Tài liệu Nghiên cứu tính nhạy cảm kháng sinh của trực khuẩn mủ xanh (pseudomonas aeruginosa)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––– NGUYỄN THỊ HẢI NGHIÊN CỨU TÍNH NHẠY CẢM KHÁNG SINH CỦA TRỰC KHUẨN MỦ XANH (PSEUDOMONAS AERUGINOSA) Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.BS. LƯU THỊ KIM THANH THÁI NGUYÊN - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Xã hội càng phát triển thì nhu cầu về chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ của con người ngày càng cao; có sức khoẻ con người có thể làm ra nhiều của cải vật chất, nâng cao chất lượng cuộc sống. Vì vậy việc tìm hiểu, nghiên cứu các tác nhân gây bệnh và cách chữa trị cho con người là việc làm thiết thực có ý nghĩa quan trọng, góp phần vào sự phát triển chung của nhân loại. Tồn tại xung quanh chúng ta có biết bao nhiêu tác nhân gây bệnh mà mắt thường không nhận biết được, trong đó có các vi sinh vật. Khi cơ thể suy yếu, sức đề kháng giảm, chúng ta đều có thể bị tấn công. Hiện nay, nhờ sự phát triển mạnh mẽ của khoa học cũng như y học, người ta đã phân lập, phát hiện ra rất nhiều loại vi khuẩn có khả năng gây bệnh; đặc biệt là loại vi khuẩn gây nhiễm trùng cơ hội Trực khuẩn mủ xanh (tên khoa học là Pseudomonas aeruginosa) - một trong những tác nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Trực khuẩn mủ xanh là trực khuẩn Gram âm, chúng phân bố rộng rãi trong các môi trường ngoại cảnh như đất, nước, không khí, nhất là ở môi trường ẩm ướt chúng có nhiều cơ hội xâm nhập và gây bệnh. Nhiễm trùng do Trực khuẩn mủ xanh gây ra điển hình là nhiễm trùng da (nhiễm trùng vết thương, vết bỏng…), nhiễm trùng đường hô hấp (viêm phổi, viêm phế quản…), nhiễm trùng đường tiểu và nặng hơn là gây nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu, và thận, sẽ gây ra những hậu quả chết người vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt bên trong cơ thể. Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh, việc sử dụng kháng sinh không đúng cách trong cộng đồng và chưa hợp lý trong bệnh viện đã đưa tới mức độ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và Trực khuẩn mủ xanh nói riêng ngày một tăng. Sử dụng kháng sinh an toàn và hợp lý trên cơ sở hiểu biết những cơ chế tác dụng của kháng sinh cũng như đặc tính của vi khuẩn và mức độ nhạy cảm với kháng sinh của chúng đóng vai trò góp phần hết sức quan trọng trong việc điều trị bệnh cho bệnh nhân. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 Trước yêu cầu của thực tiễn, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tính nhạy cảm kháng sinh của Trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)” nhằm những mục tiêu nghiên cứu sau: 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tỷ lệ nhiễm trùng do Trực khuẩn mủ xanh trên bệnh nhân và tỉ lệ ô nhiễm Trực khuẩn mủ xanh ở môi trường bệnh viện. - Định loại Trực khuẩn mủ xanh. - Xác định mức độ đơn kháng và đa kháng kháng sinh của Trực khuẩn mủ xanh. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập P.aeruginosa từ một số bệnh phẩm (mủ vết thương, dịch mũi họng, nước tiểu), từ môi trường (nước, không khí, bề mặt dụng cụ y tế đang sử dụng) trong bệnh viện. - Nghiên cứu mức độ kháng kháng sinh của P.aeruginosa dựa trên kết quả kháng sinh đồ của các chủng P.aeruginosa phân lập được. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Những nghiên cứu về Pseudomonas aeruginosa 1.1.1. Lược sử nghiên cứu P.aeruginosa Năm 1872, P.aeruginosa được Schroeter mô tả lần đầu tiên với tên gọi là Bacterium aeruginosa [8]. Ngay từ trước khi phân lập, đã có nhiều nhận xét cho rằng trong một số trường hợp vết thương sinh ra một loại mủ đặc biệt có màu xanh như màu rỉ đồng. Hiện tượng này được giải thích theo nhiều ý kiến khác nhau, nhưng lời giải thích thỏa đáng khi người ta phân lập được vi khuẩn từ ổ mủ thuần khiết. Năm 1882, nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về Bacterium aeruginosa đó là dược sĩ Carle Gessard. Ông phân lập vi khuẩn này trên mủ vết thương và kết quả nghiên cứu đã tìm thấy đặc trưng của Bacterium aeruginosa là sinh sắc tố có màu xanh, tan trong nước. Từ đó người ta còn gọi vi khuẩn này là trực khuẩn mủ xanh [32]. Năm 1900, Migula đã nghiên cứu và phân loại vi khuẩn này vào chi Pseudomonas; từ đó vi khuẩn này mang tên P.aeruginosa [8]. Năm 2000, một nhóm các nhà khoa học đại học Washington và khoa sinh của trường đại học California, San Diego đã nghiên cứu và giải được trình tự genome của P.aeruginosa PA01 [33]. Năm năm sau đó, trình tự genome của PA14 cũng đã được tìm ra bởi các nhà khoa học thuộc trường Đại học Y Harvard [33]. Trong những năm gần đây, P.aeruginosa là một trong những căn nguyên gây bệnh rất phổ biến và kháng lại hầu hết các kháng sinh đang dùng. Vì vậy, nó thu hút rất nhiều đề tài nghiên cứu của các nhà khoa học và các y bác sĩ trong cũng như ngoài nước. Nghiên cứu nhiễm khuẩn huyết bỏng do P.aeruginosa gây ra tại Viện Bỏng Quốc gia (6/1996 - 12/1998) đã cho thấy P.aeruginosa là vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết bỏng hàng đầu (chiếm khoảng 66,7%) [10]. Năm 2002, Chu Anh Tuấn, Nguyễn Văn Huệ, Lê Đức Mẫn nghiên cứu căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết và yếu tố bệnh lý liên quan tại Viện Bỏng Quốc Gia đã cho thấy P.aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm hàng đầu (74,3%) [24]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 Năm 2003, theo kết quả giám sát của Bộ y tế về các vi khuẩn gây bệnh thường gặp ở Việt Nam thì P.aeruginosa là vi khuẩn đứng đầu trong số các vi khuẩn đó chiếm tỷ lệ 22,3% [11]. Hoàng Kim Tuyến và cộng sự nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập tại bệnh viện Thống Nhất (8/2002 - 8/2005) đã chứng minh được P.aeruginosa là nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi tại bệnh viện với tỷ lệ kháng thuốc khá cao (>60%) [25]. Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiện (bộ môn vi sinh - Học viện quân y) đã nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng P.aeruginosa đa giá, tinh chế và đánh giá hiệu quả điều trị tại chỗ của chế phẩm trên động vật và bệnh nhân bỏng [12]. Theo một nguồn tin mới đây, một loại vaccine đường uống có thể bảo vệ cơ thể người kháng lại P.aeruginosa mang tên Pseudostat - 1 đã được công bố bởi các nhà khoa học Anh và Úc vào tháng 6/2006. Đây là một loại vaccine sử dụng P.aeruginosa tinh chế đã bất hoạt [26]. Ngoài ra, còn rất nhiều nghiên cứu khác ở trong nước và trên thế giới đánh giá tình trạng nhiễm trùng và mức độ kháng thuốc của loài vi khuẩn này. 1.1.2. Đặc điểm sinh vật học của P.aeruginosa 1.1.2.1. Hình thái, cấu tạo Là trực khuẩn gram âm, hình que, thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn, hai đầu tròn, chiều dài 1 - 1,5μm, rộng 0,5 - 1μm, đứng một mình hay thành đôi hoặc kết hợp thành chuỗi ngắn. Trực khuẩn mủ xanh không sinh bào tử, có khả năng di động nhờ một tiêm mao đơn cực [32]. Hình 1.1: P.aeruginosa soi trên kính hiển vi quang học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 1.1.2.2. Cấu trúc tế bào  Vỏ polysaccaride: P. aeruginosa tiết ra chất nhầy có cấu tạo là polysaccharide gồm nhiều tiểu phần mannuronic acid và glucuronic acid hay còn được gọi là alginate. Các dạng alginate này kết hợp với nhau tạo thành dạng cấu trúc biofilm giúp bảo vệ che chở vi khuẩn tồn tại được trong môi trường tự nhiên cũng như tránh được hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ. [34].  Màng sinh chất: Hầu hết các chủng P.aeruginosa có khả năng tổng hợp một loại protein trên bề mặt màng sinh chất (pr F). Protein F vận chuyển có chọn lọc các chất qua lại màng trong giới hạn khoảng 500Da. Vì vậy, nó làm giảm tính thấm của màng, ngăn không cho các chất có hại đi vào bên trong tế bào giúp cho P.aeruginosa có khả năng đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh [30].  Tiên mao: P.aeruginosa có một tiên mao duy nhất ở một cực, tiên mao giúp cho vi khuẩn di động. Về cấu tạo hoá học, tiên mao được cấu tạo bởi các protein gọi là Flagellin. Các Flagellin mang tính chất kháng nguyên gọi là kháng nguyên lông H.  Tiêm mao: - Là những sợi lông rất mảnh, dài khoảng 6nm, mọc quanh bề mặt tế bào. Vai trò: Giúp cho vi khuẩn bám vào môi trường lỏng hay bề mặt biểu mô của tế bào vật chủ trong quá trình lây nhiễm.  Nhân: Vật chất di truyền của P.aeruginosa là một phân tử DNA trần, dạng vòng tồn tại trong nguyên sinh chất. Kích thước DNA từ 5,2 - 7 triệu cặp base chứa khoảng 65% là (Guanine + Cytosine). Ngoài ra, P.aeruginosa cũng có chứa vật chất di truyền ngoài nhân đó là các plasmid. Các plasmid chứa các đoạn gen như TEM, OXA, PSE mã hóa sinh ra enzyme betalactamase làm phá huỷ vòng betalactam của chất kháng sinh dẫn tới P.aeruginosa kháng lại với hầu hết các kháng sinh thuộc nhóm này. Do vậy mà rất khó khăn trong việc lựa chọn thuốc điều trị nhiễm khuẩn do P.aeruginosa gây ra [35]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 1.1.2.3. Phân bố Trực khuẩn mủ xanh được tìm thấy ở rất nhiều nơi trong môi trường sống như: trong đất, nước, các bể bơi, hồ tắm nước nóng…nhưng phổ biến nhất là những nơi ẩm thấp. Ở người, chúng có thể sống ở vùng da ẩm như nách, háng và một số ít sống trong ruột. Ngoài ra, vi khuẩn này còn được phát hiện sống bám bên ngoài của thực vật, động vật, kể cả trong bệnh viện [28]. Ít khi có nhiễm trùng do P.aeruginosa ở người khỏe mạnh. Chúng là căn nguyên quan trọng nhất trong các nhiễm khuẩn ở bệnh nhân bị bệnh nặng như bệnh tăng bạch cầu, u xơ bàng quang và bệnh nhân có bỏng rộng. Trong điều kiện ướt, nước và nếu thêm yếu tố giàu chất khoáng, giàu dinh dưỡng thì rất thuận lợi cho sự tồn tại và phát triển của trực khuẩn P.aeruginosa (như dụng cụ làm ẩm oxy, ống hút, lavabo rửa tay, nước lưu cữu…). Vi khuẩn chứa trong các hạt khí dung khi được hít vào cơ thể thì có thể tránh được những cơ chế bảo vệ bình thường của đường hô hấp để gây ra nhiễm khuẩn. Có nhiễm khuẩn do P.aeruginosa sinh trưởng ngay trong các thuốc dùng cho điều trị. Thậm chí vi khuẩn này tồn tại được ngay cả trong một số chất tẩy uế. Bồn và các dụng cụ làm thông khí có thể ô nhiễm nặng và là nguồn gây nhiễm ra môt trường. Tuy nhiên, nguy cơ chính bị nhiễm khuẩn do P.aeruginosa là từ sự phơi nhiễm, tiếp xúc của các bộ phận mẫn cảm với những dụng cụ, phương tiện… ô nhiễm vi khuẩn này [6]. Ở bênh viện, trực khuẩn mủ xanh thường tìm thấy ở đầu các ống thông, máy khí dung, máy hô hấp nhân tạo, máy hút ẩm, bình chứa nước, thậm chí ở trong cả một số dung dịch sát khuẩn dùng để rửa vết thương. 1.1.2.4. Đặc điểm nuôi cấy Trực khuẩn mủ xanh hiếu khí, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường như thạch dinh dưỡng, thạch máu, canh thang nhưng thích hợp nhất là môi trường SS. Nhiệt độ thích hợp từ 30 - 370C, PH = 4,5 - 9,0; tối ưu là 370C, pH từ 7,2 - 7,5 [1]. Trên môi trường lỏng làm đục đều, trên bề mặt có váng. Trên môi trường đặc có hai loại khuẩn lạc: Khuẩn lạc S (tròn đều mặt nhẵn, trung tâm hơi lồi). Khuẩn lạc R (nhỏ, xù xì hoặc nhầy, lồi) (hình 1.2 phụ lục ảnh). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 Tính chất đặc trưng của trực khuẩn mủ xanh là sinh sắc tố (hình 1.3 phụ lục ảnh) và chất thơm. Trên môi trường nuôi cấy có pepton, nó có thể tiết ra các loại sắc tố sau: + Pyocyanin: Là loại sắc tố phenazin có màu xanh lơ, tan trong nước và chlorofoc, khuyếch tán ra môi trường nuôi cấy làm cho môi trường và khuẩn lạc có màu xanh. Sắc tố này sinh ra thuận lợi trong môi trường tiếp xúc nhiều với không khí. Chỉ có trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố pyocyanin. Đây là một đặc điểm quan trọng để phân biệt P.aeruginosa với các vi khuẩn khác. + Pyoverdin: Là loại sắc tố huỳnh quang, phát màu xanh khi chiếu tia cực tím có bước sóng 400nm, tan trong nước nhưng không tan trong chlorofoc. Ngoài trực khuẩn mủ xanh chỉ có một số loài Psedomonas tạo sắc tố này. + Pyorubrin: Sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố này. + Pyomelanin: Sắc tố màu nâu đen, chỉ 1-2% số chủng trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố Pyomelanin. Có khoảng 5-10% số chủng trực khuẩn mủ xanh không sinh sắc tố. 1.1.3. Một số tính chất sinh hóa cơ bản - Hiếu khí tuyệt đối, oxidase (+), lên men đường glucoza, không lên men đường lactose, xitrat simmons (+), mannit (+), idol (-), H2S (-), LDC (-), ODC (-), ADH (-). 1.1.4. Sức đề kháng Trực khuẩn mủ xanh có sức đề kháng cao với nhiều yếu tố ở ngoại cảnh, chúng có thể tồn tại được ngay cả trong một số chất tẩy uế. Trong số các vi khuẩn, Trực khuẩn mủ xanh có sức kháng lại mạnh nhất với các thuốc kháng sinh. Mức độ kháng thuốc này là do cấu trúc các lỗ porin của màng ngoài làm hạn chế các thuốc kháng sinh đi vào khoảng trống của màng bào tương hơn so với những vi khuẩn Gram âm khác[6]. 1.1.5. Cấu trúc kháng nguyên Vi khuẩn có kháng nguyên H và kháng nguyên O chịu nhiệt. - Kháng nguyên H: Là kháng nguyên lông của vi khuẩn. Kháng nguyên có đặc điểm: Không chịu được nhiệt, bị cồn 50% và các men tiêu protein phá hủy, chịu được tác động của focmol 0,5%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 8 - Kháng nguyên O: Là kháng nguyên thân, đã có đến 16 loại do đó dựa vào kháng nguyên O để phân chia P.aeruginosa thành 16 typ huyết thanh ký hiệu từ P1 đến P16. Kháng nguyên O có đặc điểm: Chịu được nhiệt, rất độc, kháng cồn, bị phá hủy bởi focmon 0,5%. 1.1.6. Độc tố Trong quá trình xâm nhập và gây bệnh P.aeruginosa tiết ra một số ngoại độc tố sau: [31]. + Exoenzyme S: Chủ yếu được sinh ra khi vi khuẩn có mặt trong những mô bỏng, độc tố này tác động lên tế bào bạch cầu trung tính và gây độc cho tế bào vật chủ. + Exotoxin A: Phần lớn P.aeruginosa sinh ra độc tố này, độc tố A không bền nhiệt, chúng có vai trò làm kìm hãm sự tổng hợp protein và gây chết tế bào. - Heamolysin: P.aeruginosa sinh ra 2 heamolysins đó là phospholipit C và rhamnolipit, chúng có vai trò phân hủy lecithin và lipit tạo ra các lỗ thủng trên màng tế bào làm tăng khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn vào trong tế bào vật chủ. Ngoài ra, Paeruginosa tiết ra một số enzym ngoại bào có vai trò trong tính độc của vi khuẩn trong quá trình xâm nhiễm là Elastase và Alkaline protease. Các protein enzyme này phá hủy các phân tử protein của vật chủ một cách đặc hiệu gây nên những đặc tính lâm sàng riêng của bệnh. + Các elastase (LasB elastase, LasA elastase): Phân cắt các protein của tế bào nhân chuẩn như collagen, elatin và hủy hoại cấu trúc protein của các tế bào này. Đồng thời nó cũng phá vỡ hệ thống miễn dịch đặc hiệu của cơ thể (IgG, IgA, bổ thể), các phân tử ngoại bào làm cho nhiễm trùng lan tỏa đến các khu vực xa hơn với các biểu hiện lâm sàng như viêm màng keratin, hoại tử tổ chức trong bỏng và tạo các xơ nang. Ngoài ra, Elastase còn dung giải fibronectin giúp cho vi khuẩn dễ dàng bám vào màng nhầy phổi. Elastase phá vỡ biểu mô và cản trở chức năng của các lông mao bên trong đường hô hấp [29]. + Alkalinne protease: Can thiệp vào sự hình thành fibrin và phân giải fibrin. Đồng thời, elastase và alkaline protease phân hủy chất nền của giác mạc và những cấu trúc bảo vệ khác cấu tạo nên fibrin và elastin. Hai enzym này cũng được cho rằng gây ra sự bất hoạt đối với hai yếu tố quan trọng của hệ miễn dịch là interferon gamma (IFN) và TNF (Tumor Necrosis Factor) [32]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 9 1.1.7. Khả năng gây bệnh của P.aeruginosa Mặc dù P.aeruginosa là vi khuẩn gây bệnh cơ hội nhưng nó là vi khuẩn có độc lực đặc biệt. Khi tuyến phòng thủ đầu tiên (hàng rào bảo vệ không đặc hiệu ở da, niêm mạc) bị phá vỡ (như khi bị vết thương) hoặc vi khuẩn được đưa vào cơ thể tắt qua hàng rào này (như theo dụng cụ nội soi hoặc ống thông khí quản…) thì gây ra nhiễm khuẩn. Đầu tiên vi khuẩn bám dính vào bề mặt tế bào biểu mô và giai đoạn này cần đến vai trò của pili và polisaccharide ngoại bào. Các chủng nhầy phân lập từ bệnh nhân bị xơ phế nang tạo ra các polisaccharide chứa nhiều vi khuẩn làm tăng sự kết dính của vi khuẩn với biểu mô đường hô hấp và giúp chúng kháng lại thực bào. Sau khi xâm nhập, sự bảo vệ dựa vào thực bào và vỏ nhầy do polisaccharide có đủ khả năng và đủ thời gian để sản xuất collagenase, elastase, pyocyanin và các sản phẩm khác để làm lan truyền và phá hủy tổ chức cục bộ. Ngoại độc tố A có thể là nhân tố góp phần quan trọng gây tổn thương tổ chức và tác dụng làm lan tỏa nhiễm khuẩn. Nghiên cứu in vitro gần đây đã cho thấy sắc tố pyocyanin ức chế sự sản sinh superoxide của bạch cầu đa nhân. Có thể các nhân tố này rất quan trọng làm thuận lợi cho việc hình thành, lan tỏa và kéo dài nhiễm khuẩn.[6] Nhiễm trùng thường xảy ra ở những người mà cơ chế bảo vệ bị tổn thương như sử dụng corticoit hay kháng sinh dài ngày, bỏng nặng hoặc tiêm tĩnh mạch ma túy…Vị trí nhiễm trùng thông thường là đường tiểu và vết thương hở (nhất là vết bỏng). Tại chỗ xâm nhiễm chúng gây viêm có mủ màu xanh, ở những cơ thể suy giảm sức đề kháng chúng có thể xâm nhập vào sâu hơn bên trong cơ thể và gây viêm ở các phủ tạng như các nhiễm trùng nung mủ và những áp xe ở những phần khác nhau của cơ thể người. Những trường hợp viêm màng trong tim, viêm phổi, viêm màng não tuy hiếm nhưng cũng xảy ra hoặc gây bệnh toàn thân như nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn ở trẻ mới sinh thường gây bệnh rất trầm trọng. Nhiễm khuẩn huyết thường gây chết ở những cơ thể suy nhược [29]. P.aeruginosa là tác nhân gây viêm tai ngoài, thường là những người hay đi bơi. Loài vi khuẩn này có thể xâm nhập vào mắt (qua chấn thương hoặc do đưa thuốc bị nhiễm khuẩn vào) gây viêm màng kết mạc mắt, viêm giác mạc mắt hoặc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 viêm nội nhãn cầu. Viêm giác mạc có khi tiến triển nhanh và làm tổn thương giác mạc sau 24 - 48 giờ[6]. Ngoài ra P.aeruginosa còn là tác nhân chính gây nhiễm trùng bệnh viện như nhiễm trùng sau mổ, bỏng nặng… 1.2. Kháng sinh 1.2.1. Khái niệm Chất kháng sinh được hiểu là các chất hóa học xác định, không có bản chất enzyme, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ biến nhất là từ vi sinh vật), với đặc tính là ngay ở nồng độ thấp hoặc rất thấp đã có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt được các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo an toàn cho người và động vật được điều trị [9]. 1.2.2. Hiện tượng và bản chất kháng thuốc của vi sinh vật Hiệu quả điều trị của chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào độ nhảy cảm của vi sinh vật gây bệnh với chất kháng sinh. Khi điều trị kháng sinh, mầm bệnh bao giờ cũng có những “đáp ứng phản hồi lại” sự có mặt của chất kháng sinh trong môi trường và kết quả là sẽ có hai khả năng xảy ra: + Vi sinh vật sẽ bị chết do kháng sinh + Vi sinh vật vẫn sống sót Vi khuẩn được coi là kháng một loại kháng sinh nào đó nếu sự phát triển của nó không bị ngừng lại khi kháng sinh đó đã được dùng ở nồng độ tối đa mà bệnh nhân còn dung nạp thuốc [22]. Các kiểu kháng thuốc của vi sinh vật:  Đề kháng tự nhiên: Đề kháng tự nhiên là khả năng đã được hình thành ở mầm bệnh ngay khi chúng chưa tiếp xúc với môi trường có kháng sinh. Nguyên nhân: Có thể do đột biến ngẫu nhiên trong nhiễm sắc thể làm cho quần thể vi sinh vật gây bệnh xuất hiện các chủng có khả năng kháng thuốc. Khi bệnh nhân được điều trị trong thời gian nhất định thì chỉ có các chủng bình thường bị tiêu diệt, còn những chủng kháng thuốc sẽ sống sót, tiếp tục sinh trưởng, phát triển. Cuối cùng làm thay đổi hoàn toàn bản chất vi sinh của bệnh và vô hiệu hóa tác dung điều trị của kháng sinh đó. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 11  Đề kháng thu được: Là khả năng kháng thuốc của vi sinh vật xuất hiện sau khi chúng tiếp xúc với kháng sinh. Nguyên nhân của đề kháng thu được: Do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có trở nên có gen đề kháng với kháng sinh. Những biến cố này bao gồm đột biến gen và nhận được gen kháng thuốc. * Đột biến gen: Biến cố này xảy ra trước hoặc sau khi vi khuẩn tiếp xúc với kháng sinh. + Đột biến một bước: mức độ đề kháng không phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh được tiếp xúc; có thể chỉ sau một lần đột biến, vi khuẩn đã đề kháng rất cao. Đột biến kháng streptomycin, lincomycin và isoniazid là những đột biến kiểu một bước. + Đột biến nhiều bước: mức độ đề kháng có liên quan tới nồng độ kháng sinh. Trong trường hợp này kháng sinh là nhân tố chọn lọc giữ lại những cá thể đột biến, cho nên ở lần đột biến sau thì nồng độ ức chế tối thiểu sẽ cao hơn lần trước. Đột biến kháng penicillin, cephalosporin, tetracycline, chloramphenicol, aminoglycoside, sulfamide và colistin là những đột biến kiểu nhiều bước. Gen đề kháng xuất hiện do đột biến sẽ được lan truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác cùng với sự phân chia của tế bào vi khuẩn. Xác suất xuất hiện một đột biến rất nhỏ (10-6 - 10-11). * Nhận gen kháng thuốc: Gen kháng thuốc có thể nằm trên nhiễm sắc thể, trên plasmid hay trên transposon. - Plasmid là những phân tử DNA xoắn kép dạng vòng khép kín, nằm ngoài nhiễm sắc thể vi khuẩn, có khả năng tự sao chép, chúng mang các gen quyết định cho sự xuất hiện một số tính chất mới của vi khuẩn. Plasmid kháng thuốc (Rplasmid) là plasmid mang một hoặc nhiều gen mã hoá cho sự đề kháng với một hoặc nhiều kháng sinh khác nhau. Vi khuẩn mang R-plasmid có thể cùng một lúc kháng lại nhiều thuốc kháng sinh khác nhau (do mang nhiều gen kháng thuốc). Các R-plasmid không chỉ có khả năng lan truyền dọc từ thế hệ trước sang thế hệ sau qua Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 12 sự phân chia của tế bào vi khuẩn, mà chúng còn có khả năng lan truyền ngang giữa các vi khuẩn cùng loài hay khác loài qua sự tiếp hợp. - Transposon (“gen nhảy”): là những đoạn DNA chứa một hoặc nhiều gen, có thể “nhảy”từ plasmid vào nhiễm sắc thể và ngược lại hoặc từ plasmid này sang plasmid khác.  Đề kháng chéo: Kháng chéo là hiện tượng một chủng vi sinh vật có khả năng kháng lại chất kháng sinh nhất định thì cũng có khả năng kháng luôn một số chất kháng sinh khác cùng nhóm cấu trúc hay có đặc tính tương đồng với chất kháng sinh ấy. Nguyên nhân: Do cấu trúc hóa học của những kháng sinh đó tương tự nhau và do chủng vi sinh vật đó có khả năng tiết ra độc tố làm mất tác dụng của một số kháng sinh. Đƣờng truyền tính kháng thuốc ở vi khuẩn Gen kháng thuốc có thể lan truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua các hình thức sau: + Phân bào: gen kháng thuốc được vi khuẩn truyền lại cho thế hệ sau qua sự phân chia của tế bào vi khuẩn. + Tiếp hợp: là hiện tượng hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với nhau và truyền cho nhau đoạn DNA có mang gen đề kháng. + Biến nạp: là hiện tượng xảy ra khi vi khuẩn đề kháng bị li giải, giải phóng các đoạn DNA tự do và những đoạn này xâm nhập vào các tế bào vi khuẩn khác. + Tải nạp: là hiện tượng phage mang gen đề kháng từ vi khuẩn này sang nạp vào tế bào vi khuẩn khác 1.2.3. Cơ chế tác động của kháng sinh lên vi khuẩn  Ức chế tổng hợp thành tế bào: Kháng sinh ức chế thành tế bào thực chất là ức chế một bước nào đó của tổng hợp peptidoglycan của vi khuẩn. Khi mất thành phần peptidoglycan cứng xung quanh tế bào vi khuẩn, tế bào thường bị chết do trương nước, sưng lên hoặc bị nổ và khi không có thành tế bào chúng cũng dễ bị các tế bào thực bào tiêu diệt. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 13  Gây rối loạn chức năng thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên tương: Làm cho các thành phần cần thiết bên trong tế bào thoát ra ngoài và nước đi vào trong khiến tế bào bị vỡ.  Ức chế tổng hợp protein: Bằng cách gắn vào ribosom 70S của vi khuẩn. Kháng sinh gắn vào tiểu phần 30S (như Steptomycin) sẽ ngăn cản hoạt động của ARN thông tin hoặc ức chế chức năng của ARN vận chuyển (như Tetracyclin). Kháng sinh gắn vào tiểu phần 50S (như Erythromycin, chloramphenicol), làm cản trở sự liên kết, hình thành các chuỗi acid amin tạo phân tử protein cần thiết cho tế bào sống.  Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic: Ngăn cản sự sao chép DNA (nhóm Quinon), ức chế sao mã RNA (Rifampicin) hay ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hóa cần thiết để ngăn cản hình thành nên các nucleotid như Sunfamid và Trimethorpim. 1.2.4. Biện pháp hạn chế sự kháng thuốc Để khắc phục hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vật gây bệnh, giải pháp trực quan và đơn giản là sử dụng các kháng sinh mới. Tuy nhiên, việc tìm kiếm, phát hiện và sản xuất ra một kháng sinh mới là cả một khối lượng công việc khổng lồ, tiêu tốn nhiều thời gian, nhân lực và tiền bạc. Đồng thời, để sự kháng thuốc xảy ra cũng đồng nghĩa với việc phải trả giá bằng sức khoẻ, tính mạng của bệnh nhân. Chính vì vậy, mọi nỗ lực nhằm hạn chế xuất hiện khả năng kháng thuốc càng trở nên cần thiết và hiệu quả mà trước hết cần tôn trọng các nguyên tắc sau khi sử dụng thuốc kháng sinh:  Chỉ dùng kháng sinh để điều trị những bệnh nhiễm khuẩn (những kháng sinh kháng khuẩn không có tác dụng trên virus).  Chọn kháng sinh theo kết quả kháng sinh đồ, nên ưu tiên kháng sinh có hoạt phổ hẹp.  Dùng kháng sinh đủ liều lượng và thời gian (cho một đợt điều trị).  Đề cao các biện pháp khử trùng và tiệt trùng, ngăn ngừa sự lan truyền vi khuẩn đề kháng.  Liên tục giám sát sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn để có chiến lược sử dụng kháng sinh hợp lý [27]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 14 1.3. Phân loại vi sinh vật 1.3.1. Khái quát về các phương pháp phân loại vi sinh vật truyền thống Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính hình thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng như sắc tố tạo thành v.v..Các đặc trưng này đôi khi cũng bộc lộ những hạn chế do các đặc tính được dùng cho nhóm vi sinh vật này (Enterobacteriaceae) nhưng lại không có ý nghĩa đối với nhóm khác (vi khuẩn gram âm - gram negative bacteria). Hạn chế của các phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật. Từ trước đến nay, đơn vị cơ bản của định tên vi sinh vật là loài, bao gồm nhóm các cơ thể có mức độ tương đồng cao về các đặc điểm hình thái. Các phƣơng pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa: Từ những hạn chế của việc xác định các đặc tính hình thái dẫn đến nhiều nghiên cứu tập trung vào các phản ứng sinh hóa đặc trưng cho các vi sinh vật riêng biệt. Sự khác biệt của các phản ứng có ý nghĩa cho phân loại các vi sinh vật. - API20E KIT Nguyên tắc: Dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Nói chung hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trường hợp gen quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả. Phân biệt bằng thực khuẩn thể Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 15 Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ. - Phân biệt theo Typ huyết thanh Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại [13]. 1.3.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới có độ chuẩn xác cao. Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử và quan hệ giữa các loài trong phạm vi loài. Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến. Việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa của các vi sinh vật, có khả năng xác định, có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật. Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNA thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay. Gen mã hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotid do có kích thước nhỏ nên thông tin chứa đựng ít do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa chi, loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng. Gen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 16 mã hóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900bp quá lớn cho nên không thuận lợi cho tách dòng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn. Gen mã hóa 16S rRNA có kích thước khoảng 1500 nucleotid vùa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen. Và được ưu tiên chọn lựa trong phân loại vi khuẩn. Cấu trúc của gen mã hóa 16S đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ và đã thiết kế rất nhiều cặp mồi chung dùng cho nhiều nhóm vi khuẩn cũng như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài. Đây là thuận lợi lớn chi các nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã hóa 16S rRNA, [18][16]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 17 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu * Đối tƣợng nghiên cứu: Các chủng P.aeruginosa phân lập được từ các bệnh phẩm và môi trường bệnh viện. * Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Các mẫu nghiên cứu - Các mẫu bệnh phẩm: + Mủ vết thương: 200 mẫu. + Dịch mũi họng: 100 mẫu. + Nước tiểu: 100 mẫu. - Các mẫu lấy từ môi trường bệnh viện: + Nước: 100 mẫu, lấy từ các nguồn nước đang sử dụng trong bệnh viện (nước rửa tay của bác sĩ, nước từ phòng mổ…) + Không khí: 100 mẫu, lấy từ các phòng mổ, phòng đẻ, phòng gây mê hồi sức cấp cứu… + Trên bề mặt các dụng cụ y tế đang được sử dụng tại các phòng khám và xét nghiệm trong bệnh viện: 200 mẫu. 2.2.2. Các thiết bị , hóa chất * Thiết bị và dụng cụ Tên dụng cụ Hãng sản xuất - Kính hiển vi quang học: Đức - Tủ ấm: Nhật - Máy đặt khoanh giấy kháng sinh: Thụy Điển - Box cấy vô trùng: Nhật - Nồi hấp tiệt trùng: Hàn Quốc - Thước đo vòng ức chế: Nhật Bản Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 18 Ngoài ra các dụng cụ vô khuẩn cần thiết cho việc lấy mẫu và nuôi cấy gồm: - Dụng cụ lấy mẫu: Ống đựng bệnh phẩm, xi lanh, lọ thuỷ tinh có nút mài vô khuẩn. - Dụng cụ nuôi cấy: Đĩa petri, pipet, ống nghiệm, lam kính, la men, đèn cồn, que cấy, khay men hoặc sắt không rỉ, giá để ống nghiệm… * Hóa chất - Thuốc nhuộm Gram: Thuốc nhuộm tím gentian, dung dịch lugol, cồn 900, dung dịch fucsin kiềm. - Thuốc thử tính chất sinh vật hoá học: Thuốc thử oxidase. Dung dịch xanh brommothymol 1,5% trong cồn 900. Dung dịch đỏ methyl: Đỏ methyl 0,1g + cồn 950.Thuốc thử kowaca (thử tính chất sinh indol). - Thuốc thử phản ứng VP: Dung dịch A: α naphton 6% trong cồn 900, để tủ lạnh trước khi dùng. Dung dịch B: NaOH 16% trong nước. - Nước muối NaCl 9‰ - Các hóa chất và thiết bị, máy móc sử dụng tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen Viện Công nghệ Sinh học. Các khoanh giấy kháng sinh - Các khoanh giấy kháng sinh được sử dụng của hãng Bio - Rad (Pháp) bao gồm: Ampicillin (AM), Piperacine (PIP), Cefalexine (CN), Cefotaxime (CTX), Cephalothin (CF), Cefazoline (CZ), Ceftazidime (CAZ), Ceftriaxone (CRO), Gentamycine (GM), Amikacine (AN), Netromycine (NET), Tobramycine (TM), Cotrimoxazol (SXT), Ciprofloxacine (CIP), Norfloxacin (NOR), Pefloxacine (PEF), Doxycylin (DO), Chloramphenicol (C), Rifamycine (RA), Nitrofurantoin (FT). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 19 2.2.3. Môi trường nuôi cấy, phân lập, xác định tính chất sinh hóa và làm kháng sinh đồ Thành phần và cách pha chế các môi trường được trình bày trong bảng 2.1 Bảng 2.1 Môi trƣờng nuôi cấy, phân lập, xác định tính chất sinh hóa và làm kháng sinh đồ Môi trƣờng Thạch thƣờng Số lƣợng Cao thịt 5g Pepton 10g Bột NaCl tinh khiết 5g Thạch sợi 20g Nước cất 1000ml Thành phần Thạch thường Máu thỏ đã loại tơ huyết Thạch máu Chocolate Xitrat simmon Thạch mềm Thạch thường Máu thỏ đã loại tơ huyết NaCl Nước cất vừa đủ Natri xitrat (NH4)HPO4 Magie sunfat, K2HPO4 Thạch Dung dịch xanh brommothymol 1,5% trong cồn 900 Pepton Cao thịt Muối tinh khiết Cao men Thạch Cách pha chế Cân đong đầy đủ các thành phần môi trường cho vào nồi nhôm, đun nóng cho tan. Điều chỉnh pH (7,4 7,6) bằng NaOH 20%. Hấp ở 1200C trong 15 phút. Đổ môi trường ra các đĩa Petri. 250ml Đun nóng chảy 250 ml thạch 15ml thường đựng trong bình cầu, để nguội khoảng 550C - 660C. Cho 15 ml máu thỏ vào bình thạch. Lấy tay lắc xoay tròn cho máu tan đều. Đổ môi trường vào đĩa Petri. 250ml Làm như thạch máu rồi đun cách 15ml thuỷ 800C trong 10 phút. Chú ý phải lắc đều bình thạch. Để nguội 45 50oC đổ ra đĩa. 5g Đun sôi tất cả các thành phần môi 1000ml trường cho đến khi tan hoàn toàn. 2g Điều chỉnh pH: 7,2. Thêm dung dịch 1g xanh brommothymol, môi trường sẽ 0,2g có màu xanh lá cây. Đổ môi trường 1g ra các ống nghiệm, hấp ở 1100C 20g trong 30 phút sau đó đem ra để 10ml nghiêng cho môi trường đông lại. 10g Đun sôi cho tan hoàn toàn các chất. 3g Điều chỉnh pH = 7,6. Hấp ở 1100C 5g trong 30 phút. Đổ ra các ống 6g nghiệm 12mm mỗi ống khoảng 3ml. 6g Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn