Nghiên cứu tổng hợp L Dopa từ L Tyrosin

  • Số trang: 96 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 35 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP L-DOPA TỪ L-TYROSIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2013 BỘ Y TẾ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP L-DOPA TỪ L-TYROSIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ: 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu HÀ NỘI 2013 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian làm việc khẩn trƣơng đƣợc sự giúp đỡ tận tình của các thầy giáo, cô giáo, gia đình cùng bạn bè, tôi đã hoàn thành Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học “Nghiên cứu tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin”. Với tất cả sự kính trọng, trƣớc tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu và PGS. TS. Nguyễn Đình Luyện đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi nghiên cứu và thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Ngọc Chiến, DS. Nguyễn Văn Giang, DS. Vũ Đức Hoàn và CN. Phan Tiến Thành đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học và thực hiện Luận văn. Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo thuộc bộ môn Công nghiệp Dƣợc, Viện Công nghệ Dƣợc phẩm Quốc gia cũng nhƣ các thầy cô trong trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các thầy cô của Phòng Sau Đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này và đã dạy bảo tôi tận tình trong suốt hai năm học. Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, đặc biệt là bố mẹ tôi và lời cảm ơn chân thành đến bạn bè tôi, là nguồn động lực không thể thiếu, luôn bên tôi giúp đỡ tôi suốt thời gian đi học và trong suốt quá trình thực hiện đề tài Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học. Hà Nội, ngày 22 tháng 10 năm 2013 Học viên Phạm Thị Hiền MỤC ỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ L-DOPA ................................................................... 3 1.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa................................................. 3 1.1.2. Tác dụng dƣợc lý .............................................................................. 4 1.1.3. Các phƣơng pháp điều chế L-dopa ................................................... 7 1.2. TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU L-TYROSIN .............................. 18 1.2.1. Cấu trúc hóa học ............................................................................. 18 1.2.2. Phƣơng pháp điều chế ..................................................................... 19 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 20 2.1. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ ................................................... 20 2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu............................................... 20 2.1.2. Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu...................................... 21 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 22 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 22 2.3.1. Tổng hợp hóa học ........................................................................... 22 2.3.2. Tinh chế sản phẩm và các chất trung gian ...................................... 23 2.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất trung gian và sản phẩm .......... 23 2.3.4. Xác định cấu trúc sản phẩm ............................................................ 23 2.3.5. Xác định một số chỉ tiêu định tính và định lƣợng sản phẩm theo chuyên luận Dƣợc điển Anh 2009 ............................................................ 23 2.3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................. 24 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 25 3.1. TỔNG HỢP L-DOPA TỪ L-TYROSIN .............................................. 25 3.1.1. Tổng hợp L-tyrosin methyl ester (9)............................................... 25 3.1.2. Tổng hợp O,N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester (10) ...................... 26 3.1.3. Tổng hợp ß-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)–N-acetyl-L-alanin (11) . 29 3.1.4. Tổng hợp L-dopa (LD) ................................................................... 35 3.2. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH CHẾ L-DOPA CÓ HÀM LƢỢNG ĐẠT TIÊU CHUẨN DƢỢC ĐIỂN ANH 2009 .......................................... 37 3.3. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ VẬT LÝ VÀ CẤU TRÚC CÁC CHẤT TRUNG GIAN VÀ SẢN PHẨM TẠO THÀNH ........................................ 38 3.3.1. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy ....................................................... 38 3.3.2. Kết quả đo năng suất quay cực ....................................................... 39 3.3.3. Kết quả phân tích cấu trúc các hợp chất ......................................... 40 3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG LDOPA THEO CHUYÊN LUẬN DƢỢC ĐIỂN ANH 2009 ....................... 42 3.4.1. Định tính ......................................................................................... 43 3.4.2. Mất khối lƣợng do làm khô ............................................................ 43 3.4.3. pH .................................................................................................... 43 3.4.4. Định lƣợng ...................................................................................... 43 Chƣơng 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 46 4.1. VỀ CÁC PHẢN ỨNGTỔNG HỢP L-DOPA TỪ L-TYROSIN ......... 46 4.1.1. Về phản ứng ester hóa L-tyrosin tạo L-tyrosin methyl ester .......... 46 4.1.2. Về phản ứng acyl hóa tạo O,N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester .... 46 4.1.3. Về phản ứng chuyển vị Fries tạo β-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-Nacetyl-L-alanin (11) .................................................................................. 47 4.1.4. Về phản ứng oxy hóa và thủy phân 11 tạo L-dopa ......................... 49 4.1.5. Về phƣơng pháp tinh chế sản phẩm L-dopa ................................... 50 4.2. VỀ CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TRUNG GIAN VÀ SẢN PHẨM50 4.2.1. Phồ hồng ngoại ............................................................................... 50 4.2.2. Phổ khối lƣợng ................................................................................ 51 4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton................................................ 52 4.3. VỀ CHẤT LƢỢNG NGUYÊN LIỆU L-DOPA TỔNG HỢP ĐƢỢC 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 55 KẾT LUẬN .................................................................................................. 55 KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 H-NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear magnetic resonance spectroscopy) Ac : Acetyl (CH3CO-) BP : Dƣợc điển Anh (British Pharmacopoeia) dd : Dung dịch Et : Ethyl (C2H5-) h : giờ HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) INN : Tên chung quốc tế (International Nonproprietary Name) IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) IUPAC : Danh pháp Hóa học theo Hiệp hội Hóa học Quốc tế (International Union of Pure and Applied Chemistry Nomenclature) KL : Khối lƣợng LD : L-dopa Me : Methyl (CH3-) MS : Phổ khối lƣợng (Mass spectroscopy) Rf : Hệ số lƣu giữ (Retention factor) SKLM : Sắc ký lớp mỏng TT : Thể tích UV : Phổ tử ngoại (Ultraviolet spectroscopy) DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU STT Bảng 2.1. Bảng 3.1. Bảng 3.2. Bảng 3.3. Bảng 3.4. Bảng 3.5. Bảng 3.6. Bảng 3.7. Bảng 3.8. Bảng 3.9. Bảng 3.10. Bảng 3.11. Bảng 3.12. Bảng 3.13. Bảng 3.14. Bảng 3.15. Bảng 3.16. Bảng 3.17. Tên bảng Trang Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu 20 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất 27 phản ứng acyl hóa Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của t lệ mol anhydrid 28 acetic: ester 9 đến hiệu suất phản ứng acyl hóa Kết quả thực hiện phản ứng ở quy mô lớn 28 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến 33 hiệu suất phản ứng chuyển vị Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của t lệ lƣợng nguyên liệu 34 10 so với lƣợng chất xúc tác cần dùng đến hiệu suất phản ứng chuyển vị Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của lƣợng H2O2 37 Kết quả tinh chế sản phẩm 38 Bảng Tonc của các chất trung gian và sản phẩm L-dopa 39 Bảng giá trị năng suất quay cực các chất trung gian và 39 sản phẩm L-dopa Kết quả phân tích phổ IR 41 Kết quả phân tích phổ MS 42 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR 42 Kết quả xác định hàm ẩm của L-dopa theo phƣơng pháp 43 mất khối lƣợng do làm khô Kết quả xác định hệ số hiệu chỉnh K của dd HClO4 0,1N 44 Kết quả xác định lƣợng L-dopa 45 Bảng tóm tắt kết quả định tính, định lƣợng L-dopa theo 45 BP 2009 So sánh kết quả phân tích phổ của D-dopa và L-dopa 53 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT Tên hình Trang Hình 3.1. SKLM của phản ứng tổng hợp L-tyrosin methyl ester (9) 25 Hình 3.2. SKLM của ß-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L- 31 alanin Hình 3.3. SKLM của phản ứng tổng hợp L-dopa (1) 36 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Tên sơ đồ STT Trang Sơ đồ 1.1. Sinh tổng hợp L-dopa từ dẫn chất của L-tyrosin Sơ đồ 1.2 Sinh tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của L. Xun Sơ đồ 1.3. Tổng hợp 9 10 L-dopa theo phƣơng pháp của M. 11 L-dopa theo phƣơng pháp của H. 11 Lewandowski Sơ đồ 1.4. Tổng hợp Bretschneider Sơ đồ 1.5. Tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của A. M. Krubiner 13 Sơ đồ 1.6. Tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của L. Bernardi 14 Sơ đồ 1.7. Tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của A. Kaiser 15 Sơ đồ 1.8. Tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của S. W. Knowles 16 Sơ đồ 1.9. Tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của F. D. Reinhold 17 Sơ đồ 1.10. Tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của V. Cannata 18 Sơ đồ 2.1. Quy trình tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin 22 Sơ đồ 3.1. Tổng hợp L-dopa từ 3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N- 35 acetyl-L-alanin Sơ đồ 4.1. Cơ chế phản ứng Fries (nội phân tử) 48 Sơ đồ 4.2. Cơ chế phản ứng Fries (liên phân tử) 48 Sơ đồ 4.3. Cơ chế phản ứng chuyển vị Baeyer-Villiger 50 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thế k qua, tuổi thọ trung bình của loài ngƣời đã tăng thêm hơn 30 năm. Đây là một trong những thành tựu vĩ đại nhất của loài ngƣời. Thành tựu này, cùng với sự tăng nhanh của dân số đồng nghĩa với số ngƣời cao tuổi trên thế giới sẽ tăng từ 600 triệu ngƣời năm 2000 lên 2 t ngƣời năm 2025. Các nƣớc đang phát triển sẽ là nơi có t lệ ngƣời cao tuổi tăng cao và nhanh nhất. Cùng với sự gia tăng của tuổi thọ trung bình, mô hình bệnh tật của các nƣớc cũng đang thay đổi nhanh chóng theo hƣớng gia tăng nhanh các bệnh không lây nhiễm của ngƣời cao tuổi. Một trong các bệnh phổ biến, thƣờng gặp là bệnh Parkinson. Tại Mỹ, t lệ mắc bệnh trong cộng đồng là 120/100.000 dân da trắng, ở lứa tuổi trên 65 t lệ đó là 1-1,5%. Ở Châu Âu, t lệ mắc bệnh Parkinson ở những ngƣời trên 65 tuổi là 1,6%. Tại Việt Nam, t lệ mắc bệnh Parkinson so với các bệnh thần kinh khác là khoảng 1,6%. Parkinson là một bệnh gây ra do hậu quả của những thƣơng tổn thoái hóa một số nhân xám ở nền não, kiểm soát các hoạt động bán tự động và tự động. Sự thƣơng tổn của nhân sẽ trực tiếp hay gián tiếp ảnh hƣởng tới hệ vận động và gây những triệu chứng ngoài bó tháp nhƣ: mất các động tác cần có sự tham gia của ý muốn; giải phóng các động tác tự động hoặc bất thƣờng gây run; tăng trƣơng lực cơ gây tƣ thế cứng nhắc. Hiện nay, ngƣời ta nhận thấy trong bệnh Parkinson có sự giảm sút rất rõ rệt hàm lƣợng dopamin - một chất trung gian hóa học quan trọng trong chức phận của các cấu trúc ngoài bó tháp nhƣ nhân đuôi, nhân bèo, liềm đen. Vì vậy trong điều trị bệnh Parkinson, ngƣời ta hay dùng loại thuốc chính là các thuốc cƣờng hệ dopaminergic, trong đó L-dopa là thuốc chủ chốt. L-dopa thay thế dopamin trong điều trị các hội chứng suy tháp ở bệnh nhân bị Parkinson. Ƣu điểm của L-dopa là bổ sung dopamin kịp thời và đúng cơ chế bệnh sinh [3,5]. 1 Tuy nhiên, trên thị thƣờng Việt Nam, các biệt dƣợc chứa L-dopa đều có nguồn gốc nhập khẩu. Cho đến nay, chƣa thấy có cơ sở nào trong nƣớc nghiên cứu tổng hợp L-dopa. Vì vậy giá thành các thành phẩm chứa L-dopa còn rất cao. Mặt khác, nguyên liệu để tổng hợp L-dopa là L-tyrosin (sản phẩm thủy phân keratin) và nguyên liệu này có thể tự túc trong nƣớc. Do vậy, để góp phần nghiên cứu tổng hợp nguyên liệu làm thuốc, đề tài “Nghiên cứu tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin” đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng quy trình tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin ở quy mô phòng thí nghiệm. 2. Tổng hợp và tinh chế L-dopa đạt tiêu chuẩn về hàm lƣợng theo chuyên luận Dƣợc điển Anh 2009. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ L-DOPA 1.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa 1.1.1.1. Cấu trúc hóa học - Công thức phân tử: C4H11NO4 - Phân tử lƣợng: 197,19 đvC. - Thành phần: 54,82% C; 5,62% H; 7,1% N; 32,45% O. - Danh pháp INN: Levodopa - Danh pháp IUPAC: Acid (S)-2-amino-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic - Tên khác: L-dopa (-)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanin β-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanin Acid (-)-2-amino-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic 3-hydroxy-L-tyrosin [35]. 1.1.1.2. Tính chất lý hóa  Tính chất vật lý: - Tinh thể không màu hoặc bột kết tinh trắng, không mùi, không vị. - Kết tinh tinh thể hình kim từ nƣớc, có nhiệt độ nóng chảy 276-278oC (kèm phân hủy) [35], cũng có tài liệu công bố là 284-286oC [47]. - Ít tan trong nƣớc (66mg/40ml); tan tốt trong dung dịch acid HCl loãng và acid formic. Đặc biệt không tan trong các các chất hữu cơ thông thƣờng (ethanol, benzen, cloroform, ethyl acetat…) [35]. 3 - Độ quay cực riêng = -13,1 (nồng độ 5,12 trong dung dịch HCl 1N) =160 đến 167o (c=2% kl/tt trong dung dịch HCl 1N) [43] và [35], = -11,5o (c=1% kl/tt trong dd HCl 1N) [12]. - Cực đại hấp thụ λmax (HCl 0,001N): 220,5 nm và 280 nm (log ε 3,79 và 3,42) [35].  Tính chất hóa học: Do có cấu trúc của một α-amino acid, chứa nhóm -NH2 và -COOH nên LD cho các phản ứng đặc trƣng của α-amino acid: Phản ứng với ninhydrin, với fluorescamin, phản ứng Biuret, Edman, Sanger. Mặt khác, LD còn có các phản ứng đặc trƣng cho các nhóm amin và acid carboxylic nhƣ phản ứng acyl hóa, phản ứng formyl hóa hay ester hóa. Do trong cấu trúc LD có chứa nhóm 3,4-dihydroxyphenyl nên khi có mặt của hơi nƣớc, LD rất dễ bị oxy hóa bởi oxy không khí và trở nên đen [24]. 1.1.2. Tác dụng dƣợc lý LD lần đầu tiên đƣợc chiết xuất vào năm 1913. Ban đầu, LD đƣợc tuyên bố không có hoạt tính sinh học. Bắt đầu từ năm 1927 các nhà hóa học phát hiện rằng LD có khả năng gây giảm huyết áp động mạch. Tới năm 1938, Peter Holz đã chứng minh LD chuyển hóa thành dopamin trong tế bào động vật có vú. Trong những năm tiếp theo, LD vẫn đƣợc nghiên cứu nhƣ là một tiền thân của adrenalin. Mãi tới năm 1959, tác dụng của LD với bệnh Parkinson mới đƣợc phát hiện. Từ những năm đầu 1960, LD đƣợc coi nhƣ là tiêu chuẩn điều trị vàng cho căn bệnh này. Với sự khởi đầu không may mắn, lịch sử nghiên cứu LD đƣợc so sánh với những tiến bộ của khoa học trong việc nhận thức đƣợc ý nghĩa của các chất dẫn truyền thần kinh, đặc biệt là vai trò của dopamin trong việc kiểm soát chức năng dây thần kinh vận động trung ƣơng [23]. 4 Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng của LD Ở trạng thái sinh lý bình thƣờng, các tế bào thần kinh dopaminergic hoạt động cân bằng với các tế bào thần kinh cholinergic. Trong bệnh Parkinson, sự suy giảm chức năng của các tế bào thần kinh dopaminergic khiến các tế bào cholinergic phải tăng cƣờng họat động, hậu quả là gây ra những cơn rung giật. Các triệu chứng đó của bệnh Parkinson có liên quan đến sự giảm dopamin trong thể vân. Trong các liệu pháp điều trị thay thế bằng dopamin ngoại vi, đều gây tác dụng dƣợc lý lên hệ thống mạch máu và không qua đƣợc hàng rào máu não (Blood-Brain Barrier - BBB), do đó không có tác dụng trong điều trị Parkinson. Trong trƣờng hợp này sẽ phải sử dụng chất tiền thân của dopamin là L-dopa. Đó đƣợc coi là cơ chế để LD giảm nhẹ đƣợc các triệu chứng của bệnh Parkinson. Nếu uống riêng LD, thuốc bị khử carboxyl nhiều với các enzym ở niêm mạc ruột và các vị trí ngoại biên khác, do đó thuốc chƣa bị biến đổi tới đƣợc tuần hoàn não tƣơng đối ít và chỉ có khoảng dƣới 1% thuốc vào đƣợc hệ thần kinh trung ƣơng. Ngoài ra, dopamin đƣợc giải phóng vào tuần hoàn do sự khử carboxyl LD ở ngoại biên gây tác dụng phụ, đặc biệt là buồn nôn. Ức chế enzym decarboxylase ở ngoại biên làm tăng rõ rệt lƣợng LD qua hàng rào máu não để phát huy tác dụng và giảm tác dụng không mong muốn trên đƣờng tiêu hóa. Carbidopa là chất ức chế enzym decarboxylase ở ngoại biên hay đƣợc sử dụng. Nhằm cải thiện khả năng thấm của L-dopa qua hàng rào máu não, thƣờng sử dụng tolcapon và entacapon nhƣ là chất ức chế enzym catechol-O-methyltransferase (ICOMT) [10,11,33,42]. Dược động học LD hấp thu nhanh qua đƣờng tiêu hóa. Thức ăn làm chậm hấp thu LD. Một lƣợng đáng kể LD bị chuyển hóa qua dạ dày và ruột. LD phân bố rộng rãi trong phần lớn các mô. Thời gian bán thải LD trong huyết tƣơng là khoảng 1 giờ. Khi uống phối hợp carbidopa và levodopa, thời gian bán thải của LD 5 trong huyết tƣơng tăng lên 1,5-2 giờ. Khoảng 80-85% LD bài xuất qua nƣớc tiểu trong vòng 24 giờ [17,27,34]. Chỉ định LD đƣợc sử dụng trong tất cả các thể hội chứng Parkinson (ngoại trừ các trƣờng hợp hội chứng ngoại tháp do thuốc gây ra): Bệnh parkinson tự phát, hội chứng Parkinson sau viêm não, hội chứng Parkinson do xơ cứng động mạch não, hội chứng Parkinson sau tổn thƣơng hệ thần kinh trung ƣơng do nhiễm độc carbon monooxyd hoặc bởi mangan [3,5,9,17,27,34]. Dạng thuốc và hàm lượng - Viên nén 10mg, 20mg, 25mg. - Dạng giải phóng ổn định chứa 50mg. - Viên nang phóng thích chậm 125mg, 250mg [5]. Liều lượng và cách dùng LD chỉ có sẵn ở dạng phối hợp: L-dopa và chất ức chế dopadecarboxylase. Các thuốc này đƣợc khuyến cáo sử dụng lúc đói hoặc khi ăn một ít thức ăn và việc mở viên nang hoặc hòa tan viên nén là điều nên tránh do sẽ làm mất tác dụng của các chất ức chế dopa-decarboxylase. - Liều tối ƣu của levodopa cần đƣợc xác định với từng ngƣời bệnh. Thƣờng khởi đầu từ liều thấp nhất có thể để giảm sự co cứng và mất hoạt động cơ đồng thời tránh sự xuất hiện của những cử động bất thƣờng. - Ở ngƣời trẻ tuổi, liều dùng hàng ngày thƣờng nằm trong khoảng 750 đến 1250 mg/24h chia ra 3-6 lần để làm giảm thiểu sự biến đổi tác dụng giữa các thời điểm khác nhau trong ngày. Đối với ngƣời cao tuổi, liều mỗi lần dùng thuốc bằng 2/3 so với liều dùng của ngƣời trẻ tuổi. - Dạng giải phóng kéo dài cho phép giảm số lần sử dụng thuốc còn 3 lần/ngày dẫn đến giảm bớt số lần đạt nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng. Nếu khoảng cách giữa những lần dùng thuốc nhỏ hơn 4h, hoặc liều thuốc dùng mỗi lần không bằng nhau, liều thấp nhất sẽ đƣợc dùng vào cuối ngày [5,34]. 6 Biệt dược Madopar, Madopar dispersible, Madopar LP (Roche), Sinemet, Sinemet LP (Merck), Nacom (Bristol-Myers Squibb), Stalevo (Novartis), Doparl (Kyowa Hakko), Parkopa (Schwarz), Duodopa® (Abbott)…[5]. 1.1.3. Các phƣơng pháp điều chế L-dopa 1.1.3.1. Chiết xuất LD từ thiên nhiên LD đƣợc chiết xuất lần đầu tiên từ Vicia faba [40,47] và sau đó là từ hạt của cây Mucuna pruriens [18,21]. Sau đó đã có rất nhiều nghiên cứu chiết xuất LD từ nhiều loài khác nhau: Mucuna sp., Euphorbia sp., Bauhinia sp., Canavalia sp., Cassia sp., Vicia sp., Alycarpus sp., Parkinsonia sp., [37]. Hàm lƣợng L-dopa chiết xuất đƣợc nhiều nhất từ hạt của cây: Mucuna birdwoodiana (9,1%), Mucura andreana (6,3-8,5%)… [21,25,37]. Một số phƣơng pháp chiết đƣợc tóm tắt nhƣ sau: Với các cây thuộc loài Mucuna sp.: Cây/ hạt đƣợc ngâm trong nƣớc tạo hỗn dịch. Sau đó đƣợc acid hóa dịch bằng acid formic 2% (tt/tt). Tạo dung dịch đồng nhất rồi làm lạnh. Ly tâm hỗn dịch. Lọc thu dịch. Từ dịch thu lấy L-dopa bằng sắc ký lỏng [46]. Với cây giống này, một số tác giả chiết xuất Ldopa theo phƣơng pháp khác: Hỗn dịch nƣớc chứa hạt giống cây đƣợc đun hồi lƣu trong EtOH 70%. Cất thu hồi ethanol và chiết với xăng để loại các tạp lipid. Pha nƣớc đƣợc nạp vào một cột sắc ký trao đổi ion H+-Dowex 50 Wx8. Rửa cột với HCl 0,01N thu đƣợc L-dopa [18]. Với nguyên liệu là Vicia faba: L-dopa thu đƣợc từ bột xay thô mịn của đậu mèo rừng đất bằng cách chiết xuất với acid sulfuric loãng. Protein trong đó phải đƣợc kết tủa bằng dung dịch chì acetat. Sau khi lọc bỏ protein kết tủa, phần dịch lọc đƣợc kiềm hoá nhẹ để kết tủa muối chì của L-dopa. L-dopa sau đó thu đƣợc bằng cách phân hủy muối chì với hydro sulfid [47]. 7 1.1.3.2. Sinh tổng hợp LD  Phương pháp của J. C. Sih và cộng sự (1969) Các tác giả sinh tổng hợp LD từ L-tyrosin nhờ vi sinh vật có khả năng chuyển đổi từ L-tyrosin sang LD nhƣ: Asperigillus ocharaceus, Asperigillus priori, Penicillium duclauxi, Gliocladium deliquescens, Memmoniella echinata, Trichoderma viride… Trong quá trình lên men, các tác giả cho thêm vào môi trƣờng acid ascorbic để tránh sự tạo thành melanin. Phƣơng pháp đƣợc thực hiện nhƣ sau: Trong môi trƣờng đậu tƣơng dextrose chứa G. deliquescens, thêm N-formyl-L-tyrosin và acid L-ascorbic. Sau 44 giờ lên men, acid hóa dịch lên men, sau đó tách chiết với n-butanol. Loại bỏ nhóm formyl bằng cách cho tác dụng với HCl 5N trong 8 giờ ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp của L-tyrosin và L-dopa thu đƣợc đƣợc tách bằng sắc ký trao đổi ion dạng H+-Dowex-50-4X (200-400 mesh). Rửa cột với HCl 0,75N cho 25,3% L-dopa, 57% L-tyrosin [41].  Phương pháp của K. Haneda và cộng sự (1971) LD có thể đƣợc sinh tổng hợp một cách có hiệu quả từ L-tyrosin trong môi trƣờng acid bởi chủng nấm Aspergillus Oryzae, A. Chevalieri và một số loại nấm khác. Quy trình sinh tổng hợp tiến hành nhƣ sau: - Nuôi cấy tế bào nấm trong môi trƣờng thích hợp (glucose, amoni clorid, kali dihydrophosphat, magnesi sulfat, polypepton, cao nấm men) ở 30oC trong 2 đến 3 ngày. - Thu sinh khối nấm, tạo hỗn dịch với L-tyrosin, rồi ủ trong điều kiện kỵ khí. - Thêm acid ascorbic và cung cấp oxy để tạo quá trình hydroxyl hóa trong 1 hoặc vài giờ: pH của môi trƣờng rất quan trọng và điều kiện tối ƣu nằm trong khoảng acid (pH từ 2 đến 5). Các tế bào A. oryzae IAM 2625 đƣợc nuôi cấy 45 giờ trong môi trƣờng vừa đề cập ở trên, thêm dung dịch đệm acetat (pH=3,5) có chứa L-tyrosin 0,25% và acid L-ascorbic ở 45oC 8 - Tách chiết, tinh chế bằng sắc ký cột thu lấy LD từ dịch lên men. Sản phẩm có nhiệt độ nóng chảy 275-278oC [22].  Phương pháp của J. Florent và cộng sự (1972) Các tác giả cũng sử dụng vi khuẩn (Vibrio tyrosinaticus) làm xúc tác cho quá trình hydroxyl hóa vi sinh học để chuyển L-tyrosin thành LD. Quá trình đƣợc tiến hành gồm các bƣớc chính sau: - Vibrio tyrosinaticus đƣợc nuôi cấy trên thạch (cao nấm men, pepton, cao thịt, glucose, NaCl, pH 6 đến 7,8), sau đó chuyển môi trƣờng sang bình lắc ở 26oC, trong 16h. - Môi trƣờng thu đƣợc đƣợc lên men trong 27 giờ, pH môi trƣờng 4-7. - Tách chiết, tinh chế bằng sắc ký cột thu lấy LD từ dịch lên men [19].  Phương pháp của E. F. Semersky và cộng sự (1974) Sơ đồ 1.1. Sinh tổng hợp L-dopa từ dẫn chất của L-tyrosin Trong phƣơng pháp này, các tác giả sinh tổng hợp LD và các dẫn xuất từ L-tyrosin và dẫn xuất, sử dụng phản ứng oxy hóa bằng enzym, tiếp theo là phản ứng khử và thủy phân sản phẩm oxy hóa. Enzym sử dụng trực tiếp là tyrosinase [39].  Phương pháp của S. Chattopadhayay và cộng sự (1990) L-tyrosin đƣợc chuyển thành LD bởi một bƣớc phản ứng oxy hóa xúc tác bởi tyrosinase hoặc tyrosin hydroxylase trong cơ thể sống. Các bƣớc sinh tổng hợp LD đƣợc tiến hành nhƣ sau: 9 - Nuôi cấy tế bào nấm trong môi trƣờng: glucose, amoni sulfat, kali dihydrophosphat, magnesi sulfat, pepton, sắt lactat, thạch aga, pH 6,5; có thêm L-tyrosin trong 48 giờ. - Xử lý dịch nuôi cấy với nƣớc thu dịch chứa sợi nấm. Ủ tĩnh ở 28oC. - Tách chiết, tinh chế thu lấy LD bằng sử dụng sắc ký cột [15].  Phương pháp của L. Xun và cộng sự (1998) Trong phƣơng pháp này, LD đƣợc sinh tổng hợp từ L-tyrosin với sự có mặt của một enzym xúc tác là 4-hydroxyphenylacetat-3-hydroxylase (HPAH) với oxy và dạng khử của beta-nicotinamid adenin dinucleotid (NADH). Sử dụng Escherichia coli làm vật chủ chứa gen mang thông tin di truyền của enzym. Sơ đồ sinh tổng hợp: Sơ đồ 1.2. Sinh tổng hợp L-dopa theo phương pháp của L. Xun Tiến hành theo các bƣớc chính sau: - Chuẩn bị hỗn dịch tế bào với phần lớn là vi khuẩn chứa HPAH có hoạt tính. - Thêm L-tyrosin và một chất nền vào hỗn dịch tế bào để tạo thành một hỗn hợp có hoạt tính. - Ủ hỗn hợp có hoạt tính một thời gian thu đƣợc LD [48].  Phương pháp của M. Kramer và cộng sự (2006) Trong phƣơng pháp này, LD đƣợc sản xuất trong môi trƣờng lên men kỵ khí của vi sinh vật tái tổ hợp gen (Escherichia coli) chứa enzym L-tyrosin3-hydroxy-monooxygenase có hoạt tính và ở các chu trình chuyển hóa tối thiểu: sự thủy phân glucose, chu trình pentose phosphat, chu trình amino acid thơm và các chu trình dẫn xuất của nó, bao gồm một pha sinh trƣởng và một 10
- Xem thêm -