Tài liệu Nghiên cứu tinh chế và phân tích đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ rong nâu sargassum oligocystum

Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Phạm Đức Thịnh và tham khảo thêm các tài liệu đáng tin cậy, có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu, kết quả trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn này. Nha Trang, ngày 12 tháng 12 năm 2019 Tác giả luận văn Lê Đỗ Thùy Vi Lời cảm ơn Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp và bạn bè. Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Phạm Đức Thịnh đã gợi mở cho tôi các ý tƣởng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thông qua đề tài Hợp tác quốc tế mã số QTRU04.06/18-19 đã hỗ trợ kinh phí thực hiện đề tài luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học và Phòng Đào tạo đã tổ chức công tác giảng dạy, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thiện luận văn và các thủ tục cần thiết. Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng nhƣ các anh chị em công tác tại phòng Hóa Phân tích đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi làm thực nghiệm và luôn động viên, giúp đỡ để tôi hoàn thành đề tài luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu trƣờng Đại học Khánh Hòa, Khoa Khoa học Tự nhiên và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những ngƣời thân luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Nha Trang, ngày 12 tháng 12 năm 2019 Xin chân thành cảm ơn! Lê Đỗ Thùy Vi Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt Carbon-13 NMR Spectroscopy Phổ CHTHN Carbon 13 DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxid EtOH Ethanol Ethanol Fuc Fucose Đƣờng fucose Fucf Fucofuranose Fucofuranose Fucp Fucopyranose Fucopyranose Galactose Đƣờng galactose Gel permeation chromatography Sắc ký lọc gel Gluc Glucose Đƣờng glucose GlucA Glucuronic Axit Axit glucuronic HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng cao áp 1 Proton NMR Spectroscopy Phổ CHTHN proton IR Infrared Spectroscopy desorption/ionization Phổ hồng ngoại Man Mannose Đƣờng mannose MeOH Methanol Methanol NMR Nuclear Magnetic Cộng hƣởng từ hạt nhân 13 C-NMR Gal GPC H-NMR Resonance (CHTHN) TFA Trifluoroacetic axit Axit trifluoroacetic Xyl Xylose Đƣờng xylose DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển. ...................... 10 Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số fucoidan ..................................... 21 Bảng 1.3. Sự phân bố trọng lƣợng phân tử của fucoidan .............................. 29 Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu ........... 39 Bảng 1.5. Hàm lƣợng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam .............................................. 48 Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thƣ gan Hep-G2 và ung thƣ mô liên kết RD ............................................ 50 Bảng 2.1. Các đỉnh phổ đặc trƣng của fucoidan trên phổ hồng ngoại ............ 59 Bảng 3.1. Hiệu quả thu nhận fucoidan chiết trong các dung môi khác nhau . 67 Bảng 3.2. Hàm lƣợng fucoidan thu nhận từ 08 loài rong nâu Việt Nam ........ 69 Bảng 3.3.Hàm lƣợng thu nhận fucoidan tổng và các phân đoạn .................... 76 Bảng 3.4. Thành phần hóa học fucoidan thu nhận từ rong S. oligocystum.....76 Bảng 3.5. Thành phần hóa học các phân đoạn chiết từ rong S. oligocystum..79 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu tỉnh Khánh Hòa ...................................................................................................... 14 Hình 1.2. Cấu trúc của fucoidan từ F. vesiculosus đƣợc mô tả vào năm 1950 ......................................................................................................................... 22 Hình 1.3. Cấu trúc của fucoidan có sunfat ở vị trí 4 và liên kết 3-O-linked từ loài rong E. Kurome đƣợc mô tả vào năm 1991 ........................................... 23 Hình 1.4. Cấu trúc fucoidan phân đoạn F32 tách từ rong nâu Hizikia fusiforme .........................................................................................................................25 Hình 1.5. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu A.nodusum ....................................................................................................... 25 Hình 1.6. Cấu trúc của một phân đoạn Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Cladosiphon okamuranus................................................................................ 26 Hình 1.7. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Chorda filum ................................................................................................... 27 Hình 1.8. Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus. .............................................. 28 Hình 1.9. Cấu trúc của fucoidan từ Sargassum polycystum. .......................... 45 Hình 1.10. Mảnh cấu trúc cơ bản fucoidan chiết tách từ rong Turbinaria decurrens ......................................................................................................... 49 Hình 1.11. Sơ đồ cấu trúc deS-2, deS-4, deS-6 rong Sargassum aquifolium .51 Hình 2.1. Mẫu rong Sargassum oligocystum .................................................. 54 Hình 2.2. Sơ đồ chiết theo bản quyền Nga (Paten WO 2005,014657) ........... 56 Hình 2.3. Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR của polysaccharide ....... 60 Hình 3.1. Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum.. ......................................................................................................................... 70 Hình 3.2. Phân đoạn fucoidan đƣợc chiết từ rong S.oligocystum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose .......................................................... 72 Hình 3.3. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đƣờng đơn chuẩn ............................ 74 Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC mẫu fucoidan chiết tách từ rong S.oligocystum .. 74 Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đƣờng đơn phân đoạn F4 ... 75 Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đƣờng đơn phân đoạn F5 ... 75 Hình 3.7. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F4(Sargassum oligocystum) .... 81 Hình 3.8. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F5(Sargassum oligocystum) .... 82 Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của phân đoạn F4 ..................................................... 84 Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của phân đoạn F5 ................................................... 84 Hình 3.11. Phổ 13C-NMR của phân đoạn F4 ................................................. 85 Hình 3.12. Phổ 13C-NMR của phân đoạn F4 ................................................. 85 1 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 6 1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU ............................................................. 6 1.1.1. Giới thiệu về rong biển ...................................................................... 6 1.1.2. Giới thiệu về rong nâu ..................................................................... 10 1.1.2.1. Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới ............................ 11 1.1.2.2. Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam .............................. 12 1.1.3. Thành phần hóa học của rong Nâu .................................................. 15 1.1.3.1. Polysaccharide .......................................................................... 15 1.1.3.2. Một số hợp chất khác................................................................. 18 1.2. TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN ........................................................... 19 1.2.1. Giới thiệu chung về fucoidan .......................................................... 19 1.2.2. Thành phần hóa học của fucoidan trong một số loài rong nâu ....... 20 1.2.3. Cấu trúc hóa học của fucoidan ........................................................ 22 1.2.4. Tính chất hóa lý của fucoidan ......................................................... 28 1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan ................................. 29 1.2.5.1. oạt t nh chống ng t máu và chống hu ết khối ................... 29 1.2.5.2. oạt t nh chống virus ................................................................ 32 1.2.5.3. oạt t nh kháng u và iều hòa miễn dịch .................................. 33 1.2.5.4. oạt t nh chống ox hóa............................................................ 34 1.2.5.5. Giảm lipid máu .......................................................................... 35 1.2.5.6. Kháng viêm ................................................................................ 35 1.2.5.7. Chống lại các bệnh về gan ........................................................ 36 1.2.5.8. oạt t nh kháng khuẩn .............................................................. 36 2 1.2.5.9. ác d ng giảm l ợng ng hu ết trong máu. ......................... 37 1.2.5.1 . Các ng d ng c a fucoidan ..................................................... 37 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN ......... 38 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................. 38 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam................................................... 43 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 53 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................. 53 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................... 55 2.2.1. Phƣơng pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan ............................. 55 2.2.1.1. Ph ơng pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu .......................... 55 2.2.1.2. Ph ơng pháp phân oạn fucoidan ............................................ 55 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu cấu trúc của fucoidan ............................. 57 2.2.2.1. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng tổng carboh drate ............. 57 2.2.2.2. Ph ơng pháp xác ịnh thành phần monosaccharide ................ 57 2.2.2.3. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng sulfate ................................ 57 2.2.2.4. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng uronic axít.......................... 57 2.2.2.5. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) ...................................................... 57 2.2.2.6. Ph ơng pháp phổ hồng ngoại IR .............................................. 58 2.2.2.7. Ph ơng pháp phổ cộng h ởng từ hạt nhân NMR ..................... 60 2.3. THỰC NGHIỆM ................................................................................... 62 2.3.1. Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu .................. 62 2.3.2. Phân tích hàm lƣợng tổng carbohydrate.......................................... 64 2.3.3. Phân tích thành phần monosaccharide ............................................ 64 2.3.4. Phân tích hàm lƣợng sulfate ............................................................ 65 3 2.3.5. Phân tích hàm lƣợng uronic axít ..................................................... 65 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 66 3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU ........ 66 3.2. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN ............................................................... 70 3.3. PHÂN TÍCH ĐẶC TRƢNG CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN ............. 80 3.3.1. Các đặc trƣng cấu trúc thu đƣợc từ phổ hồng ngoại IR............... 80 3.3.2. Các đặc trƣng cấu trúc thu đƣợc từ phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR .......................................................................................................... 83 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 87 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 87 4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 92 4 MỞ ĐẦU Trong đa dạng và vô tận của thảm thực vật đại dƣơng, rong nâu là một trong số các loài thực vật biển có thể tự tái tạo đáng lƣu ý nhất mà con ngƣời đã phát hiện ra. Rong nâu chứa rất nhiều polysaccharide sinh học quí nhƣ alginate, laminaran, fucoidan với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [1,2]. Trong số đó, fucoidan là hợp chất đƣợc đặc biệt quan tâm nghiên cứu. Fucoidan là tên gọi chung cho các polysaccharide sulfate có trong thành phần của rong nâu. Từ hơn 100 năm qua kể từ lần đầu tiên fucoidan đƣợc phát hiện trong thành phần của rong nâu bởi Kylin và cộng sự vào năm 1913, cho tới nay fucoidan vẫn đang là hợp chất đặc biệt thu hút đƣợc sự quan tâm nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới nhờ sự đa dạng về cấu trúc cũng nhƣ phổ rộng các hoạt tính sinh học nhƣ: kháng ung thƣ, kháng viêm, chống đông máu, kháng virut, chống tạo mạch (antiangiogenic), chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, [3,4].... Vì vậy, fucoidan đã trở thành một nguồn dƣợc liệu đầy tiềm năng cho các ứng dụng làm thực phẩm chức năng, mỹ phẩm, thực phẩm bổ dƣỡng và thuốc. Fucoidan rong nâu là một polymer dị thể có cấu trúc rất phức tạp bởi tính đa dạng về thành phần đƣờng đơn, khả năng phân nhánh cũng nhƣ các vị trí nhóm sulfate trên các gốc đƣờng biến đổi không theo quy luật. Thành phần của nó bao gồm nhiều loại đƣờng, chủ yếu là fucose và một số các gốc đƣờng khác nhƣ galactose, glucose, manose, xylose..., bên cạnh đó trong một số trƣờng hợp còn phát hiện thấy sự có mặt của các nhóm uronic axit và acetyl. Ngoài ra, các nghiên cứu trƣớc đây còn chỉ ra rằng sự biến đổi về cấu trúc của fucoidan phụ thuộc vào loài rong, mùa vụ thu hoạch, vùng địa lý thu mẫu cũng nhƣ các kỹ thuật chiết tách. Việt Nam có nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú với hơn 100 loài đã đƣợc phát hiện gồm nhiều chi rong khác nhau, trong đó riêng chi Sargassum chiếm khoảng hơn 60 loài, ƣớc tính đạt tới 10.000 tấn rong khô/năm [5,6]. Đây đƣợc coi là nguồn tiềm năng rất lớn cho các nghiên cứu về fucoidan theo hƣớng phát triển thành các sản phẩm có giá trị cao ứng dụng trong lĩnh vực y dƣợc. Fucoidan đã đƣợc nghiên cứu ở Việt Nam trong hơn 5 một thập kỷ qua, các kết quả mà các nhà khoa học trong nƣớc thu đƣợc là rất có ý nghĩa, bƣớc đầu đã đƣa đƣợc sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam vào phục vụ cuộc sống... Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ rong nâu nói chung và chi rong Sargassum nói riêng ở Việt Nam vẫn còn rất ít, theo các tài liệu tham khảo cho thấy các nghiên cứu về fucoidan từ loài rong Sargassum oligocystum ở Việt Nam vẫn chƣa đầy đủ, mới chỉ có các nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học của mẫu fucoidan chiết thô.Trong khi đó, đây là một trong số các loài rong tƣơng đối phổ biến và có trữ lƣợng tự nhiên lớn so với một số loài rong khác trong cùng chi Sargassum, có khả năng khai thác để sử dụng làm nguyên liệu cho việc sản xuất fucoidan vào mục đích làm thực phẩm chức năng hoặc làm thuốc. Vì vậy, thực hiện đề tài “Nghiên cứu tinh chế và phân tích đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum” là cần thiết nhằm đóng góp thêm các nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu ở Việt Nam theo hƣớng phát triển các hoạt chất mới cũng nhƣ khả năng ứng dụng hiệu quả fucoidan trong lĩnh vực y dƣợc. - - Mục tiêu của luận văn: Nghiên cứu tinh chế và phân đoạn fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum Việt Nam. Phân tích thành phần hóa học và các đặc trƣng cấu trúc của fucoidan thu nhận đƣợc sau quá trình chiết tách. Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: Thu thập rong nâu Sargassum oligocystum tại vùng biển Nha Trang. Tách chiết và phân đoạn fucoidan từ rong nâu thu đƣợc. Phân tích thành phần hóa học của fucoidan và các phân đoạn của chúng. Xác định các đặc trƣng cấu trúc của phân đoạn fucoidan có hàm lƣợng quan tâm. 6 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU 1.1.1. Giới thiệu về rong biển Rong biển hay còn gọi là tảo, là những loài thực vật bậc thấp sinh sống ở biển, sống tự dƣỡng bằng cách quang hợp, hình thái dạng tản, thuộc nhóm tảo biển. Chúng là loại thực phẩm lành mạnh, tốt cho sức khỏe và còn đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc thảo dƣợc. Rong biển sinh trƣởng phát triển nhanh, có vòng đời sinh trƣởng không quá một năm, tốc độ tăng trọng nhanh và tạo ra sinh khối lớn. Tổng số loài rong biển trên thế giới đƣợc phân loại chủ yếu thuộc 3 ngành chính: Ngành rong lục (Chlorophyta): 900 loài Ngành rong nâu (Phaeophyta): 1800 loài Ngành rong đỏ (Rhodophyta): 4000 loài Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu phát hiện loài mới bổ sung vào tổng số loài rong biển phân bố trên toàn thế giới. Trong số 03 ngành rong trên, rong nâu là ngành rong có trữ lƣợng lớn nhất và phân bố đa dạng nhất với hơn 1800 loài đã đƣợc phân loại. Tại các vùng biển ở Việt Nam, tổng số loài rong biển ƣớc tính khoảng 1.000 loài, trong đó có khoảng 639 loài có trữ lƣợng lớn với 151 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 143 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta), 269 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và 76 loài thuộc ngành rong lam (Cyanophyta) [6]. Trong tất cả các loài này, 310 loài phân bố ở vùng ven biển các tỉnh phía Bắc và 484 loài hiện diện ở các tỉnh phía Nam, 156 loài phân bố ở cả hai vùng [6,7]. Đại dƣơng cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển hàng năm. Các nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất đƣợc tổng hợp nhờ quang hợp, trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển. Việc sử dụng các sản phẩm từ rong biển đã trải qua thời kì lịch sử rất lâu dài. Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, ngƣời Nhật đã dùng rong biển từ hơn 10.000 năm trƣớc. Trong 7 nền văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển đƣợc coi là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc hay khách của hoàng thân, quốc thích mới đƣợc thƣởng thức. Rong biển cũng đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác, chúng là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan...), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel hoặc chất ổn định), thức ăn gia súc, nông nghiệp ... Qua các tài liệu tham khảo trong lịch sử và trong thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây hại sức khỏe nào đƣợc đề cập đến. Vì vậy, ngày nay rong biển đƣợc xếp vào loại thực phẩm chức năng ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới. Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là những quốc gia tiêu thụ lƣợng rong biển thực phẩm lớn nhất và nhu cầu sử dụng của họ là cơ sở của nghề nuôi trồng rong biển với sản lƣợng hằng năm trên toàn thế giới khoảng 6 triệu tấn rong tƣơi, trị giá lên đến 5 tỉ USD. Các nƣớc cung cấp rong biển làm thực phẩm chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan. Các nƣớc cung cấp chính rong biển cho các ngành công nghiệp là Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban Nha, Mỹ và Nhật. *Thành phần hóa học có trong rong biển Rong biển có thành phần hóa học đa dạng, các hợp chất có trong rong biển đều là những hợp chất có giá trị dinh dƣỡng và dƣợc dụng cao. Hàm lƣợng của các chất có trong rong biển phụ thuộc vào loài rong, điều kiện sống, sinh trƣởng và phát triển của rong. Theo kết quả phân tích ở các loài rong đã đƣợc nghiên cứu, thành phần trong rong biển gồm có : nƣớc chiếm 80 – 90 %, protein chiếm khoảng 5 – 20,5% trọng lƣợng khô, 17 loại axít amin, trong đó có mặt tất cả các amino axit thiết yếu, hàm lƣợng lipid trong rong chiếm từ 0,2 – 0,6%, các loại sắc tố : sắc tố màu nâu (fucoxanhthin), các sắc tố xanthophyll khác là violaxanthin, antheraxanthin, neoxanthin, diainoxanthin và diatoxanhthin, chất khoáng, các nguyên tố đa lƣợng ( K, Na, Mg, S, P,…) và đặc biệt là các nguyên tố vi lƣợng ( Sr, Fe, Cu, Zn, Mn, Mo,…). Thành phần hóa học quan trọng của rong nâu là các glucid, chúng 8 đƣợc chia thành 2 nhóm : monosaccharide và polysaccharide. Nhóm monosaccharide gồm các đƣờng đơn nhƣ : mannitol, fucose, galactose, manose, xylose,….trong đó quan trọng nhất là mannitol. Mannitol thuộc nhóm đƣờng kép của rong nâu, đƣợc phát hiện đầu tiên vào năm 1884 và nghiên cứu sâu hơn vào năm 1913. Các nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng mannitol của rong biển ở vùng biển phía Nam cao hơn phía Bắc. Hàm lƣợng mannitol trong rong biển thƣờng cao vào các tháng mùa hè và có xu hƣớng tăng dần theo thời gian sinh trƣởng của rong... Mannitol đƣợc sử dụng nhiều trong dƣợc phẩm, trong công nghiệp để làm nguyên liệu tổng hợp một số hợp chất hữu cơ, làm thuốc nổ, diêm và trong công nghiệp thực phẩm đặc biệt là trong công nghiệp bánh kẹo để sản xuất các loại bánh gato có độ ngọt cao nhƣng đảm bảo độ mềm và xốp của bánh [8,9,10]. Nhóm polysaccharides gồm có : fucoidan, laminaran, alginate, agar và carrageenan. Fucoidan là hợp chất đƣợc đặc biệt quan tâm nghiên cứu nhờ các tính chất sinh học đa dạng và đặc thù của nó nhƣ khả năng tăng cƣờng miễn dịch, chống đông tụ máu, chống viêm nhiễm, kháng virus, điều trị rối loạn đƣờng huyết và hỗ trợ trong điều trị ung thƣ. Laminaran đóng vai trò nhƣ chất dự trữ trong rong nâu. Laminaran là chất tạo hệ miễn dịch ở động vật có vú, laminaran sulfate hóa đã đƣợc chứng minh là có đặc tính giống heparin.. Laminaran có hoạt tính chống đông tụ máu và chống ung thƣ. Agar và alginate đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm : đƣợc sử dụng làm chất ổn định trong bánh kẹo, kem, nƣớc ngọt hay làm chất làm đông đặc và tạo gel trong sản xuất thịt đông lạnh; trong công nghệ sinh học đƣợc dùng làm môi trƣờng nuôi cấy, trong y học dùng làm vải băng bó vết thƣơng truyền thống, lấy dấu răng, pha thuốc, pha huyết thanh, trong một số công thức chống chảy máu dạ dày, trong việc cấy ghép tế bào, tác động vào các tế bào sản xuất insulin để điều trị bệnh tiểu đƣờng loại 1. Vỏ nang bằng alginate không bị dịch tiêu hóa phân hủy và chỉ tan trong ruột. Màng đƣợc tạo thành từ alginate và gelatin kết hợp với một số chất nhƣ tinh dầu tràm, rau má, nghệ, dầu mù u có tác dụng trong điều trị vết thƣơng nhƣ vết bỏng, làm giảm sự nhiễm khuẩn, làm nhanh lành vết thƣơng; trong công nghiệp giấy : alginate đƣợc trộn lẫn với bột giấy rồi xử lý sẽ cho bề mặt giấy nhẵn, mịn không xù xì; trong công nghiệp dệt và tơ nhân tạo: 9 alginate cho nhũ tƣơng mịn và bền nên đƣợc dùng trong kỹ nghệ sơn, xà phòng, cao su, phim ảnh, vải lợp nhuộm vecni và sơn để tăng độ bền của màu. Màu vẽ có alginate dễ tan đều trong nƣớc. Carrageenan là một ionic polysaccharide, mạch thẳng đƣợc sulfate hóa, chúng mang đầy đủ tính chất đặc trƣng của polysaccharide. Carrageenan là polysaccharide có khả năng tạo gel và làm đặc dung dịch, chúng tồn tại trong một số loài rong đỏ thuộc họ Rhodophyceae. Hiện nay, carrageenan thƣờng đƣợc chiết từ một số loài rong nhƣ Gigartina, Chondrus, Iridea, Eucheuma. Carrageenan tách chiết từ các loài rong khác nhau có thành phần hóa học, đặc điểm cấu trúc cũng nhƣ khả năng tạo gel khác nhau. Tính chất và khả năng tạo gel của carrageenan phụ thuộc vào độ lặp lại của các mắt xích, vị trí và số lƣợng nhóm sulfate và đặc biệt là sự có mặt của vòng 3,6 anhyđro D – galactose. Cầu 3,6 anhyđro D – galactose cho phép tạo nên cấu trúc xoắn, là điều kiện chủ yếu để tạo gel của carrageenan. Ngoài ra, rong biển còn đƣợc sử dụng để làm thức ăn cho nuôi tôm, thức ăn gia súc, đƣợc dùng trong công nghiệp dệt, nhuộm, mực in, sơn, hàn điện, lọc và hấp thụ các hợp chất, công nghiệp giấy, trong kỹ thuật nuôi cấy vi sinh. Rong biển cũng là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp nƣớc giải khát, đồ hộp, socola, mỹ phẩm cao cấp. Rong biển cũng đƣợc sử dụng chữa trị ung thƣ theo các bài thuốc gia truyền dƣới dạng dùng kết hợp với các thuốc khác. Polyphenol trong rong nâu cũng đƣợc dùng làm trà chống lão hóa. Năm 2007, tại Mỹ đã có quy trình sản xuất biodiesel từ rong biển. Thực tế còn cho thấy rong biển có tiềm năng sử dụng trong xử lý nƣớc thải. Một số loài rong biển có khả năng hấp thụ các ion kim loại nặng nhƣ : Zn và Cd từ nƣớc bị ô nhiễm. Do khả năng hấp thụ cao mà một số vi lƣợng có trong rong khá cao nên rong đƣợc dùng làm thức ăn bổ sung để phòng bệnh thiếu một số chất nhƣ sắt, iod,.. [1,11,12,13,14]. 10 Bảng 1.1. Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển. Ascophylm Laminariad Alariaes Palmaria Porpha Porphyra culenta nodosum igitata palmata sp. yezoensis Ngành Nâu Nâu Nâu Đỏ Đỏ Ulva sp. Đỏ Lục rong Nƣớc 7085 73-90 73-86 79-88 86 70 78 Tro 15- 10-25 14-27 15-30 8-16 7,8 13-22 25 Alginic axít 1530 20-45 21-42 0 0 0 0 Xylan 0 0 0 29-45 0 0 0 Laminaran 0-10 0-18 0-34 0 0 0 0 Mannitol 5-10 4-16 4-13 0 0 0 0 Fucoidan 4-10 2-4 nd 0 0 0 0 Floridosid 0 0 0 2-20 nd nd 0 Protein 5-10 8-15 9-18 8-25 33-47 43,6 15-25 Chất béo 2-7 1-2 1-2 0,3-0,8 0,7 2,1 0,6-0,7 Tannin 2-10 0,1 0,5-6,0 nd nd nd nd Kali 2-3 1,3-3,8 nd 7-9 3,3 2,4 0,7 Natri 3-4 0,9-2,2 nd 2,0-2,5 Nd 0,6 3,3 Magie 0,5-0,9 0,5-0,8 nd 0,4-0,5 2,0 nd nd Iod 0,01-0,1 0,3-1,1 0,05 0,010,1 0,0005 nd nd Nd : Không phát hiện thấy 1.1.2. Giới thiệu về rong nâu Rong nâu là nhóm rong có kích thƣớc lớn (macroalgae), chủ yếu gồm 4 chi Sargassum, chi Turbinaria, chi Dictyota, chi Padina, sản lƣợng tự nhiên cao nhất so với các nhóm rong biển khác. Đặc biệt chi rong Sargassum, chúng 11 hình thành các thảm rong biển rộng từ vài hecta cho đến cả vài chục hecta, các chi còn lại mật độ vừa phải, chúng mọc trên các bãi triều và rạn ngầm có nền đáy đá hoặc san hô. Chúng phân bố rộng, chiếm ƣu thế ở các bãi triều ven biển ở vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới. Rong nâu nơi sâu phát triển muộn hơn nơi cạn; sinh lƣợng cao vào tháng 3 và kéo dài đến tháng 6. Đặc biệt, những vùng có nền đáy cứng, nƣớc trong, sóng mạnh, những bãi triều có độ dốc 5-25% rong phát triển tốt nhất [1,6,7,10,11,12]. 1.1.2.1. Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới Việc phân loại tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học...ngƣời ta chia rong thành một số ngành riêng biệt. Con số các ngành rong hiện nay vẫn chƣa thống nhất tùy theo các tác giả khác nhau. Một trong những tác giả có các công trình nghiên cứu quan trọng về bộ rong nâu này là J. Agardh. Năm 1820, ông đã lập ra một hệ thống phân loại về chi rong Mơ và đã mô tả 62 loài. Ông chia chi này thành 7 nhóm và sắp xếp vào một bộ Fucoideae. Năm 1824, ông bổ sung thêm số lƣợng lên 67 loài. Sau đó một số tác giả khác nhƣ Greville, Gaudichaud, Montagne… có mô tả thêm loài nhƣng vẫn sắp xếp vào hệ thống J. Agardh. Năm 1889, ông đã bổ sung thêm vào hệ thống phân loại với nhiều chi, nhóm… trong đó có 180 loài. Hệ thống phân loại của J. Agardh đƣa ra năm 1889 đã đƣợc nhiều tác giả đồng tình và sử dụng. Quan trọng nhất là Grunow (1915-1916), đã triển khai và sử dụng hệ thống phân loại của J. Agardh, mô tả 230 loài với nhiều thứ và dạng trên cơ sở thu mẫu ở nhiều nƣớc trên thế giới. Một số tác giả khác đã góp phần vào việc nghiên cứu họ này nhƣ ở Nhật Bản đã mô tả 41 loài, 45 loài ở vùng biển Ấn Độ. Đến năm 1931-1936, Setchell nghiên cứu rong biển ở Hồng Kông, Trung Quốc đã đặc biệt chú ý đến họ Sargassaceae, ông đã mô tả thêm 32 loài. Từ đó đến nay, nhiều tác giả ở Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Philippin, Úc, Ấn Độ, Mỹ… đã có nhiều nghiên cứu bổ sung, đã có nhiều hội 12 nghị quốc tế về rong biển kinh tế, trong đó các loài rong nâu mới cũng đƣợc bổ sung, nâng tổng số loài đƣợc biết hiện nay trên thế giới khoảng 1500 loài. Nhƣ vậy đến thời điểm này rong nâu đƣợc phân chia thành 9 bộ, 265 chi và hơn 1500 loài trong đó số lƣợng thành phần loài một số chi rong nâu trên thế giới nhƣ: Chi Sargassum C.Agardh, 1820. thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales có khoảng 873 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhƣng trong đó 562 loài đƣợc chấp nhận sự phân loại Chi Turbinaria J.V.Lamouroux, 1825. thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales có khoảng 53 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhƣng trong đó 28 loài đƣợc chấp nhận sự phân loại. Chi Dictyota J.V.Lamouroux, 1809. thuộc họ Dictyotaceae, bộ Dictyotales có khoảng 316 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhƣng trong đó 76 loài đƣợc chấp nhận sự phân loại. Chi Padina Adanson, 1763. thuộc họ Dictyotaceae, bộ Dictyotales. Hiện nay số lƣợng loài chi Padina có khoảng 62 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhƣng trong đó 39 loài đƣợc chấp nhận sự phân loại (Tsutsui Isao et al, 2005). Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ai-len, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chi Lê, Argentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Trong đó bộ Fucales, đối tƣợng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới. Sản lƣợng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên 667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum . Hàn Quốc khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng 51.000 tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng 27.000 tấn. 1.1.2.2. Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam Đối với rong nâu Việt Nam, các tác giả trong nƣớc và nƣớc ngoài đã nghiên cứu tƣơng đối đầy đủ về mặt phân loại. Việc phân loại đƣợc thực hiện 13 theo phƣơng pháp hình thái so sánh, trong đó các tiêu chí phân loại là đặc điểm của cơ quan sinh sản vì đây là cơ quan ít biến đổi theo các điều kiện sinh thái, đƣợc sử dụng phổ biến ở Việt Nam và trên thế giới. Theo một số tác giả con số thành phần loài hiện có thể dự báo khoảng 800 loài. So với các nƣớc trong khu vực thì thành phần loài của rong biển Việt Nam đa dạng phong phú giữa tự nhiên và nuôi trồng, có nhiều tiềm năng, góp phần lớn về sản lƣợng khai thác nguồn lợi rong biển khu vực Đông Nam Á. Hiện nay, một số chi rong nâu đƣợc thống kê bao gồm: Chi Dictyota 14 loài, chi Padina 5 loài, chi Turbinaria 5 loài, chi Sargassum 68 loài trong đó ở Khánh Hòa hiện nay khảo sát có 39 loài [5,6,7,8,9,10]. Năm 2013, theo công bố của Nguyễn Văn Tú, Lê Nhƣ Hậu và cộng sự đã có tổng số 827 loài đƣợc công bố, trong đó chi rong nâu Chlorophyta (180 loài). So với các nƣớc Philippin, Đài Loan, Thái Lan hay Malaysia, rong biển Việt Nam rất đa dạng về số lƣợng loài. Nguồn lợi rong nâu đƣợc tập trung phân bố trên 4 khu vực ven biển Khánh Hòa theo trình tự từ Bắc đến Nam (Hình 1.1) + Khu vực 1: Vịnh Vân Phong (Hòn Bịp, Hòn Ó, Hòn Dút, Cù Meo, Rạn Trào, Rạn Tƣớng, Mũi Dù, Mũi Đá Son, Sủng Rong, Lạch Cổ Cò, Sủng Ké..). + Khu vực 2: ven biển xã Ninh Thuỷ, xã Ninh Phƣớc, xã Ninh Vân, Đầm Nha Phu (Bãi Đá lát, Mỹ Giang, Hòn khô, Bãi Đá nọc, Bãi Cây Tra, Bãi Cỏ, Bãi Cây Bàn, Bãi Vũng Tàu, Hòn Thị, Đảo Khỉ... và vài bãi cạn ngầm Bãi Cỏ - Thị xã Ninh Hòa. + Khu vực 3: Vịnh Nha Trang (Mũi Kê Gà, Bãi tiên Đƣờng Đệ, Hòn Chồng, khu vực Hòn Đỏ, Hòn Rùa, Đảo Hòn Tre - Mũi Nam Bãi Trủ, Bãi Rạn, Bãi Ngéo, Hòn Một, Hòn Mun, Bãi rạn ngầm Lớn, Mũi Cá sấu Trí Nguyên, Sông Lô, Mũi Cầu. + Khu vực 4: Đảo Bình Ba, xã Cam Lập ( dọc theo bờ Đông bán đảo Cam Lập, từ mũi Sốp đến mũi Cà Tiên) – Thành phố Cam Ranh.