Tài liệu Nghiên cứu thủy phân protein báng dầu đậu nành thành đạm hòa tan bằng nấm mốc aspergillus oryzae, kết hợp enzyme papain và vi khuẩn bacillus subtilis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HOC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN PROTEIN BÁNH DẦU ĐẬU NÀNH THÀNH ĐẠM HÒA TAN BẰNG NẤM MỐC Aspergillus oryzae, KẾT HỢP ENZYME PAPAIN VÀ VI KHUẨN Bacillus subtilis CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. LÊ THANH HÙNG NGUYỄN THANH PHƯƠNG MSSV: 3064409 LỚP: CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 06 năm 2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) Nguyễn Thanh Phương Lê Thanh Hùng DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………....................... .................................... Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) CẢM TẠ Con xin cảm ơn cha mẹ đã hết lòng nuôi dạy, chăm sóc và tạo mọi điều kiện cho con học tập đến nơi đến chốn. Em xin chân thành cảm tạ và biết ơn sâu sắc: Thầy Lê Thanh Hùng đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm nghiên cứu, kiến thức khoa học và tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Chân thành cảm ơn cô cố vấn học tập Trần Thị Xuân Mai đã động viên và giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Quý thầy cô Viện Nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt kiến thức và giúp đỡ em trong suốt bốn năm đại học. Cám ơn thầy Phương, thầy Song Toàn, chị Dung, anh Quệ, anh Phong, anh Thạnh, chị Giang đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài này. Luôn nhớ và cảm ơn tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học K32 đã chia sẻ, động viên và giúp đỡ trong quá trình học ở lớp. Sinh viên thực hiện Nguyễn Thanh Phuơng TÓM TẮT Dịch đạm acid amin là một sản phẩm trung gian của quá trình sản xuất nước tương, có 3 phương pháp công nghệ thường được sử dụng: công nghệ vi sinh, công nghệ hóa học và công nghệ enzyme. Tuy nhiên các phương pháp trên còn tồn tại một số nhược điểm như: phương pháp hóa học gây ô nhiễm môi trường và tạo ra độc tố không an toàn cho người sử dụng..., phương pháp vi sinh thì thời gian kéo dài và phương pháp enzim thì chi phí lại cao. Do đó, chúng tôi tiến hành thủy phân protein bánh dầu đậu nành thành dịch đạm amin có hàm lượng đạm acid amin cao và an toàn cho người tiêu dùng đồng thời rút ngắn thời gian sản xuất. Bánh dầu đậu nành được lên mốc với tỷ lệ 0,2% nấm mốc Aspergillus oryzae. Tiếp tục, thủy phân bánh dầu bằng 1,2% enzyme papain ở pH= 6,5, nhiệt độ 600C trong 5 giờ và 2% vi khuẩn Bacillus subtilis ở hàm lượng muối 20% , pH 6,5, ở nhiệt độ 50 0C thu được dung dịch có hàm lượng đạm tổng số cao là 15,18mg/ml vào ngày thứ 20, hàm lượng đạm amin cao là 13,59mg/ml vào ngày thứ 15 và hàm lượng đạm amoniac thấp là 0,93mg/ml ở ngày thứ 20. Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Sau quá trình phân giải các đại phân tử protein làm chúng biến thành những acid amin và hấp thu vào cơ thể qua đường tiêu hóa dưới tác dụng của dịch tiêu hóa. Người ta đã tìm ra được 20 loại acid amin khác nhau, trong đó có 8 loại acid amin mà cơ thể không thể tự tổng hợp được. Các acid amin này tham dự vào nhiều quá trình chuyển hóa trong cơ thể như tổng hợp các chất dẫn truyền thần kinh, đổi mới các sợi cơ bắp... do vậy nhu cầu cho cơ thể bao giờ cũng chỉ đáp ứng đủ, thừa hoặc thiếu đều gây nên bất lợi cho cơ thể. Hiện nay cần phải đẩy mạnh nghiên cứu về nguồn thực phẩm giàu hàm lượng protein cung cấp cho con người trong mỗi bữa ăn hàng ngày. Trong đó, chủng nấm mốc Aspergillus oryzae rất được quan tâm và sử dụng rộng rải trong việc sản xuất nước tương từ đậu nành do chúng có hoạt tính cao và không sinh độc tố. Bên cạnh đó, những vi khuẩn thuộc giống Bacillus có khả năng sản sinh enzyme protease cao và được dùng làm giống nuôi ở các thùng lên men trong công nghiệp sản xuất acid amin. Thêm vào đó, dưới tác động của mạnh enzyme papain sẽ đẩy nhanh quá trình thủy phân đậu nành một cách triệt để và an toàn. Ngoài ra trong số các loài thực vật thì đậu nành có hàm lượng protein khá cao, giá trị dinh dưỡng tương đương với thịt, chứa đầy đủ các acid amin với tỷ lệ hết sức cân đối hài hòa và có hệ số tiêu hóa cao. Bánh dầu đậu nành là sản phẩm phụ thu được sau khi ép đậu lấy dầu trong công nghiệp sản xuất dầu ăn, nên sử dụng bánh dầu đậu nành làm nguyên liệu sản xuất đạm amin vừa tiết kiệm vừa giúp giảm ô nhiểm môi trường. 1.2 Nội dung đề tài Áp dụng qui trình thủy phân bánh dầu đậu nành bằng nấm mốc Aspergillus oryzae. Đồng thời kết hợp enzyme papain với vi khuẩn Bacillus subtilis. Tìm những thông số tốt nhất của qui trình thủy phân bánh dầu đậu nành để sản xuất dịch đạm amin giàu dinh dưỡng và an toàn cho người sử dụng. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Sơ lược về đậu nành Đậu nành có tên khoa học là Glycine max Merli. Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau, trong đó đậu nành màu vàng là loại tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều. Hạt đậu nành có 3 bộ phận: Hình 1. Hạt đậu nành. - Vỏ hạt chiếm 8% trọng lượng hạt. - Phôi chiếm 2%. - Tử diệp chiếm 90%. - Hạt đậu nành có thành phần hóa học như sau: Bảng 1. Thành phần hóa học của hạt đậu nành. Thành phần Tỷ lệ Protein % Dầu % Tro % Hydratcacbon % 100,0 40,0 21,0 4,9 34,0 Tử diệp 90,3 43,0 23,0 5,0 29,0 Vỏ hạt 8,0 8,8 1,0 4,3 86,0 Phôi 2,4 41,1 11,0 4,4 43,0 Hạt đậu nành nguyên Trong thành phần của đậu nành, thành phần protein chiếm một tỷ trọng rất lớn. Thành phần acid amin trong protein của đậu nành ngoài hai thành phần methionin và tryptophan còn có các acid amin khác, có số lượng khá cao tương đương lượng acid amin có trong thịt. Bảng 2: Thành phần acid amin trong protein của đậu nành. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Acid amin Hàm lượng % Isoleucine 1,1 Leucine 7,7 Lysine 5,9 Methionine 1,6 Cystin 1,3 Phenylalanine 5,0 Treonine 4,3 Tryptophan 1,3 Valine 5,4 Histidine 2,6 Trong đậu nành globulin chiếm 85% – 95%. Ngoài ra còn có một lượng nhỏ albumin, một lượng không đáng kể prolamin và glutein. Hidrocarbon trong đậu nành chiếm 34% gồm 2 loại: loại tan và không tan trong nước. Loại tan trong nước chỉ chiếm khoảng 10% tổng lượng hidrocarbon. Bảng 3: Thành phần hidrocarbon trong đậu nành. Hidrocarbon Hàm lượng % Cellulose 4,0 Hemixenlulose 15,4 Starch 3,8 Raffinose 1,1 Saccarose 5,0 Các loại đường khác 5,1 Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% lượng chất khô. Trong đó, đáng chú ý nhất là Ca, P, Mn, Zn và Fe. Bảng 4: Thành phần khoáng chất trong đậu nành. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Chất khoáng Hàm lượng % Ca 0,16 – 0,47 P 0,41 -0,82 Mn 0,22 – 0,24 Zn 37 mg/kg Fe 90 – 150 mg/kg Ngoài ra, đậu nành có nhiều vitamin khác trừ vitamin C và D. Đậu nành là loại hạt nhiều chất dinh dưỡng. Chính vì thế đậu nành là nguồn thực phẩm quan trọng và được trồng rộng rải ở Trung Quốc, Mỹ, Braxin. ở Việt Nam, đậu nành được trồng nhiều ở các tỉnh phái Bắc và phía Nam. Trong công nghiệp thực phẩm, đậu nành được coi là một nguyên liệu quan trọng để sản xuất dầu thực vật và sản xuất các loại sản phẩm lên men. (Nguyễn Đức Lượng, 2001). 2.1.2 Bánh dầu đậu nành Bã đậu nành chính là sản phẩm phụ thu được sau khi đã ép đậu lấy dầu trong công nghiệp sản xuất dầu ăn. Bã đậu nành được ép thành bánh được gọi là bánh dầu đậu nành, trước khi sản xuất cần nghiền nhỏ ra đến 2-3 mm. (http://www.enviroment-safety.com) Nếu bành dầu nhỏ hơn 1% chất béo, tách dầu bằng dung môi hữu cơ. Còn nguyên liệu lớn hơn 2% chất béo, tách dầu bằng cách ép. Bên cạnh đó, thiết bị Hình 2. Bánh dầu đậu nành sản xuất phải đạt tiêu chuẩn an toàn lao động, không gây ô nhiễm môi trường và vệ sinh thực phẩm.(http://www.food.gov.uk) Bánh dầu đậu nành đang là nguồn đạm rất được quan tâm vì có hàm lượng protein cao khoảng 43 – 47%, protein của nó chứa tất cả các acid amin không thay thế. Bánh dầu đậu nành ly trích có thành phần acid amin khá cân bằng so với các loại hạt có dầu khác. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Bảng 5: Hàm lượng protein thô (CP) và thành phần các acid béo thiết yếu trong bánh dầu đậu nành ly trích bằng dung môi hữu cơ. CP Arg Cys His Leu Lys Met Phe Thr Trp Val % % % % % % % % % % % 45,8 3,2 0,67 2,5 3,4 2,9 0,6 2,2 1,7 0,6 2,4 (Kemllem và Church, 1998) Hiện nay bánh dầu đậu nành được dùng chủ yếu làm nguồn thức ăn trong chăn nuôi và chế biến nước chấm phục vụ cho con người. Với hàm lượng protein trong bánh dầu đậu nành khá cao nên bánh dầu đậu nành có thể được sử dụng làm nguồn cơ chất để tiến hành thủy phân cho ra hỗn hợp đạm dễ tiêu. Bảng 6: Các thành phần trong bánh dầu đậu nành. Protein (%) Chất béo (%) Xơ (%) Tro (%) Ẩm (%) 44 1 7 6 12 ( Lý Thị Thùy Trang, 2006). 2.1.3 Bột mì Bột mì có thành phần hóa học như sau: Bảng 7. Thành phần hóa học của bột mì. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Thành phần Hàm lượng (%) Nước 11,61 Gluxid 73,80 Protein 12,48 Lipid 1,78 0,48 (mg) Vitamin B1 PP 76 Ca 36 (Nguyễn Đức Lượng, 2001) 2.2 Sự thủy phân Theo Trần Bích Lam tại Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Miinh: Sự thủy phân protein là cơ sở của các phương pháp công nghệ chế biến nước tương. n H2O Protein n H2O pepton xt n H2O peptide xt acid amin xt Bản chất của sự thủy phân protein là sự thủy phân liên kết peptide. Do liên kết peptide là một liên kết mạnh, sự thủy phân xảy ra trong điều kiện có xúc tác. Tác nhân xúc tác hóa học là acid hoặc kiềm và tác nhân xúc tác sinh học là nhóm enzyme thủy phân protein có tên chung là protease. Trong chế biến, sự thủy phân protein được ứng dụng để thu nhận các sản phẩm thủy phân hoàn toàn hoặc thu nhận các sản phẩm thủy phân chưa hoàn toàn. Các sản phẩm thủy phân chưa hoàn toàn (Protein hydrolysates) hay bị đắng, nhất là khi nó được thủy phân bởi các protease của vi khuẩn. Vị đắng liên quan đến các peptid chứa các acid amin kỵ nước. Sản phẩm có vị đắng khi mức độ thủy phân chỉ đạt từ 4 – 40%. Vị đắng chỉ ảnh hưởng đến tính chất cảm quan, không ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng.(http://www.Tuoitre.com.vn) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Do đó, để đạt được sản phẩm thủy phân mong muốn cần kiểm soát được các yếu tố ảnh hưởng tới tốc độ thủy phân như: pH, nhiệt độ, tỷ lệ nước bổ sung và hàm lượng cơ chất... 2.2.1 Ảnh hưởng của pH pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme, do nó liên quan đến tương tác giữa enzyme và cơ chất. Phản ứng xúc tác phụ thuộc vào đặc tính của các nhóm chức hóa học phân bổ trên cả enzyme lẫn cơ chất, đặc biệt là trên phân tử enzyme. Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường. pH quá cao hay quá thấp có thể làm enzyme biến tính. Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định, gọi là pH tối thích. pH tối thích của mỗi enzyme không cố định, có thể thay đổi tùy theo nhiệt độ, tính chất và hàm lượng của cơ chất. Vì thế để đảm bảo cho quá trình thủy phân cần phải nghiên cứu tìm một giá trị pH thích hợp đảm bảo cho hoạt động của protease bổ sung thêm. 2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ Tốc độ phản ứng tăng theo nhiệt độ có nghĩa là nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng tăng nhưng đến mức nào đó thì tốc độ phản ứng giảm xuống do enzyme bị biến tính. Nhiệt độ ứng với vận tốc enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích. Nhiệt độ tối thích của các enzyme khác nhau thì chúng khác nhau. Thường nhiệt độ tối thích của enzyme có nguồn gốc thực vật cao hơn nguồn gốc động vật khoảng 50 – 60 0C, enzyme từ nguồn gốc động vật 37 – 500C. Protease chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định, nhiệt độ thích hợp với đa số protease nằm trong khoảng 40 – 500C. Ở nhiệt độ lớn hơn 70 0C đa số protease bị mất hoạt tính. Do vậy, trong quá trình sản xuất protein đậu nành cần nghiên cứu điều kiện nhiệt độ thích hợp trong quá trình thủy phân. 2.2.3 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme và cơ chất Khi có đầy đủ cơ chất hàm lượng enzyme tăng thì mức độ thủy phân sẽ tăng. Khi giới hạn cơ chất thì tốc độ phản ứng của enzyme cũng bị giới hạn. Trong quá trình thủy phân, sản phẩm sinh ra có thể ức chế hoạt động của enzyme. Nếu tăng hàm lượng protease bằng hoặc hơn hàm lượng cơ chất thì vận tốc của quá trình thủy phân cũng không tăng. Mặt khác, khi tăng hàm lượng protease sẽ làm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT tăng giá thành của sản phẩm nên cần nghiên cứu chọn một hàm lượng enzyme phù hợp cho quá trình thủy phân. 2.2.4 Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc Trong quá trình thủy phân một yếu tố thúc đẩy quá trình thủy phân là diện tích tiếp xúc. Ta đã biết rằng, enzyme là chất xúc tác sinh học có tác dụng tích cực trong việc thủy phân protein để cho sản phẩm cuối cùng là acid amin. Để tạo điều kiện tốt hơn cho thủy phân của enzyme là tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Muốn vậy phải gây biến tính cơ chất trước khi thủy phân nhằm làm tăng khả năng tiếp cận của enzyme với các liên kết cần phân cắt trên phân tử cơ chất. 2.2.5 Ảnh hưởng của thời gian Theo một số nghiên cứu thì mức độ thủy phân tăng vọt trong thời gian đầu của phản ứng, sau đó tốc độ phản ứng chậm lại. Thời gian thủy phân dài hơn và sử dụng lượng enzyme lớn hơn thì mức độ thủy phân cao hơn. 2.2.6 Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung Nước là môi trường thuận lợi cho quá trình thủy phân protein bằng protease nhưng nước cũng làm tăng khả năng hoạt động của vi sinh vật. Do đó, trong quá trình thủy phân nếu bổ sung nước với tỷ lệ thấp thì hạn chế sự hoạt động của vi sinh vật nhưng đồng thời cũng hạn chế sự hoạt động của protease làm giảm hiệu suất thuỷ phân. Nhưng nếu bổ sung nước với tỷ lệ cao thì sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật hoạt động làm ảnh hưởng đến chất lượng protein đậu nành. Vì vậy, cần chọn được tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân. Như vậy, có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân trong sản xuất protein đậu nành bằng phương pháp sử dụng protease. Vì vậy, cần phải chọn ra được những nhân tố thích hợp và phối hợp chúng để quá trình sản xuất đạt hiệu quả cao. (Lý Thị thùy Trang, 2006) 2.2.7 Ảnh hưởng của hàm lượng muối Muối ăn có tác dụng kiềm hãm sự hoạt động của vi sinh vật gây thối rửa, nhưng sử dụng với một lượng cao thì phản ứng thủy phân rất chậm. Do đó ta phải chọn lựa hàm lượng muối thích hợp để hiệu suất thủy phân cao. 2.2.8 Ảnh hưởng của vi khuẩn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Mật số vi khuẩn khác nhau sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân. Mật số vi khuẩn cao sẽ thúc đẩy tốc độ thủy phân cơ chất nhanh hơn. Nhưng mật số vi khuẩn cao hay thấp đều ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân. Khi mới đưa vào môi trường thủy phân, đây là giai đoạn vi khuẩn làm quen với môi trường và chuẩn bị cho sự tăng trưởng, hoạt động vượt bậc sau đó. Khi đã quen với môi trường mới, vi khuẩn đã bắt đầu nhân mật số lên với vận tốc rất nhanh theo cấp số nhân. Đến một lúc nào đó mật số vi khuẩn không tăng thêm mà giữ ổn định ở một mức trong giới hạn nhất định. Tuy nhiên, hoạt động thủy phân còn tác dụng sau đó nhờ enzyme sản sinh trong quá trình biến dưỡng. Protein đậu nành được chuyển hóa thành acid amin. (Phan Thiên Tùng, 2006). 2.3 Nghiên cứu bổ sung vi sinh vật 2.3.1 Vi khuẩn (VK) Bacillus subtilis  Đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis Phân loại khoa học: Bacillus subtilis thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillates Họ: Bacillaceae Hình 3. Vi khuẩn Bacillus subtilis Giống: Bacillus (http://www.waterscan.rs/images/virusibakterije//Bacillus%20subtilis.jpg ). Loài: Subtilis Bacillus subtilis là trực khuẩn gram dương, sinh bào tử, chiều ngang của bào tử không vượt quá chiều ngang của tế bào. Vì thế khi tạo thành bào tử, tế bào không thay đổi hình dạng, chúng thường thuộc loại hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Bacillus subtilis có thể kết thành chuổi dài ngắn khác nhau và tế bào có thể đứng riêng rẽ. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 36 – 50oC tối đa khoảng 60oC. Bào tử chịu nhiệt khá cao và có thể giữ sức sống từ vài năm đến vài chục năm (Đào Minh Thi, 2008). Chủng vi khuẩn này có khả năng thủy phân cao tạo thành các acid amin không tích tụ trong tế bào mà tiết ra môi trường xung quanh được dùng làm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT giống nuôi ở các thùng lên men trong công nghiệp sản xuất acid amin (Lương Đức Phẩm, 1988).  Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi khuẩn Nước: chiếm khoảng 80 – 90% trọng lượng vi khuẩn, tất cả những phản ứng hóa học trong cơ thể sống xảy đều cần có nước. Hơn nữa nước phải pha lỏng và ở vùng sinh động học, mới có hoạt tính. Oxy: Bacillus là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí không bắt buộc nên tương đối dễ thích nghi với điều kiện nuôi cấy trong môi trường lỏng bằng cách tạo trên bề mặt môi trường một lớp ván khuẩn lạc (Đào Minh Thi, 2008).  Sự tiết enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis Bacilus subtilis là chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất protease với hoạt tính cao được phân lập từ tự nhiên. Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid (- CO – NH -) trong phân tử protein hoặc các polypeptid, tạo thành các acid amin tự do hoặc các peptid phân tử thấp. Nhiều protease được chiết xuất từ các vi khuẩn, đặc biệt Bacillus thuộc nhóm serine protease. Serine protease gồm serin hay alkaline protease cần có nhóm – OH trong tâm hoạt động. Nhóm protease này hoạt động ở pH kiềm, thường khoảng 7,5 – 10,5. Trypsin là enzyme đại diện cho nhóm này (Nguyễn Phú Thọ, 2009). 2.3.2 Nấm mốc Aspergillus oryzae  Đặc điểm nấm mốc Aspergillus oryzae Phân loại khoa học: Aspergillus oryzae thuộc: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Aspergilus Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Loài: A. oryzae Aspergillus oryzae là một loại nấm vi thể, cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Aspergillus oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Aspergillus oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau… Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới (Trần Duy Tiến, Mai Hoàng Vũ và Nguyễn Quốc Cường, 2008).  Yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của nấm mốc Aspergillus oryzae Protease nấm mốc có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease của vi khuẩn. Protease của nấm mốc Aspergillus oryzae hoạt động trong khoảng pH 3,5 – 9. Dựa vào khoảng pH hoạt động, người ta chia protease ra làm ba loại: + Loại acid hoạt động vùng pH 2,5 – 3. + Loại trung tính hoạt động ở pH 6 – 7,5. + Loại kiềm hoạt động trong khoảng pH 8 – 11. (Lương Đức Phẩm, 1998) Bảng 8. Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc Aspergillus oryzae Độ ẩm pH môi trường 45% – 55% 5,5 – 6,5 Độ ẩm không khí Nhiệt độ nuôi Thời gian 85% – 95% 27oC – 30oC 30 – 36 giờ (Nguyễn Đức Lượng, 2001) 2.4 Enzyme papain 2.4.1 Đặc điểm của papain Được tách từ nhựa trái đu đủ xanh, papain thuộc nhóm enzyme thủy phân có nguồn gốc từ thực vật được nghiên cứu nhiều nhất về tính chất và cơ chế hoạt động, là Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT protease có hàm lượng cao nhất tới 95% tổng hàm lượng protease có trong nhựa đu đủ và là enzyim có ý nghĩa quan trọng nhất. 2.4.2 Tính chất của enzyme papain  Tính chất vật lý và hóa học Trọng lượng phân tử: 23.000 (Dreuth et al. 1968) Papain là một chuổi peptid mạch đơn chứa 211 đơn vị acid amin cuộn lại thành hai phần tạo một khe hở. Mủ đu đủ sau khi sấy có màu vàng hay nâu phụ thuộc vào phương pháp sấy. Cấu trúc không gian ba chiều của papain được giới thiệu bởi Wolthers ctv, 170. Nhóm – SH tự do trong phân tử là nhóm chức năng papain (Nguyễn Phú Thọ, 2009). Hình 5. Cây đu đủ. Bảng 9. Một số tính chất vật lý của papain Điểm đẳng điện pI = 8.75 Hằng số lắng S20 2.42 ± 0.04 Hằng số phân tán D20 (10-7sec.cm2) 10.27 ± 0.13 Độ truyền quang 66.7 o Độ xoắn 17% Thể tích riêng phần V(ml/g) 0.724 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Bảng 10. Thành phần amino acid của papain Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Amino acid Trường ĐHCT Số lượng Amino acid Số lượng Alanine 13 Lycine 9 Arginine 10 Phenylalanine 4 Aspartic acid 17 Proline 9 Half - cysteine 6 Serine 11 Glutamic acid 17 Theronine 7 Glycine 23 Tryptophan 5 Histidine 2 Tyrosine 17 Isoleucine 10 Valine 15 Leucine 10 Methionine 0 Tổng cộng: 185 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Thành phần chính của papain chưa được hoạt hóa là hỗn hợp protein disulfurcysteine. Khi hoạt hóa papain bằng KCN sẽ giải phóng ra nhóm thiol của enzyme và β-thio cyanatalnine do sự tương tác giữa cyanur và cysteine. Sau đó, β-thio cyanatalnine khép vòng tạo thành α-iminotiazolidin. Khi có oxy không khí, cơ chế trên xảy ra theo chiều ngược lại, tức là cysteine kết hợp với nhóm sulfurhydride của papain hoạt hóa tạo thành sản phẩm không hoạt hóa. Quá trình hoạt hóa papain không làm thay đổi cấu trúc không gian của nó.  Hoạt tính enzyme và cơ chế tác dụng So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác, papain có khả năng thủy phân sâu hơn. Vì vậy, nó được dùng để thủy phân tiếp các pepetide còn lại sau khi đã thủy phân bằng trypsin hay chymotrypsin. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng, papain có khả năng thủy phân hầu hết các peptide trừ các liên kết với proline và với các glutamic acid có nhóm carboxyl tự do. Khả năng thủy phân cơ chất của papain còn tùy thuộc vào trạng thái của cơ chất, tức là cơ chất bị biến tính hay không. Nếu cơ chất bị biến tính thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn. Giống như các protease serine khác như chymotrypsin hay Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT trypsin, papain có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân các dẫn xuất acyl. Phản ứng được tiến hành như sau: (1) RCOX + pap–SH  pap–S–C–R + HX (2) pap–S–C–R + H2O  pap–SH + R–COOH Tính ái nhân của phân tử sulfur và nhóm – SH mạnh hơn oxygen và được tăng lên nhiều nhờ hệ thống histidine-asparagine mặc dù ảnh hưởng của nó không rộng như hệ thống histidine-asparagine trong cơ chế enzyme chymotrypsin. Nhờ đó mà nó thúc đẩy phản ứng thủy phân xảy ra dễ dàng hơn do carbon của cơ chất có khuynh hướng phản ứng với những nguyên tử có tính ái nhân: I _ s Enzyme có thể nhận biết chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình. Enzyme sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên chuỗi có phenylalanine ở vị trí P2 như hình sau: Hình 6. Sự sắp xếp tương ứng của enzyme và chuỗi gồm 7 gốc amino acid của cơ chất (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Các amino acid được nhận biết nằm ở trên và ở dưới điểm thủy phân được ký hiệu bằng Pi và P’i; còn Si và S’i … (i = 1, 2, 3, 4) là các vùng tương ứng trên phân tử enzyme, do đó các peptide kiểu như X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì sẽ được cắt tại vị trí giữa Y và Z. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Bảng 11. Hoạt tính thủy giải protein của chế phẩm papain Việt Nam Chế phẩm Hoạt tính protease (UI/mg) Hoạt tính amidase (UI/mg) Thương mại (Merk) 19,9 1,5 Đông khô (VN) 53,5 3,1 Tươi (VN) 42,2 1,9 (Nguyễn Đức Lượng, 2004)  Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Papain cần nhóm sulfhydryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc tác. Chất hoạt hóa có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của protease thực vật nói chung hay papain nói riêng. Do trung tâm hoạt động của papain gồm cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hóa papain là chất có tính khử như: cysteine, glutation acid, hydrocyanic, hydrogensulfite, sodiumthiosulfate… trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. Khi có mặt các chất này thì nhóm – SH ở trung tâm hoạt động của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Sự hoạt hóa càng được tăng cường khi có sự hiện diện của các chất có khả năng liên kết với kim loại EDTA. Cơ chế của sự hoạt hóa là: Các chất có khả năng tương tác với nhóm sulfhydryl như: các kim loại nặng, các chất cacbonyl sẽ gây ức chế hoạt động của papain (Morihara, 1967). Các chất này ức chế hoạt tính của papain bằng cách phản ứng với nhóm – SH ở trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó. Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, O3, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide. Các tác nhân aldehyde như phenyl hydrazine, hydroxylamine,… cũng ức chế papain. Điều đáng chú ý là papain rất bền đối với các tác nhân biến tính Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT như dung môi hữu cơ hay được dùng trong hóa học protein (độ quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6 – 8 M/l. Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC. Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5 oC và nếu tăng nhiệt độ cao hơn (>100oC) thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch. Điều này là do ở dạng dung dịch ta tăng nhiệt độ lên đến nhiệt độ >100 oC thì cấu trúc tâm hoạt động của enzyme bị phá hủy hoàn toàn. Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5 – 8.5 nhưng dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trường mạnh pH > 12. Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau. Chẳng hạn papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7 – 7.5, albumin ở pH tối ưu 4.5 – 7.1 và với gelatin lại có pH tối ưu 5.2 – 6 và 6.4. Điểm đẳng điện pI = 9. Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được ổn định, có thể chịu được các pH = 1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút. (Dương Thị Hương Giang, Nguyễn Xuân Dung và Phan Bích Trâm, 2006). CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Phương tiện 3.1.1 Nguyên liệu - Bánh dầu đậu nành được mua tại cửa hàng thức ăn gia súc trong thành phố Cần Thơ. - Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae được cung cấp bởi phòng Công Nghệ Sinh Học Thực Phẩm - Viện nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại học Cần Thơ. - Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được cung cấp từ cơ sở của PGS.TS Nguyễn Văn Bá. - Muối ăn (NaCl) mua ở chợ Xuân Khánh- Cần Thơ. - Bột mì mua ở chợ Xuân Khánh- Cần Thơ. - Mủ đu đủ được lấy ở Ô Môn – Cần Thơ. 3.1.2 Thiết bị và hóa chất Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 16 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học