Tài liệu Nghiên cứu tình hình nhiễm, vai trò của vi khuẩn clostridium perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở bò, lợn nuôi tại hà nội và một số vùng phụ cận

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ i BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI HUỲNH THỊ MỸ LỆ NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH NHIỄM, VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÒ, LỢN NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ MỘT SỐ VÙNG PHỤ CẬN LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Dịch tễ học Thú y Mã số : 62 62 50 15 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Bá Hiên 2. TS. ðỗ Ngọc Thuý HÀ NỘI – 2010 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan: công trình khoa học này là của tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan: mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện ñề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án ñều ñã ñược cảm ơn. Các thông tin trích dẫn trong luận án ñều chính xác và ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 15 tháng 3 năm 2010 Tác giả Huỳnh Thị Mỹ Lệ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận án, tôi luôn nhận ñược sự giúp ñỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Viện ðào tạo Sau ðại học, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y - trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện cho tôi ñược theo học chương trình ñào tạo Nghiên cứu sinh tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn ban ñiều hành dự án Việt - Bỉ, trường ðHNN Hà Nội ñã hỗ trợ kinh phí ñể tôi thực hiện ñề tài nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ thuộc bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, khoa Thú y - Trường ðHNN Hà Nội; bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia và Trung tâm Cúm Quốc Gia - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương ñã nhiệt tình giúp ñỡ, tạo ñiều kiện thuận lợi nhất ñể tôi hoàn thành ñề tài nghiên cứu. ðặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến các thầy hướng dẫn khoa học là TS. Nguyễn Bá Hiên - bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, khoa Thú y - trường ðHNN Hà Nội và TS. ðỗ Ngọc Thuý - bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia ñã trực tiếp hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn ñến Giáo sư Jacques Mainil, Giáo sư Annick Linden khoa Thú y - trường ðại học Liège, Vương quốc Bỉ và PGS.TS. Trương Quang, TS. Trần Thị Lan Hương, GVC. Lê Văn Lãnh - khoa Thú y - trường ðHNN Hà Nội ñã cung cấp tài liệu và những ý kiến quý báu ñể tôi hoàn thiện ñề tài nghiên cứu. Tôi luôn biết ơn gia ñình, bạn bè và các em sinh viên ñã ñóng góp công sức, ñộng viên, giúp ñỡ tôi hoàn thành ñề tài nghiên cứu và luận án. Hà Nội, ngày 15 tháng 3 năm 2010 Tác giả Huỳnh Thị Mỹ Lệ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ iv MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ðẦU Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS VÀ BỆNH DO CLOSTRIDIUM PERFRINGENS GÂY RA 1.1.1. Giới thiệu chung về genus (giống, chi) Clostridium 1.1.2. Vi khuẩn Clostridium perfringens 1.1.3. Hiểu biết về một số bệnh ñường tiêu hoá chủ yếu ở bò và lợn do vi khuẩn C. perfringens gây ra Trang i ii iii v vi viii 1 4 4 4 11 22 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM VỀ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS VÀ BỆNH DO CLOSTRIDIUM PERFRINGENS GÂY RA 31 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 31 31 1.3. MỘT SỐ BIỆN PHÁP PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH DO VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS GÂY RA 1.3.1. Biện pháp phòng bệnh 1.3.2. Biện pháp ñiều trị Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nghiên cứu tình hình nhiễm vi khuẩn C. perfringens ở bò và lợn mắc hội chứng tiêu chảy 2.1.2. Nghiên cứu vai trò của vi khuẩn C. perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở bò và lợn 2.1.3. Bước ñầu nghiên cứu dịch tễ học phân tử vi khuẩn C. perfringens gây hội chứng tiêu chảy ở bò và lợn 2.2. NGUYÊN LIỆU 2.2.1. ðối tượng nghiên cứu 2.2.2. ðộng vật thí nghiệm 2.2.3. Môi trường, hoá chất 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 34 34 38 40 40 40 40 40 41 41 41 41 42 42 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ v 2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn hiếu khí và yếm khí 2.3.3. Phương pháp giám ñịnh một số ñặc tính sinh học của vi khuẩn C. perfringens phân lập ñược 2.3.4. Phương pháp xác ñịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng C. perfringens phân lập ñược 2.3.5. Phương pháp xác ñịnh gen mã hóa ñộc tố và ñịnh typ bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.3.6. Phương pháp giải trình tự gen 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. TÌNH HÌNH NHIỄM VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Ở BÒ VÀ LỢN MẮC HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens ở bò 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens ở lợn 43 46 49 51 53 56 57 57 57 62 3.2. NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÒ VÀ LỢN 3.2.1. Số lượng của vi khuẩn C. perfringens trong phân bò, lợn bị tiêu chảy và khoẻ mạnh 3.2.2. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens trong môi trường chuồng nuôi, sữa bò và bệnh phẩm của bò, lợn bị tiêu chảy 3.2.3. Kết quả giám ñịnh ñặc tính sinh học và khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng C. perfringens ñã phân lập ñược 72 72 77 84 3.3. BƯỚC ðẦU NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGRENS GÂY HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÒ VÀ LỢN 3.3.1. Kết quả xác ñịnh gen mã hóa yếu tố ñộc lực và ñịnh typ các chủng C. perfringens phân lập ñược 3.3.2. Kết quả giải trình tự gen các chủng C. perfringens Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN 4.2. ðỀ NGHỊ DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 100 100 117 123 123 124 125 126 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ vi CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN A ADP AMP API ATCC BHI bp C CAMP CDC CFU CI CPE CW C. perfringens DNA dNTP E. coli ELISA EYA FAO G HBS kDa KM LD µl NCCLS OR RNA rRNA PCR SIM T TAE TE TC TGC TGE TSC : Adenin : adenosine diphosphate : Amplification buffer : Analytical Profile Index : American Type Culture Collection : Brain Heart Infusion : base pair : Cytosin : Christie Atkins Munch-Petersen : Centers for Disease Control and Prevention : Colony Forming Unit : Confidence interval : Clostridium perfringens enterotoxin : Clostridium welchii : Clostridium perfringens : Deoxyribonucleic Acid : deoxyribonucleotide triphosphate : Escherichia coli : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay : Egg Yolk Agar : Food and Agriculture Organization : Guanin : Haemorrhagic bowel syndrome : kilo Dalton : Khoẻ mạnh : Lethal dose : microlitre : National Committee of Clinical Laboratory Standards : Odds Ratio : Ribonucleic Acid : Ribosomal Ribonucleic Acid : Polymerase Chain Reaction : Sulfide – Indole - Motility : Thymin : Tris - Acetate - EDTA : Tris - EDTA : Tiêu chảy : Thioglycollate : Transmissible gastroenteritis : Tryptose Sulphite Cycloserine Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ vii DANH MỤC CÁC BẢNG TT 1.1 1.2 1.3 1.4 2.1 Tên bảng Trang Bệnh do vi khuẩn Clostridium gây ra ở người và ñộng vật 5 ðiều kiện nuôi cấy thích hợp của vi khuẩn C. perfringens 12 Các loại ñộc tố do vi khuẩn C. perfringens sản sinh ra 13 Bệnh gây ra bởi các ñộc tố chính của vi khuẩn C. perfringens 20 Tiêu chuẩn ñánh giá mức ñộ mẫn cảm và kháng kháng sinh theo NCCLS (1999) 50 2.2 Trình tự mồi của phản ứng Multiplex PCR dùng ñể xác ñịnh 52 gen mã hoá ñộc tố của các chủng C. perfringens 2.3 Thành phần các chất trong phản ứng Multiplex PCR dùng ñể xác ñịnh gen mã hoá ñộc tố của các chủng C. perfringens 52 2.4 Chu kỳ nhiệt của phản ứng Multiplex PCR dùng ñể xác ñịnh gen mã hoá ñộc tố của các chủng C. perfringens 53 2.5 Trình tự cặp mồi ñể giải trình tự gen 54 2.6 Thành phần phản ứng PCR ñể giải trình tự gen 54 2.7 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR ñể giải trình tự gen 54 2.8 Chu kỳ nhiệt của phản ứng giải trình tự gen 55 3.1 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy và bò khỏe mạnh 57 3.2 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy tại các ñịa phương 58 3.3 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy theo lứa tuổi 60 3.4 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy và lợn khỏe mạnh 64 3.5 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy tại các ñịa phương 67 3.6 Số lượng vi khuẩn C. perfringens và E. coli trong mẫu phân bò bị tiêu chảy và bò khỏe mạnh 73 3.7 Số lượng vi khuẩn C. perfringens và E. coli trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy và lợn khỏe mạnh 75 3.8 Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens trong mẫu môi trường chuồng nuôi và sữa của bò bị tiêu chảy 78 3.9 Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens trong bệnh phẩm của bò và lợn bị tiêu chảy 82 3.10 Một số ñặc tính sinh học của các chủng C. perfringens phân lập ñược từ mẫu phân bò, lợn bị tiêu chảy và khỏe mạnh 85 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ viii 3.11 Một số ñặc tính sinh học của các chủng C. perfringens phân lập ñược từ môi trường chuồng nuôi, sữa và phủ tạng 3.12 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh hóa và ñịnh danh các chủng C. perfringens phân lập ñược bằng hệ thống API 20A 3.13 Kết quả kiểm tra ñộc tố trong chất lọc từ một số mẫu phân bò bị tiêu chảy 3.14 Kết quả kiểm tra ñộc lực của một số chủng C. perfringens phân lập ñược từ bò bằng phương pháp tiêm truyền trên chuột 3.15 Kết quả kiểm tra ñộc lực của một số chủng C. perfringens phân lập ñược từ lợn bằng phương pháp tiêm truyền trên chuột 3.16 Khả năng mẫn cảm của các chủng C. perfringens phân lập ñược từ bò và lợn bị tiêu chảy với 12 loại kháng sinh 3.17 Kết quả ñịnh typ các chủng C. perfringens phân lập ñược từ mẫu phân và phủ tạng bò bị tiêu chảy 3.18 Kết quả xác ñịnh gen cpe và cpb2 của các typ vi khuẩn C. perfringens phân lập từ bò 3.19 Kết quả xác ñịnh gen cpe và cpb2 của các typ vi khuẩn C. perfringens phân lập từ lợn 3.20 Kết quả xác ñịnh gen cpe và cpb2 của các typ vi khuẩn C. perfringens phân lập từ môi trường chuồng nuôi và sữa 3.21 Một vài ñặc tính sinh học của những chủng C. perfringens ñược lựa chọn ñể giải trình tự gen 86 87 89 91 93 97 102 109 113 117 118 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ ix DANH MỤC CÁC HÌNH TT 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 3.20 3.21 3.22 Tên hình Trang Sơ ñồ quy trình phân lập vi khuẩn hiếu khí và yếm khí từ các mẫu phân của gia súc bị tiêu chảy 44 Sơ ñồ quy trình phân lập và giám ñịnh vi khuẩn C. perfringens 45 Biểu ñồ so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy và bò khỏe mạnh 58 Biểu ñồ so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy theo lứa tuổi 61 Biểu ñồ so sánh tỷ lệ lợn bị tiêu chảy có các trạng thái phân khác nhau 63 Biểu ñồ so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy và lợn khỏe mạnh 65 Biểu ñồ so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy theo lứa tuổi 65 Bò bị tiêu chảy nặng, gầy còm 69 Phân bò bị tiêu chảy (màu ñen, nhiều nước, mùi thối khắm) 69 Lợn bị chết vì tiêu chảy (ruột ñầy hơi, xuất huyết) 69 Các thiết bị dùng ñể tạo môi trường nuôi yếm khí vi khuẩn C. perfringens 70 Vi khuẩn C. perfringens trong môi trường nước thịt gan yếm khí 70 Vi khuẩn C. perfringens trong môi trường Cooked meat 71 Vi khuẩn C. perfringens trong môi trường Thioglycollate 71 Vi khuẩn C. perfringens dưới kính hiển vi với ñộ phóng ñại 71 1000 lần Vi khuẩn C. perfringens trên môi trường CW (+ 4% lòng ñỏ trứng) 71 Khuẩn lạc C. perfringens gây dung huyết kép trên môi trường thạch máu 72 Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường TSC 72 Biểu ñồ biến ñộng số lượng vi khuẩn C. perfringens và E. coli 74 trong mẫu phân bò bị tiêu chảy và bò khỏe mạnh Biểu ñồ biến ñộng số lượng vi khuẩn C. perfringens và E. coli trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy và lợn khỏe mạnh 76 Bò bị tiêu chảy, toàn bộ bầu vú sưng, ñỏ ửng 81 Phản ứng CAMP ngược của vi khuẩn C. perfringens trên môi trường thạch máu 88 ðặc tính mọc của vi khuẩn C. perfringens trên môi trường SIM 88 Vi khuẩn C. perfringens trên môi trường Litmus Milk 88 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ x 3.23 3.24 3.25 3.26 3.27 3.28 3.29 3.30 3.31a 3.31b 3.31c 3.32a 3.32b 3.33 3.34 Giám ñịnh các ñặc tính sinh hoá và ñịnh danh vi khuẩn C. perfringens bằng hệ thống API 20A Tính chất mọc của C. perfringens trên môi trường thạch lòng ñỏ trứng Chuột thí nghiệm chết do ñộc tố của vi khuẩn C. perfringens Mổ khám kiểm tra bệnh tích của chuột thí nghiệm chết do ñộc tố của vi khuẩn C. perfringens Kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn C. perfringens Sản phẩm của phản ứng PCR sau quá trình ñiện di ñể xác ñịnh các loại gen mã hóa ñộc tố của vi khuẩn C. perfringens phân lập từ bò Sản phẩm của phản ứng PCR sau quá trình ñiện di ñể xác ñịnh các loại gen mã hóa ñộc tố của vi khuẩn C. perfringens phân lập từ lợn Không có tín hiệu A tại vị trí 54 của cả 5 chủng T1, T2, T3, T4 và T5 Tín hiệu C/T tại vị trí 172 của chủng T4 Tín hiệu A/G tại vị trí 319 của chủng T4 Tín hiệu T/G tại vị trí 438 của chủng T4 Tín hiệu A tại vị trí 508 của chủng T2 Tín hiệu A tại vị trí 552 của chủng T2 và T3 Tín hiệu C tại vị trí 608, C tại vị trí 609 và G tại vị trí 615 của chủng T2 Tín hiệu A tại vị trí 676 của 5 chủng T1, T2, T3, T4 và T5 88 89 95 96 100 104 107 119 119 120 120 120 121 121 122 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 1 MỞ ðẦU Việt Nam là một nước nông nghiệp, khoảng hơn 70% dân số sống ở các vùng nông thôn có ñời sống gắn liền với các hoạt ñộng sản xuất nông nghiệp, bao gồm trồng trọt và chăn nuôi. Thống kê hàng năm cho thấy ñàn trâu, bò và lợn của cả nước không chỉ tăng mạnh về số lượng mà còn ñược cải thiện rõ rệt về chất lượng con giống, góp phần ñáp ứng nhu cầu thực phẩm trong nước cũng như phục vụ xuất khẩu. Mục tiêu phấn ñấu trong chiến lược phát triển chăn nuôi ñến năm 2010, cả nước sẽ có tổng số bò là 7 triệu con, lợn 33 triệu con. ðịnh hướng ñến năm 2020, tổng bò sẽ ñạt khoảng 13 triệu con và lợn ñạt khoảng 35 triệu con [140]. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển trên, ngành chăn nuôi luôn phải ñối mặt với tình hình dịch bệnh diễn biến rất phức tạp ở ñàn gia súc, trong ñó phải kể ñến hội chứng tiêu chảy. Nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước ñã ñược tiến hành ñể tìm hiểu vai trò gây bệnh ở ñường tiêu hoá của những vi khuẩn hệ ñường ruột ñối với vật nuôi, trong ñó các tác giả ñặc biệt quan tâm ñến một số loại vi khuẩn thường gặp như Escherichia coli (E. coli), Salmonella, Clostridium perfringens (C. perfringens). Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu ñầy ñủ về Hội chứng tiêu chảy ở bò và lợn thường tập trung vào vi khuẩn E. coli và Salmonella; trong khi ñó, nghiên cứu về vai trò gây bệnh của vi khuẩn yếm khí C. perfringens chưa nhiều và chưa có hệ thống. ðặc biệt, từ năm 1997 trở về ñây, ở nước ta xuất hiện hiện tượng trâu, bò chết ñột ngột tại một số tỉnh phía Bắc và Bắc Trung Bộ mà nguyên nhân chính gây bệnh ñược xác ñịnh là do vi khuẩn C. perfringens, với tên gọi của bệnh là “Bệnh nhiễm ñộc tố ruột huyết” (Enterotoxaemia) (Lê Văn Tạo, 2006) [19], do ñó vấn ñề nghiên cứu về vi khuẩn C. perfringens càng trở nên cấp thiết. C. perfringens ñược xác ñịnh là một trong những vi khuẩn gây bệnh ở Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 2 gia súc bằng cách sản sinh ñộc tố; việc phân lập, ñịnh typ, xác ñịnh ñộc lực vi khuẩn có ý nghĩa quan trọng, sẽ là cơ sở khoa học trong công tác phòng và trị bệnh do vi khuẩn này gây ra. Vì C. perfringens là vi khuẩn yếm khí nên khi nuôi cấy, phân lập gặp khó khăn hơn so với các vi khuẩn hiếu khí; ñể nghiên cứu cần trang thiết bị và môi trường chuyên biệt. ðiều này cũng lý giải tại sao trong nước chưa có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn C. perfringens và bệnh do chúng gây ra. Hơn nữa, vì C. perfringens là vi khuẩn yếm khí nên việc phòng bệnh và ñiều trị cũng gặp nhiều khó khăn. Hiện tại, các chế phẩm sử dụng ñể phòng, trị bệnh do C. perfringens gây ra chưa khẳng ñịnh ñược hiệu quả, luôn gặp phải vấn ñề vi khuẩn kháng thuốc; vì vậy, cần có những nghiên cứu ñầy ñủ hơn về bệnh cũng như vi khuẩn gây bệnh này. Trên thế giới, Clostridium là nguyên nhân gây rất nhiều vụ dịch trên người và gia súc. Trong thời gian từ 1/10/2001 ñến 31/12/2004, EU ñã có chương trình QLK2-2001-01267 “Nghiên cứu bệnh lý học và mối quan hệ của giống Clostridium ở người, ñộng vật và thực phẩm - nguyên nhân gây bệnh, dịch tễ học và cách phòng bệnh”. Kết quả nghiên cứu ñã nêu rõ những ñặc ñiểm dịch tễ bệnh do Clostridium gây ra, xác ñịnh các ñặc tính của vi khuẩn gây bệnh và ñề xuất biện pháp phòng chống có hiệu quả (Mainil và cs, 2006) [84]. Nhằm góp phần ñể có ñược những hiểu biết ñầy ñủ hơn về vi khuẩn C. perfringens và bệnh do chúng gây ra, từ ñó ñề xuất những biện pháp giảm thiểu dịch bệnh ñường tiêu hoá ở ñàn gia súc tại khu vực Hà Nội, chúng tôi tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu tình hình nhiễm, vai trò của vi khuẩn Clostridium perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở bò, lợn nuôi tại Hà Nội và một số vùng phụ cận”
MỤC TIÊU CỦA ðỀ TÀI Bước ñầu ñánh giá ñược vai trò của vi khuẩn C. perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở bò, lợn nuôi tại Hà Nội và một số vùng phụ cận, làm cơ sở khoa học cho việc ñề xuất biện pháp phòng trị bệnh. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 3
Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI - ðây là tài liệu nghiên cứu khá ñầy ñủ về ñặc tính sinh học và vai trò của vi khuẩn C. perfringens gây hội chứng tiêu chảy ở bò và lợn tại Việt Nam. - Là nghiên cứu ñầu tiên ở Việt Nam về ñộc tố của vi khuẩn C. perfringens và cấu trúc phân tử của vi khuẩn C. perfringens có ñộc tố gây bệnh. - Kết quả nghiên cứu và thông tin sử dụng trong luận án có thể là tài liệu tham khảo cho giảng dạy và nghiên cứu về vi khuẩn C. perfringens. - Mặc dù phạm vi nghiên cứu chỉ giới hạn ở một số vùng chăn nuôi nhất ñịnh, nhưng kết quả có thể là cơ sở ñể xác ñịnh nguyên nhân cũng như phương pháp chẩn ñoán và phòng chống bệnh do vi khuẩn C. perfringens gây ra.
Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI - Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học ñể chẩn ñoán bệnh ñường tiêu hoá do C. perfringens gây ra ở bò và lợn tại Việt Nam. - Dựa vào kết quả nghiên cứu giúp ñề xuất các phương pháp có hiệu quả cao trong phòng và trị bệnh ñường tiêu hoá do vi khuẩn C. perfringens gây ra. - Trên cơ sở kết quả giải trình tự gen của vi khuẩn, có thể xây dựng phương pháp chẩn ñoán chính xác và chế tạo vacxin phòng bệnh có hiệu quả.
NHỮNG ðÓNG GÓP MỚI CỦA ðỀ TÀI - Lần ñầu tiên ñã phân lập ñược vi khuẩn C. perfringens typ D và C ở ñàn bò tại Việt Nam, cho thấy sự tồn tại và gây bệnh của chúng. - Là nghiên cứu ñầu tiên về khả năng sản sinh ñộc tố ruột và ñộc tố β-2 của các chủng C. perfringens phân lập ñược từ bò và lợn tại Việt Nam - ðã giải trình tự gen một số chủng ñại diện cho vi khuẩn C. perfringens có ñộc tính gây bệnh ở ñàn bò và lợn. Kết quả thu ñược ñem lại những hiểu biết ñầu tiên về dịch tễ học phân tử của vi khuẩn C. perfringens tại Việt Nam và nghiên cứu ứng dụng phòng bệnh do vi khuẩn này gây ra. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS VÀ BỆNH DO CLOSTRIDIUM PERFRINGENS GÂY RA 1.1.1. Giới thiệu chung về genus (giống, chi) Clostridium Giống Clostridium gồm những trực khuẩn yếm khí, bắt màu Gram dương, có kích thước 0,3 - 1,3 x 3 - 10 µm (Quinn và cs, 1999) [106]. Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào và nha bào thường lớn hơn bề ngang của vi khuẩn. Chỉ riêng loài C. spiroform có hình hơi cong hoặc hình xoắn ốc còn tất cả các loài gây bệnh trong giống Clostridium ñều có dạng trực khuẩn thẳng. Vi khuẩn sau khi hình thành nha bào hoặc trong canh trùng nuôi cấy lâu thường có xu hướng khó bắt màu. Trong khi hầu hết các loài trong giống Clostridium ñều có khả năng di ñộng nhờ lông rung thì C. perfringens là loài duy nhất không di ñộng. Vi khuẩn Clostridium có khả năng lên men ñường, phản ứng oxidase và catalase âm tính. Yêu cầu mức ñộ yếm khí tuyệt ñối thay ñổi tuỳ theo loài, nhưng hầu hết ñều thích hợp phát triển trong ñiều kiện môi trường có 2 - 10% CO2, pH gần trung tính và nhiệt ñộ nuôi cấy thích hợp là 370C. Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn Clostridium thường ñược bổ sung amino acid, carbohydrate, vitamin và máu hoặc huyết thanh. Vi khuẩn Clostridium phân bố rộng rãi khắp nơi trên thế giới, thường có mặt trong ñất, nước và cát; một số loài hoặc một số chủng chỉ có ở các vùng ñịa lý nhất ñịnh. Nhiều loài gây bệnh tồn tại trong ñường tiêu hoá của người và ñộng vật, chúng thường gây nhiễm trùng từ trong. Các loài khác phân bố trong ñất và gây nhiễm trùng từ ngoài qua các vết thương hoặc qua ñường tiêu hoá. Hiện ñã có trên 40 loài Clostridium ñược công bố là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh ở người, gia súc và gia cầm. Có thể tóm tắt các bệnh do vi khuẩn Clostridium gây ra như trong bảng 1.1 (Quinn và cs, 1999) [106]: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 5 Bảng 1.1. Bệnh do vi khuẩn Clostridium gây ra ở người và ñộng vật Loài Clostridium Loài vật mắc bệnh Tên bệnh CLOSTRIDIUM GÂY ðỘC TỐ THẦN KINH Clostridium tetani Clostridium botulinum (typ A - F) Clostridium argentinense (C. botulinum typ G) Ngựa, loài nhai lại và Uốn ván (tetanus) các ñộng vật khác Nhiều loài ñộng vật và Trúng ñộc thịt người Người (Argentina) Trúng ñộc thịt CLOSTRIDIUM GÂY ðỘC MÔ BÀO Clostridium chauvoei Clostridium septicum Bò, cừu (lợn) Bò, cừu và lợn Cừu Gia cầm Ung khí thán (blackleg) Phù thũng ác tính Braxy Chứng viêm da hoại tử Cừu Bò và cừu Cừu, (bò) Trâu Chứng Cừu con ñầu to Hoại thư sinh hơi Bệnh ñen (Viêm gan hoại tử) Viêm tuỷ xương Clostridium novyi typ A typ B typ C Clostridium haemolyticum Bò, (cừu) (C. novyi typ D) Bò, cừu, ngựa Clostridium sordellii Chim cảnh, gà con và Clostridium colinum gà tây Chứng ñái ra huyết sắc tố Hoại thư sinh hơi Viêm loét ruột BỆNH NHIỄM ðỘC TỐ RUỘT HUYẾT Clostridium perfringens typ A typ B typ C typ D typ E Trúng ñộc thức ăn, hoại thư sinh hơi Chứng vàng da do nhiễm ñộc Cừu tố ruột huyết Cừu (dưới 3 tuần tuổi) Bệnh lỵ Bê non và ngựa non Nhiễm ñộc tố ruột huyết Lợn choai, cừu, bê, Nhiễm ñộc tố ruột huyết ngựa con Cừu trưởng thành Run cơ Gà Viêm ruột hoại tử Cừu (trừ con sơ sinh), Bệnh nhũn thận dê, bê Bê và cừu (ít gặp) Nhiễm ñộc tố ruột huyết Người Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 6 Loài Clostridium Loài vật mắc bệnh Tên bệnh BỆNH DO CLOSTRIDIUM GÂY RA SAU KHI SỬ DỤNG KHÁNG SINH Thỏ Clostridium spiroform Clostridium difficile Viêm ruột có màng nhày Tiêu chảy sau khi sử dụng Thỏ và chuột lang kháng sinh Ngựa con và lợn Viêm ruột non kết Người, chuột hamster, Viêm ruột non kết do sử thỏ, chuột lang dụng kháng sinh Chó, ngựa con, lợn, Tiêu chảy ñộng vật thí nghiệm 1.1.1.1. Tính chất nuôi cấy Trong giống Clostridium, khi nuôi cấy yêu cầu ñiều kiện yếm khí của các loài cũng có sự khác nhau: một số loài yếm khí triệt ñể và không thể phát triển ñược nếu như có dấu vết của O2; một số loài tương ñối tuỳ tiện (C. histolyticum, C. tertium) có thể phát triển ñược trong ñiều kiện hỗn hợp khí: 5% O2, 10% CO2, 85% N2, hoặc thậm chí trong môi trường không khí bình thường. Ngược lại với Bacillus, Clostridium chỉ hình thành nha bào khi không có O2 (Peck và cs, 2004) [104] và có thể dễ dàng phân biệt với các vi khuẩn giống Bacillus (Mainil và cs, 2004) [83]. Hầu hết các loài của Clostridium gây bệnh cho ñộng vật ñều chỉ phát triển trong ñiều kiện yếm khí tuyệt ñối, riêng C. perfringens có thể sinh trưởng trong ñiều kiện yếm khí không triệt ñể. Clostridium có thể phát triển tốt trên một số môi trường thạch máu như thạch CDC (của trung tâm phòng chống dịch bệnh Hoa Kỳ - Centers for Disease Control and Prevention) hoặc thạch Schaedler, có bổ sung thêm 5% máu cừu và tiến hành nuôi trong ñiều kiện yếm khí. Các loại môi trường thạch cổ ñiển có 5% máu cừu như Columbia, Brucella và BHI (Brain Heart Infusion) thì cần bổ sung thêm chiết xuất nấm, vitamin K1 và heamin ñể tối ưu hóa cho sự phát triển của vi khuẩn yếm khí (Bisping và Amtsberg, 1988 [35]; Quinn và cs., 1999) [106]. ðiều ñáng lưu ý là các loại môi trường trên rất dễ hấp thu oxy vì vậy môi trường chế xong tốt nhất nên nuôi cấy vi khuẩn ngay; nếu chưa dùng ñến phải bảo quản môi trường trong ñiều kiện yếm khí. Việc bảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 7 quản các ñĩa thạch trong ñiều kiện yếm khí hoặc trước khi cấy vài giờ ñể thạch trong ñiều kiện yếm khí sẽ làm tăng khả năng phân lập ñược vi khuẩn Clostridium. Khi nuôi cấy vi khuẩn Clostridium trên các môi trường khác nhau, hình thái khuẩn lạc và vùng dung huyết của chúng khác nhau nên có thể sử dụng là tiêu chuẩn ñể ñịnh danh vi khuẩn. Loại máu sử dụng ñể chế môi trường thạch máu cũng rất quan trọng. Khi nuôi cấy trên thạch máu bò, vùng dung huyết của các chủng C. perfringens phân lập từ bò mang ñộc tố typ A rộng hơn và rõ hơn so với khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu cừu (Mainil và cs, 2006) [84]. Các loại môi trường lỏng hoặc bán cố thể có khả năng oxy hoá khử thấp như môi trường nước thịt ñã qua xử lý (Cooked Meat Broth) và môi trường Thioglycollate thường ñược sử dụng ñể nuôi cấy và giữ giống vi khuẩn Clostridium. Các môi trường này cần phải ñược ñun sôi cách thủy trong vòng 5 - 10 phút nhằm loại bỏ khí O2, sau ñó làm nguội thật nhanh ñến nhiệt ñộ phòng rồi mới tiến hành cấy vi khuẩn (Quinn và cs, 1999) [106]. 1.1.1.2. Vai trò của phân tử 16s rRNA trong chẩn ñoán và phân loại vi khuẩn Clostridium a) Phân tử 16s rRNA: Ribosom là một tổ hợp các ñại phân tử. ðây là bộ máy sinh tổng hợp protein trong mọi tế bào sống, trong ñó các rRNA (ribosomal Ribonucleic Acid) là thành phần trung tâm của ribosom và giữ chức năng như yếu tố chính tổng hợp nên protein của tế bào. Ở vi khuẩn, ribosom ñược cấu tạo từ 3 loại phân tử rRNA là 16S, 23S và 5S (Brown, 1998 [36]; Lewin, 1997 [80]). ðể thực hiện cùng một chức năng ở mọi cơ thể sống, cũng như ñảm bảo sự khác biệt tinh tế về cấu trúc và chức năng giữa các loài, cấu trúc phân tử của các phân tử rRNA gồm các vùng bảo tồn (bất biến) U (Universal – là các vùng có sự biến ñổi rất ít giữa các loài), các vùng biến ñổi V (Variable), ngoài ra, còn có các vùng biến ñổi ít và gọi là vùng bán bảo tồn S (Semi-conserved) (Johanson, 1993) [69]. Trình tự gen mã hóa các rRNA thay ñổi chậm theo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 8 thời gian và ñược coi như một cái “ñồng hồ” ghi chép sự tiến hóa của các loài (Woese, 1987) [135]. Trong số các phân tử rRNA, phân tử 16s rRNA ñược coi là công cụ quan trọng và có ý nghĩa nhất trong việc ñánh giá các tiến hóa di truyền, rất hữu ích cho việc giám ñịnh và phân loại vi khuẩn. ðiều này ñược thể hiện rõ qua một số ñặc tính sau ñây: i) Gen mã hóa 16s rRNA có mặt ở tất cả các loại vi khuẩn, vì vậy nó là mục tiêu quan trọng cho việc nhận biết vi khuẩn; ii) Chức năng của 16s rRNA ñược bảo tồn qua thời gian dài, bởi vậy sự thay ñổi của chuỗi cũng sẽ phản ánh những thay ñổi ngẫu nhiên hơn là những thay ñổi có tính chọn lọc; iii) Chuỗi gen mã hoá cho phân tử 16s rRNA có kích thước vừa phải (khoảng 1550 bp) - ñủ ñộ lớn ñể có thể chứa các thông tin có tính thống kê về chuỗi có liên quan, và quan trọng là phân tử này có chứa khoảng 50 vùng (domain) có các chức năng nhất ñịnh (Patel, 2001) [103]. Số lượng các bản sao của phân tử 16s rRNA ở mỗi chủng là khác nhau giữa các loài vi khuẩn. Chẳng hạn, E. coli có mang 7 bản sao của 16s rRNA, C. perfringens có 10 bản sao, còn Mycobacterium chỉ có 1 hoặc 2 bản sao (Patel, 2001 [103], Takeshi và cs, 2001 [124]). b) Vai trò 16s rRNA trong chẩn ñoán và phân loại vi khuẩn Carl Woese là người ñầu tiên tiến hành phân tích và giải mã trình tự các gen mã hoá phân tử 16s rRNA của các loại vi khuẩn (Woo và cs, 2008) [136]. Ông ñã mô tả phương pháp này như là “công nghệ của ñồ họa” và sử dụng các chuỗi ñược giải mã trong các nghiên cứu về thông tin ña hình sinh học. Các chuỗi gen rRNA ñược bảo tồn chặt chẽ trong các vi sinh vật của cùng một giống hoặc một loài, nhưng lại khác nhau với các vi sinh vật của giống và loài khác. Ngày nay, việc sử dụng các thông tin thu ñược từ giải mã trình tự gen của 16s rRNA ñang ñược ứng dụng rộng rãi tại nhiều phòng thí nghiệm trên toàn thế giới. Theo các phương pháp truyền thống, việc xác ñịnh một loại vi khuẩn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 9 nào ñó chủ yếu ñược tiến hành dựa trên kết quả làm tiêu bản nhuộm Gram và các phản ứng sinh hóa, ñặc tính phát triển trên các môi trường. Tuy nhiên, các phương pháp này có một số nhược ñiểm nhất ñịnh như: i) Có những loại vi khuẩn, ñôi khi, mang các ñặc tính sinh hóa bất thường hoặc không hề trùng lặp với các mẫu sinh hóa của các loại vi khuẩn ñã ñược công bố trước ñó; ii) Một số loại vi khuẩn không thể tiến hành nuôi cấy ñược (Treponema pallidum) hoặc phát triển rất chậm như Mycobacterium; iii) Việc giám ñịnh một số nhóm vi khuẩn (ví dụ như các vi khuẩn yếm khí và Mycobacterium), ñòi hỏi phải có thiết bị chuyên dùng ñặc biệt, cũng như hiểu biết sâu về chuyên môn của các chuyên gia mà không phải phòng thí nghiệm lâm sàng nào cũng ñáp ứng ñược. Do vậy, sử dụng kỹ thuật giải mã trình tự gen của 16s rRNA sẽ khắc phục ñược các nhược ñiểm này (Woo và cs, 2008) [136]. Từ việc phân tích thông tin trình tự gen 16s rRNA của một loài vi khuẩn cần nghiên cứu có thể ñưa ra các bằng chứng ñể kết luận về giống hoặc loài, cũng như xác ñịnh ñược vị trí của vi khuẩn này trong bảng phân loại và quan hệ họ hàng với các vi khuẩn khác. ðến nay, trình tự gen 16s rRNA của hầu hết các loài vi khuẩn ñều ñã ñược giải mã. GenBank [139] là ngân hàng dữ liệu lớn nhất hiện ñang lưu giữ khoảng hơn 20 triệu chuỗi gen, trong ñó hơn 90.000 là các gen 16s rRNA (Clarridge, 2004) [41]. Bằng cách giải mã trình tự gen của 16s rRNA, rất nhiều giống và loài khác nhau của vi khuẩn ñã ñược phân loại và ñặt tên lại, các vi khuẩn không thể nuôi cấy cũng có thể tiến hành phân loại ñược, mối quan hệ ña hình về kiểu gen cũng ñược xác ñịnh, các loài vi khuẩn mới cũng ñược phát hiện và phân loại nhanh hơn. ðối với hầu hết các loại vi khuẩn, ñể có thể nhận dạng ñược vi khuẩn ở mức ñộ loài, không nhất thiết phải tiến hành giải mã toàn bộ chuỗi gen của 16s rRNA (~1500 bp) vì mặc dù các vị trí mang tính quyết ñịnh trong sự ña dạng thông tin di truyền có mặt xuyên suốt trong cả ñoạn gen, nhưng vùng dị Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 10 chủng rõ rệt nhất nằm trong khoảng 500 bp ñầu tiên của ñầu 5’ (Rogall và cs, 1990 [109]; Tang và cs, 1998 [125]; Woese và cs, 1983 [134]). Do ñó, chỉ cần giải mã khoảng 500 bp ñầu tiên cũng ñủ ñể nhận biết một chủng vi khuẩn nào ñó; nhưng việc giải mã toàn bộ gen thì sẽ giúp ích tốt hơn cho việc xác ñịnh ñặc tính của các chủng vi khuẩn mới (Patel, 2001) [103]. c) Sử dụng thông tin trên phân tử 16s rRNA trong phân loại vi khuẩn Clostridium Các vi khuẩn thuộc giống Clostridium ñược xác ñịnh dựa vào một số ñặc ñiểm như có dạng trực khuẩn, phát triển trong môi trường yếm khí, hình thành nha bào. Tính dị chủng của các vi khuẩn thuộc giống Clostridium là rất lớn, ñược thể hiện bằng các ñặc tính sinh lý và sinh hóa ña dạng của chúng như tính chất bắt màu Gram không ổn ñịnh, và thành phần của tổng số các nucleotid G + C có thể dao ñộng từ 24 ñến 58 mol% (Finegold, 1977 [54], ; Hippe, 1991 [66]). Garnier và cs (1991) [57] ñã tiến hành dòng hóa và giải mã trình tự gen rRNA của 4 (rrnA, rrnB, rrnE và rrnH) trong số 10 operon của C. perfringens chủng CPN50. Gần ñây nhất, Takeshi và cs (2001) [124] ñã tiến hành giải mã trình tự gen rRNA của cả 10 operon của C. perfringens chủng 13, trong ñó có 9 operon (rrnA, rrnB, rrnC, rrnD, rrnE, rrnF, rrnG, rrnH, rrnI) ñược cấu trúc gồm cả 3 loại 16s, 23s và 5s, còn operon rrnJ chỉ gồm 2 loại 16s và 23s. Nghiên cứu ñã cho thấy: ñộ dài của các gen của 16s, 23s và 5s trên cả 10 operon là giống nhau, chỉ khác nhau ở vùng ñệm giữa 16s-23s hoặc 23s-5s; so với các gen của 23s và 5s, trình tự gen của 16s rRNA tương ñối ñồng nhất giữa các operon. Trên cơ sở tiến hành các phân tích ña hình về kiểu gen của 16s rRNA của Clostridium, rất nhiều tác giả ñã tiến hành nghiên cứu và phân loại các chủng Clostridium mới phát hiện, từ ñó xác ñịnh vị trí của chúng trong cây tiến hóa và mối quan hệ họ hàng giữa các loài trong cùng một giống hoặc lớp. Collins và cs (1994) [43] ñã tiến hành giải mã, phân tích so sánh thông tin trình tự gen 16s rRNA của 34 loài Clostridium. Từ thông tin thu ñược, tác giả ñã