Tài liệu Nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể rong giấy và phụ liệu

i LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan tất cả những số liệu trong đề tài: “Nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể rong Giấy và phụ liệu” là số liệu thật và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với số liệu nghiên cứu của mình. Sinh viên Vũ Mạnh Tùng ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài: “Nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể rong Giấy và phụ liệu”, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô Th.S KHÚC THỊ AN, ngƣời đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn tôi từ buổi đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học và trong suốt quá trình tiến hành hoàn thành đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học, cán bộ phòng thí nghiệm - Viện Công nghệ sinh học & Môi trƣờng đã nhiệt tình truyền đạt kiến thức trong suốt thời gian của khóa học. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, anh chị em trong gia đình, mọi ngƣời đã cho tôi những điều kiện tốt nhất về mặt tinh thần cũng nhƣ vật chất giúp tôi trong suốt khóa học. Cuối cùng tôi xin cảm ơn tập thể lớp 48sh và toàn thể đồng bạn đã giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian qua. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 07 năm 2010 Sinh viên Vũ Mạnh Tùng iii Mục lục LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... v DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. vi CHƢƠNG 1 ................................................................................................................ 1 ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................. 1 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ....................................................................... 1 1.2. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI ............................................................... 2 1.3. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ............................................................... 2 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC ............................... 3 1.4.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NẤM TRÊN THẾ GIỚI ............... 3 1.4.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NẤM LINH CHI Ở TRONG NƢỚC ......................................................................................................................... 4 1.4.4.1. Đặc điểm sinh học của nấm linh chi .............................................................. 6 CHƢƠNG 2 ................................................................................................................ 8 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 8 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................ 8 2.1.3. Môi trƣờng và hóa chất ..................................................................................... 8 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 9 2.2.1. Những nghiệm thức đƣợc thiết lập.................................................................... 9 2.2.2. Dự kiến quy trình thực nghiệm nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể rong Giấy và phụ liệu ................................................................................................ 10 2.2.2.1. Phân lập giống nấm hoàng chi cấp 1 bằng phƣơng pháp tách mô vô trùng ................. 10 2.2.2.2. Nhân giống nấm hoàng chi trên môi trƣờng hạt lúa cấp 2 ........................... 11 2.2.2.3. Xử lý nguyên liệu rong Giấy và phụ liệu ..................................................... 12 2.2.2.4. Hấp vô trùng tạo bịch phôi và cấy từ môi trƣờng hạt qua ........................... 12 2.2.2.5 . Chăm sóc và đón hái nấm ........................................................................ 12 iv 2.2.3. Phƣơng pháp thu nhận kết quả ........................................................................ 13 2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................... 13 CHƢƠNG 3 .............................................................................................................. 14 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 14 3.1. Kết quả nuôi trồng thực nghiệm......................................................................... 14 3.1.1. Kết quả phân lập giống cấp 1 bằng phƣơng pháp tách mô vô trùng .............................. 14 3.1.2. Kết quả nhân giống trên môi trƣờng hạt lúa .................................................. 16 3.1.3. Kết quả trên môi trƣờng ra quả thể ................................................................. 18 3.1.4 Kết quả phân tích hình thái giải phẫu quả thể nấm linh chi ............................. 22 3.1.5 Kết quả phân tích hình thái giải phẫu quả thể nấm hoàng chi ......................... 28 3.1.6. Kết quả phân tích thành phần hóa học trong quả thể ...................................... 29 3.2. Đề xuất quy trình nuôi trồng nấm hoàng chi trên giá thể rong giấy và phụ liệu 31 CHƢƠNG 4 .............................................................................................................. 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ....................................................................... 32 4.1. Kết luận .............................................................................................................. 32 4.2. Đề xuất ý kiến .................................................................................................... 33 PHỤ LỤC .................................................................................................................... 1 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.3. Thành phần sinh học của Rong Giấy ....................................................... 6 Bảng 2.1. Tỷ lệ thành phần cơ chất trong các nghiệm thức . ................................. 9 Bảng 3.1. Kết quả số liệu của hệ sợi nấm linh chi ở các nghiệm thức .................. 18 Bảng 3.2. Kết quả giải phẫu sinh học trong các nghiệm thức ................................ 28 Bảng 3.3. kết quả tính hiệu suất sinh học ở các nghiệm thức. ............................... 29 Bảng 3.4. Kết quả phân tích thành phần hóa học ................................................... 29 Bảng 3.5. Kết quả so sánh tổng hợp sự phát triển của nấm ở 2 môi trƣờng. ......... 30 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Rong giấy tại bờ biển Nha Trang - Khánh Hòa ..................................................... 5 Hình 3.1. Nấm hoàng chi sau 5 ngày phân lập trên môi trƣờng thạch ................................ 15 Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn tốc độ lan tơ nấm trên môi trƣờng thạch ................................ 15 Hình 3.3. Giống nấm hoàng chi trên môi trƣờng hạt sau 12 ngày cấy truyền từ môi trƣờng thạch cấp 1 ........................................................................................................................... 17 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn tốc độ tơ nấm trên môi trƣờng hạt lúa ....................................... 17 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn tốc độ lan tơ của tổ chức hệ sợi ở các nghiệm thức .................. 19 Hình 3.6. Màu sắc và tốc độ lan tơ nấm hoàng chi sau 16 ngày nuôi ở môi trƣờng truyền thống .................................................................................................................................... 20 Hình 3.7. Màu sắc và tốc độ lan tơ nấm hoàng chi sau 16 ngày ở môi trƣờng bổ sung 80 % rong giấy .............................................................................................................................. 21 Hình 3.8. Sự khác nhau về màu sắc, tốc độ lan tơ nấm hoàng chi giữa môi trƣờng truyền thống và môi trƣờng rong giấy sau 16 ngày ........................................................................ 21 Hình 3.9.Ụ nấm sau 10 ngày ở ......................................................................................... 22 Hình 3.10. Ụ nấm sau 10 ngày ở ........................................................................................ 22 Hình 3.11. Tai nấm ở MTTT ............................................................................................... 24 Hình 3.12. Tai nấm ở MT rong ............................................................................................ 24 Hình 3.13. Tác giả và sản phẩm nấm hoàng chi trên môi trƣờng rong giấy........................ 24 Hình 3.14. Sự khác nhau giữa quả thể nấm hoàng chi ở môi trƣờng rong và môi trƣờng truyền thống ......................................................................................................................... 25 Hình 3.15. Nấm hoàng chi thu trong đợt 2 ở môi trƣờng 80% rong giấy............................ 26 Hình 3.16. Loại nấm mốc (verticillum fungicola) ký sinh trên nấm hoàng chi ................... 27 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MTTT: môi trƣờng truyền thống NT : nghiệm thức RG : rong giấy MT : môi trƣờng 1 CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Nấm linh chi (tên khoa học là Ganoderma lucidum) là một loại dƣợc liệu quý đã đƣợc dùng trong y học cổ truyền để trị bệnh và bảo vệ sức khỏe từ lâu đời. Hiện nay có 6 loại nấm linh chi phổ biến đã đƣợc con ngƣời nghiên cứu đầy đủ và đang đƣợc sử dụng một cách rộng rãi, đó là: linh chi trắng (Bạch chi), linh chi vàng (Hoàng chi), linh chi xanh (Thanh chi), linh chi đỏ (Xích chi), linh chi tím (Tử chi), linh chi đen (Hắc chi). Nấm linh chi có tính bình, không độc, có tác dụng làm tăng trí nhớ, dƣỡng tim, bổ gan khí, an thần, chữa trị tức ngực. Với hệ hô hấp có tác dụng ích phổi, thông mũi, chữa ho nghịch hơi, an thần, ích tỳ khí. Nấm Linh Chi còn có các tác dụng chữa trị chứng bí tiểu, bổ thận khí, chữa trị đau nhức khớp xƣơng, gân cốt…Acid ganoderic cũng là một trong những thành phần chủ yếu của nấm linh chi nói chung và nấm hoàng chi nói riêng. Chất này có hoạt tính dƣợc lý rất mạnh, có tác dụng giảm đau, trấn tĩnh, ức chế sự phóng thích histamin tổ chức, giải độc, bảo vệ tế bào gan, giảm lipid máu và tiêu diệt tế bào ung thƣ. Theo Shiao và cộng sự (1994), dùng nấm linh chi có thể tăng khả năng miễn dịch và chữa đƣợc nhiều bệnh nhƣ: hen phế quản, huyết áp cao, mỡ trong máu, chống lão hóa, co thắt tim, an thần, đau nhức xƣơng, phòng ngừa bệnh ung thƣ, tốt cho hệ tiêu hóa, hệ bài tiết… Do đó số lƣợng các loài nấm linh chi dùng trong công nghệ dƣợc liệu ngày càng tăng. Ở Việt Nam có điều kiện tự nhiên, kinh tế và xã hội thuận lợi cho việc sản xuất nấm, tuy nhiên việc phát triển nấm dƣợc liệu còn khá chậm so với các nƣớc trong khu vực và trên thế giới và nghề trồng nấm cũng đang đứng trƣớc một số khó khăn nhƣ: Trình độ công nghệ của ngƣời sản xuất ở quy mô nhỏ lẻ, còn nhiều hạn chế, nhà xƣởng, trang thiết bị phục vụ cho sản xuất chƣa đƣợc đầu tƣ một cách bài bản có hệ thống. Bên cạnh đó số giống nấm đang sử dụng bị thoái hóa, thiếu nguồn giống gốc thay thế, quá trình sản xuất nhiều năm trên một diện tích dễ bị sâu bệnh phá hoại, chi phí đầu vào khá cao. Việc sử dụng nguồn giá thể để trồng loại nấm 2 dƣợc liệu không đƣợc phổ biến, chủ yếu trên mạt cƣa cao su, gỗ lim, vỏ hạt nhãn... Tuy nhiên nguồn nguyên liệu này không phải vô tận và không phải địa phƣơng nào cũng sẵn có. Theo Thạc sĩ Cổ Đức Trọng Trung tâm Nghiên cứu linh chi và nấm dƣợc liệu TP HCM, hiện nay lƣợng tiêu thụ nấm linh chi ở Việt Nam hàng năm là 70 tấn. Trong đó, lƣợng linh chi nhập về từ Trung Quốc khoảng 36 tấn, từ Hàn Quốc khoảng 17 tấn, số còn lại do trong nƣớc sản xuất. Tại khu vực Nha Trang - Khánh Hòa cho đến nay vẫn rất ít cơ sở nuôi trồng đƣợc nấm linh chi để cung cấp cho thị trƣờng, do đó hàng năm thị trƣờng này phải nhập một số lƣợng nấm linh chi khá lớn từ nơi khác về để phục vụ nhu cầu của ngƣời dân. Qua nghiên cứu về những đặc tính sinh học và sinh thái của nấm linh chi, chúng tôi nhận thấy tại khu vực Nha Trang - Khánh Hòa có đủ những điều kiện đảm bảo cho loài nấm này sinh trƣởng và phát triển tốt trong việc hình thành thể quả. Trong quá trình đa dạng hóa nguồn cơ chất để trồng nấm linh chi nhằm tạo ra đƣợc sản phẩm có hiệu suất sinh học và có giá trị dƣợc liệu cao, các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu, tìm hiểu, nuôi trồng khảo nghiệm loài nấm linh chi trên những loại giá thể khác nhau nhƣ: mạt cƣa, bã mía, vỏ hạt nhãn… Tuy nhiên ở mỗi loại môi trƣờng khác nhau thì sẽ cho giá trị sinh học nấm khác nhau. 1.2. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI  Xây dựng đƣợc quy trình kỹ thuật và tạo ra một công thức mới về nuôi trồng nấm linh chi với nguồn nguyên liệu từ rong biển.  Đóng góp vào bảo tàng nguồn cơ chất một loại giá thể mà nấm linh chi có thể sinh trƣởng và phát triển.  Tạo cơ sở khoa học cho tiến trình nghiên cứu về sau.  Nâng cao giá trị tiềm năng kinh tế của biển. 1.3. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI  Tận dụng nguồn rong Giấy dồi dào làm giá thể trồng nấm linh chi, giải quyết bài toán ô nhiễm môi trƣờng do rong Giấy đang gây ra. 3  Ứng dụng quy trình kỹ thuật, tận dụng nguồn rong để tạo ra sản phẩm Nấm hoàng chi có chất lƣợng tốt phục vụ đời sống.  Chuyển giao quy trình công nghệ cho ngƣời dân địa phƣơng. 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC 1.4.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NẤM TRÊN THẾ GIỚI Trong số trên 2000 loài nấm lớn đã đƣợc biết đến trên thế giới có khoảng 300 loài đƣợc xếp vào nhóm nấm đƣợc dùng để làm thuốc nhƣ nấm linh chi, nấm đầu khỉ, nấm ngân nhĩ, nấm phục linh nhĩ… Hiện nay nấm linh chi đƣợc sản xuất tập trung ở khu vực Châu Á, trong đó các nƣớc Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc là các nƣớc sản xuất lớn nhất. Đặc điểm của nghiên cứu khoa học về nấm dƣợc liệu ở Trung Quốc là có sự kết hợp chặt chẽ giữa các cơ quan nghiên cứu chuyên trách và cơ quan nghiên cứu dân lập, giữa nghiên cứu và đào tạo, nghiên cứu mau chóng chuyển thành sản xuất thƣơng phẩm. Phúc Kiến - Trung Quốc đã bỏ ra hơn 30 triệu USD nhập các loại công nghệ, thiết bị: máy hàn, thái lát, rút chân không nắn nắp, đóng túi, sấy khô…Đồng thời đi tham quan, khảo sát học tập kinh nghiệm và kỹ thuật tiên tiến của nhiều nƣớc trên thế giới. Viện Nghiên Cứu Nấm Tam Minh đã đi sâu vào nghiên cứu phân lập nhóm nấm dƣợc liệu thuần chủng nhƣ nấm đầu khỉ, nấm linh chi, ngân nhĩ...và kỹ thuật nuôi các đối tƣợng này. Để nhằm giảm giá thành của sản phẩm họ đã không ngừng nghiên cứu cải tiến phƣơng pháp nuôi trồng trên bình bằng nuôi trồng trên túi polime và đã nghiên cứu thành công phƣơng pháp lai đơn bào nhóm nấm dƣợc liệu để chọn loại nấm có chất lƣợng cao, sau đó đã sáng tạo công nghệ nuôi cấy nấm trên túi polime thay cho gỗ khúc. Tại Hàn Quốc, nấm linh chi đã đƣợc nuôi trồng nhân tạo ở quy mô lớn. Ngoài phƣơng pháp nuôi trồng trên thân gỗ, trên các bịch phụ phẩm nông lâm nghiệp đã nghiền nhỏ, còn có thể nuôi cấy chìm để thu nhận sinh khối trong các nồi lên men. 4 1.4.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NẤM LINH CHI Ở TRONG NƢỚC TS. NGÔ ANH khoa sinh trƣờng ĐH HUẾ là ngƣời đầu tiên ở nƣớc ta nuôi trồng thành công nấm hoàng chi trên giá thể mạt cƣa có bổ sung hàm lƣợng dƣỡng chất. Các nhà khoa học thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học thực vật (Viện Di truyền nông nghiệp Việt Nam) vừa nghiên cứu thành công trồng nấm linh chi trên bã mía, nguồn nguyên liệu dƣ thừa ở nhiều địa phƣơng. Nấm linh chi trồng trên bã mía cho năng suất cao. Khoa Sinh học, ĐH Khoa học Tự nhiên (ĐHQG Hà Nội) vừa hoàn thiện công nghệ sản xuất nấm linh chi từ bột sinh khối dạng sợi. Công nghệ này gồm các bƣớc: Tuyển chọn giống, nhân giống, xử lý nguyên liệu, phối trộn nguyên liệu, thanh trùng, cấy giống, lên men, thu hồi, sấy…Có thể nói đây là công nghệ mang tính đột phá trong ngành sản xuất nấm linh chi. TS. Trƣơng Bình Nguyên, Viện Sinh Học Tây Nguyên (Lâm Đồng), vừa thành công trong việc trồng thử nghiệm giống nấm mới có nguồn gốc từ Nhật Bản mang tên Bunashimeji, còn gọi là nấm linh chi nâu. Theo đề tài “Nghiên cứu nuôi trồng loài nấm Bunashimeji tại Đà Lạt - Lâm Đồng” của TS. Nguyên, khí hậu Đà Lạt rất phù hợp để trồng loại nấm này quanh năm, trừ ba tháng 5, 6, 7 khi nhiệt độ phòng lên trên 20ºC; cho kết quả về hình dáng và hàm lƣợng các chất protein, xơ, lipid... đều đạt chất lƣợng cao. Nghiên cứu của Viện cơ điện và nông nghiệp: “Trồng Nấm Linh Chi trên vỏ và hạt nhãn trên qui mô lớn” đƣợc đánh giá là mô hình sản xuất thân thiện với môi trƣờng và cho giá trị kinh tế rất cao. 5 1.4.3 TỔNG QUAN VỀ RONG GIẤY Hình 1.1. Rong giấy tại bờ biển Nha Trang - Khánh Hòa Rong Giấy (Ulva retieulata) là loài thực vật thủy sinh, có đời sống gắn liền với nƣớc. Rong Giấy sống ở biển, hấp thụ một lƣợng thức ăn phong phú chảy trôi dạt từ lục địa ra, rong có nhiều tính chất không giống thực vật sống trên cạn. Do đó trong rong Giấy chứa khá nhiều hàm lƣợng khoáng chất phù hợp cho hệ enzyme có trong nấm linh chi phân giải, chuyển hóa thành phần dinh dƣỡng nuôi tơ nấm và hình thành hệ sợi cho ra quả thể. Vì vậy nếu ứng dụng đƣợc nguồn nguyên liệu này làm cơ chất cho việc trồng nấm thì sẽ không phải bổ sung một số thành phần dinh dƣỡng nhƣ cám gạo, phân NPK, cám bắp. Đồng thời sẽ làm sạch đƣợc bờ biển, giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng do loài rong này đang trực tiếp gây ra. Qua phân tích chúng tôi thấy thành phần hóa học của rong Giấy khá cao. Kết quả thể hiện ở bảng sau: 6 Bảng 1.3. Thành phần sinh học của Rong Giấy (Phân tích mẫu tại Viện CNSH & MT-Trƣờng ĐH Nha Trang) Chỉ tiêu phân tích Tên mẫu Rong Giấy Protein (%) Gluxit (%) Khoáng Ca (mg/kg) 10,38 3,39 6,72 Trên cơ sở đó chúng tôi đã tiến hành “Nghiên cứu ứng dụng nuôi trồng nấm linh chi trên giá thể là rong Giấy và phụ liệu”, đề tài thành công sẽ mở ra một tiềm năng khai thác nguồn nguyên liệu vô cùng phong phú từ biển để phục vụ cho việc nuôi trồng, sản xuất nấm linh chi. Đồng thời sẽ đóng góp vào sự đa dạng hóa bảo tàng nguồn cơ chất mà nấm linh chi có thể sinh trƣởng và phát triển. 1.4.4. TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI 1.4.4.1. Đặc điểm sinh học của nấm linh chi * Hình dạng và màu sắc quả thể: Nấm linh chi (quả thể) gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến đối điện với mũ nấm). - Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đƣờng kính 0,5-3 cm. - Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm. Mũ nấm khi non có hình trứng, màu trắng đục, lớn dần có hình quạt. Trên mặt - mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím nhẵn bóng nhƣ láng vecni. Mũ nấm có đƣờng kính 2-15 cm, dày 0,8-1,2 cm, phần đính cuống thƣờng gồ lên hoặc hơi lõm. Khi nấm đến tuổi trƣởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm. Dinh dƣỡng: Sử dụng trực tiếp nguồn cellulose. 7 * Điều kiện nuôi trồng: - Độ thông thoáng: Trong suốt quá trình nuôi sợi và phát triển quả thể, nấm hoàng chi đều cần có độ thông thoáng tốt, nhà xƣởng phải sạch sẽ, thoáng. Nấm cần có oxy để phát triển vì vậy nhà trồng cần có độ thông thoáng vừa phải, nhƣng phải tránh gió lùa trực tiếp. - Ánh sáng: yếu tố này chỉ cần thiết trong giai đoạn ra quả thể nhằm kích thích nụ nấm phát triển. Nhà nuôi trồng nấm cần có ánh sáng khoảng 200 – 300 lux (ánh sáng khuếch tán – ánh sáng phòng). Quá trình hình thành quả thể, nấm hoàng chi không đƣợc tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời. - Độ ẩm: độ ẩm rất quan trọng đối với sự phát triển tơ và quả thể của nấm. Trong giai đoạn tăng trƣởng tơ, độ ẩm nguyên liệu yêu cầu từ 50 – 60%, còn độ ẩm không khí không đƣợc nhỏ hơn 70%. Ở giai đoạn tƣới đón nấm ra quả thể, độ ẩm không khí tốt nhất là 80 – 95%. Ở độ ẩm không khí 50%, nấm ngừng phát triển và có thể chết, tai nấm sẽ bị khô mặt và cháy vàng bìa mũ nấm. Nhƣng nếu độ ẩm cao trên 95%, tai nấm dễ bị nhũn và rũ xuống. - Nhiệt độ thích hợp: Giai đoạn ủ tơ: 200-300C Giai đoạn ra quả thể: 220-280C - Độ pH: Nấm linh chi chỉ thích nghi trong môi trƣờng trung tính đến axit hơi yếu (5,5-7). 8 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Nấm hoàng chi Loài nấm linh chi hiện nay có tên khoa học là: Ganoderma lucidum. Trong đề tài này chúng tôi chọn loài: Nấm hoàng chi (có tên khoa học là Ganoderma colossum), quả thể đƣợc tuyển chọn tại bảo tàng Vƣờn Quốc Gia Cát Tiên - Đồng Nai làm đối tƣợng nghiên cứu chính. Có đặc tính sinh học khá phù hợp điều kiện ở Nha Trang - Khánh Hòa và các địa phƣơng có khí hậu nóng ẩm. Họ : Ganodermataceae. Bộ : Ganodermatales Lớp : Hymenomycetes Ngành phụ : Basidiomycotina Giới : Nấm thật 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị  Ống nghiệm  Bông gòn không thấm nƣớc  Chai thủy tinh  Đèn cấy  Túi nilon chịu nhiệt  Panh cấy  Bình tam giác  Cân phân tích  Nồi hấp Autoclauve  Tủ sấy, tủ cấy vi sinh 2.1.3. Môi trƣờng và hóa chất  Môi truờng PGA cải tiến (môi trƣờng phân lập và nhân giống cấp 1): nƣớc chiết (*), Glucose, cao nấm men , Agar, vi lƣợng (KH2PO4, MgSO4…) (*) Nƣớc chiết gồm có: Giá đỗ, khoai tây, cà rốt. 9  Môi trƣờng hạt lúa (môi trƣờng nhân giống cấp 2): Thóc, cám gạo, CaCO3. Môi trƣờng nuôi trồng ra quả thể: Rong Giấy, mùn cƣa cao su, cám gạo, vôi bột. Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí Nghiệm Công nghệ Sinh học (Viện Công nghệ sinh học & Môi trƣờng – Trƣờng ĐH Nha Trang). 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Những nghiệm thức đƣợc thiết lập Bảng 2.1. Tỷ lệ thành phần cơ chất trong các nghiệm thức Tỷ lệ thành phần cơ chất ở các nghiệm thức (%) Mạt cƣa Bột đậu Cám Nghiệm 75 tƣơng gạo 1 22 CaCO3 Rong Nƣớc Đƣờng sạch 1 Đủ ẩm giấy 1 thức đối chứng (1) Nghiệm 49 1 50 Đủ ẩm 2 60 Đủ ẩm 3 70 Đủ ẩm 4 80 Đủ ẩm thức 2 Nghiệm 38 thức 3 Nghiệm 27 thức 4 Nghiệm 16 thức 5 10 2.2.2. Dự kiến quy trình thực nghiệm nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể rong Giấy và phụ liệu Rong giấy Tai nấm tự nhiên Xử lý và đóng bịch Bịch giá thể Giống cấp 1 Vô trùng Bịch giá thể vô trùng Giống cấp 2 Chăm sóc Đón hái nấm 2.2.2.1. Phân lập giống nấm hoàng chi cấp 1 bằng phƣơng pháp tách mô vô trùng Môi trƣờng thạch là môi trƣờng dùng để nhân giống cấp 1 trong sản xuất và cũng là môi trƣờng dùng để giữ giống, ở đây là môi trƣờng PGA cải tiến. Công thức môi trƣờng PGA cải tiến: - Nƣớc chiết (*) 1 lít. - Glucose 20 g. - Cao nấm men 1g, Agar 20g (*) Nƣớc chiết gồm có: 100g giá đỗ, 200g khoai tây, 100g cà rốt. Môi trƣờng PGA cải tiến đƣợc thực hiện nhƣ sau: Khoai tây, cà rốt, giá đỗ đƣợc gọt vỏ, rửa, cắt lát, cho vào nồi đun chung với giá đỗ, nƣớc, đun sôi khoảng 20 phút, lọc lấy nƣớc chiết và bổ sung nƣớc cất cho đủ 1 lít. Sau đó bổ sung thêm agar và cao nấm men, đun cho các chất này hòa tan đều vào nhau sau đó đợi nguội đến khoảng 11 500C (áp vào má có thể chịu đƣợc) đem rót vào trong các ống nghiệm, và bình tam giác, dùng để phân lập, cấy chuyền giống nấm và khảo sát tốc độ lan tơ của nấm. Với ống nghiệm rót 1/3 ống chiều dài ống nghiệm, còn với bình tam giác thì đổ dày khoảng 1 cm. Không đổ môi trƣờng vào các dụng cụ trên khi đang quá nóng vì hơi nƣớc sẽ đọng lại trên thành, nắp sau đó rơi xuống làm ƣớt bề mặt thạch. Cũng không đổ môi trƣờng khi đã nguội vì đang đổ có thể môi trƣờng đã bị đông vón lại. Sau đó khử trùng ở nhiệt độ 121,1oC (2500F), 1atm trong 25 phút sau đó để nguội. Để nhân giống đối tƣợng nghiên cứu trên môi truờng thạch chúng tôi tiến hành làm nhƣ sau: - Cấy các giống đã phân lập đƣợc từ ống giống thuần chủng sang các bình tam giác và ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn. - Ủ cho tơ nấm phát triển trong điều kiện nhiệt độ phòng 26 – 30oC, quá trình ủ tiến hành trong môi trƣờng ánh sáng khuếch tán nhẹ (ánh sáng phòng đọc). - Sau 2 ngày tơ nấm bắt đầu bung ra có màu trắng yếu, trong 2-4 ngày tơ nấm còn yếu nhƣng sau khoảng 1 tuần lễ thì tơ bắt đầu bung mạnh, 15 ngày sau ta có thể cấy truyền sang môi trƣờng cấp 2. 2.2.2.2. Nhân giống nấm hoàng chi trên môi trƣờng hạt lúa cấp 2 Môi trƣờng hạt lúa có bổ sung cám gạo là môi trƣờng chúng tôi chọn để nhân giống cấp 2 đối với đối tƣợng trên. Công thức môi trƣờng hạt: - Thóc hạt: 90% - Cám gạo: 8% - CaCO3 : 2% - Quá trình chuẩn bị môi trƣờng hạt đƣợc tiến hành nhƣ sau: Lúa ngâm trong nƣớc lạnh khoảng 12 giờ, rửa thật sạch sau đó cho vào nồi nấu đến khi hạt thóc nở bung ra thì ngừng lại, để ráo nƣớc, sau đó bổ sung thêm 8% cám gạo, 2% CaCO3. Mang đi khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 30 phút sau đó để nguội. Tiếp đó cấy giống từ trong môi trƣờng thạch vào trong chai có môi trƣờng hạt. 12 - Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng, sau khoảng 3 tuần lễ thì tơ nấm lan kín đáy bình và có thể chuyển sang môi trƣờng ra quả thể. 2.2.2.3. Xử lý nguyên liệu rong Giấy và phụ liệu - Rong giấy thu từ bờ biển Nha Trang – Khánh Hòa đƣợc xử lý sơ bộ bằng nƣớc ngọt. - Mạt cƣa sàng qua bằng rây lỗ nhỏ để loại bỏ các mảnh gỗ vụn, mang ủ trong 3-5 ngày. 2.2.2.4. Hấp vô trùng tạo bịch phôi và cấy từ môi trƣờng hạt qua Nguyên liệu sau khi đã đƣợc phối trộn và tạo độ ẩm thích hợp, ta cho vào túi nilon chịu nhiệt, nghiệm thức truyền thống có trọng lƣợng 900 (g), nghiệm thức bổ sung rong có trọng lƣợng 600 (g) dùng nút cao su chịu nhiệt làm cổ túi và lấy bông gòn không thấm nƣớc làm nút bông. Bịch nguyên liệu phải đƣợc đóng căng các góc. Sau đó mang những bịch môi trƣờng hấp ở nồi Autoclave trong 40 phút, hấp làm 2 lần, mỗi lần cách nhau 24 giờ. Bịch hấp xong, để nơi sạch sẽ trong 12-24 giờ, chờ nguội rồi mới cấy. Chúng tôi đã tiến hành đo nồng độ pH của bịch phôi, kết quả cho thấy pH là 6 - 6,5. Chúng tôi tiến hành cấy giống trong tủ cấy vi sinh vô trùng. 2.2.2.5. Chăm sóc và đón hái nấm Bịch sau khi cấy giống, đƣợc chuyển vào nhà ủ cho tơ nấm mọc, và nhà ủ cần thỏa mãn những yêu cầu sau:  Sạch, thoáng mát và không cần ánh sáng vì trong giai đoạn này để trong bóng tối sẽ hạn chế đƣợc sự phát triển của vi sinh vật, đồng thời tơ nấm cũng sẽ phát triển nhanh hơn.  Bịch đem ủ có thể xếp trên kệ và treo lên giàn, tuyệt đối không chồng chất lên nhau thành nhiều lớp, thời gian ƣơm kéo dài khoảng 25- 40 ngày, sợi nấm phát triển, ăn dần vào bịch nguyên liệu tạo nên màu trắng đồng nhất, bịch rắn chắc nhìn rất đẹp.  Tƣới nƣớc: khi nấm bắt đầu nhú ra khỏi miệng cổ nút bông, tiến hành tƣới nƣớc bên ngoài bịch nấm, về nguyên tắc tƣới nấm ở dạng phun sƣơng, trung bình mỗi ngày tƣới 2-3 lần tùy theo độ ẩm môi trƣờng.  Thu hái nấm: nấm linh chi ra ở dạng 1 tai xòe ra ở đầu cổ bông, hái nấm đúng tuổi sẽ cho năng suất cao, chất lƣợng tốt. 13 2.2.3. Phƣơng pháp thu nhận kết quả Mẫu đƣợc lấy theo phƣơng pháp lấy mẫu ngẫu nhiên. Tất cả số liệu thực nghiệm đƣợc đo 3 lần bằng thƣớc, đơn vị cm. Lấy giá trị trung bình. Hiệu suất sinh học của nấm hoàng chi trên giá thể là tỷ lệ giữa lƣợng thể quả thu hoạch/trọng lƣợng cơ chất. Khi nấm ra và đạt kích thƣớc tối đa, bắt đầu có biểu hiện già ta tiến hành thu hái. Quan sát hình thái bên ngoài, cắt ngang quả thể, đo chiều dài của tai nấm, chiều dài phi cuống nấm và tiến hành cân. Phân tích thành phần khoáng Ca, K của nghiệm thức chính. 2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng bảng tính Microsoft Excel 2003. 14 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nuôi trồng thực nghiệm Để bƣớc đầu khảo sát quy trình nuôi trồng, so sánh sự phát triển của tơ nấm trên môi trƣờng truyền thống và môi trƣờng mới, chúng tôi tiến hành trồng thử nghiệm nấm hoàng chi với các nghiệm thức trên môi trƣờng mới nhƣ đã nêu trong phần phƣơng pháp. 3.1.1. Kết quả phân lập giống cấp 1 bằng phƣơng pháp tách mô vô trùng Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, nấm hoàng chi (Ganoderma colossum) đƣợc phân lập trên môi trƣờng thạch PGA cải tiến, các mẫu không bị nhiễm bắt đầu có sợi nấm phát triển bao phủ xung quanh bề mặt mẫu sau 3-4 ngày cấy. Thu đƣợc giống cấp 1. Phƣơng pháp phân lập giống nhƣ sau: Từ tán nấm tƣơi thu hái, dùng nƣớc cất rửa 2 - 3 lần cho sạch, dùng bông thấm cồn 70 độ lau nhanh qua mặt ngoài tán nấm. Đƣa vào tủ cấy vô trùng dùng dao gọt bỏ toàn bộ phần bên ngoài của nấm, tách lấy phần mô vô trùng bên trong, cắt thành miếng mẫu bằng hạt gạo, chuyển vào môi trƣờng đã chuẩn bị ở trên, đem ủ trong tối ở nhiệt độ 270C. Đối với loài nấm linh chi thì việc phân lập trên môi trƣờng thuần khiết khá dễ dàng, chỉ sau 2 ngày thì tơ đã bắt đầu bung sợi. Khảo sát khả năng trƣởng hệ sợi nấm trên môi trƣờng PGA cải tiến ở nhiệt độ phòng (27±20C). Đây là môi trƣờng tối ƣu cho việc nhân giống cấp 1, bởi lẽ đây là môi trƣờng có chứa nhiều dinh dƣỡng và cũng là môi trƣờng đƣợc thuần khiết nhất.