BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
PHẠM THỊ HIỀN
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP
L-DOPA TỪ L-TYROSIN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
HÀ NỘI 2013
BỘ Y TẾ
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
PHẠM THỊ HIỀN
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP
L-DOPA TỪ L-TYROSIN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ
MÃ SỐ: 60720402
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
HÀ NỘI 2013
LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian làm việc khẩn trƣơng đƣợc sự giúp đỡ tận tình của các
thầy giáo, cô giáo, gia đình cùng bạn bè, tôi đã hoàn thành Luận văn Thạc sĩ
Dƣợc học “Nghiên cứu tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin”.
Với tất cả sự kính trọng, trƣớc tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
thầy giáo PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu và PGS. TS. Nguyễn Đình
Luyện đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ
tôi nghiên cứu và thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Ngọc Chiến, DS.
Nguyễn Văn Giang, DS. Vũ Đức Hoàn và CN. Phan Tiến Thành đã giúp đỡ
và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học và thực hiện
Luận văn.
Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo thuộc bộ môn
Công nghiệp Dƣợc, Viện Công nghệ Dƣợc phẩm Quốc gia cũng nhƣ các thầy
cô trong trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các thầy cô của Phòng Sau Đại học đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này và đã dạy
bảo tôi tận tình trong suốt hai năm học.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, đặc biệt là bố
mẹ tôi và lời cảm ơn chân thành đến bạn bè tôi, là nguồn động lực không thể
thiếu, luôn bên tôi giúp đỡ tôi suốt thời gian đi học và trong suốt quá trình
thực hiện đề tài Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học.
Hà Nội, ngày 22 tháng 10 năm 2013
Học viên
Phạm Thị Hiền
MỤC ỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ L-DOPA ................................................................... 3
1.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa................................................. 3
1.1.2. Tác dụng dƣợc lý .............................................................................. 4
1.1.3. Các phƣơng pháp điều chế L-dopa ................................................... 7
1.2. TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU L-TYROSIN .............................. 18
1.2.1. Cấu trúc hóa học ............................................................................. 18
1.2.2. Phƣơng pháp điều chế ..................................................................... 19
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 20
2.1. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ ................................................... 20
2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu............................................... 20
2.1.2. Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu...................................... 21
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 22
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 22
2.3.1. Tổng hợp hóa học ........................................................................... 22
2.3.2. Tinh chế sản phẩm và các chất trung gian ...................................... 23
2.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất trung gian và sản phẩm .......... 23
2.3.4. Xác định cấu trúc sản phẩm ............................................................ 23
2.3.5. Xác định một số chỉ tiêu định tính và định lƣợng sản phẩm theo
chuyên luận Dƣợc điển Anh 2009 ............................................................ 23
2.3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................. 24
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 25
3.1. TỔNG HỢP L-DOPA TỪ L-TYROSIN .............................................. 25
3.1.1. Tổng hợp L-tyrosin methyl ester (9)............................................... 25
3.1.2. Tổng hợp O,N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester (10) ...................... 26
3.1.3. Tổng hợp ß-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)–N-acetyl-L-alanin (11) . 29
3.1.4. Tổng hợp L-dopa (LD) ................................................................... 35
3.2. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH CHẾ L-DOPA CÓ HÀM LƢỢNG
ĐẠT TIÊU CHUẨN DƢỢC ĐIỂN ANH 2009 .......................................... 37
3.3. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ VẬT LÝ VÀ CẤU TRÚC CÁC CHẤT
TRUNG GIAN VÀ SẢN PHẨM TẠO THÀNH ........................................ 38
3.3.1. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy ....................................................... 38
3.3.2. Kết quả đo năng suất quay cực ....................................................... 39
3.3.3. Kết quả phân tích cấu trúc các hợp chất ......................................... 40
3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG LDOPA THEO CHUYÊN LUẬN DƢỢC ĐIỂN ANH 2009 ....................... 42
3.4.1. Định tính ......................................................................................... 43
3.4.2. Mất khối lƣợng do làm khô ............................................................ 43
3.4.3. pH .................................................................................................... 43
3.4.4. Định lƣợng ...................................................................................... 43
Chƣơng 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 46
4.1. VỀ CÁC PHẢN ỨNGTỔNG HỢP L-DOPA TỪ L-TYROSIN ......... 46
4.1.1. Về phản ứng ester hóa L-tyrosin tạo L-tyrosin methyl ester .......... 46
4.1.2. Về phản ứng acyl hóa tạo O,N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester .... 46
4.1.3. Về phản ứng chuyển vị Fries tạo β-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-Nacetyl-L-alanin (11) .................................................................................. 47
4.1.4. Về phản ứng oxy hóa và thủy phân 11 tạo L-dopa ......................... 49
4.1.5. Về phƣơng pháp tinh chế sản phẩm L-dopa ................................... 50
4.2. VỀ CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TRUNG GIAN VÀ SẢN PHẨM50
4.2.1. Phồ hồng ngoại ............................................................................... 50
4.2.2. Phổ khối lƣợng ................................................................................ 51
4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton................................................ 52
4.3. VỀ CHẤT LƢỢNG NGUYÊN LIỆU L-DOPA TỔNG HỢP ĐƢỢC 53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 55
KẾT LUẬN .................................................................................................. 55
KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1
H-NMR
: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton
(Proton Nuclear magnetic resonance spectroscopy)
Ac
: Acetyl (CH3CO-)
BP
: Dƣợc điển Anh (British Pharmacopoeia)
dd
: Dung dịch
Et
: Ethyl (C2H5-)
h
: giờ
HPLC
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High performance liquid chromatography)
INN
: Tên chung quốc tế (International Nonproprietary Name)
IR
: Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
IUPAC
: Danh pháp Hóa học theo Hiệp hội Hóa học Quốc tế
(International Union of Pure and Applied Chemistry
Nomenclature)
KL
: Khối lƣợng
LD
: L-dopa
Me
: Methyl (CH3-)
MS
: Phổ khối lƣợng (Mass spectroscopy)
Rf
: Hệ số lƣu giữ (Retention factor)
SKLM
: Sắc ký lớp mỏng
TT
: Thể tích
UV
: Phổ tử ngoại (Ultraviolet spectroscopy)
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
STT
Bảng 2.1.
Bảng 3.1.
Bảng 3.2.
Bảng 3.3.
Bảng 3.4.
Bảng 3.5.
Bảng 3.6.
Bảng 3.7.
Bảng 3.8.
Bảng 3.9.
Bảng 3.10.
Bảng 3.11.
Bảng 3.12.
Bảng 3.13.
Bảng 3.14.
Bảng 3.15.
Bảng 3.16.
Bảng 3.17.
Tên bảng
Trang
Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu
20
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất
27
phản ứng acyl hóa
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của t lệ mol anhydrid
28
acetic: ester 9 đến hiệu suất phản ứng acyl hóa
Kết quả thực hiện phản ứng ở quy mô lớn
28
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến
33
hiệu suất phản ứng chuyển vị
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của t lệ lƣợng nguyên liệu
34
10 so với lƣợng chất xúc tác cần dùng đến hiệu suất phản
ứng chuyển vị
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của lƣợng H2O2
37
Kết quả tinh chế sản phẩm
38
Bảng Tonc của các chất trung gian và sản phẩm L-dopa
39
Bảng giá trị năng suất quay cực các chất trung gian và
39
sản phẩm L-dopa
Kết quả phân tích phổ IR
41
Kết quả phân tích phổ MS
42
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR
42
Kết quả xác định hàm ẩm của L-dopa theo phƣơng pháp
43
mất khối lƣợng do làm khô
Kết quả xác định hệ số hiệu chỉnh K của dd HClO4 0,1N
44
Kết quả xác định lƣợng L-dopa
45
Bảng tóm tắt kết quả định tính, định lƣợng L-dopa theo
45
BP 2009
So sánh kết quả phân tích phổ của D-dopa và L-dopa
53
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
STT
Tên hình
Trang
Hình 3.1.
SKLM của phản ứng tổng hợp L-tyrosin methyl ester (9)
25
Hình 3.2.
SKLM của ß-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-
31
alanin
Hình 3.3.
SKLM của phản ứng tổng hợp L-dopa (1)
36
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Tên sơ đồ
STT
Trang
Sơ đồ 1.1.
Sinh tổng hợp L-dopa từ dẫn chất của L-tyrosin
Sơ đồ 1.2
Sinh tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của L. Xun
Sơ đồ 1.3.
Tổng
hợp
9
10
L-dopa
theo
phƣơng
pháp
của
M.
11
L-dopa
theo
phƣơng
pháp
của
H.
11
Lewandowski
Sơ đồ 1.4.
Tổng
hợp
Bretschneider
Sơ đồ 1.5.
Tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của A. M. Krubiner
13
Sơ đồ 1.6.
Tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của L. Bernardi
14
Sơ đồ 1.7.
Tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của A. Kaiser
15
Sơ đồ 1.8.
Tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của S. W. Knowles
16
Sơ đồ 1.9.
Tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của F. D. Reinhold
17
Sơ đồ 1.10. Tổng hợp L-dopa theo phƣơng pháp của V. Cannata
18
Sơ đồ 2.1.
Quy trình tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin
22
Sơ đồ 3.1.
Tổng hợp L-dopa từ 3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N-
35
acetyl-L-alanin
Sơ đồ 4.1.
Cơ chế phản ứng Fries (nội phân tử)
48
Sơ đồ 4.2.
Cơ chế phản ứng Fries (liên phân tử)
48
Sơ đồ 4.3.
Cơ chế phản ứng chuyển vị Baeyer-Villiger
50
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong thế k qua, tuổi thọ trung bình của loài ngƣời đã tăng thêm hơn
30 năm. Đây là một trong những thành tựu vĩ đại nhất của loài ngƣời. Thành
tựu này, cùng với sự tăng nhanh của dân số đồng nghĩa với số ngƣời cao tuổi
trên thế giới sẽ tăng từ 600 triệu ngƣời năm 2000 lên 2 t ngƣời năm 2025.
Các nƣớc đang phát triển sẽ là nơi có t lệ ngƣời cao tuổi tăng cao và nhanh
nhất. Cùng với sự gia tăng của tuổi thọ trung bình, mô hình bệnh tật của các
nƣớc cũng đang thay đổi nhanh chóng theo hƣớng gia tăng nhanh các bệnh
không lây nhiễm của ngƣời cao tuổi. Một trong các bệnh phổ biến, thƣờng
gặp là bệnh Parkinson. Tại Mỹ, t
lệ mắc bệnh trong cộng đồng là
120/100.000 dân da trắng, ở lứa tuổi trên 65 t lệ đó là 1-1,5%. Ở Châu Âu, t
lệ mắc bệnh Parkinson ở những ngƣời trên 65 tuổi là 1,6%. Tại Việt Nam, t
lệ mắc bệnh Parkinson so với các bệnh thần kinh khác là khoảng 1,6%.
Parkinson là một bệnh gây ra do hậu quả của những thƣơng tổn thoái
hóa một số nhân xám ở nền não, kiểm soát các hoạt động bán tự động và tự
động. Sự thƣơng tổn của nhân sẽ trực tiếp hay gián tiếp ảnh hƣởng tới hệ vận
động và gây những triệu chứng ngoài bó tháp nhƣ: mất các động tác cần có sự
tham gia của ý muốn; giải phóng các động tác tự động hoặc bất thƣờng gây
run; tăng trƣơng lực cơ gây tƣ thế cứng nhắc. Hiện nay, ngƣời ta nhận thấy
trong bệnh Parkinson có sự giảm sút rất rõ rệt hàm lƣợng dopamin - một chất
trung gian hóa học quan trọng trong chức phận của các cấu trúc ngoài bó tháp
nhƣ nhân đuôi, nhân bèo, liềm đen. Vì vậy trong điều trị bệnh Parkinson,
ngƣời ta hay dùng loại thuốc chính là các thuốc cƣờng hệ dopaminergic, trong
đó L-dopa là thuốc chủ chốt. L-dopa thay thế dopamin trong điều trị các hội
chứng suy tháp ở bệnh nhân bị Parkinson. Ƣu điểm của L-dopa là bổ sung
dopamin kịp thời và đúng cơ chế bệnh sinh [3,5].
1
Tuy nhiên, trên thị thƣờng Việt Nam, các biệt dƣợc chứa L-dopa đều có
nguồn gốc nhập khẩu. Cho đến nay, chƣa thấy có cơ sở nào trong nƣớc
nghiên cứu tổng hợp L-dopa. Vì vậy giá thành các thành phẩm chứa L-dopa
còn rất cao. Mặt khác, nguyên liệu để tổng hợp L-dopa là L-tyrosin (sản phẩm
thủy phân keratin) và nguyên liệu này có thể tự túc trong nƣớc. Do vậy, để
góp phần nghiên cứu tổng hợp nguyên liệu làm thuốc, đề tài “Nghiên cứu
tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin” đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng quy trình tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin ở quy mô phòng thí
nghiệm.
2. Tổng hợp và tinh chế L-dopa đạt tiêu chuẩn về hàm lƣợng theo chuyên
luận Dƣợc điển Anh 2009.
2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ L-DOPA
1.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa
1.1.1.1. Cấu trúc hóa học
- Công thức phân tử: C4H11NO4
- Phân tử lƣợng: 197,19 đvC.
- Thành phần: 54,82% C; 5,62% H; 7,1% N; 32,45% O.
- Danh pháp INN: Levodopa
- Danh pháp IUPAC: Acid (S)-2-amino-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic
- Tên khác:
L-dopa
(-)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanin
β-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanin
Acid (-)-2-amino-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic
3-hydroxy-L-tyrosin [35].
1.1.1.2. Tính chất lý hóa
Tính chất vật lý:
- Tinh thể không màu hoặc bột kết tinh trắng, không mùi, không vị.
- Kết tinh tinh thể hình kim từ nƣớc, có nhiệt độ nóng chảy 276-278oC (kèm
phân hủy) [35], cũng có tài liệu công bố là 284-286oC [47].
- Ít tan trong nƣớc (66mg/40ml); tan tốt trong dung dịch acid HCl loãng và
acid formic. Đặc biệt không tan trong các các chất hữu cơ thông thƣờng
(ethanol, benzen, cloroform, ethyl acetat…) [35].
3
- Độ quay cực riêng
= -13,1 (nồng độ 5,12 trong dung dịch HCl 1N)
=160 đến 167o (c=2% kl/tt trong dung dịch HCl 1N) [43] và
[35],
= -11,5o (c=1% kl/tt trong dd HCl 1N) [12].
- Cực đại hấp thụ λmax (HCl 0,001N): 220,5 nm và 280 nm (log ε 3,79 và
3,42) [35].
Tính chất hóa học:
Do có cấu trúc của một α-amino acid, chứa nhóm -NH2 và -COOH nên LD
cho các phản ứng đặc trƣng của α-amino acid: Phản ứng với ninhydrin, với
fluorescamin, phản ứng Biuret, Edman, Sanger. Mặt khác, LD còn có các
phản ứng đặc trƣng cho các nhóm amin và acid carboxylic nhƣ phản ứng acyl
hóa, phản ứng formyl hóa hay ester hóa. Do trong cấu trúc LD có chứa nhóm
3,4-dihydroxyphenyl nên khi có mặt của hơi nƣớc, LD rất dễ bị oxy hóa bởi
oxy không khí và trở nên đen [24].
1.1.2. Tác dụng dƣợc lý
LD lần đầu tiên đƣợc chiết xuất vào năm 1913. Ban đầu, LD đƣợc
tuyên bố không có hoạt tính sinh học. Bắt đầu từ năm 1927 các nhà hóa học
phát hiện rằng LD có khả năng gây giảm huyết áp động mạch. Tới năm 1938,
Peter Holz đã chứng minh LD chuyển hóa thành dopamin trong tế bào động
vật có vú. Trong những năm tiếp theo, LD vẫn đƣợc nghiên cứu nhƣ là một
tiền thân của adrenalin. Mãi tới năm 1959, tác dụng của LD với bệnh
Parkinson mới đƣợc phát hiện. Từ những năm đầu 1960, LD đƣợc coi nhƣ là
tiêu chuẩn điều trị vàng cho căn bệnh này. Với sự khởi đầu không may mắn,
lịch sử nghiên cứu LD đƣợc so sánh với những tiến bộ của khoa học trong
việc nhận thức đƣợc ý nghĩa của các chất dẫn truyền thần kinh, đặc biệt là vai
trò của dopamin trong việc kiểm soát chức năng dây thần kinh vận động trung
ƣơng [23].
4
Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng của LD
Ở trạng thái sinh lý bình thƣờng, các tế bào thần kinh dopaminergic
hoạt động cân bằng với các tế bào thần kinh cholinergic. Trong bệnh
Parkinson, sự suy giảm chức năng của các tế bào thần kinh dopaminergic
khiến các tế bào cholinergic phải tăng cƣờng họat động, hậu quả là gây ra
những cơn rung giật. Các triệu chứng đó của bệnh Parkinson có liên quan đến
sự giảm dopamin trong thể vân. Trong các liệu pháp điều trị thay thế bằng
dopamin ngoại vi, đều gây tác dụng dƣợc lý lên hệ thống mạch máu và không
qua đƣợc hàng rào máu não (Blood-Brain Barrier - BBB), do đó không có tác
dụng trong điều trị Parkinson. Trong trƣờng hợp này sẽ phải sử dụng chất tiền
thân của dopamin là L-dopa. Đó đƣợc coi là cơ chế để LD giảm nhẹ đƣợc các
triệu chứng của bệnh Parkinson. Nếu uống riêng LD, thuốc bị khử carboxyl
nhiều với các enzym ở niêm mạc ruột và các vị trí ngoại biên khác, do đó
thuốc chƣa bị biến đổi tới đƣợc tuần hoàn não tƣơng đối ít và chỉ có khoảng
dƣới 1% thuốc vào đƣợc hệ thần kinh trung ƣơng. Ngoài ra, dopamin đƣợc
giải phóng vào tuần hoàn do sự khử carboxyl LD ở ngoại biên gây tác dụng
phụ, đặc biệt là buồn nôn. Ức chế enzym decarboxylase ở ngoại biên làm tăng
rõ rệt lƣợng LD qua hàng rào máu não để phát huy tác dụng và giảm tác dụng
không mong muốn trên đƣờng tiêu hóa. Carbidopa là chất ức chế enzym
decarboxylase ở ngoại biên hay đƣợc sử dụng. Nhằm cải thiện khả năng thấm
của L-dopa qua hàng rào máu não, thƣờng sử dụng tolcapon và entacapon nhƣ
là chất ức chế enzym catechol-O-methyltransferase (ICOMT) [10,11,33,42].
Dược động học
LD hấp thu nhanh qua đƣờng tiêu hóa. Thức ăn làm chậm hấp thu LD.
Một lƣợng đáng kể LD bị chuyển hóa qua dạ dày và ruột. LD phân bố rộng
rãi trong phần lớn các mô. Thời gian bán thải LD trong huyết tƣơng là khoảng
1 giờ. Khi uống phối hợp carbidopa và levodopa, thời gian bán thải của LD
5
trong huyết tƣơng tăng lên 1,5-2 giờ. Khoảng 80-85% LD bài xuất qua nƣớc
tiểu trong vòng 24 giờ [17,27,34].
Chỉ định
LD đƣợc sử dụng trong tất cả các thể hội chứng Parkinson (ngoại trừ
các trƣờng hợp hội chứng ngoại tháp do thuốc gây ra): Bệnh parkinson tự
phát, hội chứng Parkinson sau viêm não, hội chứng Parkinson do xơ cứng
động mạch não, hội chứng Parkinson sau tổn thƣơng hệ thần kinh trung ƣơng
do nhiễm độc carbon monooxyd hoặc bởi mangan [3,5,9,17,27,34].
Dạng thuốc và hàm lượng
- Viên nén 10mg, 20mg, 25mg.
- Dạng giải phóng ổn định chứa 50mg.
- Viên nang phóng thích chậm 125mg, 250mg [5].
Liều lượng và cách dùng
LD chỉ có sẵn ở dạng phối hợp: L-dopa và chất ức chế dopadecarboxylase. Các thuốc này đƣợc khuyến cáo sử dụng lúc đói hoặc khi ăn
một ít thức ăn và việc mở viên nang hoặc hòa tan viên nén là điều nên tránh
do sẽ làm mất tác dụng của các chất ức chế dopa-decarboxylase.
- Liều tối ƣu của levodopa cần đƣợc xác định với từng ngƣời bệnh. Thƣờng
khởi đầu từ liều thấp nhất có thể để giảm sự co cứng và mất hoạt động cơ
đồng thời tránh sự xuất hiện của những cử động bất thƣờng.
- Ở ngƣời trẻ tuổi, liều dùng hàng ngày thƣờng nằm trong khoảng 750 đến
1250 mg/24h chia ra 3-6 lần để làm giảm thiểu sự biến đổi tác dụng giữa các
thời điểm khác nhau trong ngày. Đối với ngƣời cao tuổi, liều mỗi lần dùng
thuốc bằng 2/3 so với liều dùng của ngƣời trẻ tuổi.
- Dạng giải phóng kéo dài cho phép giảm số lần sử dụng thuốc còn 3
lần/ngày dẫn đến giảm bớt số lần đạt nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng. Nếu
khoảng cách giữa những lần dùng thuốc nhỏ hơn 4h, hoặc liều thuốc dùng
mỗi lần không bằng nhau, liều thấp nhất sẽ đƣợc dùng vào cuối ngày [5,34].
6
Biệt dược
Madopar, Madopar dispersible, Madopar LP (Roche), Sinemet,
Sinemet LP (Merck), Nacom (Bristol-Myers Squibb), Stalevo (Novartis),
Doparl (Kyowa Hakko), Parkopa (Schwarz), Duodopa® (Abbott)…[5].
1.1.3. Các phƣơng pháp điều chế L-dopa
1.1.3.1. Chiết xuất LD từ thiên nhiên
LD đƣợc chiết xuất lần đầu tiên từ Vicia faba [40,47] và sau đó là từ
hạt của cây Mucuna pruriens [18,21].
Sau đó đã có rất nhiều nghiên cứu chiết xuất LD từ nhiều loài khác
nhau: Mucuna sp., Euphorbia sp., Bauhinia sp., Canavalia sp., Cassia sp.,
Vicia sp., Alycarpus sp., Parkinsonia sp., [37].
Hàm lƣợng L-dopa chiết xuất đƣợc nhiều nhất từ hạt của cây: Mucuna
birdwoodiana (9,1%), Mucura andreana (6,3-8,5%)… [21,25,37].
Một số phƣơng pháp chiết đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
Với các cây thuộc loài Mucuna sp.: Cây/ hạt đƣợc ngâm trong nƣớc tạo
hỗn dịch. Sau đó đƣợc acid hóa dịch bằng acid formic 2% (tt/tt). Tạo dung
dịch đồng nhất rồi làm lạnh. Ly tâm hỗn dịch. Lọc thu dịch. Từ dịch thu lấy
L-dopa bằng sắc ký lỏng [46]. Với cây giống này, một số tác giả chiết xuất Ldopa theo phƣơng pháp khác: Hỗn dịch nƣớc chứa hạt giống cây đƣợc đun
hồi lƣu trong EtOH 70%. Cất thu hồi ethanol và chiết với xăng để loại các
tạp lipid. Pha nƣớc đƣợc nạp vào một cột sắc ký trao đổi ion H+-Dowex 50
Wx8. Rửa cột với HCl 0,01N thu đƣợc L-dopa [18].
Với nguyên liệu là Vicia faba: L-dopa thu đƣợc từ bột xay thô mịn của
đậu mèo rừng đất bằng cách chiết xuất với acid sulfuric loãng. Protein trong
đó phải đƣợc kết tủa bằng dung dịch chì acetat. Sau khi lọc bỏ protein kết tủa,
phần dịch lọc đƣợc kiềm hoá nhẹ để kết tủa muối chì của L-dopa. L-dopa sau
đó thu đƣợc bằng cách phân hủy muối chì với hydro sulfid [47].
7
1.1.3.2. Sinh tổng hợp LD
Phương pháp của J. C. Sih và cộng sự (1969)
Các tác giả sinh tổng hợp LD từ L-tyrosin nhờ vi sinh vật có khả năng
chuyển đổi từ L-tyrosin sang LD nhƣ: Asperigillus ocharaceus, Asperigillus
priori, Penicillium duclauxi, Gliocladium deliquescens, Memmoniella
echinata, Trichoderma viride… Trong quá trình lên men, các tác giả cho thêm
vào môi trƣờng acid ascorbic để tránh sự tạo thành melanin.
Phƣơng pháp đƣợc thực hiện nhƣ sau: Trong môi trƣờng đậu tƣơng
dextrose chứa G. deliquescens, thêm N-formyl-L-tyrosin và acid L-ascorbic.
Sau 44 giờ lên men, acid hóa dịch lên men, sau đó tách chiết với n-butanol.
Loại bỏ nhóm formyl bằng cách cho tác dụng với HCl 5N trong 8 giờ ở nhiệt
độ phòng. Hỗn hợp của L-tyrosin và L-dopa thu đƣợc đƣợc tách bằng sắc ký
trao đổi ion dạng H+-Dowex-50-4X (200-400 mesh). Rửa cột với HCl 0,75N
cho 25,3% L-dopa, 57% L-tyrosin [41].
Phương pháp của K. Haneda và cộng sự (1971)
LD có thể đƣợc sinh tổng hợp một cách có hiệu quả từ L-tyrosin trong
môi trƣờng acid bởi chủng nấm Aspergillus Oryzae, A. Chevalieri và một số
loại nấm khác. Quy trình sinh tổng hợp tiến hành nhƣ sau:
- Nuôi cấy tế bào nấm trong môi trƣờng thích hợp (glucose, amoni clorid,
kali dihydrophosphat, magnesi sulfat, polypepton, cao nấm men) ở 30oC trong
2 đến 3 ngày.
- Thu sinh khối nấm, tạo hỗn dịch với L-tyrosin, rồi ủ trong điều kiện kỵ khí.
- Thêm acid ascorbic và cung cấp oxy để tạo quá trình hydroxyl hóa trong 1
hoặc vài giờ: pH của môi trƣờng rất quan trọng và điều kiện tối ƣu nằm trong
khoảng acid (pH từ 2 đến 5). Các tế bào A. oryzae IAM 2625 đƣợc nuôi cấy
45 giờ trong môi trƣờng vừa đề cập ở trên, thêm dung dịch đệm acetat
(pH=3,5) có chứa L-tyrosin 0,25% và acid L-ascorbic ở 45oC
8
- Tách chiết, tinh chế bằng sắc ký cột thu lấy LD từ dịch lên men. Sản phẩm
có nhiệt độ nóng chảy 275-278oC [22].
Phương pháp của J. Florent và cộng sự (1972)
Các tác giả cũng sử dụng vi khuẩn (Vibrio tyrosinaticus) làm xúc tác
cho quá trình hydroxyl hóa vi sinh học để chuyển L-tyrosin thành LD. Quá
trình đƣợc tiến hành gồm các bƣớc chính sau:
- Vibrio tyrosinaticus đƣợc nuôi cấy trên thạch (cao nấm men, pepton, cao
thịt, glucose, NaCl, pH 6 đến 7,8), sau đó chuyển môi trƣờng sang bình lắc ở
26oC, trong 16h.
- Môi trƣờng thu đƣợc đƣợc lên men trong 27 giờ, pH môi trƣờng 4-7.
- Tách chiết, tinh chế bằng sắc ký cột thu lấy LD từ dịch lên men [19].
Phương pháp của E. F. Semersky và cộng sự (1974)
Sơ đồ 1.1. Sinh tổng hợp L-dopa từ dẫn chất của L-tyrosin
Trong phƣơng pháp này, các tác giả sinh tổng hợp LD và các dẫn xuất
từ L-tyrosin và dẫn xuất, sử dụng phản ứng oxy hóa bằng enzym, tiếp theo là
phản ứng khử và thủy phân sản phẩm oxy hóa. Enzym sử dụng trực tiếp là
tyrosinase [39].
Phương pháp của S. Chattopadhayay và cộng sự (1990)
L-tyrosin đƣợc chuyển thành LD bởi một bƣớc phản ứng oxy hóa xúc
tác bởi tyrosinase hoặc tyrosin hydroxylase trong cơ thể sống. Các bƣớc sinh
tổng hợp LD đƣợc tiến hành nhƣ sau:
9
- Nuôi cấy tế bào nấm trong môi trƣờng: glucose, amoni sulfat, kali
dihydrophosphat, magnesi sulfat, pepton, sắt lactat, thạch aga, pH 6,5; có
thêm L-tyrosin trong 48 giờ.
- Xử lý dịch nuôi cấy với nƣớc thu dịch chứa sợi nấm. Ủ tĩnh ở 28oC.
- Tách chiết, tinh chế thu lấy LD bằng sử dụng sắc ký cột [15].
Phương pháp của L. Xun và cộng sự (1998)
Trong phƣơng pháp này, LD đƣợc sinh tổng hợp từ L-tyrosin với sự có
mặt của một enzym xúc tác là 4-hydroxyphenylacetat-3-hydroxylase (HPAH)
với oxy và dạng khử của beta-nicotinamid adenin dinucleotid (NADH). Sử
dụng Escherichia coli làm vật chủ chứa gen mang thông tin di truyền của
enzym.
Sơ đồ sinh tổng hợp:
Sơ đồ 1.2. Sinh tổng hợp L-dopa theo phương pháp của L. Xun
Tiến hành theo các bƣớc chính sau:
- Chuẩn bị hỗn dịch tế bào với phần lớn là vi khuẩn chứa HPAH có hoạt
tính.
- Thêm L-tyrosin và một chất nền vào hỗn dịch tế bào để tạo thành một hỗn
hợp có hoạt tính.
- Ủ hỗn hợp có hoạt tính một thời gian thu đƣợc LD [48].
Phương pháp của M. Kramer và cộng sự (2006)
Trong phƣơng pháp này, LD đƣợc sản xuất trong môi trƣờng lên men
kỵ khí của vi sinh vật tái tổ hợp gen (Escherichia coli) chứa enzym L-tyrosin3-hydroxy-monooxygenase có hoạt tính và ở các chu trình chuyển hóa tối
thiểu: sự thủy phân glucose, chu trình pentose phosphat, chu trình amino acid
thơm và các chu trình dẫn xuất của nó, bao gồm một pha sinh trƣởng và một
10
- Xem thêm -