau, màu giống nhau ở hai hệ dung môi khác nhau. - Theo đánh giá của Nguyễn Minh Đức, Võ Duy Huấn trong nǎm 1994 thì từ sâm Ngọc Linh đã chiết được 50 hợp chất, xác định cấu trúc hóa học cho thấy 26 hợp chất có cấu trúc đã biết (thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật) và 24 saponin pammaran có cấu trúc mới không bắt gặp tại các loại sâm khác trên thế giới. - Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu các saponin triterpen, nhưng cũng là một trong những cây sâm có hàm lượng saponin khung pammaran cao nhất (khoảng 12-15%) và số lượng saponin nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax. Ngoài ra trong sâm Ngọc Linh còn có 14 axít béo, 16 axít amin 5 (trong đó có 8 axít amin không thay thế được) và 18 nguyên tố đa lượng, vi lượng. - Theo tiến sĩ Nguyễn Bá Hoạt cán bộ Viện Dược liệu thì về mặt hoá học, thân rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh hiện nay (2007) đã phân lập được 52 saponin trong đó 26 sanopin thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật. Trong lá và cọng đã phân lập được 19 saponin pammaran, trong đó có 8 saponin có cấu trúc mới. Đã xác định được trong sâm Ngọc Linh 17 axít amin, 20 chất khoáng vi lượng và hàm lượng tinh dầu là 0,1%. - Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con. - Từ rễ và thân rễ Sâm Việt Nam thiên nhiên, hơn 50 hợp chất saponin đã được chiết xuất và xác định, trong đó có 24 saponin có cấu trúc mới. - Saponin có cấu trúc đã biết: gồm chủ yếu các saponin nhóm damaran: ginsenosid-Rb1, -Rb2, -Rb3 , -Rc, -Rd, pseudoginsenosid-RC1, gypenosid-IX, gypenosid-XVII, quinquenosid-R1, notoginsenosid-Fa và majorosid-F1 (nhóm proto-panaxadiol); ginsenosid-Re, 20gluco-ginsenosid-Rf, ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rh1 và 20(R)-ginsenosideRh1, pseudo-ginsenosid-RS1 (=mono-acetyl ginsenosid-Re), notoginsenosidR1, notogin-senosid-R6 (nhóm protopanaxatriol); pseudoginse-nosid-RT4, 24(S)-pseudo-ginsenosid-F11, majonosid -R1 và majonosid-R2 (nhóm ocotillol). - Sâm Việt Nam chứa rất ít saponin thuộc nhóm olean gồm ginsenosid-Ro (= Chikusetsu-saponin-V) và hemslosid-Ma3. - Các saponin có cấu trúc mới: được đặt tên là vina-ginsenosid-R1 --> R24. Công thức và thu suất các hợp chất mới này được trình bày trong hình 1. - Sâm Việt Nam chứa chủ yếu saponin thuộc nhóm damaran và có rất ít saponin nhóm olean. Thành phần saponin của Sâm Việt Nam rất giống với thành phần của các loài sâm trồng đã nêu (Bảng 1). 6 Bảng 1. Hàm lượng saponin (tính theo thu suất %) của Sâm Việt Nam và các loài Panax trồng trọt. (ppd: protopanaxadiol; ppt: protopanaxatriol). Loại aglycon P. ginseng P. P. P. notoginseng quinquefolium vietnamensis 20(S)-ppd 2.9 2.1 2.7 3.1 20(S)-ppt 0.6 2.4 1.2 2.0 Ocotillol ---0.02 ---- 0.04 5.6 0.07 0.09 4.5 4.0 Oleanolic acid ---Thu suất toàn phần 3.5 10.8 (%) 5.2.Công dụng: - Trong dân gian sâm ngọc linh được dùng như một loại thuốc trong những bài thuốc cổ truyền cầm máu, lành vết thương, làm thuốc bổ, sốt rét, đau bụng, phù thũng. - Một số nghiên cứu gần đây cho thấy sâm Ngọc Linh có tác dụng chống stress vật lý, stress tâm lý và trầm cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống ôxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan. 7 - Nghiên cứu dược lý lâm sàng của sâm Ngọc Linh cũng cho kết quả tốt: bệnh nhân ăn ngon, ngủ tốt, lên cân, tăng thị lực, hoạt động trí tuệ và thể lực cải thiện, gia tăng sức đề kháng, cải thiện các trường hợp suy nhược thần kinh và suy nhược sinh dục, nâng cao huyết áp ở người bị huyết áp thấp. - Theo dược sĩ Đào Kim Long, sâm Ngọc Linh có những tính năng tuyệt hảo như tăng lực, phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình trạng của cơ thể trở lại bình thường; kháng các độc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài sự sống của tế bào và tăng các tế bào mới. - Đặc biệt, sâm Ngọc Linh có những tính năng mà sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc không có là tính kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm lo âu, chống ôxi hóa, và hiệp lực tốt với thuốc kháng sinh, thuốc trị bệnh tiểu đường. - Về mặt dược lý, Sâm Việt Nam chứa một hàm lượng saponin có cấu trúc mạch nhánh ocotillol rất cao, nhất là chất majonosid-R2 (25) (thu suất khoảng 5% và chiếm phân nửa lượng saponin toàn phần).Streptococci bệnh lý và có tác dụng tốt với chứng viêm họng (sore-throat). Gần đây, các thử nghiệm dược lý cho thấy majonosid-R2, saponin chủ yếu của Sâm Việt Nam, có tác dụng chống stress và là một chất xúc tiến chống ung thư (anticancer promoting agent) quan trọng. - Cấu trúc của các saponin mới trong sâm Việt Nam còn giúp giải thích quá trình sinh tổng hợp các triterpen dammaran trong thực vật. 6. Giá trị kinh tế: - Hiện nay, giá trị kinh tế của sâm Ngọc Linh rất cao. Bình quân 150 cây sâm Ngọc Linh 6 năm tuổi sẽ cho sản lượng 1kg củ tươi với giá hơn 15 triệu đồng. Ngoài việc phát triển cây sâm Ngọc Linh như là loại cây có giá trị kinh tế cao thì việc di thực cây sâm Ngọc Linh về Tây Giang còn có ý nghĩa bảo tồn một loại dược liệu quý hiếm trên địa bàn tỉnh. Phó Giám đốc Sở Y 8 tế Nguyễn Như Chính cho biết: Cây sâm Ngọc Linh là loại dược liệu quý đặc hữu ở vùng núi Ngọc Linh. Giá trị dược liệu của nó không thua kém sâm Triều Tiên, sâm Mỹ hay sâm Siberi... 7. Các phương pháp để kiểm nghiệm dược liệu chứa saponin:  Dựa trên tính chất tạo bọt: Đây là tính chất đặc trưng nhất của saponin do phân tư saponin lớn và có cùng một lúc một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước. Người ta dựa trên hiện tượng gây bọt ở môi trường kiềm và acid để sơ bộ phân biệt saponin streroid và triterpenoid: lấy 1g bột nguyên liệu thực vật, thêm 5ml cồn, đun sôi cách thủy 15 phút. Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml NaOH 0.1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống nghiệm 2-3 giọt dung dịch chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả hai ống trong 15 giây. Để yên, nếu cột bọt trong cả hai ống cao ngang nhau và bền như nhau thì sơ bộ xác định trong dược liệu có saponin triterpenoid. Nếu ống kiềm có bọt cao hơn ống kia thì sơ bộ xác định là saponin steroid. Có thể dựa vào tỉ số bọt để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin: chỉ số bọt là số ml nước để hòa tan saponin trong 1g nguyên liệu cho một cột bọt cao 1cm sau khi lắc và đọc (tiến hành trong điều kiện quy định). Cách tiến hành: cân 1g bột nguyên liệu (qua rây số 32), cho vào bình có thể tích 500ml đã chứa sẵn 100ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ trong 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cho đúng 100ml. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao16cm và đường kính 16mm, cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3,…,10ml nước sắc, thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ mỗi ống 10ml. Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây 2 lần lắc. Để yên trong 15 phút và đo chiều cao của các cột bọt. Nếu cột bọt trong ống thấp dưới 100. Nếu ống có 9 cột bọt cao 1cm nằm giữa gam, ví dụ ống số 4 chẳng hạn thì tính như sau: ống này có 4ml nước sắc 1% tương ứng với 0,04g bột thì chỉ số là: (10*1)/4=250 - Nếu chỉ số bọt nằm trong ống số 1,2 thì cần pha loãng để có chỉ số nằm giữa gam.  Dựa trên tính chất phá huyết: đây cũng là tính chất đặc trưng của saponin. Tuy nhiên cũng có một vài saponin cũng có tính chất này. Khả năng phá huyết cũng khác nhau nhiều tùy loại saponin. Người ta cho răngf tính phá huyết có liên quan đến sự tao phức với cholesterol và các ester của nó trong màng hầu cầu nhưng lại thấy rằng giữa chỉ số phá huyết và khả năng tạo phức với cholesterol có nhiều trường hợp không tỉ lệ thuận với nhau nên người ta cho răng phải xét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành phần khác của màng hồng cầu. Qua việc theo dõi tính phá huyết nhưng phần đường cũng có ảnh hưởng. Hồng cầu của các động vật khác nhau cũng bị tác động khác nhau cũng bị tác động khác nhau đối với một saponin. Hồng cầu cừu dễ bị phá huyết nên dung tốt, có thể dung máy của súc vật có sừng khác, hoặc dung máu thỏ thường dễ kiếm đối với các phòng thí nghiệm. - Để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin, người ta dựa trên chỉ số phá huyết là số ml dung dịch đệm cần thiết để hòa tan saponin có trong 1g nguyên liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên saponin và toàn đối với một thứ * o o o * o máu đã chọn (tiến hành trong điều qui định). Cách tiến hành: Pha dung dịch đệm: Dung dịch mono kali phosphat 9,07% 28ml Dung dịch dinatri phosphate 11.87% 162ml NaCl tinh khiết 1.8g Pha dung treo máu: Để làm cho máu không đông thì phải loại fibrin bằng cách lấy 300ml máu súc vật có sừng mới cắt tiết cho vào bình một lít có miệng rộng, dung đũa 10 quấy tròn đều hoặc cho vào bình một ít bi thủy tinh và lắc tròn khoảng 10 phút, lọc qua rạc để loại fibrin, để tủ lạnh có thể dung được vài ngày. Từ máy đã loại fibrin này đem pha thành dung treo máu 2% với dung dịch đệm. Có thể tiến hành chống đông máu và pha thành dung treo máu để làm thí nghiệm bằng cách khác nhau như sau: Lấy 4.5ml máu thỏ trộn với 0.5ml dung dịch 3.65% Natri citrate rồi thêm 200ml dung dịch đệm. * Pha dung dịch saponin: o Bột nguyên liệu đã rây qua rây 0.5 mm, cân chính xác 0.5-1g, cho vào bình, thêm dung dịch đệm (50-100ml) rồi đặt lên nồi cách thủy (95-980C) trong 30 phút. Lọc rồi pha đến thể tích chính xác. * Thử sơ bộ: Pha các hỗn hợp theo bảng dưới đây: 11 Ống (ml) I II III IV Dung dịch 0.10 0.20 0.50 1.00 chiết dược liệu Dung dịch 0.90 0.80 0.50 đệm Dung treo máu 1.00 1.00 1.00 1.00 2% - Lắc nhẹ ngay hỗn hợp ( tránh tạo bọt ). Sau 30 phút, lắc lại rồi để yên trong 6h ở nhiệt độ phòng. Quan sát các ống và xác định ống ( hoặc các ống ) có hiện tượng phá huyết hoàn toàn, nghĩa là ống đỏ đều và trong, không có hồng cầu lắng đọng. - Nếu chỉ có ống IV có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì dùng dung đệm để pha loãng gấp đôi (1:1), nếu cả 3 ống II, III, IV thì pha loãng dịch chiết dược liệu gấp 5(1+4), nếu cả 4 ống đều trong suốt và đỏ thì pha loãng dịch chiết dược liệu gấp 10 lần (1+9) và làm lại thí nghiệm sơ bộ từ đầu. Nếu trường hợp ngược lại, nghĩa là 4 ống đều không có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì tiến hành thử sơ bộ lại với dung dịch nguyên liệu đậm đăc hơn. - Thí nghiệm quyết định: Lấy 2 ống nghiệm nhỏ (còn gọi là ống phá huyết), đánh số thứ tự rồi cho vào mỗi ống lần lượt như sau: dung dịch chiết nguyên liệu theo thứ tự tăng dần: ống thứ nhất 0.05ml, ống thứ hai 10ml, dung dịch đệm theo thứ tự giảm dần: ống thứ nhất 0.95ml, ống thứ hai 0.90ml, dung treo nữa. Sau 24 giờ thì đọc kết quả: tìm ống đầu tiên có hiện tượng phá huyết hoàn toàn, tính độ pha loãng của nguyên liệu trong ống đó. Chính độ pha loãng của ống này là chỉ số phá huyết của nguyên liệu. Có thể đọc kết quả sớm hơn bằng cách ly tâm 10 phút (1500 vòng/phút) sau khi đã để yên 2 giờ.  Dựa trên độ độc đối với cá: Cá là động vật rất nhạy cảm với saponin nên người ta dùng các cây có saponin để thuốc cá (đừng nhầm với rotenon). Để đánh giá nguyên liệu chứa saponin, người ta có thể dựa vào chỉ số cá. Chỉ số 12 cá cũng phải tiến hành trong những điều kiện quy định: môi trường, loại cá, …  Khả năng tạo phức với Cholesterol: Những Saponin triterpenoid tạo phức kém hơn loại steroid. Trong loại steroid thì digitonin kết hợp với cholesterol gần như hoàn toàn do đó digitonin được dùng làm thuốc thử để định lượng cholesterol trong hóa sinh.  Các phản ứng màu: Acid sulfuric đậm đặc hoàn tan các saponin và cho màu thay đổi từ và, đỏ, lơ-xanh lá hay lơ-tím (phản ứng Salkowski). - Saponin triterpenoid cho tác dụng với vannillin 1% trong HCl và hơ nóng (phản ứng Rosenthaler) sẽ có màu hoa cà. - Saponin tác dụng với antimoin trichlorid trong dung dịch cloroform rồi sôi dưới đèn phân tích tử ngoại thì saponin triterpernoid có huỳnh quang xanh còn saponin steroid thì màu vàng. - Phản ứng Liebermann-Burchardt cũng hay dùng để phân biệt 2 loại sapogenin: lấy vài miligram sapogenin hòa nóng vào 1ml anhydrid acetic, cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc, nếu là dẫn chất steroid thì có màu lơ-xanh lá, còn dẫn chất triterpenoid thì có màu hồng đến tía.  Sắc kí lớp mỏng: Chất xuất và chiết xuất sơ bộ saponin: đối với saponin trung tính và acid có thể tiến hành như sau: bột dược liệu được chiết với ether dầu hỏa để loại chất chất béo rồi chiết saponin bằng methanol-nước (4:1). Loại methanol dưới áp suất giảm. Hòa cặn trong nước để có dung dịch 10% rồi lắc với n-butanol. Tách lớp n-butanol, bóc hơi butanol dưới áp suất giảm rồi hòa căn với methanol để có dung dịch chấm sắc kí. Có thể tinh chế thêm bằng cách rót từ từ dung dịch methanol vào ether có lượng lớn gấp 10-15 lần (có khi dùng aceton hoặc hexan thay ether). - Saponin thuộc nhóm spirosolan và solanidan có thể chiết như sau: bọt dược liệu thêm methanol đun nóng đến sôi trên nồi cách thủy. Dịch lọc đem bốc hơi đến khô trên nồi cách thủy. Cắn được hòa tan trong acid acetic 5%, đun 13 nóng đến 800C rồi kiềm hóa bằng amoniac. Tủa được ly tâm rồi hòa tan vào ethanol 96% để chấm sắc kí. - Sau đây là một vài hệ dung môi dùng để khai triển trên các bản mỏng silicagel-G: - Saponin triterpenoid: a) Chloroform-methanol-nước (65:35:10). b) Ethyl acetat-acid acetic-nước (8:2:1). c) Buthanol-ethanol (10:2). - Saponin nhóm spirostan: a)Chloroform-methanol-nước (65:35:10). b) Chloroform-methanol (8:2). c) Butanol bão hòa nước. - Saponin kiềm: a) Chloroform-ethanol-dd.ammoniac 1% /nước (2:2:1). b)Ethanol-pyridin-nước (3:1:3). - Cách hiện màu: Dựa vào tính phá huyết bằng cách tráng một lớp gelatinmáu (hòa tan 5g gelatin trong 100 ml dung dịch NaCl 9 ‰ ở 600C, khi nguội đến 400C thì thêm máu bò đã loại fibrin) hoặc phun dung treo máu 2% đã loại fibrin lên bản mỏng. - Các thuốc thử dùng cho các loại saponin và sapogenin nêu dưới đây sau khi phun cần phải sấy 10 phút ở 110 0C rồi quan sát màu ở ánh sáng thường hoặc ánh sáng tử ngoại (365nm): thuốc thử Carr-Price (SbCl 3 bão hòa trong chloroform), thuốc thử Liebermann-Burchardt (1ml H2SO4 + 20ml anhydrid acetic + 50ml chloroform), thuốc thử salkowski (dung dịch acid phosphoric 50% trong nước vanillin sulfuric (vanillin 1% trong cồn tuyệt đối 100ml + acid sulfuric 2ml). - Saponin nhóm spirostan còn có thể hiện màu bằng thuốc thử Sannie′ ( dung dịch vanillin 1% trong cồn (a), anhydrid acetic + H 2SO4 12:1 (b), phun dung dịch rồi sấy 1200C trong 3 phút sau đó phun dung dịch (b), vết saponin có màu vàng. 14 - Đối với nhóm spirostan và nhóm steroid alcaloid có thể dùng thuốc thử Carrprice để phân biệt các dẫn chất có nối đôi và không có nối đôi ở vị trí C5. Các dẫn chất ∆5 có màu đỏ ở 200C và tím đỏ sau khi sấy 1050C. Cũng có thể phân biệt hai loại dẫn chất trên bằng thuốc thử Marquis (0.1ml dung dịch formaldehyd 37% trong nước + 10ml H2SO4), chỉ có loại ∆5 cho phanr ứng. - Các Saponin nhóm spirosolan và solanidan có thể phát hiện bằng thuốc thử Dragendorff.  Định lượng: - Phương pháp cân. Chiết saponin rồi cân. Cách tiến hành chiết như trình bày ở phần SKLM. Có khi người ta thủy phân saponin, phần sapogenin rất ít tan trong nước được lọc hoặc được hòa tan trong dung môi hữu cơ rồi đem hơi dung môi hữu cơ, sấy, cân. - Phương pháp đo quang: Đối với nhóm triterpenoid có thể dùng thuốc thử vanillin-sulfuric. Ví dụ định lượng acid glycyrrhetic trong cam thảo, phản ứng cho màu tím. - Đối với nhóm spiroacetan, A.Akahori dùng aldehyd có nhân thơm + acid phosphoric để định lượng: 50g sapogenin + 500µg anis aldehyd trong ethanol 99%, đun 10 phút ở 1000C để yên 1h rồi đo mật độ quang ở 550nm. Các dẫn chất ∆5-sapogenin ví dụ diosgenin thì dùng thuốc thử FeCl 3-H3PO4: 800mg FeCl3 trong 100ml nước (a), lấy 1ml (a) thêm đủ 50ml H 2PO4 (b). 50µg diosgenin +50ml (b) làm lạnh 5 phút trong nước đá, thêm 0.5ml H2SO4, làm lạnh 10 phút rồi đăt trong tủ sấy ở nhiệt độ 70 0C trong 9 phút. Sau khi làm lạnh 10 phút và để yên 60 phút đem đo ở 485 nm. Phương phap này có thể dùng định lượng riêng biệt các sapogenin sau khi tách bằng sắc kí giấy hoặc sắc kí lớp mỏng.  Xác định bằng quang phổ: Các sapogenin triterpenoid trong H2SO4 đậm đăc có tính hấp thu cực đại trong vùng tử ngoại ở 310nm. Cực này không thể hiện với các saponin steroid. 15 - Phổ hồng ngoại của các sapogenin steroid đặc biệt có 4 pic đặc trưng của mạnh nhánh spiroacetal: pic thứ nhất ở 850-857 cm-1 đối với các chất 25S hoặc 860-866cm-1 đối với các chất 25R. Pic thứ hai ở gần 980 (980-987). Để phân biệt sapogenin thuộc 25R hoặc 25S thì căn cứ vào cường độ hấp thụ mạnh hơn pic thứ ba: các chất 25R thì pic thứ hai có cường độ hấp thụ mạnh hơn pic thứ ba; đối với 25S thì ngược lại. 8. Ứng dụng công nghệ sinh học trong nhân giống sâm ngọc linh: - Sau khi dược tính và tác dụng đối với sức khỏe của sâm Ngọc Linh được công khai trên các phương tiện đại chúng, những năm 80 của thế kỷ 20, trên thị trường tự do giá sâm Ngọc Linh tương đương giá sâm Triều Tiên, và vào những năm 90, giá sâm Ngọc Linh còn đắt hơn sâm Triều Tiên nhiều lần. Từ đó, việc khai thác, mua bán, và khai thác sâm Ngọc Linh ngày càng tràn lan dẫn đến nguy cơ bị tuyệt chủng của giống sâm quí. - Để bảo tồn nguồn gen này, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy tế bào sâm Ngọc Linh. Trong những năm gần đây, đã có nhiều thành công trông việc nuôi cấy tế bào sâm Ngọc Linh trong phòng thí nghiệm. - Từ năm 2006-2008, được sự giúp đỡ của bộ Khoa học và Công nghệ, Bộ Quốc phòng và các nhà khoa học Hàn Quốc, Học viện Quân y đã triển khai nghiên cứu Đề tài “ Ứng dụng công nghệ Biomass tạo sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh” theo nghị định thư giữa Việt Nam và Hàn Quốc. Toàn bộ quy trình chỉ kéo dài từ 10-20 ngày trong khi bình thường phải mất 6 năm, sâm Ngọc Linh mới cho thu hoạch. Từ củ sâm tự nhiên, nhóm nghiên cứu tiến hành nuôi cấy tạo callus trong điều kiện vô khuẩn. Sau khi đã có callus, tiến hành nhiều lần trên môi trường thạch để tế bào trở nên mềm mại và không còn biệt hóa. Các tế bào này tiếp tục cấy chuyển sang môi trường lỏng. Giai đoạn này nhầm tìm ra môi trường thích hợp cho tế bào phát triển tốt nhất, có hàm lượng hoạt chất cao nhất. Khi tìm ra được môi trường thích 16 hợp, các nhà khoa học tiếp tục phát triển quy mô nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy sinh học (Bioreactor) có dung tích khác nhau tùy theo khốối lượng nguyên liệu yêu cầầu. Thoạt đầầu nhóm nghiên c ứu nuối cầốy trong bình 500ml, c ứ 15 ngày thu đ ược 100gr têố bào. Sau đó nhóm nghiên cứu đã thành cống trên mối tr ường nuối cầốy 30 lít và đang têốn t ới quy mố 100 lít. Th.S Vũ Bình Dương tại phòng nghiên cứu sinh khối tế bào thực vật - Ảnh: Mỹ Hằng www.tienphong.vn/Tianyon/Index.aspx?ArticleID... - Dương Tấn Nhựt và ctv (2006) đã triển khai Đề tài: “ Bước đầu nghiên cứu nhân sinh khối rễ bất định sâm Ngọc Linh”. Họ đã tìm ra môi trường thích hợp cho việc tăng bội rễ bất định và bước đầu ứng dụng hệ thống bioreactor để nhân rễ bất định sâm Ngọc Linh. Môi trường thích hợp cho nhân rễ bất định là môi trường SH bổ xung 3mg/l NAA, 30g/l sucrose, 8g/l agar.Việc nuôi cấy sinh khối bằng hệ thống bioreactor 3 lít sau 8 tuần nuôi cấy đạt 6.05 lần trọng lượng tươi/trọng lượng khô. - Qua các công trình khoa học trên cho thấy hệ thống bioreactor có rất nhiều thuận lợi cho việc tăng sinh khối và sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp. Với phương pháp nhân sinh khối tế bào bằng hệ thống bioreactor, các nhà khoa học có thể chủ động được nguồn nguyên liệu dồi dào trong thời gian ngắn, 17 phục vụ công tác nghiên cứu và sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng, thuốc,v.v…, phục vụ sức khỏe cộng đồng. 9. Giới thiệu một số phương pháp tách chiết saponin: Có nhiều quy trình khác nhau: - Thẩm tích. - Dùng bột Mg oxyd hoặc bột polyamid để tách saponin ra khỏi tanin: saponin được hòa vào nước rồi trộn với bột polyamid hoặc bột Mg oxyd trên nồi cách thủy 10 phút để có một khối nhão. Sau đó chiết saponin từ khối nhão này bằng ethanol 80% nóng. Lọc rồi bóc hơi. - Dùng Sephadex G-25, G-50, G-75: Lượng Sephadex dùng gấp 50 lần saponin đem ngâm nước cất cho trương lên, gạn lượng nước thừa, cho gel vào cột sắc kí. - Dung dịch đậm đặc saponin trong nước cho lên phần trên cột rồi khai triển bằng nước cất. Saponin có phân tử lớn sẽ ra khỏi trước saponin có phân tử nhỏ. - Bằng cách acyl hóa hoặc akyl hóa các nhóm OH trong phân tử của các loại Sephadex nói trên, người ta chế được các loại Sephadex vừa có tính thân nước vừa có tính thân dung môi hữu cơ. Ví dụ từ Sephadex G-25 bằng cách alkyl hóa người ta thu được Sephadex LH-20 có khả năng hút được nước, alcol và cả chloroform. Loại này dùng để tách các saponin rất hiệu quả. - Để tinh chế saponin steroid có thể dùng phương pháp kết hợp với cholesterol: 1g saponin hòa trong 200 ml ethanol đun nóng, tủa phức sẽ tạo thành. Sau khi nguội sẽ đem lọc tủa và sấy khô. Phá phức bằng cách hòa tan trong pyridin. Saponin tinh khiết sẽ được tủa trong ether. Để hỏi chlesterol, tủa được hòa tan trong methanol rồi tủa với ether. - Để tinh chế các dẫn chất nhóm glycoalcaloid, ta hòa tan một ít n-butanol rồi cho lên cột chứa nhóm oxyd, đẩy ra bằng nước bão hòa n-butanol. 18 - Ngoài các phương pháp trên, hiện nay người ta sử dụng một phương pháp khá mới đó là phương pháp chiết xuất sử dụng dung môi CO 2 siêu tới hạn (SFE). Siêu tới hạn: Là quá trình phân tách một hay một số chất từ hỗn hợp (dược liệu, hỗn hợp nguyên liệu) bằng cách sử dụng chất lỏng CO2 siêu giới hạn như một dung môi. Khi ở trạng thái này CO2 có đặc tính về độ tan tương tự như một chất lỏng đồng thời có khả năng khuếch tán và độ nhớt gần với chất khí, nhờ vậy chúng có khả năng khuếch tán và hòa tan nhanh các hoạt chất trong dược liệu. Gore (1891) là người đầu tiên phát hiện ra khả năng hòa tan tốt của Naphtalen và Camphor trong CO2 lỏng. Sau đó Andrews (1875) đã nghiên cứu về đặc tính của CO2 ở trạng thái siêu tới hạn. Tuy nhiên tới đầu những năm 1970 công nghệ chiết xuất các hợp chất tự nhiên bằng dung môi CO2 siêu tới hạn (SC-CO2) mới thực sự phát triển và đi vào ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm như: loại cafein trong cà phê và chè xanh, chiết xuất dầu vừng đen, chiết polyphenol từ chè xanh, loaị bỏ cholesterol trong thực phẩm, loại alcol trong đồ uống, chiết xuất phẩm màu, chiết xuất các hoạt chất chống oxy hóa, chiết xuất tinh dầu, hương liệu từ thực vật sử dụng trong mỹ phẩm, thực phẩm…Ưu điểm của phương pháp CO 2 lỏng siêu tới hạn là nhiệt độ tới hạn của CO 2 là 31.040C, do đó nhiệt độ của quá trình trích đủ thấp để đảm bảo cho điều kiện trích và do CO 2 trơ và ổn định trong thiên nhiên nên không có phản ứng không mong muốn như phản ứng oxi-hóa. Một điều kiện khác là CO2 không độc, không cháy, không nổ, không mùi, không màu nên không hư hại sản phẩm. Thời gian trích nhanh và sản phẩm hoàn toàn là thiên nhiên. Và do điều kiện áp suất nên thu được những thành phần theo y muốn. 19 Thiết bị siêu tới hạn (SFE) KẾT LUẬN *** 20
- Xem thêm -