Tài liệu Nghiên cứu và hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm bổ sung neo-polynut

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Trương Ba Hùng NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BỔ SUNG NEO-POLYNUT Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. PHẠM VIỆT CƯỜNG Hà Nội - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Mở đầu ............................................................................................................... 1 Chương I: Tổng quan tài liệu ........................................................................... 3 1. Giới thiệu sơ lược về beta – glucan ................................................................. 3 1.1. Tình hình nghiên cứu beta-glucan trong và ngoài nước .............................. 3 1.2. Nguồn nguyên liệu chứa -glucan .............................................................. 4 1.3. Ứng dụng của -glucan ............................................................................... 4 1.3.1. Ứng dụng trong thực phẩm ....................................................................... 4 1.3.2. Ứng dụng  -glucan trong y dược, mỹ phẩm ........................................... 5 1.3.3. Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản ......................................................... 6 2. Probiotics ......................................................................................................... 7 2.1. Định nghĩa probiotics ................................................................................... 7 2.2. Cơ chế tác động của probiotics .................................................................... 8 2.2.1. Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn .................................................... 8 2.2.2. Cạnh tranh vị trí gắn kết ............................................................................ 10 2.2.3. Cạnh tranh nguồn dinh dưỡng ................................................................... 11 2.2.4. Kích thích miễn dịch ................................................................................. 11 2.3. Vi sinh vật probiotics ................................................................................... 12 2.3.1. Vi khuẩn lactic .......................................................................................... 12 2.3.2. Bacillus spp ............................................................................................... 13 2.4. Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotics ..................................................... 14 2.5. Ứng dụng của probiotics ….. .................................................................. 15 2.5.1. Trong thực phẩm và dược phẩm ............................................................... 15 2.5.2. Nông nghiệp .............................................................................................. 19 2.5.2.1. Nuôi trồng thủy hải sản. ......................................................................... 19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.5.2.2. Chăn nuôi ............................................................................................... 22 Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .......................................... 27 2.1. Vật liệu ........................................................................................................ 27 2.2 . Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 29 Chương III: Kết quả ........................................................................................ 31 3.1. Hoàn thiện công nghệ lên men thu nhận sinh khối chủng saccharomyces cerevisiae 1 ............................................................. 31 3.1.1. Lựa chọn môi trường tối ưu ..................................................................... 31 3.1.2. Khảo sát các điều kiện tăng trưởng tối ưu ................................................ 32 3.2. Hoàn thiện lên men các chủng probiotics bổ sung ...................................... 35 3.2.1. Hoàn thiện công nghệ lên men thu nhận sinh khối chủng ........................ 35 3.2.1.1. Kết quả xác định đường cong sinh trưởng vi khuẩn l. acidophilus trong hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu. ............ 35 3.2.1.2. Kết quả xác định sự thay đổi pH theo thời gian của hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu ...................................... 36 3.2.1.3. Kết quả xác định hàm lượng đường giảm theo thời gian của hai môi trường lên men MRS và dịch chiết dứa tối ưu ............................... 37 3.2.1.4. Kết quả so sánh khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị của dịch nuôi cấy l. acidophilus trong môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu. .... 39 3.2.1.5. Nghiên cứu trạng thái nuôi cấy .............................................................. 42 3.2.2. Hoàn thiện công nghệ lên men thu nhận sinh khối chủng bacillus subtilis B1 ........................................................................... 43 3.2.2.1. Xác định đường cong sinh trưởng của chủng bacillus subtilis B1 trên 2 loại môi trường .................................................................................. 43 3.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh trưởng của vi khuẩn bacillus subtilis ....................................................................... 46 3.2.3. Hoàn thiện công nghệ tách chiết thu hồi thành tế bào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn từ sinh khối saccharomyces cerevisie ........................................................ 53 3.2.4. Hoàn thiện công nghệ tách beta-glucan từ thành tế bào làm nguyên liệu cho thực phẩm chức năng ................................................. 54 3.2.5. Hoàn thiện công nghệ thủy phân nấm men thu hồi acid amin tự do và protein ............................................................ 55 3.2.5.1. Tách thu hồi protein từ dịch tế bào nấm men ........................................ 56 3.2.5.2. Thủy phân protein tách axit amin tự do ................................................ 57 3.2.6. Hoàn thiện và ổn định công nghệ sản xuất chế phẩm thức ăn bổ sung phục vụ chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản ................................... 58 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm chức năng cho chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản..........................................................62 Chương IV. Kết luận ......................................................................................... 67 Tài liệu tham khảo ............................................................................................ 68 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Mật độ tế bào của chủng nấm men S.cerevisae 1 trên hai môi trường nghiên cứu. Bảng 3.2: Ảnh hưởng của pH ban đầu lên sinh khối S.cerevisiae1 sau 30 giờ Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng S. cerevisiae1 Bảng 3.4: Mật độ tế bào của chủng S.cerevisiae1 sau khoảng thời gian lên men Bảng 3.5: Các thông số tối ưu lên men thu hồi sinh khối chủng S.cerevisiae1 Bảng 3.6: Tính toán giá thành cho 1 lít môi trường dịch chiết dứa tối ưu (2009) Bảng 3.7: Xác định mật độ L.acidophilus VN1 dưới các trạng thái nuôi khác nhau Bảng 3.8 Mật độ chủng vi khuẩn nghiên cứu trong các loại môi trường khác nhau theo thời gian Bảng 3.9. Sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu theo thời gian Bảng 3.10. Sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu với các nguồn cacbon khác nhau Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng của B.subtilis Bảng 3.13. Sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu dưới các điều kiện pH ban đầu khác nhau Bảng 3.14: Đánh giá sự phát triển của B.subtilis B1 Bảng 3.15: Điều kiện lên men tối ưu cho 2 chủng probiotics Bảng 3.16: Thực hiện thu hồi và sản xuất nguyên liệu bột probiotic Bảng 3.17: Hàm lượng protein và hexose trong sản phẩm glucan tách chiết từ thành tế bào của chủng nấm men nghiên cứu Bảng 3.18: Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng protein thu được trong dịch thủy phân Bảng 3.19: Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình thủy phân thu nhận axit amin Bảng 3.20: Thông số lên men của các chủng vi sinh vật probiotic Bảng 3.21: Đánh giá khả năng sấy phun Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.22: Công thức phối trộn cho 100 kg sản phẩm NEO-POLYNUT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 3.1: Mối tương quan giữa pH ban đầu của môi trường đến sinh khối chủng S.cerevisiae1 Hình 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng S. cerevisiae1 Hình 3.3: Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae1 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn đường công sinh trưởng của vi khuẩn L. acidophilus nuôi trong hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH theo thời gian của hai môi trường lên men MRS và dịch chiết dứa tối ưu Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng đường và OD Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường tổng thay đổi theo thời gian lên men của hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu Hình 3.8: Môi trường dịch chiết dứa tối ưu không sinh H2O2 Hình 3.9 : Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị (E.coli) của dịch nuôi cấy L. acidophilus trên môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu Hình 3.10. Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis B1 trong MT1 Hình 3.11. Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis B1 trong MT2 Hình 3.12. Biểu đồ biểu hiện ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau tới sinh khối của B.subtilis B1 Hình 3.13. Biểu đồ biểu hiện ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau tới tích luỹ sinh khối Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU Việc kết hợp giữa các chất có hoạt tính sinh học và các chủng probiotic trong các công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ đời sống nói chung và trong sản xuất nông nghiệp nói riêng hiện đang là hướng đi tích cực và có tính khả quan. Các chất có hoạt tính sinh học đang được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới cũng như trong nước quan tâm trong đó có polysaccharide. Polysaccharide là thành phần quan trọng trong phần lớn các chất trùng hợp sinh học (biopolymer), chúng có vai trò chính trong việc tạo cấu trúc và tính toàn vẹn của vi khuẩn và nấm (Bohn & Bemiller, 1995, Sakurai et al., 1996, Vetvika et al., 1997).  -glucan là một polysaccharide cũng rất được chú ý bởi những đặc tính sinh học của nó có, như hiệu quả mạnh trong việc củng cố hoạt động của miễn dịch không đặc hiệu, có đặc điểm kháng khối u mạnh, có hiệu ứng kháng virut và kháng khuẩn, và cuối cùng chúng giúp cho vết thương mau lành và chống nhiễm sau khi bị thương hoặc sau khi phẫu thuật. Bên cạnh đó việc sử dụng các chế phẩm sinh học bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để cải thiện năng suất, thay thế kháng sinh , hóa dược và nâng cao chất lượng sản phẩm chăn nuôi đang là một su hướng tất yếu của các nước trong khu vực và trên thế giới (Hill, 1990; Charteris và cs,1998; Chang và cs, 2001). Trong nước đã có những nghiên cứu sản xuất probiotic bổ sung vào thức ăn để giảm tiêu chảy, cải thiện khả năng tiêu hóa (Phạm Văn Toản,1996; Đỗ Trung Cứ và cs, 2000; Phan Ngọc Kính, 2001; Nguyễn Như Pho và Trần Thị Thu Thủy, 2003; Võ Thị Hạnh, 2003). Nhưng các nghiên cứu này mới là bước đầu, chưa có sự hợp tác triệt để giữa các chuyên gia công nghệ vi sinh và dinh dưỡng thức ăn để tạo ra sản phẩm có tính ổn định cao và sử dụng hiệu quả cho vật nuôi [7]. Hiện nay ở Việt nam việc kết hợp giữa các nhóm vi khuẩn probiotic và -glucan để tạo chế phẩm bổ sung thức ăn chăn nuôi vẫn là một hướng nghiên cứu còn nhiều mới mẻ. Do đó chúng tôi lựa chọn đề tài : “Nghiên cứu và hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm bổ sung NEO-POLYNUT”, nhằm hướng tới mục đích tạo ra một chế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 phẩm sinh học chức năng, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi giúp tăng khả năng chuyển hóa thức ăn, tăng cường hệ thống miễn dịch cho vật nuôi, hạn chế các nguy cơ gây bệnh, và giảm chi phí chăn nuôi thông qua việc giảm hệ số tiêu thụ thức ăn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu sơ lƣợc về Beta - Glucan 1.1. Tình hình nghiên cứu beta-glucan trong và ngoài nƣớc Từ đầu những năm 1970, một số viện nghiên cứu ở Nhật Bản đã thử tách chiết -glucan từ nấm lớn và nó trở thành hướng chính ở Nhật Bản. Những năm gần đây, beta-glucan phân lập từ thành tế bào nấm men ngày càng được chú ý. Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như tăng cường miễn dịch, kháng khối u và là tác nhân bảo vệ phóng xạ, kích thích hệ thống miễn dịch (Bohn & Bemiller 1995, Sakurai et al. 1996, Vetvika et al. 1997). Theo Paulsen et al. (2001, 2003) sử dụng -glucan nấm men cho cá hồi Atlantic và cá hồi cầu vồng sẽ làm tăng hoạt tính lysozym huyết thanh của chúng. Khoa Công nghệ Sinh học, trường tổng hợp Hàn Quốc đã tách chiết được glucan tan trong kiềm từ thành tế bào Sacchromyces cerevisiae chủng dại và chủng đột biến có độ tinh sạch cao (Ha et al.,2002). Thái Lan, cũng như Australia, beta-glucan cũng đã được chiết từ nấm men và sử dụng như một chất kích thích miễn dịch tiềm năng cho Penaeus monodon và Salmo salar L. (Suphantharika et al., 2003, Paulsen et al., 2000). Ngoài ra, ở nhiều nước khác như Nhật Bản, Mỹ, Canađa, Tiệp Khắc, Nga ... cũng tiến hành khá nhiều nghiên cứu trong lĩnh vực này phục vụ nuôi trồng thuỷ sản. Trong giai đoạn 2004-2005 của chương trình công nghệ sinh học, với sự tài trợ của đề tài KC-04-28, lần đầu tiên ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học đã bắt tay nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết -glucan từ thành tế bào Sacchromyces cerevisiae, bước đầu đã thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao. Sản phẩm beta-glucan từ chủng nấm men S.cerevisiae 1 chỉ có một loại mạch bêta-1,6. Sản phẩm beta - glucan từ chủng nấm men S.cerevisiae 3 có hai loại mạch bêta-1,6 và bêta1,3. Chế phẩm Bêta glucan từ chủng S.cerevisiae 1 có trên 80% hexoza và 0.99% protein. Chế phẩm beta - glucan từ chủng S.cerevisiae 2 và S.cerevisiae 3 có hàm lượng protein khoảng 1,2% và hơn 50% hexoza. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 Chế phẩm -glucan được thử nghiệm trên chuột có tác dụng phục hồi số lượng tế bào bạch cầu máu ngoại vi và khả năng thực bào của đại thực bào ổ bụng của động vật gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm bằng chiếu xạ. Chế phẩm  - glucan từ chủng S.cerevisiae 1 có tác dụng tốt đối với hệ thống miễn dịch không đặc hiệu ở nồng độ nghiên cứu. Hiện nay, Liên hiệp Khoa học sản xuất Công nghệ sinh học và Môi trường đã sử dụng beta - glucan trong chế phẩm Neo-Polynut phục vụ chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Chế phẩm Neo-Polynut đã được Bộ thủy sản công nhận chất lượng và cho phép sản xuất lưu hành. 1.2. Nguồn nguyên liệu chứa -glucan Glucan thu được từ các nguồn khác nhau như: thực vật, tế bào nấm men, nấm nói chung được miêu tả như polymer của glucoza. Glucan có một số hoạt tính sinh học như hoạt hóa hệ miễn dịch, chống ung thư, kích thích sinh trưởng. -glucan tìm thấy trong nấm lớn có phân nhánh chỉ với một phân tử glucoza và chỉ tăng cường miễn dịch đến một mức nào đó. Bên cạnh đó, - glucan chiết từ thành tế bào nấm men bánh mỳ phân nhánh rất mạnh và nó có khả năng tăng hoạt tính miễn dịch mạnh nhất trong tất cả các loại - glucan. -1,3-D-Glucan đã được chiết từ thành tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae và được đặt tên vào đầu năm 1960 bởi nhóm nghiên cứu ở Mỹ (trường Tổng hợp Tulane, khoa Y học, chuyên ngành sinh lý học). -Glucan đã được tách chiết từ các chủng nấm men như Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces delbrueckii, Candida albicans, Candida cloacae, Candida tropicalis, Hansenula henricii...Đặc biệt - Glucan đã được tách từ xác nấm men lên men bia với nồng độ Glucan lên tới 92%. 1.3. Ứng dụng của -glucan 1.3.1. Ứng dụng trong thực phẩm - Cung cấp nguồn xơ thực phẩm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 - Cung cấp chất đóng cục phân. - Cung cấp nguồn axit béo chuỗi ngắn qua lên men vi khuẩn trong ruột già, cải thiện sự tiêu hóa, giúp ích cho các tế bào màng trong ruột kết và ruột nói chung. Để khẳng định hiệu quả của Glucan như một phụ gia có lợi trong thực phẩm, các nhà khoa học đã sử dụng chuột đồng vì lypoprotein profile máu của chúng giống người. Chuột được nuôi bằng thức ăn có hàm lượng cholestorol cao (0,2% cholesterol và 10% dầu dừa), sau 7 tuần lượng cholesterol trong máu của chúng dao động từ 267279mg/dl. Sáu tuần tiếp theo, chuột thí nghiệm được nuôi với thức ăn có bổ sung 5% cám yến mạch, cám lúa mỳ hoặc Glucan từ thành tế bào nấm men. Kết quả nhận được cho thấy Glucan giảm lượng cholesterol tổng (42%), LDL cholesterol (69%) và tăng đáng kể lượng HDL cholesterol (16%). Glucan cũng có hiệu quả giảm lượng cholesterol trong huyết thanh. Khi chuột được nuôi ở chế độ dinh dưỡng giàu cholesterol đồng thời với 5% Glucan hoặc cám yến mạch, sau 4 tuần, Glucan giảm lượng cholesterol tổng xuống 13% so với 6% của cám yến mạch. LDL đã giảm 15% trong nhóm ăn thêm Glucan và 4% trong nhóm ăn thêm cám [3]. Những kết quả trên cho thấy -Glucan là nguồn phụ gia có giá trị trong công nghiệp thực phẩm. 1.3.2. Ứng dụng  -Glucan trong y dƣợc, mỹ phẩm Từ những nghiên cứu cơ sở tác dụng của -Glucan lên hệ thống miễn dịch của chuột, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu trên rất nhiều loài động vật khác nhau như tôm, cá, gà, thỏ, -Glucan đều có hoạt tính gây kích thích miễn dịch và 4 cơ chế miễn dịch chính là: - Tạo ra các bạch cầu (hematopoiesis) để phá hủy nguồn bệnh. - Huy động tế bào, là khả năng của các bạch cầu chuyển đến chỗ bị thương. - Năng lực thực bào hay khả năng nhấn chìm tế bào lạ. - Tạo ra các chất trung gian hoạt hóa oxy và các nhân tố khác giết chết vật thể lạ. Cơ chế -Glucan thể hiện hiệu quả có lợi là kết hợp với thụ quan glucan đặc hiệu nằm trên tế bào đại thực bào, như vậy, nó sẽ hoạt hóa tế bào này. Một khi đại thực Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 bào đã được hoạt hóa, chúng sinh ra cytokine có nhiệm vụ chuyển thông tin cần thiết đến các tế bào miễn dịch khác và cuối cùng hoạt hóa hoặc hiệu chỉnh chức năng của hệ thống miễn dịch. 1.3.3. Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản -glucan được biết như một chất tăng cường hệ thống miễn dịch và có hiệu lực tăng cường hệ thống miễn dịch của vật chủ (Yadomae T. và Ohno N.,1996). Đã có một số nghiên cứu sử dụng -glucan như một chất kích thích hệ thống miễn dịch tiềm năng trong nuôi trồng thuỷ sản. Hệ thống prophenoloxidaza (proPO) được đánh giá giữ vai trò quan trọng trong hệ bảo vệ của các loài giáp xác. Vì vậy hoạt tính PO trong hemocyte của P.monodon được sử dụng như chỉ thị cho đặc tính kích thích miễn dịch của  - glucan. Kết quả thí nghiệm in vitro của Suphantharika et al.(2003) cho thấy,  - glucan tăng hoạt tính PO trong tất cả hemocyte được xử lý. Chế phẩm -glucan từ nấm men bánh mì (YGT) có thành phần -glucan cao hơn 40% so với -glucan từ bã men bia (BYG) và YGT tăng hoạt tính PO cao hơn gấp 2 lần so với BYG. Như vậy hoạt tính PO không những phụ thuộc vào hàm lượng -glucan mà có lẽ còn phụ thuộc vào các tính chất lý học khác như trọng lượng phân tử và cấu trúc hoá học của -glucan. Thí nghiệm in vivo khi cho tôm ăn thêm 0,2% -glucan cũng nhận được những kết quả khả quan như trong thí nghiệm in vitro. Nhưng trong thí nghiệm này, YGT cho đáp ứng thấp hơn so với BYG. Điều này có thể giải thích do sự khác biệt thời gian xử lý: ở thí nghiệm in vitro, hemocyte tiếp xúc trực tiếp với -glucan trong 30 phút, còn trong thí nghiệm in vivo, -glucan được cho ăn trong 3 ngày. Nhưng -glucan và các sản phẩm phân huỷ của nó làm thế nào được hấp thu vào hệ tiêu hoá và nó kích thích hemocyte thế nào để hoạt hoá hoạt tính PO vẫn còn chưa rõ. Kết quả thí nghiệm của Rostad Gunnar và cs. (1995) cho thấy, khi bổ sung glucan vào thức ăn hàng ngày của Salmo salar với hàm lượng 1g/kg thức ăn trong 12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 tuần trước khi cho nhiễm nguồn bệnh, lượng cá sống sót tăng lên rất nhiều. Cụ thể đối với Vibrio salmonicida subsp. salmonicida gây bệnh furuncolusis, lô thí nghiệm cá được ăn thức ăn bổ sung M-glucan sẽ chết ít hơn 33% so với đối chứng. Kết quả tương tự đối với Vibrio anguillarum serotype 1, cá non trong lô thí nghiệm chết 15%, trong khi ở lô đối chứng, cá chết đến 85%. Với thí nghiệm tiêm 0,2 ml dung dịch chứa 2mg M-glucan trực tiếp dưới bụng cá, sau 3 tuần tiêm một lượng vi khuẩn gây bệnh cho cá, M-glucan cũng làm giảm đáng kể tỉ lệ cá bị chết. M-glucan còn là một tá dược với vaccine tăng sức đề kháng của cá lớp Osteichthyes, đặc biệt là cá hồi Atlantic (Salmo salar). Kết quả thí nghiệm cho thấy khi Salmo salar non (30g/con) được tiêm dưới bụng một lượng dung dịch vaccine và 0,5mg M-glucan, hoặc chỉ có M-glucan hoặc vaccine, tỉ lệ cá chết sẽ tương ứng 20 %, 28%, 38%. Riêng ở lô đối chứng khi cá chỉ được tiêm dung dịch muối sinh lý, sau khi bị xử lý với nguồn bệnh, tỉ lệ cá chết cuối cùng là 42%. Như vậy, sự kết hợp giữa M-glucan và vaccine furunculosis là phương pháp hiệu quả nhất để tăng sức đề kháng của Salmo salar đối với furunculosis. Kết quả tương tự cũng nhận được đối với bệnh vibriosis do các loại vi khuẩn chi Vibrio khác nhau gây nên. Hiệu quả của Beta-glucan như một dược phẩm phòng bệnh để tăng sức đề kháng của tôm hùm lớn (Penaeus monodon) cũng đã được các tác giả nghiên cứu. Tôm non được bổ sung 5g glucan/kg thức ăn hàng ngày, sau 5 tuần chúng bị nhiễm bởi nguồn bệnh virut và hỗn hợp Vibrio harenggii và Vibrio parahemolytiens. Bảy tuần sau khi bị nhiễm, lượng tôm bị chết trong lô đối chứng là 80%, trong khi ở lô thí nghiệm tôm được nuôi với thức ăn có bổ sung M-glucan lượng tôm chết giảm xuống 50%. 2. Probiotics 2.1. Định nghĩa Probiotics Probiotics là thuật ngữ có nguồn gốc từ Hy Lạp bao gồm có hai từ: “pro” có ý nghĩa là vì, “biosis” có nghĩa là sự sống. Probiotics được định nghĩa đầu tiên là do Parker(1974): “ những sinh vật và các chất mà giúp cân bằng hệ sinh vật đường ruột”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 8 Nhưng 1989, Fuller đã định nghĩa lại Probiotics:” những vi sinh vật sống bổ sung vào thức ăn mà chúng có tác động tốt đến sức khoẻ của động vật chủ bằng cách tạo cân bằng hệ sinh vật đường ruột” [33]. Bifidobacteria và lactobacilli là chi được sử dụng rộng rãi nhất. Nấm men (Saccharomyces cerevisiae), một vài chủng E. coli và Bacilllus spp cũng được sử dụng như một probiotics [32]. Havenaar và Huis Int Veld, 1992 định nghĩa:” probiotics là một hoặc sự kết hợp của các vi sinh vật sống, ảnh hưởng có lợi đến vật chủ, hoàn thiện hệ vi sinh vật đường ruột [34]. Theo viện khoa học quốc tế ( International Life Sciences Institute), nhóm làm việc tại châu Âu (1998) định nghĩa probiotics: “ là vi sinh vật sống bổ sung vào thức ăn tác động có lợi đến vật chủ” [34]. Theo tổ chức thực phẩm, nông nghiệp và sức khỏe thế giới “ probiotics là những vi sinh vật sống, khi mà sử dụng một lượng đầy đủ như là thức ăn, sẽ mang lại sức khỏe tốt cho vật chủ ” [37]. Theo FAO:” Những vi sinh vật khi sử dụng với một lượng đủ sẽ tác động có lợi đến vật chủ”. Hầu hết probiotics là vi khuẩn, sinh vật đơn bào [36]. 2.2. Cơ chế tác động của probiotics Sự tương tác lẫn nhau bình thường của hệ vi sinh đường ruột là một trong các yếu tố quan trọng đảm bảo sức khỏe của vật chủ, sự tương tác này bị gián đoạn có thể dẫn đến một số bệnh lý do mất cân bằng hệ vi sinh đường ruột làm tăng nhanh số lượng vi khuẩn gây bệnh. Probiotics được chứng minh là có khả năng chống lại một số tác nhân gây bệnh như Escherichia coli, Salmonella, Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, và rotavirus. Cơ chế tác động của probiotics như sau: 2.2.1. Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn: bao gồm bacteriocins, acid hữu cơ, và hydrogen peroxide . Bacteriocins là một chất kháng khuẩn, được chia làm 4 lớp:  Lớp thứ nhất là những phân tử peptid nhỏ (< 5 kDa) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 9  Lớp thứ hai là những phân tử peptid nhỏ (< 10 kDa), thường là những phân tử peptid hoạt động ở màng tế bào.  Lớp thứ 3 là những phân tử protein lớn (>30 kDa), bền về nhiệt, gồm các enzyme ngoại bào  Lớp thứ tư là những bacteriocins phức tạp, ngoài protein còn có các thành phần khác như lipid và cacbohyrate [37]. Bacteriocins được sản xuất bởi vi khuẩn lactic, khi tiến hành phân tích gen cuả các vi khuẩn lactobacilus gồm L. plantarum, L. acidophilus NCFM, L. johnsonii NCC 533, và L. sakei đều thấy chúng là các loài có khả năng sinh bacteriocins và chúng thường độc đối vi khuẩn gram dương như Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Listeria, và Mycobacteria. Cơ chế hoạt động cơ bản của bacteriocins chủ yếu tạo nên những lỗ trên màng tế bào chất và sau đó enzyme được tiết ra gây trở ngại cho quá trình trao đồi chất của vi khuẩn gây bệnh. Một vài vi khuẩn thuộc chi Bifidobacteria cũng có khả năng sản xuất ra bacteriocins gây độc cho cả vi khuẩn gram âm và gram dương. Đặc biệt probiotics còn kích thích các tế bào biểu mô ruột sản xuất ra các chất kháng khuẩn [37]. Acid hữu cơ cũng có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, được sản xuất bởi vi khuẩn lactic như acetic, lactic, acid propionic làm pH môi trường hạ thấp xuống ảnh hưởng đến pH nội bào của vi khuẩn gây bệnh. Một vài vi khuẩn chi Lactobacillus ngăn chặn sự phát triển của Salmonella enterica bằng cách sản xuất ra acid lactic [37]. Hydrogen Peroxide cũng là chất kháng khuẩn, một vài vi khuẩn Lactobacillus trong cơ quan âm đạo phụ nữ được tìm thấy chúng có khả năng sản sinh ra hydrogen peroxide ngăn cản sự phát triển vi khuẩn gây bệnh gonococci trong cơ quan sinh dục nữ. Ngoài ra vi khuẩn Lactobacillus còn ngăn chặn sự phát triển của Gardnerella vaginalis khi có sự kết hợp của hydrogen peroxide, lactic acid, và bacteriocins [37]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 2.2.2 Cạnh tranh vị trí gắn kết Khả năng gắn kết trên biểu mô ruột là một yếu tố quan trọng cho vi sinh vật cư trú trên ruột, và cũng chính là giai đoạn đầu của qu trình xm nhiễm. Probiotics trong hệ tiêu hóa có chức năng ngăn chặn khả năng bám dính của tác nhân gây bệnh và giảm lượng chất độc của chúng trên biểu mô ruột. Một vài vi khuẩn Lactobacilli và Bifidobacteria có khả năng cạnh tranh vị trí với vi khuẩn gây bệnh bao gồm S. enterica, Yersinia enterocolitica và bám dính trên tế bào biểu mô ruột. Một vài trường hợp, vi khuẩn probiotics có thể chiếm cả vị trí gắn kết của vi khuẩn gây bệnh ngay cả khi những vi khuẩn gây bệnh này đã bám chặt trên tế bào biểu mô nếu được xử lý với probiotics [37]. Lactobacillus GG và Lactobacillus plantarum 299V cạnh tranh vị trí bám với Escherichia coli 0157H7 và HT-29, Lactobacilli fermentum RC-14 cạnh tranh vị trí bám dính với Staphylococcus aureus do đó làm giảm sự bám dính của các tác nhân gây bệnh [37]. Ngoài ra probiotics còn có các cơ chế khác tác động lên các vi khuẩn gây bệnh. Vi khuẩn probiotics như Treptococcus thermophilus và Lactobacillus acidophilus enha hoạt hóa tạo ra protein bịt kín vùng bị tổn thương của ruột. Thứ hai, các vi khuẩn probiotics khác như Lactobacillus rhamnosus GG có khả năng ngăn ngừa bệnh viêm ruột và các tế bào chết bám trên biểu mô ruột. Cuối cùng là chức năng ngăn chặn, lactobacillus được chứng minh rằng là chủng có khả năng làm giảm độ thẩm thấu vào màng nhầy, hạn chế được sự xâm nhập của vi sinh vật có kích thước nhỏ ở chuột [26]. Sinh tổng hợp chất nhày là một trong những cơ chế chống lại các tác nhân gây bệnh, chất nhầy sẽ cô lập, bất hoạt vi sinh vật gây bệnh. MUC2 và MUC3 là hai mRNA làm tăng kích thích sản sinh ra chất nhầy, bảo vệ tế bào biểu mô chống lại sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh. Lactobacillus plantarum 299v được chứng minh rằng có khả năng làm giảm tác động của E. coli trên tế bào biểu mô ruột. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 2.2.3. Cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng Probiotics còn có khả năng cạnh tranh các chất dinh dưỡng với các vi sinh vật gây bệnh. Bất kỳ vi sinh vật nào cũng cần có nguồn dinh dữơng để phát triển, chẳng hạn sự phát triển vi khuẩn probiotics sử dụng đường đơn (glucose, fructose) làm giảm sự phát triển của Clostridium difficile (sử dụng đường đơn ) [26]. Sắt là yếu tố quan trọng đối với tất cả các tế bào sống ngoại trừ Lactobacillus plantarum và Borrelia burgdorferi, nó cần thiết trong các quá trình sinh hóa trong tế bào và có thể gây độc ở ngưỡng cao. Sự hấp thu và lưu trữ sắt được điều chỉnh bởi tế bào [38]. Siderophore lá chất có khối lượng phân tử thấp, có khả năng gắn kết các ion sắt. Siderophore có thề hòa tan sắt tủa thành dạng dễ sử dụng cho vi sinh vật. Do đó tận ứng yếu tố này, có thể chọn các vi sinh vật vô hại có khả năng sản xuất siderophore làm vi khuẩn probiotic, nó sẽ cạnh tranh ion sắt với vi khuẩn gây bệnh [9]. Bifidobacteria có khả năng sản sinh siderophore và cạnh tranh ion sắt trong ruột già như E. coli [38]. Ngoài ra probiotics còn tác động đến hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây độc, quorum sensing có liên quan đến quá trình điều hòa các nhân tố gây độc của vi khuẩn đặc biệt là Virio. Vi khuẩn probiotics sẽ phá vỡ hệ thống này, đây cũng là một biện pháp mới để chống lại các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản. 2.2.4. Kích thích miễn dịch Mặc dù cơ chế vẫn chưa được sáng tỏ, việc sử dụng probiotics có tác dụng làm tăng dáp ứng miễn dịch, nhất là miễn dịch tự nhiên. Spanhaak et al thí nghiệm sử dụng Lactobacillus casei Shirota ở 20 người đàn ông. Những ngừơi đàn ông này được ăn theo chế độ trong 8 tuần, 10 người đàn ông được uống sữa lên men bổ sung 1x1012 cfu/ml Lactobacillus casei Shirota, 10 người còn lại uống sữa lên men. Kết quả làm tăng đáp ứng miễn dịch ở 10 người sử dụng sữa chua có bổ sung Lactobacillus casei Shirota [39]. Nhiều chủng Lactobacillus có khả năng hoạt hóa đại thực bào, kích thích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 12 hình thành bạch cầu trung tính, kích thích tế bèo tua (dendrit) làm tăng khả năng tổng hợp IgA và interferon gamma. 2.3. Vi sinh vật probiotics: 2.3.1. Vi khuẩn lactic: Lactobacillus spp: Hầu hết các vi sinh vật probiotics đều là các vi khuẩn sản sinh ra acid lactic. Từ xưa con người đã biết cách sử dụng các vi khuẩn có lợi bổ sung vào các sản phẩm lên men, chủ yếu thuộc loài L. casein và một vài chủng L. acidophilus. Cách đây khoảng 40 năm và 30 năm ở Đức vi khuẩn lactic đã được ứng dụng bổ sung vào trong các sản phẩm sữa lên men. Hai loài “Lactobacillus acidophilus” và “Bifidobacterium bifidum” được giới thiệu rất phổ biến ở Đức vào cuối 1960 trong các sản phẩm bơ sữa bởi vì nó có thể giúp ổn định vi khuẩn đường ruột và tạo một cảm giác chua nhẹ gây cảm hứng cho người tiêu dùng trong các sản phẩm sữa chua. Ở Đức sản phẩm có tên thương mại là “mild yogurts” hoặc “bioyogurts“. Ở Mỹ sữa acidophilus lại được phát triển và điều quan trọng đối với các loài này là phải được chứng minh là an toàn với người sử dụng. L. casei/paracasei, L. rhamnosus, L. acidophilus, và L. johnsonii đây là những loài được sử dụng nhiều nhất và đã được chứng minh là an toàn cho người sử dụng [38]. Lactobacillus có khoảng 60 loài bao gồm L. acidophilus, L. plantarum, L. casei, và L. rhamnosus…. Cách đây hơn 100 năm con người đã sử dụng các vi khuẩn Lactobacillus bổ sung vào thực phẩm nhằm tăng thời gian bảo quản, tăng vị ngon, tạo ra các cấu trúc khác nhau trong thực phẩm. Hương vị của sản phẩm là do các sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus. Chẳng hạn acetaldehyde có trong yogurt, diacety có trong có trong các sản phẩm sữa lên men [38]. Khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh của lactobacillus đã được nghiên cứu trong điều kiện in vitro, đặc biệt khả năng bám dính và cạnh tranh vị trí bám dính của lactobacillus với các vi khuẩn gây bệnh. Coconnier et al, chứng minh được L. acidophilus ngăn cản sự bám dính của E. coli O157:H7, Salmonella enterica, Yersinia Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 13 pseudotuberculosis và Listeria monocytogenes trên tế bào Caco-2 cells. Tương tự như vậy, Forestier et al. cũng chứng minh được khả năng ngăn cản bám dính của L. casei và L. rhamnosus Lcr35 đối với E. coli và Klebsiella pneumoniae trên tế bào Caco-2 cells. Ngoài cớ chế cản trở sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh thì Lactobacillus còn ức chê vi khuẩn gây bệnh bằng sinh acid làm pH môi trường giảm xuống và bacteriocins. Theo nghiên cứu của Vescovo et al, ông tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của năm chủng L. casei trên Aeromonas hydrophila, L. monoytogenes, S. typhimurium,và S. aureus trong điều kiện invitro. Tuy nhiên ở nghiên cứu này, L. casei IMPCLC34 là chủng có tác động mạnh nhất đối với Aeromonas hydrophila, S. typhimurium, và S. aureus, tuy nhiên nó không có tác động kháng đối với L. monocytogenes. Nhưng ngược lại Lactobacillus spp phân lập từ gà lại có khả năng kháng lại Campylobacter spp trong điều kiện invitro [38]. Dựa vào khả năng sinh bacteriocins của Lactobacillus, mà Lactobacillus được sử dụng rất nhiều trong các sản phẩm rau quả, thịt, và cá lên men. Khả năng sinh bacteriocins của lactobacillus được khám phá vào 1975, và nhiều loại bacteriocins khác đã được biết đến. Hiện nay lactobacillus được ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm cá, bơ sữa, và thịt trong vấn đề bảo quản và nâng cao chất lượng sản phẩm. Hầu hết các chủng sinh bacteriocins đều đã được biết, như Lactocin 705 bởi L. casei CRL705 kháng S. aureus, L. monocytogenes, S. pyogenes, Acidocin CH5 bởi L. acidophilus CH5 kháng vi khuẩn gram âm, acidophilin 801 bởi L. acidophilus IBB 801 kháng một số vi khuẩn gram âm và gram dương… [38]. 2.3.2. Bacillus spp Bacillus subtilis là trực khuẩn hình que, Gram dương, hô hấp hiếu khí, sinh rất nhiều enzyme, đặc biệt là enzyme endo--1,4-glucanase có giá trị ứng dụng trong thực tế cao. Kích thước của vi khuẩn là (3 - 5) m x 0,6 m. Vi khuẩn Bacillus subtilis có bao nhày (giác mạc), bao nhày cấu tạo từ polypeptit, chủ yếu là axit polyglutamic. Việc hình thành giác mạc giúp cho vi khuẩn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 14 Bacillus subtilis có khả năng chịu được điều kiện môi trường khắc nghiệt do giác mạc có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi bị khô hạn. Quan sát dưới kính hiển vi tiêu bản nhuộm màu, có thể nhìn thấy màng nhày của vi khuẩn Bacillus subtilis không màu, trong suốt, tế bào của vi khuẩn bắt màu nâu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen. Bacillus subtilis là loài vi khuẩn có khả năng di động. Điều đó được thể hiện khi quan sát khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường đặc: vi khuẩn Bacillus subtilis có khuẩn lạc mỏng, mầu trắng, bề mặt nhăn nheo, mép có răng cưa. Một phương pháp có thể xác định khả năng di động của vi khuẩn trên môi trường đặc: nếu khuẩn lạc mỏng, lan nhanh, mép không đều, hình không tròn thì chứng tỏ đó là vi khuẩn có tiêm mao và có khả năng chuyển động. Ngược lại, nếu khuẩn lạc tròn, mép phẳng, khá dày thì thường là khuẩn lạc của vi khuẩn không có khả năng di động. Một đặc điểm nữa của vi khuẩn Bacillus subtilis là sinh bào tử. Vào cuối thời kỳ sinh trưởng, phát triển, bên trong tế bào sẽ sinh ra một thể nghỉ có dạng hình cầu hoặc hình bầu dục được gọi là bào tử hay nội bào tử. Vì mỗi tế bào chỉ sinh ra một loại bào tử cho nên đây không phải là loại bào tử có chức năng sinh sôi nảy nở như ở nấm. Khác với Clostridium, Bacillus subtilis khi sinh ra bào tử vẫn giữ được hình dạng tế bào là hình que, không bị biến đổi hình thái tế bào. Bào tử có thể giữ sức sống trong vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống trong 200 300 năm của bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis. Khi gặp điều kiện thuận lợi, những bào tử này lại được tái phục hồi và chúng lại tiếp tục chu kỳ sống của mình. 2.4. Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotics: Các vi sinh vật dùng làm probiotics phải đảm bảo các đặc điểm sau: - Không gây bệnh, khi sử dụng nó sẽ có tác động tốt đối với vật chủ - Có khả năng tồn tại khi đi xuyên qua dạ dày ( dịch tiêu hoá, dịch acid, dịch mật) - Có khả năng bám đính tốt trên niêm mạc ruột của đường tiêu hoá vật chủ - Sản xuất các kháng sinh chống lại các mầm bệnh: acid, bacteriocin, H2O2…. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn