Tài liệu Nghiên cứu thu thập và lưu trữ nguồn gen của cây thất diệp nhất chi hoa (paris polyphylla sm.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NÔNG LỆ THÙY NGHIÊN CỨU THU THẬP VÀ LƢU TRỮ NGUỒN GEN CÂY THẤT DIỆP NHẤT CHI HOA (PARIS POLYPHYLLA SM.) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. VŨ THỊ THU THỦY THÁI NGUYÊN - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ cho bất kỳ một học vị nào. Tác giả NÔNG LỆ THÙY i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Thị Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Chu Hoàng Mậu, Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học và các thầy cô giáo, cán bộ của Khoa, sự giúp đỡ tận tình của TS. Nguyễn Thị Thu Ngà, KTV Trần Thị Hồng đã giúp tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ về kinh phí của đề tài NCKH cấp Bộ có mã số - - - Sinh họ ủ trì. - Tôi xin cảm ơn sự động viên của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn. Tác giả NÔNG LỆ THÙY ii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan ........................................................................................................ i Lời cảm ơn ........................................................................................................... ii Mục lục ...............................................................................................................iii Danh mục các bảng.............................................................................................. v MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. Đặc điểm chung về cây Thất diệp nhất chi hoa ............................................ 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ............................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm nông sinh học ............................................................................ 4 1.1.3. Thành phần hóa học và công dụng ............................................................ 5 1.1.4. Một số bài thuốc sử dụng cây Thất diệp nhất chi hoa ............................... 7 1.2. Một số phương pháp định danh thực vật ...................................................... 8 1.3. Một số phương phương pháp lưu trữ và bảo tồn giống cây trồng ................... 10 1.3.1 Bảo tồn nội vi( in – situ) ........................................................................... 11 1.3.2 Bảo tồn ngoại vi (Ex – situ) ...................................................................... 12 1.3.3 Bảo tồn giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro ......................................... 13 1.3.3.1 Cơ sở lý luận của phương pháp bảo quản và nhân giống in vitro ......... 13 1.3.3.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy in vitro .............................................. 15 1.3.3.3. Các đường hướng trong nhân giống in vitro ........................................ 18 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 22 2.1. Vật liệu nghiên cứu..................................................................................... 22 2.1.1. Vật liệu..................................................................................................... 22 iii 2.1.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................................... 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 23 2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu ...................................................................... 23 Thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa trong tự nhiên, mô tả và chụp ảnh....... 23 2.2.2. Phương pháp bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa tại Thái Nguyên ........ 23 2.2.3. Phương pháp phân lập gen rpoC1 ........................................................... 23 2.2.4. Phương pháp nuôi cấy in vitro ................................................................ 24 2.2.5. Phương pháp xử lí số liệu ........................................................................ 26 2.3. Địa điểm tiến hành thí nghiệm ................................................................... 26 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................... 27 3.1. Kết quả thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại một số tỉnh miền núi phía Bắc của Việt Nam ...................................................................................... 27 3.1.1. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Bình GiaLạng Sơn ........................................................................................................... 27 3.1.2. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Quản BạHà Giang ............................................................................................................ 29 3.1.3. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Sa Pa- Lào Cai 30 3.2. Kết quả phân tích gen rpoC1 của cây Thất diệp nhất chi hoa .................... 32 3.3. Kết quả nghiên cứu bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa trồng tại tỉnh Thái Nguyên34 3.4. Kết quả bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa in vitro ................................... 37 3.4.1. Kết quả khử trùng mẫu ............................................................................ 37 3.4.2. Kết quả thăm dò môi trường nảy mầm và phát sinh hình thái của các mẫu nghiên cứu.......................................................................................................... 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 47 iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4 Dichlorphenoxyacetic acid Cs Cộng sự CT Công thức ĐHST Điều hòa sinh trưởng IBA Indole-3-buttyric acid BAP 6-Benzylaminopurine IAA Indole - 3 - acetic - acid MS Murashige and Skoog NAA 1-Naphthalene acetic acid GA3 Gibberellic acid DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Mẫu cây thu được tại huyện Bình Gia - Lạng Sơn ........................... 27 Bảng 3.2. Số lượng mẫu Thất diệp nhất chi hoa thu tại Hà Giang.................... 29 Bảng 3.3. Số lượng mẫu Thất diệp nhất chi hoa thu tại Sa Pa .......................... 31 Bảng 3.4. Tên loài và mã số trình tự gen rpoC1 ............................................... 33 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giá thể tới tỉ lệ sống của cây Thất diệp nhất chi hoa..... 35 Bảng 3.6. Đặc điểm sinh trưởng của cây Thất diệp nhất chi hoa trong phòng sinh trưởng tại Thái Nguyên. ............................................................................. 36 Bảng 3.7. Kết quả khử trùng hạt cây Thất diệp nhất chi hoa ............................ 38 Bảng 3.8. Kết quả khử trùng lá cây Thất diệp nhất chi hoa .............................. 40 Bảng 3.9. Kết quả khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa .................................... 41 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các chất ĐHST đến hệ số nảy mầm của củ ........... 44 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình thái cây Bảy lá một hoa................................................................... 3 Hình 3.1. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại Hồng Phong - Bình Gia - Lạng Sơn ........ 28 Hình 3.2. Mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại xã Hội Hoan, huyện Bình Gia .. 28 Hình 3.3. Mẫu củ thu được tại Quản Bạ - Hà Giang ......................................... 29 Hình 3.4. Quả và hạt cây Thất diệp nhất chi hoa thu tại Hà Giang ................... 30 Hình 3.5. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại Sa Pa ................................................. 31 Hình 3.6. Cây Thất diệp nhất chi hoa trong phòng sinh trưởng của cây in vitro tại Thái Nguyên ................................................................................................. 37 Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm nhân gen rpoC1 ....................................... 32 ất diệp nhất chi hoa ..... 34 rpo ệt Nam ............................................................................... 34 Hình 3.9. Mẫu hạt sạch cây Thất diệp nhất chi hoa cấy trên môi trường MS cơ bản.. 39 Hình 3.10. Mẫu sạch khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa ............................... 42 Hình 3.11. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến sự phát sinh hình thái mô lá. ........ 43 Hình 3.12. Mẫu sạch từ củ cây Thất diệp nhất chi hoa trên môi trường MS có bổ sung thêm các chất kích thích sinh trưởng ................................................... 44 Hình 3.13. Mẫu củ bật chồi có bổ sung BAP 0,5mg/l + Than hoạt tính ........... 45 Hình 3.14. Mẫu củ bật chồi bổ sung BAP 0.5mg/l ........................................... 45 vi MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Thất diệp nhất chi hoa có tên khoa học là Paris polyphylla Sm., hay còn gọi là cây Bảy lá một hoa, độc cước liên, thiết đăng đài, chi hoa đầu, tảo hưu, thảo hà xà…[9]. Chi Paris gồm 27 loài phân bố rộng khắp ở Châu Âu và Châu Á trong đó tập trung nhiều nhất ở Trung Quốc. Chi Paris gồm các loài từ 03lá đến 11 lá. Loài Paris Polyphylla có 13 giống [52]. Tại Việt Nam, cây Thất diệp nhất chi hoa được phát hiện tại các vùng núi Cúc Phương (Ninh Bình), Sapa (Lào Cai), Đà Bắc (Hòa Bình), Hà Giang, Lạng Sơn, Lai Châu… Cây Thất diệp nhất chi hoa được Pectelot phát hiện đầu tiên vào năm 1934 tại Sapa với nhiều loài khác nhau [9]. Theo y học cổ truyền, cây Thất diệp nhất chi hoa có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, trị rắn cắn, trị viêm tuyến vú, trị sốt rét, trị ho lâu ngày [9]. Trong những năm gần đây, cây Thất diệp nhất chi hoa còn được phát hiện có tác dụng diệt khuẩn, kháng viêm mạnh, ức chế các virus, tăng cường chức năng của tuyến thượng thận, an thần, trấn tĩnh, chống ho. Đặc biệt, cây có tác dụng ức chế tế bào ung thư phổi và ung thư dạ dày, kéo dài tuổi thọ cho người bệnh [11], [42], [43], [46]. Với nhiều tác dụng chống lại bệnh nên cây Thất diệp nhất chi hoa đang là đối tượng được thu mua và khai thác với số lượng lớn. Bên cạnh đó, nạn phá rừng làm nương rẫy dẫn đến giảm khả năng tái sinh và phân bố của cây Thất diệp nhất chi hoa trong tự nhiên bị thu hẹp. Theo phân hạng về độ góc bảo tồn, cây Thất diệp nhất chi hoa được xếp hạng EN A1 c,d, và cấp đánh giá ở mức hiếm (R). Cây cũng được khuyến cáo khai thác, sử dụng hợp lí và cần thiết phải lưu giữ và bảo vệ nguồn gen [6]. Việc lưu giữ và bảo tồn giống cây trồng có thể được thực hiện bằng nhiều cách khác nhau như: bảo tồn tại chỗ, bảo tồn chuyển chỗ và bảo tồn in vitro. Công tác tái sinh và nhân giống vô tính cây Thất diệp nhất chi hoa đã được thực 1 hiện tại một số tỉnh miền núi phía bắc Việt Nam như: Hà Giang, Sơn La, Lai Châu. Tuy nhiên, kết quả tái sinh cây chưa được như mong muốn. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thu thập và lƣu trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) nhằm bảo tồn nguồn gen và phục vụ cho công tác phục tráng giống sau này. 2. Mục tiêu nghiên cứu Thu thập được một số cây Thất diệp nhất chi hoa ở một số miên núi phía Bắc Việt Nam Bước đầu sử dụng được kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu định loại mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa . Lưu trữ được một số mẫu cấy Thất diệp nhất chi hoa trong phòng sinh trưởng và nuôi cấy in vitro. 3. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm và thu thập mẫu của Thất diệp nhất chi hoa ở một số địa phương miền núi phía Bắc Việt Nam. Phân lập và xác định trình tự nucleotit của gen rpoC1 Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh trưởng của cây Thất diệp nhất chi hoa trong phòng sinh trưởng cây in vitro của phòng công nghệ tế bào tại trường Đại học sư phạm Thái Nguyên. Nghiên cứu bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm chung về cây Thất diệp nhất chi hoa 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Cây Thất diệp nhất chi hoa có tên khoa học là Paris polyphylla Sm., hay còn gọi là Bảy lá một hoa, độc cước liên, thiết đăng đài, chi hoa đầu, tảo hưu, thảo hà xà [9]. Theo trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, cây Thất diệp nhất chi hoa được phân loại thuộc giới thực vật; ngành thực vật có hoa, mộc lan, hạt kín; lớp một lá mầm; bộ củ nâu; họ trọng lâu; chi Paris Hình 1.1. Hình thái cây Bảy lá một hoa [60] [54]. Chi này gồm có 27 loài, loài Paris Polyphylla gồm 13 giống có dị thảo từ 3 - 11 lá [52]. Cây Thất diệp nhất chi hoa được tìm thấy đầu tiên ở độ cao 1500 - 3000m tại dãy núi Hymalaya (Ấn Độ) và được Smith miêu tả lần đầu vào năm 1813 [9]. Trên thế giới, cây phân bố ở Trung Quốc (bao gồm An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Giang Tây, Tứ Xuyên...), Ấn Độ, Nepal và Myanma [25]. Tại Việt Nam, cây Thất diệp nhất chi hoa được tìm thấy ở các vùng núi Cúc Phương (Ninh Bình), Sapa (Lào Cai), Đà Bắc (Hòa Bình), Hà Giang, Lạng Sơn, Lai Châu… Cây Thất diệp nhất chi hoa được Pectelot phát hiện đầu tiên vào năm 1934 tại Sapa với nhiều loài khác nhau [9]. Theo nghiên cứu của Pectelot, ở nước ta ít nhất có 5 loài khác nhau, trong đó có 3 loài được mô tả khá kĩ. Loài thứ nhất có tên khoa học là Paris delavayi Franch. Cây của loài Paris delavayi Franch có thân gầy, cao chừng 1m, cành lá khoảng 2/3 phía trên thân. Lá dài chừng 20cm, rộng khoảng 3,5cm, có 3 gân xuất phát từ cuống lá, gân giữa rõ hơn, gân hai bên chạy cách theo mép lá chừng 5mm. Cuống lá dài 3 khoảng 2cm, phiến lá hình mác dài, đầu lá và cuống lá nhọn. Cánh tràng hình sợi. Lá đài nhỏ hơn lá thật, dài khoảng 4 - 4,5cm, rộng khoảng 8mm. Thường thấy mọc ở độ cao khoảng 1.400m đến 1.800m, trong những rừng ẩm ở Sapa (Lào Cai). Loài này ra hoa vào tháng 4, kết quả vào tháng 6 hoặc tháng 7 [9]. Loài thứ 2 có tên khoa học Paris hainanensis. Loài này có thân cây to, cao chừng 0,80m. Lá tập trung thành vành, gồm 6 lá, ở vào khoảng 2/3 ở phía trên thân. Lá dài khoảng 20cm, rộng khoảng 12cm. Đầu lá nhọn, hình ba cạnh dài 1cm. Cuống lá dài tới 7cm, phiến lá hình trứng rộng, hơi không đối xứng. Lá đài khoảng 5cm, rộng khoảng 2cm. Cánh tràng hình sợi, dài gấp 2 lần lá đài. Loài Paris hainanensis ra hoa vào tháng 4, đậu quả vào tháng 6, loài này hay gặp hơn ở những vùng rừng ẩm, thấp quanh Sapa, độ cao chừng 1500m [9]. Loài thứ 3 được gọi là Paris fargessi Franch. Thân của loài này cao chừng 1m đến 1,3m. Vành lá cũng ở khoảng 2/3 phía trên thân, gồm 5 lá. Cuống lá dài khoảng 5 - 5,5cm, phiến lá hình bầu dục, phía cuống hình tim, đầu lá nhọn, lá có 5 gân. Lá đài hình mác, dài khoảng 6cm, rộng khoảng 1,2cm. Cánh tràng hình sợi, ngắn hơn lá đài. Cây ra hoa vào tháng 4, kết quả vào tháng 6. So với các loài trên, loài Paris fargessi Franch hiếm hơn [9]. Trong số 2 loài Paris chưa xác định được tên, có một loại cao tới 2,5m. Petelot phát hiện thấy 2 cây nhỏ trên đường từ Sapa (Lào Cai) đến Bình lư (Tam Đường – Lai Châu) [9]. Loại thứ 2 được phát hiện ở độ cao 400m vùng núi Ba Vì (Hòa Bình) và trên bờ suối có nhiều bóng rợp, khoảng giữa từ Hà Nội đến Hòa Bình [9]. 1.1.2. Đặc điểm nông sinh học Cây Thất diệp nhất chi hoa là một loại cây nhỏ, sống lâu năm. Cây thường mọc hoang ở những khe núi ẩm ướt, có độ cao trên 600m và ưa bóng, hoặc dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều mùn. Phần thân trên mặt đất, lụi hàng năm vào cuối thu. Thân rễ mang 1 - 2 chồi ngủ tồn tại qua mùa 4 đông và mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau. Trong tự nhiên, thường chỉ những cây lớn có chiều dài thân rễ trên 5cm mới thấy có hoa, quả [25]. Cây Thất diệp nhất chi hoa ưa nơi có khí hậu mát, ít gió, nhưng không chịu được úng. Cây chưa được trồng trên quy mô lớn mà chỉ ở phạm vi các vườn cây thuốc tại một số địa phương theo phương thức nhân giống bằng hạt hoặc bằng thân rễ. Theo đó, hàng năm vào khoảng tháng 10 - 11, người ta thu quả chín, đem gieo trong vườn ươm hoặc phơi khô để đến mùa xuân năm sau mới reo. Mỗi cây chỉ có một hoa, mỗi hoa chỉ có ít hạt nên hệ số nhân giống bằng hạt không cao. Thân rễ Thất diệp nhất chi hoa có nhiều đốt chứa mắt ngủ, có thể tách từng đoạn để trồng. Thời vụ trồng chủ yếu là mùa xuân và mùa thu [25]. Theo Đỗ Tất Lợi, ở Việt Nam cây Thất diệp nhất chi hoa được mô tả là những cây có thân rễ ngắn, dài chừng 5 - 15cm, đường kính 2,5 - 5cm rất nhiều đốt, khó bẻ, vết bẻ trông như có bột, màu vàng trắng hay xám vàng. Từ thân rễ nổi lên mặt đất một thân mọc thẳng đứng cao tới 1m, phía gốc có một số lá thoái hóa thành vẩy, bao lấy thân. Giữa thân có một tầng lá mọc vòng, gồm 3-10 lá, nhưng thường là 7 lá. Cuống lá dài 2,5 - 3cm, phiến lá hình mác rộng, dài 15- 21cm, rộng 4 - 8cm. Đầu phiến lá nhọn, mép lá nguyên, hai mặt lá nhẵn, mặt dưới màu xanh nhạt, đôi khi có màu tím nhạt. Hoa mọc đơn độc ở đỉnh cành, cuống hoa dài 15 - 30cm. Số cánh tràng bằng số lá đài, hình sợi rủ xuống, màu vàng nâu. Chiều dài của cánh tràng bằng hay ngắn hơn chiều dài của lá đài. Nhụy màu đỏ tím, bầu thường gồm 3 ngăn. Quả mọng, màu tím đen. Ở Sapa, cây ra hoa vào các tháng 3, 4, 5 và tạo quả vào các tháng 10 - 11 [9]. Người ta thường dùng thân rễ với tên Tảo hưu. Có thể thu hái Tảo hưu quanh năm, nhưng tốt nhất là vào thu đông, tảo hưu được đào về rửa sạch và phơi khô [9]. 1.1.3. Thành phần hóa học và công dụng Bộ phận làm thuốc của cây Thất diệp nhất chi hoa là thân rễ. Theo đông y, Tảo hưu có vị ngọt, hơi cay, tính bình, không độc. Tác dụng chủ yếu của Tảo hưu là thanh nhiệt, giải độc, điều trị rắn độc cắn, trị viêm tuyến vú, 5 trị sốt rét, trị ho lao, trị ho lâu ngày, trị hen xuyễn... Nếu dùng ngoài da thì đắp lên những nơi sưng đau [9]. Các công trình nghiên cứu y học hiện đại đã tìm thấy trong cây Thất diệp nhất chi hoa có chất glicozit. Đặc biệt loại glucozit có lợi cho sức khỏe được kể đến như tinh chất saponin (gọi là paridin C16H28O7) và tinh chất paristaphin (C38H64O18) [9], [32]. Ở Nepal, Devkota (2005) đã cô lập được 6 hợp chất từ Paris polyphylla. Các hợp chất là: przewalskinone B, polyphyllin C, polyphyllin D, saponin-1, stigmasterol và stigmasterol-3-O-P-D-glucoside [33]. Theo đó, nghiên cứu của Lee và cộng sự (2005), hợp chất polyphylin D của cây Thất diệp nhất chi hoa có thể được sử dụng trong điều trị ung thư vú [40]. Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy, các hợp chất saponin của cây Thất diệp nhất chi hoa gây ức chế sự tăng trưởng của khối u của bệnh ung thư phổi trên chuột thử nghiệm và gây độc đối với các dòng tế bào ung thư của người như dòng tế bào ung thư dạ dày [41], hay các dòng tế bào ung thư phổi A549 [42]. Dòng tế bào ung thư đại tràng (LoVo và W-116), dòng tế bào ung thư thực quản (ECA 109) hay các bệnh ung thư đường tiêu hóa nói chung [50]. Năm 2008, Deng và cộng sự đã đánh giá hoạt tính kháng nấm của saponin từ cây Thất diệp nhất chi hoa với Cladosporium cladosporioides và loài Candida. Kết quả cho thấy, saponin có hoạt tính kháng nấm. Hoạt tính này được đem so sánh với một số thuốc thương mại, từ đó đưa ra một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các loại thuốc tổng hợp [32]. Năm 2005, Wang đã nghiên cứu thấy 2 hợp chất steroid là dioscin và polyphyllin D có tiềm năng là tác nhân chống lại ký sinh trùng Dactylogyrus [50]. Năm 2012, Li và cộng sự đã phân lập được bốn hợp chất saponin steroid mới đó là parisyunnanasides G-J và 3 hợp chất đặc biết của Paris polyphylla var. Yunnanensis là padelaoside B, pinnatasterone, và 20-hydroxyecdyson. Tất 6 cả các hợp chất trên được đánh giá có khả năng gây độc chống lại tế bào ung thư bạch cầu CCRF của người [41]. Ngoài ra, cây Thất diệp nhất chi hoa còn có tác dụng trong điều trị các rối loạn về da liễu [9], hoạt động co cơ tử cung trên chuột thí nghiệm [36], hoạt động diệt tinh trùng có hiệu quả ở chuột, thỏ và người. Vì vậy, có thể sử dụng làm thuốc tránh thai [9]. Wang (2005) cho rằng Paris polyphylla var yunanensis ở dạng thô có thời gian làm đông máu nhanh hơn so với Paris polyphylla chinensis và chứng tỏ thành phần saponin 6 (một nhóm pennogennin) trong những loài này là thành phần chính trong thuốc dùng để cầm máu [50]. 1.1.4. Một số bài thuốc sử dụng cây Thất diệp nhất chi hoa Hiệu quả làm thuốc của cây Thất diệp nhất chi hoa đã được thực hiện với nhiều bài thuốc quý được sử dụng trong dân gian để chữa rắn cắn, ho hen... Sau đây xin giới thiệu một số bài thuốc hay bằng cách sử dụng cây Thất diệp nhất chi hoa để điều trị như: * Chữa rắn độc cắn: Dùng 6g bột cây Thất diệp nhất chi hoa sắc uống 1 lần và uống 2 đến 3 lần trong một ngày. Hoặc có thể sắc 20g cây Thất diệp nhất chi hoa lấy nước uống trong ngày. Nếu dùng thân rễ tươi thì giã nát, sau đó trộn với rượu trắng đắp vào chỗ bị rắn cắn, cách chữa này không kể liều lượng [59]. * Chữa sốt cao co giật, quai bị, sởi: Trộn 4g bột khô của cây Thất diệp nhất chi hoa với 12g bạc hà và 8g thiên hoa phấn sắc lấy nước uống. Chia làm 3 lần uống trong ngày sẽ chữa được sốt cai, co giật, quai bị, sởi. * Chữa trẻ nhỏ kinh sài, chân tay co giật: Dùng bột Thất diệp nhất chi hoa để uống, uống 4-5 lần/ ngày, mỗi lần 0,5 - 1g [59]. * Chữa lòi dom: Mài củ cây Thất diệp nhất chi hoa trộn với dấm rồi bôi trực tiếp nước thuốc vào hậu môn, sau đó dùng gạc băng lại. Ngày làm 2 - 3 lần sẽ khỏi bệnh lòi dom [59]. 7 * Chữa ho, hen suyễn lâu ngày: Sắc 15g Thất diệp nhất chi hoa lấy nước uống; hoặc hầm với thịt gà hay phổi lợn để ăn [59]. * Chữa các loại mụn độc sƣng thũng: Thất diệp nhất chi hoa trộn với dấm, giã nát, đắp lên chỗ sưng đau. Làm đến khi khỏi bệnh [59]. 1.2. Một số phƣơng pháp định danh thực vật Việt Nam là đất nước có hệ sinh thái đa dạng, ở đó số loài thực vật cũng vô cùng phong phú. Để mô tả, xếp loại hay định tên cho thực vật người ta phải dùng nhiều phương pháp phân loại khác nhau. Có 2 nhóm phương pháp chủ yếu đó là phương pháp truyền thống và phương pháp phân loại phân tử. Các phương pháp truyền thống cần phải kể đến như: hình thái so sánh, giải phẫu so sánh, cổ thực vật học, hóa sinh học... Sử dụng phương pháp hình thái so sánh, người nghiên cứu sẽ dựa vào đặc điểm hình thái, nhất là hình thái cơ quan sinh sản. Những thực vật càng gần nhau thì càng có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau. Hiện nay, ngoài những đặc điểm hình thái bên ngoài, người ta còn dùng cả những đặc điểm vi hình thái (micromorphologie), tức là hình thái cấu trúc của tế bào, của mô, kể cả cấu trúc siêu hiển vi, để phân loại [61]. Với phương pháp giải phẫu so sánh, đây là phương pháp chính xác và khách quan cho phép xác lập mối quan hệ thân cận không những của các nhóm lớn (như lớp, bộ, họ) mà còn cả các nhóm nhỏ (giống, loài...) và quan hệ chủng loại. Ví dụ: cây 2 lá mầm phân biệt với cây 1 lá mầm bởi cấu tạo và sự sắp xếp của mô dẫn truyền trong thân. Phương pháp này bổ sung thêm cho phương pháp hình thái so sánh [61]. Phân loại theo phương pháp cổ thực vật học, người nghiên cứu dựa vào các mẫu hóa đá của thực vật để tìm quan hệ thân thuộc, tìm nguồn gốc của các nhóm thực vật [57]. Những nghiên cứu về bào tử và phấn hoa, đặc biệt di tích của phấn hoa trong các thời đại địa chất đã giúp xác định thành công quan hệ họ 8 hàng của một số thực vật và góp phần vào việc xây dựng hệ thống chủng loại phát sinh [61]. Theo phương pháp hóa sinh học, các loài gần nhau thường chứa những hợp chất hoá học giống nhau. Ví dụ, các loài thuốc lá chứa nicotin, các loài họ Hoa môi chứa tinh dầu... Phương pháp này có ý nghĩa thực tiễn rất lớn, nó cho ta hướng tìm những hợp chất cần thiết trong các loài gần gũi nhau [61]. Phương pháp phát triển cá thể, dựa trên cơ sở của qui luật phát triển cá thể: Trong quá trình phát triển, mỗi cá thể đều lặp lại những giai đoạn (những hình thức) chủ yếu mà tổ tiên nó đã trải qua. Theo dõi quá trình phát triển lịch sử của cây để xét đoán quan hệ nguồn gốc của nó [61]. Ngày nay, khoa học hiện đại ngày càng phát triển, các phương tiện nghiên cứu về định loại sinh vật khá nhanh chóng và chính xác nhờ phương pháp phân loại học phân tử. Theo đó, phân loại học phân tử là phương pháp phân loại sinh vật ở mức độ phân tử thông qua các dẫn liệu so sánh hóa sinh của các phân tử lớn như DNA, RNA, protein [56]. Hiện nay, phân loại sinh học phân tử đã và đang trở thành khoa học mũi nhọn trong phân loại học, bổ sung cho phân loại học truyền thống những phương pháp nghiên cứu mới và đặc biệt phân loại hoàn toàn khác với những phân loại đã dùng trước đây. Một số phương pháp thường dùng hiện nay như: so sánh hàm lượng và thành phần protein, so sánh trình tự gen lục lạp, trình tự rRNA... [56]. Đa số hệ gen lục lạp thường tồn tại ở dạng vòng kép, lớn. Hệ gen lục lạp chỉ chứa khoảng 100 gen, đặc biệt với thực vật ở cạn các gen gần như là giống nhau, chúng mã hóa cho 4 loại RNA ribosom, 30 - 31 tRNA, 21 loại protein ribosom và 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase [49]. Hệ gen lục lạp có một phần nhỏ chứa những đoạn trình tự bảo thủ, khó bị đột biến, và gần như không biến đổi trong quá trình tiến hóa. Do vậy, nhiều nhà khoa học đã sử dụng các đoạn gen này ở các loại thực vật khác nhau để làm chỉ thị định danh thực vật. Các vùng gen trong hệ gen lục lạp 9 được sử dụng trong công nghệ mã vạch DNA hiện nay như atpF-atpH, gen matK, gen rbcL, gen rpoC1, vùng xen psbK-psbI, vùng xen trnH-psbA và vùng gen nhân ITSAB [49]. rpoC1 là một gen mã hóa cho tiểu phần của Gen rpoC1 rất bảo thủ mức độ đột biến trong trình tự nucleotit của gen có thể phân biệt được loài này với loài kia, hay xác định được quan hệ họ hàng với các loại nghiên cứu. Theo Kwon - Lee KH và cs (2010) cho rằng gen rpoC1 có thể là một marker quan trọng để phân biệt nhân sâm trồng và nhân sâm hoang dại [39]. Phân tích trình tự gen rpoC1 cho phép xác định sự khác biệt giữa các chủng C. Raciborskii [37]. Trên GenBank hiện nay đã có 10 trình tự gen rpoC1 của lúa [56]. Ở cây Thất diệp nhất chi hoa các công trình nghiên cứu về gen rpoC1 công bố còn khá hạn chế. Theo Do và cs (2014) phân lập gen rpoC1 từ DNA của chi Paris polyphylla thu được gen có kích thước 2784bp trong đó gồm 2 exon và 1 intron [30]. Theo Zhu và cs phân lập gen rpoC1 của chi Paris công bố trên ngân hàng gen Bank có mã số GU178917 đến GU178922. Đều thu được gen có kích thước giống nhau dài 487bp trong đó chứa 1 intron từ DNA nhằm xác định loài của 10 loại paris đã lấy mẫu nghiên cứu [64]. Theo tổ chức Hệ thống dữ liệu mã vạch của sự sống (The Barcode of Life Data - viết tắt là BOLD) để tăng hiệu quả giám định loài cần kết hợp kết quả của nhiều vùng gen trong đó có gen rpoC1. Ví dụ, như tổ hợp gen rpoC1 kết hợp với gen rpoB và gen matK hay sự kết hợp của rpoC1 với gen matK và gen trnH-psbA; một tổ hợp khác là sự kết hợp của 5 gen bao gồm rbcL, trnH, atpF-H, psbK-I, và gen matK cũng đã được thực hiện [62]. 1.3. Một số phƣơng phƣơng pháp lƣu trữ và bảo tồn giống cây trồng Nằm ở vùng Đông Nam châu Á với diện tích khoảng 330.541 km2, Việt Nam là một trong 16 nước có tính đa dạng sinh học cao trên thế giới. nguồn tài nguyên đa dạng sinh học trong các ngành Nông nghiệp, Lâm nghiệp, Thủy sản 10 hàng năm cung cấp cho đất nước khoảng 2 tỷ đô la [9]. Nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá về sinh giới này, có thể đáp ứng những nhu cầu hiện tại và tương lai của chúng ta trong quá trình phát triển về kinh tế, y tế... Tuy nhiên thay vì bảo tồn nguồn tài nguyên này, thì trong thực tế hoạt động khai thác quá mức và bừa bãi nguồn tài nguyên quý giá này. Nhiều loài hiện đã trở nên hiếm, một số loài đang có nguy cơ bị diệt vong. Hiện nay, nguồn tài nguyên này đang suy thoái nhanh chóng [12]. Nhiều báo cáo đã ghi nhận sự biến mất của các loài thực vật bị đe dọa ở Việt Nam trong đó có những loài cây thuốc quý có tên trong sách đỏ do tình trạng khai thác không có kế hoạch. Khi các loài thực vật biến mất khỏi tự nhiên, đó là sự ra đi vĩnh viễn và nguồn gen không thể tái tạo được [6]. Theo số liệu điều tra của Viện Dược liệu năm 2000, Việt Nam có tới 3.800 cây thuốc thuộc khoảng 270 họ thực vật. Các loài cây thuốc phân bổ khắp các vùng sinh thái ở Việt Nam. Trong số đó, phần lớn các cây thuốc là mọc tự nhiên và khoảng 20% đã được gieo trồng. Từ năm 1988, công tác bảo tồn nguồn gen cây thuốc đã được triển khai. Tuy vậy, trong số 848 loài cây thuốc được xác định cần bảo tồn mới chỉ có 120 loài, dưới loài được bảo tồn trong các vùng và các cơ sở nghiên cứu Để ngăn ngừa sự suy thoái đa dạng sinh học, Việt Nam đã tiến hành công tác bảo tồn đa dạng sinh học khá sớm. Hai hình thức bảo tồn đa dạng sinh học phổ biến được áp dụng ở Việt Nam là: Bảo tồn nội vi hay nguyên vị (Insitu conservation) và bảo tồn ngoại vi hay chuyển vị (Exsitu conservation). 1.3.1 Bảo tồn nội vi( in – situ) Bảo tồn nội vi bao gồm các phương pháp và công cụ nhằm mục đích bảo vệ các loài, các chủng và các sinh cảnh, các hệ sinh thái trong điều kiện tự nhiên. Tuỳ theo đối tượng bảo tồn để áp dụng các hình thức quản lý thích hợp. Thông thường bảo tồn nguyên vị được thực hiện bằng cách thành lập các khu bảo tồn và đề xuất các biện pháp quản lý phù hợp. 11 Bảo tồn tại chỗ hay bảo tồn nội vi (Insitu conservation) là hình thức bảo tồn nguồn gen tại vùng chúng được trồng, được tồn tại trong điều kiện sinh thái tự nhiên, có thể bảo tồn trong trang trại, bảo tồn trong vườn gia đình hoặc xây dựng các vườn quốc gia [12]. Bảo tồn nội vi là hình thức chủ yếu ở Việt Nam, phương pháp này thể hiện rõ rệt nhất là đã xây dựng và đưa vào hoạt động hệ thống một hệ thống rừng đặc dụng. Theo số liệu thống kê đến 10/2006 – Cục kiểm lâm và viện điều tra quy hoạch rừng có 128 khu bảo tồn rừng. Trong đó, có 30 Vườn quốc gia (VQG), 48 Khu dữ trữ thiên nhiên, 12 khu bảo tồn loài và sinh cảnh, 38 khu bảo vệ cảnh quan, với tổng diện tích 2.400.092 ha, chiếm gần 7,24% diện tích tự nhiên trên đất liền của cả nước. Như Khu bảo tồn vườn quốc gia Cúc Phương là khu bảo tồn được thành lập đầu tiên ở miền bắc, vườn quốc gia Ba Bể (Bắc Cạn), vườn quốc gia Hoàng Liên (Lào Cai)... Tuy nhiên, sự đa dạng di truyền vẫn bị đe dọa [12] 1.3.2 Bảo tồn ngoại vi (Ex – situ) Bảo tồn ngoại vi hay bảo tồn chuyển chỗ (ex-situ consertion) là một trong những biện pháp quan trọng và có hiệu quả trong bảo tồn và phát triển đa dạng sinh học. Bảo tồn ngoại vi bao gồm các vườn thực vật, vườn động vật, các bể nuôi thuỷ hải sản, các bộ sưu tập vi sinh vật, các bảo tàng, các ngân hàng hạt giống, bộ sưu tập các chất mầm, mô cấy... Các biện pháp gồm di dời các loài cây, con và các vi sinh vật ra khỏi môi trường sống thiên nhiên của chúng. Mục đích của việc di dời này là để nhân giống, lưu giữ, nhân nuôi vô tính hay cứu hộ trong trường hợp: Nơi sinh sống bị suy thoái hay huỷ hoại không thể lưu giữ lâu hơn các loài nói trên, Dùng để làm vật liệu cho nghiên cứu, thực nghiệm và phát triển sản phẩm mới, để nâng cao kiến thức cho cộng đồng. Kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro là một trong các phương pháp bảo quản nguồn gen có vai trò quan trọng và là một bước tiến bộ vượt bậc 12