Tài liệu Nghiên cứu tính kháng carbapenem ở mức độ phân tử của acinetobacter baumannii gây nhiễm khuẩn tại bệnh viện đa khoa thống nhất đồng nai

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN SĨ TUẤN NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG CARBAPENEM Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA ACINETOBACTER BAUMANNII GÂY NHIỄM KHUẨN TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA THỐNG NHẤT ĐỒNG NAI LUẬN ÁN TIẾN SĨ TP. HỒ CHÍ MINH - NĂM 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN SĨ TUẤN NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG CARBAPENEM Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA ACINETOBACTER BAUMANNII GÂY NHIỄM KHUẨN TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA THỐNG NHẤT ĐỒNG NAI Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số chuyên ngành: 60420201 Phản biện độc lập 1: PGS. TS. Cao Hữu Nghĩa Phản biện độc lập 2: PGS. TS. Nguyễn Tú Anh Phản biện 1: PGS. TS. BS. Lý Văn Xuân Phản biện 2: PGS. TS. Ngô Thị Hoa Phản biện 3: PGS. TS. Phan Thị Phượng Trang NGƯỜI HƯỚNG DẪN 1. PGS. TS. Nguyễn Thúy Hương 2. TS. BS. Phạm Hùng Vân LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định. Tác giả luận án, Chữ ký Nguyễn Sĩ Tuấn i TÓM TẮT LUẬN ÁN Acinetobacter baumannii là một tác nhân đa kháng thuốc hàng đầu trong các cơ sở y tế ở Việt Nam từ thập kỷ thứ 2 của thế kỷ 21. Các nghiên cứu từ tháng 1 năm 2013 đến tháng 12 năm 2017 cho thấy 105 chủng A. baumannii đa kháng thuốc gây nhiễm khuẩn ở bệnh viện Đa khoa Thống Nhất tỉnh Đồng Nai đã không còn nhạy cảm (kháng 100%) với hầu hết các kháng sinh chủ yếu để điều trị nhiễm khuẩn do trực khuẩn Gram âm (các beta-lactam; fluoro-quinolon; các beta-lactam kết hợp chất ức chế betalactamase; các aminoglycoside – ngoại trừ amikacin còn nhạy cảm 10,4% và tobramycin còn nhạy cảm 7,5%), kể cả nhóm kháng sinh được xem là lựa chọn cuối cùng để điều trị nhiễm khuẩn do A. baumannii là carbapenem (meropenem và imipenem). A. baumannii đa đề kháng chỉ còn nhạy cảm 100% với kháng sinh colistin và 99,0% với kháng sinh tigecycline. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của meropenem đối với A. baumannii trong nghiên cứu này rất cao, với 100% các chủng có MIC ≥ 32µg/ml. Trong hai kháng sinh còn nhạy cảm cao với A. baumannii đa kháng thuốc, 87% MIC colistin bằng 1µg/ml và chỉ có 0,9% MIC tigecycline > 2 µg/ml. Các kiểu phối hợp kháng sinh giữa meropenem/colistin và meropenem/rifampicin có tác dụng hiệp đồng và cộng lực với tỷ lệ rất cao, lần lượt là 94,3% và 81,9% lên các chủng A. baumannii. Tuy nhiên, tổ hợp tigecycline/colistin chỉ cho tác dụng hiệp đồng và cộng lực với tỷ lệ là 36,2%. Tác dụng của colistin ở nồng độ từ 1 µg/ml hoặc rifampicin ở nồng độ 2 µg/ml dưới MIC đều có khả năng chuyển các chủng A. baumannii từ không nhạy meropenem thành nhạy với meropenem với tỷ lệ cao. Về nhóm gen liên quan đến tính kháng carbapenem, nghiên cứu cho thấy nhóm gen mã hóa carbapenemase lớp D gồm blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-58 phân bố ở A. baumannii với tỷ lệ lần lượt là 97,1%; 79% và 7,6%. Trong khi đó, gen blaNDM-1 mã hóa carbapenemase lớp B phân bố ở A. baumannii với tỷ lệ 13,3% và chưa ghi nhận có gen blaKPC mã hóa carbapenemase lớp A ở A. baumannii. Trong nghiên cứu này, có 93,3% các chủng A. baumannii đa kháng thuốc có mang trình tự chèn Aba1 (ISAba1). Hơn nữa, A. baumannii đa kháng thuốc đề kháng carbapenem có sự tích lũy nhiều gen kháng, với 80% các chủng có mang đồng thời 3 gen liên quan đến tính kháng carbapenem và ii trong đó có 97,6% chủng có ISAba1 trong 3 gen liên quan đến tính kháng carbapenem. Để tìm hiểu sâu hơn về đặc điểm hệ gen, mối quan hệ phát sinh loài và các hệ gen so sánh của các chủng A. baumannii trong nghiên cứu, 2 chủng đặc trưng nhất về các gen liên quan đến tính kháng carbapenem được chọn để giải trình tự và phân tích hệ gen (Chủng DMS06669 và DMS06670). Lắp ráp trình tự toàn bộ hệ gen chủng DMS06669 và DMS06670 thu được kích thước bộ gen ước tính lần lượt là 4,2Mb và 3,8Mb. Bằng phương pháp này, việc xác định các gen kháng thuốc tiềm năng được tiến hành và nghiên cứu cho thấy xác suất chủng DMS06669 và DMS06670 là mầm bệnh ở người lần lượt là 85,8% và 85,3%, với tương ứng là 632 và 622 họ protein gây bệnh. Ngoài ra, việc phân tích các nhóm tương đồng (COG) trong chuỗi protein của các chủng A. baumannii DMS06669 và DMS06670 được so sánh với bốn hệ gen khác cho thấy các cụm protein tương đồng chịu trách nhiệm cho nhiều thuốc tồn tại trong các chủng kháng kháng sinh cao. Phân tích cây phát sinh loài cho thấy, dựa trên giá trị nhận dạng nucleotit trung bình, A. baumannii DMS06670 là một nhóm họ hàng với hai chủng A. baumannii LAC-4, BJAB0715 trong khi chủng A. baumannii DMS06669 là một nhóm 5 chủng A. baumannii gồm ATCC_17978, D1279779, ZW85-1, ab031, và SDF. Cuối cùng, phân tích so sánh 23 hệ gen sẵn có của các chủng A. baumannii cho thấy một pan-genome gồm 15.883 gen. Tiến hành phân lập in-vitro 19 gen kháng thuốc bằng phương pháp PCR và xác nhận lại 19 trình tự DNA các gen kháng thuốc bằng phương pháp Sanger cải tiến. Như vậy, các chủng A. baumannii gây nhiễm khuẩn bệnh viện đã đề kháng với hầu hết các nhóm kháng sinh và chỉ còn nhạy cảm cao với colistin, tigecyline, rifampicin. Việc phối hợp in-vitro một carbapenem là meropenem với colistin, rifampicin có thể tạo tác dụng hiệp đồng và cộng lực để điều trị các nhiễm khuẩn A. baumannii đề kháng carbapenem. Đa số sự đề kháng carbapenem của A. baumannii có tích lũy ba gen mã hóa enzyme carbapenemase. Việc giải trình tự hệ gen hai chủng đặc trưng giúp hiểu rõ về các cơ chế mức độ phân tử của sự kháng thuốc kháng sinh ở A. baumannii. iii ABSTRACT Acinetobacter baumannii is the leading multidrug resistant agent in Vietnamese health care systems in the second decade of the 21st century. Studies from January 2013 to December 2017 revealed that 105 strains of multidrug-resistant A. baumannii, which cause infectious diseases in Dong Nai Genral Hospital, were not 100% sensitive to most antibiotics for the treatment of Gram-negative bacillii. These antibiotics include beta-lactam; fluoroquinolones; beta-lactam/beta-lactamase inhibitors combinations; aminoglycosides, although they are remaining sensitive to amikacin (10,4%) and tobramycin (7,5%). These agents are resistant even with carbapenem (meropenem and imipenem) – the rescue strategy for the treatment of infections caused by A. baumannii. Acinetobacter baumannii was 100% sensitive to only one antibiotic, named colistin and 99.0% to tigecycline. Meropenem/colistin and meropenem/rifampicin showed strong synergistic and additive effects on A. baumannii, accounted for 94.3% and 81.9%, respectively. However, the combination of tigecycline and colistin only showed synergistic and additive effects at just 36.2%. Effects of colistin at concentrations of 1 μg/ml or rifampicin at 2 μg/ml under MIC are likely to transfer the A. baumannii from meropenem insensitivity to meropenem in a high. Considering group of gens related to carbapenem resistance, the study showed that gens encoding the class-D carbapenemase, namely blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-58 were distributed in A. baumannii with 97.1%; 79% and 7.6% respectively. Meanwhile, the figure for blaNDM-1, genes encoding class B carbapenemase were about 13.3% and gene blaKPC encoding the A-type carbapenemase in A. baumannii has not been reported. In this study, 93.3% of multidrug-resistant A. baumannii strains had an Aba1 insertion sequence (ISAba1). Furthermore, carbapenem resistant in multidrug-resistant A. baumannii is due to the accumulation of resistant genes, with 80% of those containing three genes associated with carbapenem resistance simultaneously and 97.6% of which have ISAba1 in three genes. To better understand the genomic characteristics and phylogentic relationships and comparative genomics of A. baumannii strains in this study, the two most typical strains of carbapenem resistance genes were selected for sequencing and gentic iv analysis (Strain DMS06669 and strain DMS06670). Assembly of whole-genome shotgun sequences of strain DMS06669 and DMS06670 yielded an estimated genome size of 4.2Mb and 3.8 Mb. In this manner, the identification of potential antibiotic resistance genes was conducted, and we predicted that the probability of A. baumannii DMS06669 (our strain in previous study) and DMS06670 as a human pathogen is 85.8% and 85.3%, with 632 and 622 pathogenic families, respectively. Additionally, the clusters of orthologous groups (COGs) analysis in protein sequence of A. baumannii strain DMS06669 and DMS06670 was compared with the other four genomes showed that the orthologous protein clusters responsible for multi-drug exist inside highly antimicrobial resistant strains. Phylogenetic analysis revealed that, based on the average nucleotide identity value, A. baumannii DMS06670 is a sister group to the LAC-4 and BJAB0715 strains of A. baumannii while A. baumannii strain DMS06669 is a sister group to strains ATCC_17978, D1279779, ZW85-1, ab031, and SDF. Lastly, comparative analysis of twenty-three available genomes of A. baumanii strains revealed a pan-genome consisting of 15,883 genes. Antibiotics resistance genes in-vitro (19 genes) were isolated by PCR and re-confirmed by improved Sanger method. So, A. baumannii strains causing infections in hospitals has been resistant to almost all antibiotic groups and is only highly susceptible to colistin, tigecline, rifampicin. The combination of carbapenem such as meropenem with colistin or rifampicin can create synergistic and additive effects to treat infections of carbapenem-resistant A. baumannii. Most of the carbapenem resistance of A. baumannii has accumulated three genes encoding for carbapenemase. Next generation sequencing of the two specific strains provide insight into the molecular mechanisms leading to antibiotic resistance in A. baumannii. v LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Cô, PGS. TS. Nguyễn Thúy Hương, Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh, người hướng dẫn khoa học, luôn giúp đỡ, động viên tôi và tận tình truyền đạt những kiến thức và những kinh nghiệm quý báu để tôi có thể hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy, Tiến sĩ – Bác sĩ Phạm Hùng Vân, Chủ tịch Hội Vi sinh Lâm sàng Thành phố Hồ Chí Minh, người luôn đồng hành, giúp đỡ tôi, chỉ bảo và truyền cảm hứng cho tôi suốt quá trình học tập, thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ – Bác sĩ Phạm Văn Dũng, Giám đốc Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất tỉnh Đồng Nai, người đã dìu dắt tôi những ngày đầu khi tôi về công tác tại đây, người đã giúp đỡ, cố vấn và tạo mọi điều kiện tốt nhất cả về vật chất và tinh thần để tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Nguyễn Cường, Trưởng phòng Tin sinh học – Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam, người đã chỉ bảo và đã giúp đỡ rất nhiều để tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc, tập thể khoa Vi sinh - bệnh viện Đa khoa Thống Nhất tỉnh Đồng Nai và các Thầy Cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Bách Khoa Tp. HCM và các bạn bè, đồng nghiệp đã hết lòng tạo điều kiện, giúp đỡ, hỗ trợ tôi suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi luôn ghi nhớ công ơn và tình yêu thương của bố mẹ, cha mẹ dành cho tôi và sự ủng hộ, động viên, thương yêu, chăm sóc, khích lệ hết lòng của vợ, hai con và các anh chị trong gia đình, những người luôn ở bên tôi, là hậu phương vững chắc để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án này./. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 2 năm 2019 NCS. Nguyễn Sĩ Tuấn vi MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN .................................................................................................................................. vi MỤC LỤC ....................................................................................................................................... vii DANH MỤC BẢNG ..........................................................................................................................x DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................................... xiii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................................... xvi MỞ ĐẦU ............................................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................................4 1.1. Chi Acinetobacter .............................................................................................................. 4 1.1.1. Acinetobacter baumannii .......................................................................................... 4 1.1.2. Sinh bệnh học và sự đề kháng kháng sinh............................................................... 5 1.2. Các yếu tố độc lực của Acinetobacter baumannii ........................................................... 9 1.3. Nhóm kháng sinh Carbapenem .................................................................................... 13 1.4. 1.5. 1.3.1. Hóa học .................................................................................................................... 13 1.3.2. Cơ chế tác động ....................................................................................................... 13 1.3.3. Sự đề kháng ............................................................................................................. 14 Carbapenemase .............................................................................................................. 16 1.4.1. Carbapenemase Ambler lớp A ................................................................................ 16 1.4.2. Carbapenemase Ambler lớp B – Metallo-beta-lactamase ...................................... 17 1.4.3. Carbapenemase Ambler lớp D – Oxacillinase........................................................ 19 1.4.4. Các trình tự chèn (IS) ở Acinetobacter .................................................................. 32 Sự đề kháng kháng sinh ở Acinetobacter baumannii ................................................... 37 1.5.1. Tình hình đề kháng carbapenem ở Nam và Đông Nam Á .................................... 38 1.5.2. Nghiên cứu về Acinetobacter baumannii kháng thuốc tại Việt Nam ................... 42 1.6. Cơ chế tác động của kháng sinh trong các phối hợp ................................................... 46 1.7. Giải trình tự hệ gen thế hệ mới (Next Genration Sequencing, NGS) ........................ 49 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...........................................................................51 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện .................................................................................... 51 2.2. Vật liệu ............................................................................................................................ 51 2.2.1. Hóa chất................................................................................................................... 51 2.2.2. Chủng vi khuẩn ....................................................................................................... 51 2.3. Sơ đồ nghiên cứu của luận án ....................................................................................... 53 2.4. Các phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 55 2.4.1. Các phương pháp vi sinh lâm sàng ....................................................................... 55 2.4.1.1. Phương pháp cấy đàm ...................................................................................... 55 vii 2.4.1.2. Phương pháp định danh và kháng sinh đồ bằng hệ thống tự động .................. 56 2.4.1.3. Phương pháp hiệp đồng bàn cờ ....................................................................... 56 2.4.2. Các phương pháp sinh học phân tử ...................................................................... 60 2.4.2.1. Phương pháp tách chiết DNA........................................................................... 60 2.4.2.2. Phương pháp PCR đa mồi................................................................................ 61 2.4.2.3. Phương pháp realtime PCR ............................................................................. 63 2.4.2.4. Phương pháp cải tiến của phương pháp Sanger .............................................. 65 2.4.2.5. Phương pháp Illumina sequencing ................................................................... 67 2.4.2.6. Phương pháp điện di trên gel-agarose ............................................................. 70 2.4.3. Các phương pháp tin – sinh học............................................................................ 71 2.4.3.1. Phương pháp thiết kế mồi................................................................................. 71 2.4.3.2. Phương pháp đánh giá và tiền xử lý dữ liệu hệ gen ......................................... 75 2.4.3.3. Phương pháp lắp ráp hệ gen ............................................................................ 75 2.4.3.4. Phương pháp chú giải chức năng và dự đoán hệ gen ...................................... 75 2.4.3.5. Phương pháp so sánh toàn bộ hệ gen và phân tích cây phát sinh loài ............ 76 2.4.4. Các phương pháp thống kê.................................................................................... 77 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .....................................................................................78 3.1. Đặc điểm kháng kháng sinh, tỷ lệ các gen liên quan đến kháng carbapenem và tác dụng diệt khuẩn in-vitro của các phối hợp kháng sinh lên Acinetobacter baumannii .............. 78 3.1.1. Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii .................................... 78 3.1.2. MIC của colistin, meropenem, rifampicin và tigecycline đối với Acinetobacter baumannii đề kháng carbapenem .......................................................................................... 81 3.1.3. Tác dụng diệt khuẩn in-vitro của các phối hợp kháng sinh lên Acinetobacter baumannii đề kháng carbapenem .......................................................................................... 87 3.1.4. Tỷ lệ các gen thường gặp có liên quan đến tính kháng carbapenem ở Acinetobacter baumannii và mối liên quan với kiểu tác dụng của 3 phối hợp kháng sinh ....................... 105 3.2. Đặc điểm hệ gen, các yếu tố độc lực và gen đề kháng kháng sinh in-silico ở các chủng Acinetobacter baumannii đặc trưng bằng phương pháp Tin – Sinh học ................................. 110 3.2.1. Đặc điểm chung của chủng các chủng Acinetobacter baumannii đặc trưng ..... 111 3.2.2. Phân tích phát sinh loài toàn bộ hệ gen của các chủng Acinetobacter baumannii đặc trưng ................................................................................................................................ 114 3.2.3. Phân tích các gen liên quan đến độc lực và kháng kháng sinh in-silico ở các chủng Acinetobacter baumannii đặc trưng ..................................................................................... 115 3.2.4. Phân tích gen ortholog ở các chủng A. baumannii đặc trưng ........................... 125 3.2.5. Phân tích pan-genome ở các chủng A. baumannii đặc trưng ............................. 127 3.3. Khuếch đại các gen đề kháng kháng sinh từ kết quả in-silico ở các chủng Acinetobacter baumannii đặc trưng bằng phương pháp thực nghiệm Sinh học Phân tử ...... 130 viii 3.3.1. PCR khuếch đại các gen đề kháng kháng sinh ở các chủng Acinetobacter baumannii đặc trưng ............................................................................................................. 130 3.3.2. Xác nhận trình tự các gen đề kháng kháng sinh in-vitro ở các chủng Acinetobacter baumannii đặc trưng bằng phương pháp Sanger cải tiến ................................................... 131 3.3.2.1. Các gen đề kháng lớp kháng sinh aminoglycoside......................................... 131 3.3.2.2. Các gen đề kháng lớp kháng sinh beta-lactam............................................... 139 3.3.2.3. Các gen đề kháng lớp kháng sinh macrolide ................................................. 146 3.3.2.4. Các gen kháng lớp kháng sinh phenicol......................................................... 152 3.3.2.5. Gen ARR-3 ở chủng A. baumannii DMS06669 đề kháng rifampicin ............. 155 3.3.2.6. Gen đề kháng lớp kháng sinh sulphonamide .................................................. 156 3.3.2.7. Gen tet(39) ở chủng A. baumannii DMS06669 kháng tetracycline................ 157 3.3.2.8. Gen dfrA27 ở chủng A. baumannii DMS06669 kháng trimethoprim ............ 158 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................161 4.1. Kết luận ......................................................................................................................... 161 4.2. Kiến nghị ....................................................................................................................... 162 CÁC ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI .................................................................................................163 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .............................................................................164 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................165 PHỤ LỤC .......................................................................................................................................180 Phụ lục 1. Quy trình vi khuẩn nuôi cấy, định danh và kháng thuốc hệ thống tự động .................. 180 Phụ lục 2. Quy trình xây dựng PCR đa mồi phát hiện 4 gen mã hóa 16S-rRNA, OXA-23, OXA-51 và OXA-58 ở 105 chủng Acinetobacter baumannii ....................................................................... 188 Phụ lục 3. Minh họa kết quả realtime PCR phát hiện các gen mã hóa ISAba1, KPC và NDM-1 200 Phụ lục 4. Các kết quả từ PathogenFinder đối với hệ gen Acinetobacter baumannii DMS06669, DMS06670 ..................................................................................................................................... 205 Phụ lục 5. Trình tự mồi của các gen kháng thuốc in-silico được dùng để phân lập in-vitro bằng phương pháp PCR .......................................................................................................................... 206 Phụ lục 6. Danh sách bệnh nhân tham gia trong nghiên cứu......................................................... 235 Phụ lục 7. Các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu khuếch đại in vitro các gen in-silico của hình 3.13 ........................................................................................................................................ 239 Phụ lục 8. Kết quả điện di của các mẫu trong nghiên cứu sau khi PCR đa mồi để phát hiện các gen blaOXA thường gặp ở A. baumannii kháng carbapenem ................................................................. 241 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1. Các điểm đặc trưng của giống Acinetobacter .................................. 4 Bảng 1. 2. Các yếu tố độc lực được xác định ở Acinetobacter baumannii..... 10 Bảng 1. 3. Đo lường động học enzyme minh họa khả năng ........................... 25 Bảng 2. 1. Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả của multiplex PCR .................. 63 Bảng 2. 2. Loại DNA làm bản mẫu và hàm lượng sử dụng............................ 65 Bảng 2. 3. Thành phần của một phản ứng giải trình tự Sanger cải tiến.......... 66 Bảng 2. 4. Kết quả kiểm tra các đặc tính vật lý của từng trình tự mồi ........... 74 Bảng 2. 5. Kết quả khuếch đại in silico xác định vị trí bắt cặp và kích thước sản phẩm PCR........................................................................................................ 74 Bảng 2. 6. Thông tin hệ gen 21 chủng A. baumannii đã được công bố trên KEGG .............................................................................................................. 76 Bảng 3. 1. Đặc điểm chung của bệnh nhân tham gia nghiên cứu ................... 78 Bảng 3. 2. Tính kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii trong nghiên cứu ................................................................................................................... 79 Bảng 3. 3. Giá trị MIC của colistin đối với A. baumannii đề kháng carbapenem ......................................................................................................................... 82 Bảng 3. 4. Giá trị MIC của meropenem đối với A. baumannii đề kháng carbapenem...................................................................................................... 83 Bảng 3. 5. Giá trị MIC của Rifampicin đối với A. baumannii đề kháng carbapenem...................................................................................................... 84 Bảng 3. 6. Giá trị MIC của Tigecycline đối với A. baumannii đề kháng carbapenem...................................................................................................... 85 Bảng 3. 7. Các kiểu tác dụng in-vitro của 3 tổ hợp kháng sinh lên Acinetobacter baumannii đề kháng carbapenem .................................................................. 102 Bảng 3. 8. Phân bố các chủng A. baumannii chuyển từ không nhạy meropenem thành nhạy khi có sự phối hợp với colistin ở các mức nồng độ thấp hơn MIC ....................................................................................................................... 103 Bảng 3. 9. Phân bố các chủng A. baumannii chuyển từ không nhạy meropenem thành nhạy khi có sự phối hợp với rifampicin ở các mức nồng độ thấp hơn MIC ....................................................................................................................... 104 Bảng 3. 10. Tóm tắt kiểm định giả thuyết về tác dụng hiệp đồng và cộng lực của 3 tổ hợp kháng sinh đối với Acinetobacter baumannii .......................... 105 Bảng 3. 11. Phân bố các gen liên quan đến tính kháng carbapenem ở A. baumannii ...................................................................................................... 107 Bảng 3. 12. Phân bố số gen trong cùng 1 chủng ở A. baumannii kháng carbapenem.................................................................................................... 108 x Bảng 3. 13. Thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh của DMS06669 và DMS06670 ....................................................................................................................... 111 Bảng 3. 14. Kết quả lắp ráp, chú giải hệ gen A. baumannii DMS06669 & DMS06670 .................................................................................................... 113 Bảng 3. 15. Một số gen liên quan đến độc lực của chủng A. baumannii DMS06669 .................................................................................................... 115 Bảng 3. 16. Một số gen liên quan đến độc lực của chủng A. baumannii DMS06670 .................................................................................................... 116 Bảng 3. 17. Các vùng tiền thể thực khuẩn ở A. baumannii DMS06669 và DMS06670 .................................................................................................... 117 Bảng 3. 18. Ổ gen đề kháng kháng sinh ở A. baumannii DMS06669, DMS06670 .................................................................................................... 118 Bảng 3. 19. Những trình tự chèn (IS) ở Acinetobacter baumannii DMS06669 ....................................................................................................................... 121 Bảng 3. 20. Những trình tự chèn (IS) ở Acinetobacter baumannii DMS06670 ....................................................................................................................... 122 Bảng 3. 21. Các loài có mang gen aadA16 tương đồng cao với Query 56683 ....................................................................................................................... 132 Bảng 3. 22. Các loài có mang gen aadB tương đồng cao với Query_244963 ....................................................................................................................... 133 Bảng 3. 23. Các loài có mang gen aadB tương đồng cao với Query_10607 136 Bảng 3. 24. Các loài có mang gen rmtB tương đồng cao với Query_59429 137 Bảng 3. 25. Các loài có mang gen blaVEB7 tương đồng cao với Query_209689 ....................................................................................................................... 139 Bảng 3. 26. Các loài có mang gen blaOXA10 tương đồng cao với Query_154333 ............................................................................................... 140 Bảng 3. 27. Các loài có gen blaADC25 tương đồng cao với blaADC25 DMS06669 .................................................................................................... 142 Bảng 3. 28. Các loài có gen blaOXA64 tương đồng cao với query 133871 143 Bảng 3. 29. Các loài có gen blaCARB2 tương đồng cao với blaCARB2 ở DMS06670 .................................................................................................... 144 Bảng 3. 30. Các loài có gen blaADC25 tương đồng cao với blaADC25 ở DMS06670 .................................................................................................... 144 Bảng 3. 31. Các loài có gen blaOXA68 tương đồng cao với Query_144315 ....................................................................................................................... 145 Bảng 3. 32. Các loài có gen mph(E) tương đồng cao với Query 4549 ......... 146 Bảng 3. 33. Các loài có gen msr(E) tương đồng cao với Query 114195 ...... 148 Bảng 3. 34. Các loài có gen mph(E) tương đồng cao với Query 173467 ..... 150 Bảng 3. 35. Các loài có gen msr(E) tương đồng cao với Query 202913 ...... 151 Bảng 3. 36. Các loài có gen cmlA1 tương đồng cao với Query 240841 ...... 153 xi Bảng 3. 37. Các loài có gen floR tương đồng cao với Query 185135 .......... 154 Bảng 3. 38. Các loài có gen ARR-3 tương đồng cao với Query 26945........ 155 Bảng 3. 39. Các loài có gen sul1 tương đồng cao với Query 185135 .......... 157 Bảng 3. 40. Các loài có gen sul1 tương đồng cao với sul1 ở DMS06670 .... 157 Bảng 3. 41. Các loài có gen tet(39) tương đồng cao với Query 69507 ........ 157 Bảng 3. 42. Các loài có gen dfrA27 tương đồng cao với Query 35229........ 159 xii DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1. Các cơ chế đề kháng kháng sinh chủ yếu ở Acinetobacter .............. 7 Hình 1. 2. Đơn giản hóa sự biểu diễn của 1 integron lớp 1 .............................. 8 Hình 1. 3. Cấu trúc lõi và các nguyên tử thay thế đối với kháng sinh carbapenem ......................................................................................................................... 14 Hình 1. 4. Các yếu tố di truyền di động kết hợp với các gen blaOXA. ............... 36 Hình 1. 5. Tỷ lệ ước tính Acinetobacter baumannii đề kháng carbapenem ở các quốc gia Nam và Đông Nam Á ....................................................................... 38 Hình 1. 6. Phương thức hoạt động kháng khuẩn của polymyxin chống lại màng tế bào vi khuẩn Gram âm; LPS: Lipopolysaccharide ..................................... 47 Hình 1. 7. Sơ đồ minh họa cơ chế hoạt động của các kháng sinh trong các tổ hợp phối hợp kháng sinh ................................................................................. 47 Hình 2. 1. Mô hình bàn cờ để xác định khả năng hiệp đồng kháng sinh ........ 56 Hình 2. 2. Minh họa phương pháp tìm MIC kỹ thuật hiệp đồng bàn cờ ........ 58 Hình 2. 3. Minh họa cách xác định có hiệp đồng hay không với kháng sinh điều trị chính (meropenem) ở các nồng độ dưới MIC của kháng sinh hỗ trợ (colistin) ......................................................................................................................... 59 Hình 2. 4. Nguyên tắc của PCR là nhân bản DNA đích qua các chu kỳ nhiệt 62 Hình 2. 5. Máy giải trình tự ABI-3500 ........................................................... 67 Hình 2. 6. Ba giai đoạn của giải trình tự thế hệ tiếp theo (1) Tách rời và tóm bắt các mảnh DNA được giải trình tự lên các giá bám; (2) Dùng PCR với mồi đặc hiệu adapter để khuếch đại các mảnh DNA trên giá bám thành từng clone; (iii) Giải trình tự bằng tổng hợp (SBS). ................................................................. 69 Hình 3. 1. Biểu đồ nồng độ colistin đạt trong dịch cơ thể với liều sử dụng khác nhau ................................................................................................................. 82 Hình 3. 2. Khả năng đạt được mục tiêu diệt khuẩn (nồng độ thuốc tự do cao hơn MIC trong 40% khoảng thời gian dùng thuốc ở các MIC cụ thể, sau khi tiêm 1g meropenem mỗi 8 giờ với thời gian truyền là 0,5 giờ; 1 giờ; 2 giờ và 3 giờ) .................................................................................................................. 83 Hình 3. 3. Sự phân bố giá trị MIC của các chủng A. baumannii với rifampicin ......................................................................................................................... 84 Hình 3. 4. Xác xuất đạt được mục tiêu của 10 ngàn bệnh nhân mô phỏng được trị liệu với tigecycline ở các liều lượng khác nhau. Mục tiêu được chọn là fAUC0-24h/MIC > 0,9 ....................................................................................... 85 Hình 3. 5. Vòng tròn đại diện và sự phân bố các thành phần trong bộ gene của chủng A. baumannii DMS06669 và DMS06670. Các vòng tròn được đánh số từ 1 (vòng ngoài cùng với màu xanh blue là chủ yếu) tới 10 (vòng tròn trong cùng gồm 2 màu tím và xanh green). Các vòng tròn bên ngoài biểu diễn trình xiii tự mã hóa protein (CDS), tRNA, rRNA và các codon mở đầu, kết thúc (4 vòng tròn ngoài cùng là của mạch “forward”, bốn vòng tiếp theo biểu diễn mạch “reverse”. Vòng thứ 9 đại diện cho tỷ lệ GC (màu đen). Vòng tròn thứ 10 thể hiện đường cong tỷ lệ GC (Tỷ lệ GC +, màu xanh green, tức là tỷ lệ G>C; tỷ lệ GC -, màu tím, tức là tỷ lệ G - Xem thêm -