Tài liệu Nghiên cứu thủy phân triglyceride trong dầu dừa để thu nhận các phân đoạn acid béo tự do có hoạt tình sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ ÁI VÂN NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN TRIGLYCERIDE TRONG DẦU DỪA ĐỂ THU NHẬN CÁC PHÂN ĐOẠN ACID BÉO TỰ DO CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ KĨ THUẬT TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ ÁI VÂN NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN TRIGLYCERIDE TRONG DẦU DỪA ĐỂ THU NHẬN CÁC PHÂN ĐOẠN ACID BÉO TỰ DO CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số chuyên ngành: 62540101 Phản biện độc lập 1: Phản biện độc lập 2: Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS. TS Phan Ngọc Hòa 2. TS. Trần Bích Lam LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng quy định. Tác giả luận án Nguyễn Thị Ái Vân i TÓM TẮT LUẬN ÁN Phản ứng thủy phân dầu dừa (VCO) với bốn loại enzyme lipase khác nhau để thu nhận acid béo tự do được nghiên cứu. Các thông số kỹ thuật đã được khảo sát như tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/ cơ chất, pH, nhiệt độ và động học enzyme. Kết quả khảo sát cho thấy, với bốn loại enzyme lipase có nguồn gốc trích ly và tính đặc hiệu khác nhau, thể hiện khả năng xúc tác phản ứng khác nhau trên cơ chất dầu dừa VCO. Trong đó, enzyme lipase Candida rugosa (CRL) có nguồn gốc từ nấm men Candida rugosa xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO để thu nhận acid béo tự do (FFA) là phù hợp nhất. Hỗn hợp FFA được thu nhận sau phản ứng thủy phân tiếp tục trải qua quá trình chưng cất chân không để thu nhận 3 phân đoạn FFA1, FFA2 và FFA3 có hàm lượng acid béo mạch trung bình (C6 – C10), acid lauric (C12) và acid béo mạch dài (C14 – C18) lần lượt là 12,6%, 38,4% và 49%. Hoạt tính sinh học của ba phân đoạn acid béo này được thể hiện qua khả năng kháng khuẩn và tác động đến hàm lượng cholesterol trong máu của chuột giống Wistar với chế độ ăn giàu béo (HFD). Các phân đoạn acid béo tự do này được đánh giá khả năng kháng một số loại vi khuẩn thường gây bệnh trong thực phẩm như Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774), Escherichia coli (ATCC 25922) và Salmonella enteritidis (ATCC 13076). Trong đó, FFA1 thể hiện khả năng ức chế được bốn loại vi khuẩn trên mạnh nhất, kế đến là FFA2, còn lại FFA3 không thể hiện khả năng kháng đối với bốn loại vi khuẩn kể trên. Thử nghiệm trên chuột giống Wistar với chế độ ăn HFD, kết quả cho thấy rằng, với chế độ điều trị bằng FFA3 không những làm tăng trọng lượng, tăng chỉ số men gan ALT, AST mà còn gây viêm gan. Trong khi đó, FFA1 giúp giảm chỉ số men gan ALT, AST; giảm hàm lượng cholesterol tổng và triglyceride, đồng thời giúp giảm trọng lượng khi so với chuột ăn chế độ HFD. Riêng FFA2 đã giúp chuột ăn chế độ HFD giảm chỉ số men gan ALT, AST; giảm trọng lượng và tăng chỉ số cholesterol “tốt” HDL. Như vậy, các acid béo tự do mạch trung bình (MCFA) và acid lauric được thu nhận từ dầu VCO đã góp phần tăng hiệu quả trong việc giảm các chỉ số sinh hóa máu dẫn đến làm lành tổn thương gan bởi chế độ ăn giàu béo của chuột giống Wistar. ii ABSTRACT In this study, to obtain free fatty acids (FFAs), virgin coconut oil (VCO) was hydrolyzed by four types of lipase derived from differently original extraction and having catalytic specificity for triglyceride. In particular, the lipase extracted from Candida rugosa was most suitable for the hydrolysis of VCO to acquire FFAs. After vacuum distillation, the initial FFAs composition was categorized into three groups that have different carbon chain lengths and are enriched in the content of each FFA fraction. They include FFA1, FFA2, and FFA3 containing 97,31% of C6 - C12, 76,49% of C12, and 85,86% of C14 – C18, respectively. Then, the antibacterial properties of FFAs were tested against four food pathogenic bacteria, including Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774), Escherichia coli (ATCC 25922) and Salmonella enteritidis (ATCC 13076). In which, two fractions FFA1 and FFA2 exhibited significant resistance. The group FFA1 inhibit the growths of all foodborne pathogens, followed by group FFA2. FFA3, however, was not as effective as an antibacterial agent. In terms of the effect of groups FFA1, FFA2 and FFA3 on the cholesterol level in mice fed an HFD diet. The results showed that group FFA3 not only increased ALT as well as AST level but also caused hepatitis. With FFA1 treatment, the levels of ALT, AST, cholesterol and triglyceride were reduced in comparison with HFD-fed mice. Particularly, FFA2 showed better results in reducing ALT, AST than other groups and increasing HDL cholesterol levels while remaining the normal status of liver tissue via histologically liver analysis. Additionally, medium chain fatty acid (MCFA) and lauric acid (C12) present in VCO content contributed to increasing the efficiency of reducing some blood biochemical values, resulting in the healing of liver damage caused by high-fat diet (HFD) in Wistar mice. iii LỜI CÁM ƠN Tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến, PGS. TS Phan Ngọc Hòa, người cô kính mến đã dẫn đường nghiên cứu khoa học xuyên suốt cho luận án này. TS. Trần Bích Lam, cô giáo tận tụy đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết để hướng dẫn khoa học cho nghiên cứu này. GS.TS Lê Văn Việt Mẫn, người thầy đáng kính đã cho tôi những lời khuyên bổ ích trong suốt quá trình học tập – nghiên cứu. Tập thể giảng viên bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM đã chân thành góp ý và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án. Bên cạnh đó, tập thể nghiên cứu vô cùng cám ơn quý công ty TNHH Chế Biến Dừa Lương Quới (tỉnh Bến Tre) đã tài trợ toàn bộ dầu dừa VCO, là nguyên liệu chính để thực hiện nghiên cứu. Đồng thời, chúng tôi xin gửi lời cám ơn đến quý công ty Novozymes, đại diện bởi công ty Brenntag Việt Nam đã tài trợ hai loại enzyme công nghiệp để phục vụ nghiên cứu này. Có những giai đoạn khó khăn, thì ông xã là người luôn ở bên động viên, cùng tôi vượt qua mọi trở ngại để hoàn thành luận án. Con xin cám ơn ba mẹ và anh chị em hai bên gia đình đã luôn hỗ trợ và là nguồn cảm hứng cho con học tập, nghiên cứu. iv MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. x DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................... xii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. xiii MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ........................................................................................ 5 1.1 Dầu dừa và các hợp chất có hoạt tính sinh học của nó ......................................... 5 1.1.1 Định nghĩa dầu dừa....................................................................................................5 1.1.2 Phân loại .....................................................................................................................5 1.1.2.1 Dầu dừa tinh luyện ................................................................................. 5 1.1.2.2 Dầu dừa tinh khiết .................................................................................. 5 1.1.3 Đặc tính dầu dừa VCO ..............................................................................................6 1.1.4 Các chất có hoạt tính sinh học trong dầu dừa VCO ................................................8 1.1.5 Triglyceride của acid béo no mạch trung bình trong dầu dừa.................................9 1.1.6 Sự chuyển hóa MCT trong cơ thể...........................................................................10 1.1.6.1 Quá trình tiêu hóa, hấp thụ MCT.......................................................... 10 1.1.6.2 Quá trình chuyển hóa Acid lauric ......................................................... 12 1.1.7 Các nghiên cứu liên quan đến hoạt tính sinh học của MCFA trong dầu dừa ......14 1.2 Các phương pháp thủy phân dầu VCO ............................................................... 16 1.3 Enzyme lipase ..................................................................................................... 17 1.3.1 Tính chất của enzyme lipase ...................................................................................17 1.3.2 Cơ chế xúc tác của các chế phẩm enzyme lipase...................................................18 1.3.3 Phân loại lipase chế phẩm .......................................................................................19 1.3.3 Các nghiên cứu liên quan đến thủy phân chất béo bởi enzyme lipase .................19 1.4 Phương pháp tách phân đoạn.............................................................................. 21 1.5 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu ...................................................................... 21 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 23 2.1 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 23 2.1.1 Dầu dừa ....................................................................................................................23 v 2.1.2 Chế phẩm enzyme lipase.........................................................................................23 2.1.2.1 Lypozyme TL 100L .............................................................................. 23 2.1.2.2 Lypozyme TL IM ................................................................................. 23 2.1.2.3 Candida rugosa lipase (CRL) ............................................................... 23 2.1.2.4 Porcine pancreas lipase (PPL) .............................................................. 24 2.1.3 Chủng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy ................................................................24 2.1.3.1 Chủng vi khuẩn .................................................................................... 24 2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy ............................................................................. 24 2.1.3.3 Đối chứng dương .................................................................................. 24 2.1.4 Chuột thí nghiệm .....................................................................................................25 2.1.4.1 Chuột .................................................................................................... 25 2.1.4.2 Thức ăn cơ sở ....................................................................................... 25 2.1.4.3 Thức ăn giàu béo – high fat diet (HFD) ............................................... 25 2.1.4.4 Đối chứng dương .................................................................................. 25 2.1.5 Hóa chất....................................................................................................................26 2.1.6 Thiết bị......................................................................................................................26 2.1.6.1 Thiết bị nghiên cứu quá trình thủy phân dầu VCO .............................. 26 2.1.6.2 Thiết bị nghiên cứu quá trình thu nhận các tổ hợp acid béo tự do ....... 26 2.1.6.3 Thiết bị nghiên cứu hoạt tính sinh học của các tổ hợp acid béo tự do . 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 27 2.2.1 Khảo sát quá trình thủy phân dầu VCO bởi bốn loại enzyme lipase khác nhau..28 2.2.1.1 Khảo sát nguyên liệu dầu VCO và hoạt tính enzyme lipase. ............... 28 2.2.1.2 Khảo sát các yếu tố tác động lên quá trình thủy phân dầu VCO bởi bốn loại enzyme lipase. ........................................................................................... 28 2.2.1.3 Động học enzyme lipase. ...................................................................... 28 2.2.1.4 Khảo sát mức độ thủy phân dầu VCO được xúc tác bởi 4 loại enzyme lipase theo thời gian.......................................................................................... 29 2.2.2 Thu nhận các phân đoạn acid béo tự do .................................................................29 2.2.2.1 Thu nhận sản phẩm sau thủy phân ....................................................... 29 2.2.2.2 Thu nhận các phân đoạn acid béo tự do. .............................................. 29 vi 2.2.3 Khảo sát hoạt tính sinh học của các phân đoạn acid béo tự do. ............................29 2.2.3.1 Khả năng kháng khuẩn của FFA, HVCO và VCO. .............................. 29 2.2.3.2 Khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 và FFA3. ................................................................................................................ 29 2.2.3.3 Tác động của các phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 và FFA3 đến hàm lượng cholesterol trong máu. ............................................................................ 30 2.3 Bố trí thí nghiệm................................................................................................. 30 2.3.1 Thí nghiệm khảo sát quá trình thủy phân dầu VCO ..............................................30 2.3.1.1 Thí nghiệm khảo sát nguyên liệu dầu VCO và hoạt tính enzyme lipase .......................................................................................................................... 30 2.3.1.2 Thí nghiệm khảo sát quá trình thủy phân dầu VCO ............................. 31 2.3.1.3 Thí nghiệm khảo sát động học enzyme lipase ...................................... 35 2.3.1.4 Thí nghiệm khảo sát mức độ thủy phân dầu VCO theo thời gian ........ 37 Thí nghiệm thu nhận các phân đoạn acid béo tự do.......................................................37 2.3.2....................................................................................................................................37 2.3.2.1 Thí nghiệm thu nhận sản phẩm thủy phân FFA và HVCO .................. 37 2.3.2.2 Thí nghiệm thu nhận các phân đoạn acid béo tự do FFA1, FFA2 và FFA3 ................................................................................................................. 38 2.3.3 Thí nghiệm khảo sát hoạt tính sinh học của các phân đoạn acid béo tự do..........39 2.3.3.1 Thí nghiệm xác định hoạt tính kháng khuẩn ........................................ 39 2.3.3.2 Thí nghiệm xác định hoạt tính của các phân đoạn acid béo ảnh hưởng đến hàm lượng cholesterol và trọng lượng chuột ............................................. 40 i). Cân trọng lượng cơ thể, trọng lượng gan và trọng lượng gan tương đối ..... 41 ii). Xác định chỉ số sinh hóa máu và men gan .................................................. 42 iii) Phân tích mô học......................................................................................... 44 iv) Thu nhận, phân tích cholesterol và thành phần acid béo trong gan chuột .. 45 2.4 Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 45 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................... 46 3.1 Kết quả nghiên cứu quá trình thủy phân dầu VCO bởi enzyme lipase .............. 46 3.1.1 Tính chất nguyên liệu dầu VCO và hoạt tính enzyme lipase ................................46 3.1.1.1 Các chỉ số ban đầu của dầu VCO ......................................................... 46 vii 3.1.1.2 Hoạt tính của bốn loại enzyme lipase trên cơ chất dầu VCO ............... 47 3.1.2 Nghiên cứu quá trình thủy phân dầu VCO bởi 4 loại enzyme lipase ...................48 3.1.2.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ VCO/đệm (w/w) đến mức độ thủy phân dầu VCO bởi 4 loại enzyme lipase ................................................................................... 48 3.1.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme đến mức độ thủy phân dầu VCO bởi 4 loại enzyme lipase ................................................................................................... 50 3.1.2.3 Ảnh hưởng pH đến mức độ thủy phân dầu VCO của 4 loại enzyme lipase ................................................................................................................. 52 3.1.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến mức độ thủy phân của 4 loại enzyme ........... 54 3.1.3 Động học enzyme lipase .........................................................................................56 3.1.3.1 Động học enzyme Lypozyme TL 100L................................................ 56 3.1.3.2 Động học enzyme TL IM ..................................................................... 57 3.1.3.3 Động học enzyme CRL ........................................................................ 58 3.1.3.4 Động học enzyme PPL ......................................................................... 59 3.1.3.5 So sánh động học của 4 loại enzyme lipase xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO ........................................................................................................... 61 3.1.3.6 Khảo sát mức độ thủy phân dầu VCO bởi bốn loại enzyme lipase theo thời gian ............................................................................................................ 64 Thu nhận các phân đoạn acid béo tự do .................................................................. 66 3.2 ............................................................................................................................. 66 3.2.1 Thu nhận sản phẩm sau thủy phân (FFA và HVCO) ............................................66 3.2.2 Thu nhận các phân đoạn acid béo tự do FFA1, FFA2, FFA3...............................68 3.2.2.1 Tỷ lệ phần trăm khối lượng giữa các phân đoạn .................................. 68 3.2.2.2 Thành phần acid béo trong từng phân đoạn ......................................... 69 3.3 Hoạt tính sinh học của các phân đoạn acid béo tự do ........................................ 71 3.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn acid béo tự do ....................................71 3.3.1.1 Hoạt tính kháng khuẩn của FFA, HVCO và VCO ............................... 71 3.3.1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của FFA1, FFA2 và FFA3 .............................. 73 3.3.2 Hoạt tính của các phân đoạn acid béo tự do tác động đến hàm lượng cholesterol trong máu ...........................................................................................................................76 3.3.2.1 Thay đổi trọng lượng ở chuột ............................................................... 76 viii 3.3.2.2 Kết quả sinh hóa máu ........................................................................... 78 3.3.2.3 Kết quả giải phẫu mô học ..................................................................... 83 3.3.2.4 Hàm lượng cholesterol trong gan ở các chế độ điều trị (thí nghiệm đợt 2) ....................................................................................................................... 85 3.3.2.5 Thành phần acid béo trong gan ở các chế độ điều trị (thí nghiệm đợt 2) .......................................................................................................................... 86 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 89 4.1 Kết luận .............................................................................................................. 89 Về mặt khoa học ...............................................................................................................89 Về mặt ứng dụng ...............................................................................................................90 4.2 Kiến nghị ............................................................................................................ 90 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Dầu dừa thương phẩm ..................................................................................... 6 Hình 1.2 Sơ đồ quá trình tiêu hóa MCT [7] ................................................................. 10 Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa acid lauric trong cơ thể [7] ............................................... 13 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................... 27 Hình 2.3 Quy trình thu nhận FFA [45] ......................................................................... 37 Hình 3.1 Ảnh hưởng tỉ lệ dầu/ đệm (w/w) đến mức độ thủy phân dầu VCO bởi 4 loại enzyme lipase. .............................................................................................................. 49 Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme đến mức độ thủy phân dầu VCO bởi 4 loại enzyme lipase. .............................................................................................................. 50 Hình 3.3 Ảnh hưởng pH đến mức độ thủy phân của 4 loại enzyme. ........................... 53 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến mức độ thủy phân dầu VCO bởi 4 loại enzyme lipase ............................................................................................................................. 54 Hình 3.5 Mối liên hệ giữa 1[S]  và 1V của phản ứng thủy phân dầu VCO bởi enzyme Lypozyme TL 100L được biểu diễn dưới dạng đồ thị Lineweaver – Burk.................. 57 Hình 3.6 Đồ thị Lineweaver – Burk biểu diễn quá trình thủy phân dầu VCO bởi enzyme Lypozyme TL IM ............................................................................................ 58 Hình 3.7 Đồ thị Lineweaver – Burk biểu diễn quá trình thủy phân dầu VCO bởi enzyme CRL ................................................................................................................. 59 Hình 3.8 Đồ thị Lineweaver – Burk biểu diễn quá trình thủy phân dầu VCO bởi enzyme PPL .................................................................................................................. 61 Hình 3.9 Mức độ thủy phân dầu VCO được xúc tác bởi bốn loại enzyme lipase trong bốn giờ đầu phản ứng ................................................................................................... 62 Hình 3.10 Mức độ thủy phân dầu VCO được xúc tác bởi 4 loại enzyme lipase .......... 66 Hình 3.11 Thành phần FFA được giải phóng bởi 4 loại enzyme lipase. ...................... 67 Hình 3.12 Thành phần FFA phân đoạn 1. .................................................................... 69 Hình 3.13 Thành phần FFA phân đoạn 2. .................................................................... 70 Hình 3.14 Thành phần FFA phân đoạn 3. .................................................................... 70 Hình 3.15 Khả năng kháng khuẩn của FFA, HVCO và VCO lên 4 loại vi khuẩn thử nghiệm. ......................................................................................................................... 72 x Hình 3.16 Đường kính kháng khuẩn của FFA1, FFA2, FFA3 và FFA tổng trên 4 loại vi khuẩn thử nghiệm ..................................................................................................... 74 Hình 3.17 Sự thay đổi chỉ số enzyme a) Aspartate transaminase (AST) và b) Alanine transaminase (ALT) với chế độ ăn HFD kết hợp với uống các tác nhân điều trị khác nhau ...................................................................................................................................... 78 Hình 3.18 Kết quả giải phẫu mô học trên gan chuột. ................................................... 83 Hình 3.19 Hàm lượng cholesterol trong các mẫu thí nghiệm ...................................... 85 Hình 3.20 Kết quả phân tích thành phần acid béo ........................................................ 86 xi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học và chỉ số chất lượng của dầu VCO [57]. ...................... 7 Bảng 1.2 Giới hạn kim loại nặng trong dầu dừa VCO [57] .......................................... 7 Bảng 1.3 Thành phần acid béo trong dầu dừa VCO [57] ............................................... 8 Bảng 2.1 Phương pháp xác định các chỉ số của dầu VCO. .......................................... 30 Bảng 2.2 Phân nhóm chuột và chế độ ăn của mỗi nhóm (đợt 1). ................................. 41 Bảng 2.3 Phân nhóm chuột và chế độ ăn của mỗi nhóm (đợt 2). ................................. 41 Bảng 3.1 Chỉ số ban đầu của dầu VCO ........................................................................ 46 Bảng 3.2 Thành phần acid béo trong dầu VCO nguyên liệu ........................................ 47 Bảng 3.3 Hoạt tính của bốn loại enzyme lipase khi bắt đầu thí nghiệm ...................... 48 Bảng 3.4 Vận tốc phản ứng thủy phân dầu VCO bởi enzyme Lypozyme TL100L ở các nồng độ cơ chất ban đầu khác nhau.............................................................................. 56 Bảng 3.5 Vận tốc phản ứng thủy phân dầu VCO bởi enzyme Lypozyme TL IM ở các nồng độ cơ chất ban đầu khác nhau.............................................................................. 57 Bảng 3.6 Vận tốc phản ứng thủy phân dầu VCO bởi enzyme CRL ở các nồng độ cơ chất ban đầu khác nhau ................................................................................................ 59 Bảng 3.7 Vận tốc phản ứng thủy phân dầu VCO bởi enzyme PPL ở các nồng độ cơ chất ban đầu khác nhau ........................................................................................................ 60 Bảng 3.8 Thông số động học của bốn loại enzyme lipase ........................................... 61 Bảng 3.9 Tỷ lệ giữa các phân đoạn. ............................................................................. 68 Bảng 3.10 Đường kính vòng kháng khuẩn của FFA, HVCO và VCO lên 4 loại vi khuẩn thử nghiệm. ........................................................................................................ 72 Bảng 3.11 Đường kính kháng khuẩn của các phân đoạn FFA1, FFA2, FFA3 và FFA tổng. .............................................................................................................................. 74 Bảng 3.12 Sự thay đổi trọng lượng chuột ở các chế độ điều trị khác nhau. ................. 76 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của các chế độ ăn và điều trị khác nhau lên chỉ số sinh hóa máu. ...................................................................................................................................... 79 xii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu ATCC Thuật ngữ tiếng Anh American Type Tiếng Việt Culture Collection Bộ sưu tập giống chủng Hoa Kỳ ALT Alanine transaminase Chỉ số men gan ALT AST Aspartate transaminase Chỉ số men gan AST B. substilis Bacillus substilis Bacillus substilis CRL Candida rugosa lipase Lipase từ nấm Candida rugosa CFU Colony Forming Unit Đơn vị tạo thành khuẩn lạc E. coli Escherichia Coli Escherichia Coli E Enzyme Enzyme FFA Free Fatty Acid Acid béo tự do GC – FID HDL Gas Chromatography - Flame Sắc ký khí với đầu dò ion hóa ngọn lửa Ionisation Detector High density lipoprotein Lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao HVCO Hydrolyzed virgin coconut oil Dầu dừa thủy phân chưa hoàn toàn HFD High fat diet Chế độ ăn giàu chất béo LCFA Long chain fatty acid Acid béo mạch dài LCT Long chain triglyceride Mạch triglyceride dài LDL Low density lipoprotein Lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp LCAD MCAD Long-chain acyl-CoA Acyl-CoA dehydrogenase mạch dài dehydrogenase Medium chain acyl-CoA Acyl-CoA dehydrogenase mạch trung dehydrogenase bình MCFA Medium chain fatty acid Acid béo mạch trung bình MCT Medium chain triglyceride Mạch triglyceride trung bình PPL Porcine pancreas lipase Lipase từ tụy heo P Product Sản phẩm SCAD Short-chain acyl-CoA Acyl-CoA dehydrogenase mạch ngắn dehydrogenase S Substrate Cơ chất S. aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus S. enteritidis Salmonella enteritidis Salmonella enteritidis xiii TC Total cholesterol Cholesterol tổng VCO Virgin coconut oil Dầu dừa tinh khiết VLCAD Very-long-chain acylCoAdehydrogenase Acyl-CoA dehydrogenase mạch rất dài xiv MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam có sản lượng dầu thực vật thấp, nhập khẩu nhiều, nhưng một số nguồn dầu trong nước chưa được khai thác chế biến tốt, nhiều nơi vẫn còn bán nguyên liệu thô, trong khi từ các nguyên liệu này có thể tạo ra các sản phẩm có giá trị sử dụng cao. Dầu dừa là một nguồn dầu béo chính của Việt Nam. Dầu dừa có thành phần acid béo mạch cacbon từ C6 đến C18, chủ yếu là các acid béo bão hòa, có đặc điểm là hàm lượng lớn các acid béo no mạch trung bình, khó bị oxi hóa. Ở một số nước Đông Nam Á như Philippines, Indonesia và Thái Lan, từ dầu dừa đã sản xuất nhiều sản phẩm có giá trị, dùng trong dược phẩm và mỹ phẩm. Theo một số công bố thì dầu dừa VCO có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu (Harini, 2009). Những nghiên cứu trước đây cũng đã chứng minh rằng, các triglyceride của acid béo mạch trung bình dễ dàng được hấp thu và giải phóng thành năng lượng, làm tăng cảm giác no sớm, nên giảm ăn, do đó giúp giảm được trọng lượng (St – Onge và cộng sự, 2002). Mặt khác, nhiều nghiên cứu cho thấy, khi ở trạng thái tự do, các acid béo mạch trung bình trong dầu dừa thể hiện được khả năng kháng khuẩn và kháng nấm (Shilling và cộng sự, 2013; Beena Shino và cộng sự, 2016). Đặc biệt là công dụng của acid lauric – một acid béo mạch trung bình điển hình trong dầu dừa, đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu và chế biến thực phẩm nhờ hoạt tính sinh học cao, như khả năng kháng vi khuẩn, kháng nấm mốc và kháng virút (Kim và cộng sự, 2016; Sun và cộng sự, 2003; F.M. Dayrit, 2014). Tùy thuộc vào điều kiện thủy phân dầu dừa, có thể thu được các sản phẩm thuỷ phân có tính chất khác nhau, vì thế có giá trị sinh học khác nhau. Tuy nhiên, việc nghiên cứu thủy phân dầu dừa bằng enzyme đến nay vẫn chưa có hệ thống, đặc biệt là tính chất sinh học của các phân đoạn acid béo trong dầu VCO thì hầu như chưa được nghiên cứu. Từ những cơ sở trên, luận án này sẽ nghiên cứu thủy phân triglyceride trong dầu dừa để thu nhận các phân đoạn acid béo tự do có hoạt tính sinh học. 1 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của luận án là chọn được loại enzyme lipase phù hợp để thủy phân dầu VCO nhằm thu nhận các phân đoạn acid béo tự do có khả năng kháng lại một số loại vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm và có khả năng cải thiện hàm lượng cholesterol trong máu. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng được sử dụng để thu nhận chất có hoạt tính sinh học là dầu VCO, do công ty TNHH Chế Biến Dừa Lương Quới, tỉnh Bến Tre sản xuất và tài trợ. Các enzyme lipase được sử dụng để thủy phân dầu VCO có nguồn gốc trích ly đa dạng như từ nấm men Candida rugosa (Sigma – Alrich), từ tụy heo lipase porcine pancreas (Sigma – Alrich); từ nấm mốc Thermomyces lanuginosus, có 2 chế phẩm là Lypozyme TL 100L (chế phẩm enzyme tự do) và Lypozyme TL IM (chế phẩm enzyme cố định) (Novozymes). Các chủng vi khuẩn thử nghiệm là Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774), Escherichia coli (ATCC 25922) và Salmonella enteritidis (ATCC 13076) được cung cấp bởi công ty Microbiologics Co. (USA). Chuột giống Wistar được cung cấp bởi Viện Pasteur TpHCM. Dầu VCO được thủy phân bởi bốn loại enzyme lipase trên. Xác định qui luật ảnh hưởng của các yếu tố như tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất, pH và nhiệt độ đến mức độ thủy phân dầu VCO của mỗi loại enzyme lipase. Xác định thông số động học 𝐾! và 𝑉!"# của mỗi loại enzyme lipase xúc tác phản ứng thủy phân dầu VCO. Xác định loại enzyme lipase phù hợp nhất để thủy phân dầu VCO. Thu nhận sản phẩm sau thủy phân là các acid béo tự do (FFA). Từ hỗn hợp acid béo sau thủy phân, thu nhận các phân đoạn acid béo tự do mạch trung bình MCFA (FFA1), acid lauric (FFA2) và acid béo tự do mạch dài LCFA (FFA3). Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn FFA1, FFA2, FFA3 lên bốn loại vi khuẩn thử nghiệm ở trên. Khảo sát ảnh hưởng của các phân đoạn acid béo tự do này đến hàm lượng cholesterol trong máu của chuột giống Wistar với chế độ ăn giàu béo (HFD). 2 Đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học và tính mới - Đã xác định được qui luật thủy phân dầu VCO của bốn loại enzyme lipase bị tác động bởi bốn yếu tố như: tỉ lệ dầu/đệm, tỉ lệ enzyme/cơ chất, pH và nhiệt độ, đồng thời xác định các thông số động học của mỗi loại enzyme lipase trên cơ chất dầu VCO. Trên cơ sở đó, đã chọn được loại enzyme lipase và điều kiện thủy phân dầu VCO phù hợp để thu sản phẩm và phân đoạn acid béo như mong muốn FFA1, FFA2 và FFA3. - Đã xác định được khả năng kháng lại bốn loại vi khuẩn Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 11774), Escherichia coli (ATCC 25922) và Salmonella enteritidis (ATCC 13076) của các phân đoạn acid béo FFA1, FFA2 và FFA3. Khả năng kháng khuẩn của 3 phân đoạn acid béo này được thể hiện như sau, hoạt tính kháng khuẩn của FFA1 cao hơn FFA2. Riêng FFA3 không thể hiện khả năng kháng cả bốn loại vi khuẩn kể trên. - Bước đầu xác định được ảnh hưởng của các phân đoạn FFA1, FFA2 và FFA3 đến sự chuyển hóa trong cơ thể chuột. FFA1 và FFA2 vừa giúp giảm hàm lượng cholesterol trong máu vừa giúp giảm trọng lượng của chuột được cho ăn chế độ HFD. Riêng FFA3 (phân đoạn chứa nhiều acid béo tự do mạch dài, C14 – C18), không những không cải thiện trọng lượng chuột được cho ăn chế độ HFD mà còn gây viêm gan. Ý nghĩa thực tiễn - Đã xác định được điều kiện thủy phân dầu VCO phù hợp nhất cho từng loại enzyme lipase và chọn được loại enzyme thủy phân VCO với mức độ thủy phân cao nhất trong thời gian ngắn nhất và hàm lượng acid béo mạch trung bình (MCFA) được giải phóng lên đến 61.37%. - Đã thu nhận được các phân đoạn acid béo tự do FFA1, FFA2 và FFA3, đồng thời xác định được thành phần cũng như hàm lượng của các acid béo tự do trong các phân đoạn trên. 3 - Đã chứng minh được, các acid béo có mạch cacbon từ C6 đến C12 (FFA1 và FFA2) là có hoạt tính kháng bốn loại vi khuẩn thử nghiệm, còn acid béo có mạch cacbon từ C14 đến C18 (FFA3) thì không có hoạt tính kháng bốn loại vi khuẩn kể trên. - Đã xác định được hai phân đoạn FFA1 và FFA2 có khả năng cải thiện hàm lượng cholesterol trong máu và trọng lượng của chuột giống Wistar được cho ăn chế độ HFD. Trong khi đó, phân đoạn FFA3, chứa chủ yếu là các acid béo mạch dài, không những gây viêm gan mà còn làm tăng trọng so với chuột được cho ăn chế độ HFD. Bố cục của luận án: Luận án gồm có 4 chương. Mở đầu. Chương 1 Tổng quan. Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Chương 3 Kết quả và biện luận. Chương 4 Kết luận và kiến nghị. 4