Tài liệu Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α-glucosidaza từ Aspergillus oryzae và hướng ứng dụng

1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề: Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) và thừa cân béo phì đã trở thành căn bệnh phổ biến không chỉ ở các nước phát triển mà còn ở nước đang phát triển, do thay đổi trong lối sống của người dân và thói quen ăn uống. Chất kìm hãm α-glucosidase (AGIs) thường được sử dụng để ngừa bệnh ĐTĐ loại II. Với cơ chế tác dụng là AGIs kết hợp với α- glucosidase ở ruột làm kìm hãm sự thủy phân tạo thành glucose, ngăn hấp thụ glucose đường huyết sau ăn. AGIs có thể được tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như: Chiết xuất từ thực vật, tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc bằng con đường sinh học nhờ các vi sinh vật. Các AGIs có nguồn gốc tự nhiên được đặc biệt quan tâm vì không gây phản ứng phụ, do đó AGIs tự nhiên là một trong những liệu pháp hấp dẫn để điều trị tăng đường huyết và thừa cân béo phì. Gần đây có nhiều nghiên cứu về các AGIs từ nguồn vi sinh vật như Bacillus subtilis, Actinoplanes spp, Aspergillus oryzae (A.oryzae). AGIs được tìm thấy trong nhiều thực phẩm lên men, được đánh giá cao về hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, ứng dụng hỗ trợ trị bệnh ĐTĐ và thừa cân béo phì. Sử dụng A.oryzae bằng lên men bề mặt trên môi trường rắn đậu đỗ đang là hướng mới cho chất chiết có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, sản phẩm AGIs từ đỗ tương lên men bằng A.oryzae hiện đang được phát triển ở nhiều quốc gia, với mục đích hỗ trợ kiểm soát đường huyết, hỗ trợ kiểm soát thừa cân béo phì. Trong các nghiên cứu đã công bố chủ yếu sử dụng đỗ tương (Glycine max) lên men bằng A.oryzae để thu nhận AGIs. Tuy nhiên các thông tin công bố về bản chất và cơ chế hình thành của AGIs từ các loại đậu đỗ lên men bề mặt trên môi trường rắn bằng A.oryzae còn hạn chế. Chính vì thế, việc nghiên cứu có hệ thống thu nhận AGIs từ A.oryzae lên men trên các nguồn nguyên liệu trong nước và hướng ứng dụng ở điều kiện hiện tại của Việt Nam là vấn đề cấp thiết, mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao“Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α-glucosidaza từ Aspergillus oryzae và hướng ứng dụng” là một việc làm cấp thiết hiện nay, được tiến hành với những mục tiêu sau: (1) Phân lập, tuyển chọn A.oryzae phù hợp cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao. (2) Xác định điều kiện lên men mặt trên môi trường rắn phù hợp cho quá trình nhân giống, sinh trưởng và hình thành AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu. (3) Xác định 2 điều kiện chiết xuất phù hợp cho tạo chế phẩm AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu. (4) Tinh chế, xác định thành phần hóa học AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu. (5) Hướng ứng dụng và đề xuất quy trình công nghệ sản xuất AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu. Để đạt được mục tiêu đề ra, luận án được tiến hành với nội dung sau: 2. Nội dung: Phần 1: Tuyển chọn A.oryzae cho hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao: Phân lập A.oryzae từ các mẫu tương, mẫu đỗ đen mốc; đỗ xanh mốc; đỗ tương mốc và gạo mốc lấy ở Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội và Chợ Đồng Xuân – Hà Nội; Tuyển chọn A.oryzae phân lập được, có hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao; Định danh A.oryzae tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2; Phần 2: Xác định một số yếu tố (độ ẩm, pH ban đầu, cơ chất môi trường lên men, nhiệt độ, tỷ lệ trấu môi trường rắn, độ dày khối môi trường lên men và thời gian nhân giống) ảnh hưởng tới quá trình nhân giống A.oryzae nghiên cứu; Phần 3: Xác định một số yếu tố (độ ẩm, pH ban đầu, cơ chất môi trường lên men, thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường, nhiệt độ, tỷ lệ tiếp giống ban đầu, tỷ lệ trấu môi trường rắn, độ dày khối môi trường lên men và thời gian lên men) ảnh hưởng tới khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu bằng lên men bề mặt trên môi trường rắn; Phần 4: Nghiên cứu ảnh hưởng dung môi, nồng độ, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs từ môi trường đỗ đen xanh lòng sau lên men bề mặt trên môi trường rắn bằng A.oryzae nghiên cứu. (mục tiêu 3); Phần 5: Nghiên cứu tinh sạch, xác định thành phần hóa học và định lượng AGIs được hình thành bằng A.oryzae nghiên cứu: Xây dựng phương pháp, xác định dung môi, nồng độ dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs; Nhận dạng AGIs bằng các enzyme thủy phân lần lượt với pepsin, trypsin, pancreatin, α- amylase và maltase; Xây dựng phương pháp tinh sạch và kiểm tra độ tinh sạch AGIs bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP - HPLC); Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs tinh sạch được phân tích bằng thiết bị MALDITOF/TOF mass spectrometer. Phổ AGIs được phân tích bằng phần mềm Mascot và dữ liệu ngân hàng Ludwig NR hoặc SwissPro; Định lượng AGIs bằng RP – HPLC; Phần 6: Xây dựng hướng ứng dụng 3 AGIs và đề xuất công nghệ sản xuất AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu: Xây dựng phương pháp cô sấy dịch chiết AGIs cho tạo chế phẩm AGIs; Đánh giá tính an toàn về độc tính cấp, hoạt tính kìm hãm αglucosidase và an toàn thực phẩm của AGIs tạo ra từ A.oryzae nghiên cứu; Đề xuất công nghệ sản xuất AGIs bằng A.oryzae nghiên cứu. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: Nước ta có nguồn nguyên liệu đậu đỗ đa dạng và A.oryzae phân lập từ tự nhiên là rất phong phú. Trong sản xuất AGIs từ A.oryzae người ta thường dùng đỗ tương làm môi trường lên men. AGIs từ môi trường rắn từ đỗ tương sau lên men bằng A.oryzae cho hiệu quả giảm đường huyết đối với người ĐTĐ cao, sử dụng an toàn và không có tác dụng phụ. Đó là lý do thúc đẩy nghiên cứu chọn các đậu đỗ trong nước để lên men bằng A.oryzae cho sản xuất AGIs. Các A.oryzae bản địa phân lập từ các nguồn nguyên liệu mẫu tương, mẫu đỗ đen mốc; đỗ xanh mốc; đỗ tương mốc và gạo mốc. Phương thức lên men bề mặt trên môi trường rắn được chọn lựa dựa trên điều kiện thí nghiệm đơn giản. Tinh sạch AGIs dùng cho nghiên cứu thành phần, hoạt tính và định lượng AGIs từ A.oryzae nghiên cứu. Chế phẩm AGIs kỹ thuật, chỉ qua chiết xuất, làm sạch sơ bộ có khả năng ứng dụng thực tiễn trong cải thiện AGIs hỗ trợ điều trị ở người bệnh ĐTĐ. 4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của luận án: Luận án nghiên cứu hệ thống từ việc lựa chọn, định tên A.oryzae, xác định bản chất của AGIs và đưa ra phương án thích hợp nhất về điều kiện lên men, tách chiết hoạt chất và hoàn thiện để có sản phẩm dạng bột chứa AGIs. Bằng quy trình công nghệ tạo ra chế phẩm đã đề xuất và bản chất của AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae có thể ứng dụng để sản xuất sản phẩm cho người bệnh ĐTĐ, góp phần nâng cao chất lượng sức khoẻ cộng đồng. Về mặt khoa học, đề tài đã đưa ra một số điểm mới: Đây là một nghiên cứu đầu tiên của Việt Nam tuyển chọn được A.oryzae cho hoạt tính αglucosidase cao trên môi trường đỗ đen xanh lòng (Vigna Cylindrica Skeels), nghiên cứu được một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống và lên men hình thành AGIs. Nghiên cứu đầu tiên sử dụng sóng siêu âm để chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men, tinh sạch được AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6, xác định được khối lượng phân tử và bản chất của AGIs này là peptide. Nghiên cứu đầu tiên đề 4 xuất được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6. Dựa vào kết quả khoa học của đề tài cho thấy tiềm năng sản xuất chế phẩm AGIs ở quy mô lớn, tạo chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6 cho chế biến thực phẩm cho người bênh ĐTĐ và béo phì. Kết quả luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về peptide có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase bằng phương pháp lên men rắn trên môi trường đỗ đen xanh lòng nhờ A.oryzae (từ việc phân lập tuyển chọn A.oryzae, các điều kiện lên men, tách tinh sạch AGIs, tạo chế phẩm, kiểm tra chất lượng, an toàn thực phẩm). Bước đầu ứng dụng có hiệu quả chế phẩm AGIs sản xuất bột ăn liền. Đây là kết quả bước đầu góp phần làm phong phú thêm nguồn thu các chất có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase để ngăn ngừa bệnh ĐTĐ và béo phì. 5. Bố cục luận án: Luận án gồm 140 trang (không kể phụ lục), 16 bảng, 33 hình và 169 tài liệu tham khảo, được trình bày 5 chương trong 7 phần lớn: Đặt vấn đề (5 trang); Tổng quan (35 trang); Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu (22 trang); Kết quả và thảo luận (59 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang ); Danh mục các công trình đã công bố của luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ lục (14 trang). Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần tổng quan của luận án đã trình bày tóm tắt về: Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) (Khái niệm ĐTĐ; Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ); Cơ sở khoa học của việc sử dụng AGIs đến quá trình trao đổi đường trong cơ thể (Enzyme α-glucosidase; Cơ sở khoa học sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ); Chất AGIs (Các AGIs từ tổng hợp; AGIs từ động vật; AGIs từ thực vật; AGIs từ vi sinh vật; AGIs từ A.oryzae); Đỗ đen và các sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ (Đỗ đen; Sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ); A.oryzae và lên men bề mặt (Đặc điểm hình thái A.oryzae; Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sinh trưởng và hình thành AGIs bằng A.oryzae (Ảnh hưởng của nguồn carbon; Ảnh hưởng của nguồn nitơ; Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng); Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và hình thành AGIs bằng A.oryzae (Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy; Độ ẩm môi trường; Ảnh hưởng độ thoáng khí; Điều kiện pH ban đầu của môi trường; Tỷ lệ giống; Thời gian lên men)); Thu nhận AGIs 5 (Chiết xuất AGIs từ sản phẩm môi trường sau lên men; Tinh sạch AGIs); Ứng dụng sóng siêu âm trong chiết xuất; Nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng AGIs từ đậu đỗ lên men trên thế giới; Nghiên cứu và ứng dụng AGIs ở Việt Nam. Trên cơ sở phân tích những vấn đề tồn tại trong công nghệ thu nhận AGIs, cũng đã nêu rõ hướng nghiên cứu và nội dung nghiên cứu của luận án. Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. 1. Nguyên vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Các nguồn vi sinh vật và vật liệu: Mẫu mốc tương và đỗ đen mốc ở Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; mẫu mốc tương, đỗ xanh mốc và đỗ đen mốc ở Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội; đỗ tương mốc và gạo mốc ở Chợ Đồng Xuân - Hà Nội; Đỗ đen xanh lòng, đỗ đen trắng lòng, đỗ tương (VN93-4), đỗ xanh (ĐX11), gạo nếp cái hoa vàng, cám gạo, trấu; Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, có trọng lượng 20±2 g, cả đực cả cái, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm. 2.1.2. Hóa chất: Rat interstinal aceton power (từ ruột non chuột), pNitrophenyl α-D-glucopyranoside, NaCL, Tris Base, đệm phosphat 0,1 M (từ Sigma Chemical Co, Mỹ), đệm phosphate 0,5M pH 6,7... 2.1.3. Môi trường: Môi trường nuôi cấy phân lập và giữ giống (Czapek-Dox); Môi trường nghiên cứu định loại Aspergillus: Czapek concentrate (bổ sung kim loại vết); Czapek Yeast Agar với 20% sucrose (CYA20S); Czapek Dox Agar (CZ); Czapek Yeast Agar (CYA25, CYA37); Luận án đã trình bày về môi trường đậu đỗ giá thể rắn và các môi trường rắn cho nhân giống. 2.1.4. Thiết bị và dụng cụ: Thiết bị siêu âm TJS-3000 V6.0, máy đo quang (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech)... 2.1.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội, Thời gian từ 2010 đến 2014 2.2. Phương pháp phân tích và đo đạc: Xác định % hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo phương pháp của Toomoyuki và cộng sự, (1999), hoạt lực kìm hãm α-glucosidase (IC50) theo phương pháp của Jing và cộng sự, (2007); Xác định số lượng tế bào nấm mốc trong mẫu bằng phương pháp đếm gián tiếp thông qua số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch thạch; Hàm lượng protein (%) theo AOAC 991,20; Hàm lượng lipit (%) theo AOAC 991,36; Độ ẩm (%) theo TCVN 4326: 2001 (ISO 6496:1999); Phân tích cảm quan: Theo 6 phương pháp của Hà Duyên Tư, (2006); Phương pháp tính toán, đánh giá hiệu quả tinh sạch chế phẩm AGIs kỹ thuật (Hiệu suất thu hồi Y(%) = (TA1 x100)/TA0, TA0: tổng AGIs có trong mẫu thô; TA1: tổng AGIs có trong mẫu sau tinh chế; Độ sạch P (%) = (CAGIs x 100)/ A với A: Hàm lượng mẫu; CAGIs: Hàm lượng AGIs của mẫu); Tổng số vi khuẩn yếu khí, nấm men, nấm men, nấm mốc theo TCVN 4886-89; E.coli, theo TCVN 6846:2007; Salmonella, theo TCVN 4829:2005; Staphylococcus aureus, theo TCVN 4830:2005; Clostridium perfringens, theo TCVN 4991:2005; Bacillus cereus, theo TCVN 4992:89; aflatoxin, theo TCVN 7596:2007; Tổng số vi sinh vật hiếu khí, theo TCVN 4884:2005; Tổng bào tử nấm men – mốc TCVN 6265:2007; Coliforms, theo TCVN 4882:2007; Hàm lượng chì, theo AOAC 994.02; Asen, theo AOAC 952,13; Cadimi, theo AOAC 2000; Thủy ngân, theo AOAC 971,21; Đồng, theo ISO 8294:1994; 3-MCPD, theo TCVN 7731: 2007; Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lập lại ít nhất 3 lần. Số liệu được xử lý trên phần mềm thống kê Irristat 4.0 và thống kê toán học. 2.3. Phương pháp nghiên cứu: Luận án đã trình bày về: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát; Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao (Phân lập A.oryzae: Định loại A.oryzae theo khóa phân loại Aspergillus của Klich; Cấy chấm điểm để nghiên cứu đặc điểm theo phương pháp của Pitt và Hocking, (1997); Tuyển chọn nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao; Định danh chủng nấm tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1-5,8SITS2); Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của A.oryzae T6; Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6; Chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sóng siêu âm; Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men (Khảo sát dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs; Khảo sát nồng độ ethanol cho tinh sạch sơ bộ AGIs; Nhận dạng AGIs theo phương pháp của Min-Gu-Kang và cộng sự, (2013); Tinh sạch AGIs bằng RP–HPLC theo Min-Gu-Kang và cộng sự, (2013); Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs bằng khối phổ theo Bringans và cộng sự, (2008). Phổ AGIs được phân tích bằng phần mềm Mascot và dữ liệu ngân hàng Ludwig NR hoặc SwissPro; Định lượng peptide AGIs bằng RP-HPLC). 7 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao 3.1.1. Phân lập Aspergillus Bảng 3.1 Kết quả phân lập Aspergillus oryzae: Từ 19 mẫu mốc tương, spp từ các nguồn khác nhau Nguồn phân lập Số Aspergillus gạo và đỗ tương thu thập ở các mẫu spp tương Bần, Yên 3 3 địa điểm khác nhau, thực Mốc Nhân, Hưng Yên nghiệm đã phân lập được 12 Mốc tương Cựu Đà, 3 3 Oai, Hà Nội chủng Aspergillus spp. Qua Thanh Đỗ đen mốc ở Bần 3 1 quan sát đặc điểm phát triển, Yên Nhân, Hưng Yên đen mốc ở Cựu Đà, 3 3 hình thái, đặc điểm vi thể và đối Đỗ Thanh Oai, Hà Nội chiếu với khóa phân loại Đỗ xanh mốc ở Cựu 3 1 Thanh Oai, Hà Nội Aspergillus của Klich, cho thấy Đà, Đỗ tương mốc ở Chợ 2 1 Đồng Xuân – Hà Nội 12 chủng phân lập được này đều mốc ở Chợ Đồng 2 0 có đặc điểm giống loài A.oryzae Gạo Xuân – Hà Nội Tổng số 19 12 và ký hiệu từ T1-T12. 3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao Kết quả trình bày (KQ) ở Hình 3.1 cho thấy bước đầu tuyển chọn được chủng T6 cho khả năng hình thành AGIs cao nhất (37,52 ± 1,23% hoạt tính kìm hãm α-glucosidase) được sử dụng cho định danh, nghiên cứu Hình 3.1 Hoạt tính kìm hãm αđiều kiện sinh trưởng và khả năng glucosidase của một số A.oryzae phân lập hình thành AGIs. được 3.1.3. Định danh chủng tuyển Kết quả điện di chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1- 5,8S 800 bp ITS2: Kết quả PCR khuếch đại gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2: Sản 400 bp phẩm Từ kết quả điện di (Hình 3.2) có PCR thể thấy, đã khuếch đại được Hình 3.2 Sản phẩm PCR của chủng T6 đoạn gen trong vùng ITS1 Trong đó: M: Maker (Thang chuẩn 100 bp), 3 5,8S - ITS2 có kích thước giếng còn lại tương ứng với N: Đối chứng âm, khoảng 500bp như mong muốn. P: Đối chứng dương, T6: mẫu nấm 8 Sản phẩm hiệu quả, nồng độ tốt. Bảng 3.2 Kết quả đánh giá mức độ Có thể tinh sạch sản phẩm PCR tương đồng của trình tự đoạn vùng ITS1để giải trình tự gen. Đọc trình tự 5,8S-ITS2 của chủng T6 với GenBank database sử dụng công cụ BLAST gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2: Sản Tên Nấm mốc Mã số truy cập Độ tương đồng (%) phẩm PCR sau khi được tinh sạch A.oryzae strain gb|JX489381.1| 99,99% tiến hành đọc trình tự bằng bộ kít Yz12 Bigdye 3.1 trên máy 3100 (ABI- A.oryzae emb|FN823241.| 99.99% Mỹ); Sau khi phân tích trình tự partial A.oryzae strain gb|HM064501.1| 99,99% gen của chủng T6, có kết quả ở SEMCC-3.248 A. spp gb|HM590656.1| 99,99% Bảng 3.2 cho thấy trình tự nucleotide này có độ tương đồng cao đạt tới 99% so với trình tự đoạn gen của A.oryzae đã được công bố trên Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế với mã số gbJX489381.1; embFN823241.1 và gbHM064501.1. Kết quả định tên bằng phương pháp sinh học phân tử hoàn toàn phù hợp với kết quả phân loại dựa trên các đặc điểm phát triển và hình thái học. Sau khi kết hợp cả hai phương pháp: Phân loại Aspergillus theo khóa phân loại của Klich và so sánh trình tự gen, có thể khẳng định chủng T6 là loài A.oryzae, ký hiệu là A.oryzae T6. 3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của A.oryzae T6 trong nhân giống trên môi trường rắn 3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae T6: KQ (Hình 3.3) cho thấy A.oryzae T6 có thể phát triển trên tất cả các môi trường khảo sát, tuy nhiên do thành phần dinh dưỡng của môi trường khác nhau nên mật độ tế bào của A.oryzae T6 thay đổi từ 31 Hình 3.3 Ảnh hưởng của thành phần × 106 đến 68 × 106 CFU/g. Xác cơ chất môi trường rắn đến mật độ tế định được môi trường M5 cho bào của A.oryzae T6 mật độ tế bào đạt cao nhất 68 × Ghi chú: M1 có tỷ lệ: Bột ngô : trấu là 4 : 1; M2 là Đỗ tương : trấu là 4 : 1; M3 là Cám gạo 106 CFU/g. : trấu là 4 : 1; M4 là Gạo : trấu là 4 : 1; M5 là Cám gạo : gạo : trấu là 2 : 2 : 1. Các môi trường này đều có độ ẩm 50% và pH 5,5. 9 3.2.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae T6: KQ ở Hình 3.4 cho thấy tỷ lệ trấu 20 % trong môi trường rắn có thành phần cám gạo và gạo (tỷ lệ 1:1), cho mật độ tế bào cao nhất trong nhân giống A.oryzae T6 đạt 66 x106 CFU/g sau 72 giờ nuôi ở nhiệt độ 30 ± 20C. 3.2.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6: KQ Hình 3.5 cho thấy độ ẩm môi trường rắn ảnh hưởng tới tốc độ phát triển của A.oryzae T6, độ ẩm 55% ban đầu ở môi trường rắn nhân giống cho mật độ tế bào cao nhất trong nhân giống A.oryzae T6 đạt 65x107 CFU/g sau 120 giờ nuôi ở nhiệt độ 30 ± 20C. 3.2.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6: KQ ở Hình 3.6 cho thấy pH môi trường có ảnh hưởng đến sinh trưởng của A.oryzae T6, pH 5,5 ban đầu của môi trường nhân giống cho A.oryzae T6 sinh trưởng đạt mật độ tế bào lớn nhất, đạt 67 x 106 CFU/g sau 72 giờ nuôi ở nhiệt độ 30 ± 20C. Hình 3.4 Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 Hình 3.5 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 Hình 3.6 Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 10 3.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6: KQ ở Hình 3.7 cho thấy, nhiệt độ 200C và 400C A.oryzae T6 phát triển với mật độ tế bào thấp tương ứng là 41x106 CFU/g và 51x106 CFU/g. Ở nhiệt độ 300C mật độ tế bào của A.oryzae T6 cao nhất, đạt 69×106 CFU/g sau 72 giờ nhân giống. 3.2.7. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6: KQ ở Hình 3.8 cho thấy độ dày khối môi trường khác nhau cho khả năng sinh trưởng của nấm mốc khác nhau, ở độ dày khối môi trường 6 cm cho sinh trưởng của A.oryzae T6 có mật độ tế bào lớn nhất, đạt 67x107 CFU/g sau 120 giờ nhân giống ở nhiệt độ 30 ± 20C 3.2.8. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6: KQ ở Hình 3.9 cho thấy thời gian 5 ngày nhân giống A.oryzae T6 là phù hợp cho mật độ tế bào cao, đạt 67x107 CFU/g ở nhiệt độ 30 ± 20C, môi trường có tỷ lệ khối lượng cám gạo : gạo : trấu là 2 : 2 : 1; độ ẩm ban đầu là 55%, pH 5,5; độ dày khối môi trường là 6 cm, tỷ lệ tiếp giống ban đầu là 105 CFU/g, Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 Hình 3.8 Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 11 3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến bằng A.oryzae T6 3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6: KQ ở Hình 3.10 cho thấy, các cơ chất được khảo sát đều cho mật độ tế bào khoảng 106 CFU/g, trong đó đỗ đen xanh lòng là thích hợp nhất để lên men hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao nhất (là 68,63±0,25% sau 48 giờ lên men ở nhiệt độ 30±20C) 3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6: KQ Hình 3.11 cho thấy môi trường đỗ đen xanh lòng có 10% cám gạo được chọn để lên men hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 cho hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao nhất (là 68,40 ± 1,24 % sau 48 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C). 3.3.3. Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4, KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến khả năng hình thành AGIs: KQ Hình 3.12 cho thấy nên sử dụng lượng S, P, K thích hợp với tỷ lệ ở công thức MT3 có thành phần khối lượng đỗ đen xanh lòng : cám gạo : K2HPO4 : KCL : MgSO4 là 900 : 100 : 0,4 : 0,08 : 0,4 cho lên men hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao nhất (là 72,60 ± 0,78 % sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C). khả năng hình thành AGIs Hình 3.10 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường đến hoạt tính kìm hãm α – glucosidase và mật độ tế bào của A.oryzae T6 Hình 3.11 Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm αglucosidase Hình 3.12 Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4, KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase Ghi chú: 12 3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến khả năng hình thành AGIs: KQ Hình 3.13 cho thấy pH 5,5 ban đầu của môi trường lên men rắn là thích hợp nhất để lên men hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao nhất (là 68,27 ± 0,71% sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C) 3.3.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến khả năng hình thành AGIs: KQ ở Hình 3.14 cho thấy độ ẩm 55% ban đầu của môi trường lên men rắn là thích hợp nhất để lên men hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao nhất (là 74,60 ± 1,03% sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C). 3.3.6. Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến khả năng hình thành AGIs: KQ Hình 3.15 cho thấy độ dày khối môi trường lên men 6 cm cho lên men rắn là thích hợp nhất để lên men hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao (là 82,15 ± 1,02 % sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C) vì ở độ dày này vẫn đảm bảo độ thoáng khí và tiết kiệm diện tích lên men. Hình 3.13 Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α glucosidase Hình 3.14 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α glucosidase Hình 3.15 Ảnh hưởng độ đầy của khối khối môi trường lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α glucosidase 13 3.3.7. Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men bằng A.oryzae T6 đến khả năng hình thành AGIs: KQ ở Hình 3.16 cho thấy lượng giống ban đầu 106 CFU/g là phù hợp cho lên men hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao (là 75,31 ± 1,17% sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C) Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Shie-Jea Lin và cộng sự (2010). 3.3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men bằng A.oryzae T6 đến khả năng hình thành AGIs: KQ Hình 3.17 cho thấy nhiệt độ 30 ± 20C là phù hợp cho lên men hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao (là 81,23 ± 1,54 % sau 60 giờ lên men) và cũng là nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng của chủng đã được khảo sát (mục 3.2.5). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Hiroyuki Fujita đã công bố. 3.3.9. Sự biến động AGIs trong quá trình lên men bề mặt trên môi trường rắn bằng A.oryzae T6: KQ ở Hình 3.18 cho thấy 58 giờ lên men là phù hợp cho lên men hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao nhất là 86,90 ± 0,47 % trên môi trường có thành phần tỷ lệ khối lượng đỗ đen xanh lòng : cám gạo : K2HPO4 : KCL : MgSO4 tương ứng Hình 3.16 Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men bằng A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α glucosidase Hình 3.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men A.oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase Hình 3.18 Hoạt tính kìm hãm αglucosidase trong quá trình lên men bề mặt trên môi trường rắn bằng A.oryzae T6 14 là 900 : 100 : 0,4 : 0,08 : 0,4; độ ẩm là 55%; pH ban đầu là 5,5; độ dày khối môi trường là 6 cm, tỷ lệ tiếp giống ban đầu là 106 CFU/g và nhiệt độ 30 ± 20C). 3.4. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6 bằng sử dụng sóng siêu âm 3.4.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men: KQ Hình 3.19 cho thấy, khả năng chiết xuất AGIs của methanol và ethanol là lớn nhất. Khả năng chiết xuất AGIs của methanol lớn hơn so với ethanol không nhiều, trong khi đó IC50 của chất hòa tan trong ethanol mạnh nhất (IC50 là 427,32 ± 12,36 Hình 3.19 Ảnh hưởng của dung môi µg/ml), mạnh hơn cả dung môi chiết xuất đến hoạt tính kìm hãm αchiết xuất là methanol (IC50 là glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết 480,43 ± 14,57 µg/ml),thấp nhất là đỗ đen lên men dung môi chiết xuất là nước (IC50 là 563,21 ± 11,61µg/ml). Do đó ethanol được lựa chọn làm dung môi chiết xuất AGIs, cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase là 61,87 ± 1,31%, IC50 là 427,32 ± 12,36 µg/ml sau 6 phút chiết xuất ở tỷ lệ dung môi ethanol 96% : bột đỗ đen lên men là 6 : 1 (lít / kg), ở nhiệt độ 600C, siêu âm cường độ 8W/cm2 ở tần số 20 kHz. 3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men: KQ ở Hình 3.20 cho thấy nồng độ ethanol 50% phù hợp cho chiết xuất AGIs cao từ đỗ đen lên men, với hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao nhất là 84,63 ± 2,17% và IC50 mạnh nhất là 235,41 ± 13,26 µg/ml sau 6 phút chiết xuất ở tỷ lệ dung môi : bột đỗ đen lên Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ men là 6 : 1 (lít / kg), ở nhiệt độ dung môi ethanol đến hoạt tính kìm 600C, siêu âm cường độ 8W/cm2 ở hãm α-glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men tần số 20 kHz). 15 3.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên men đến khả năng chiết xuất AGIs: Kết quả (Hình 3.21) cho thấy ở tỷ lệ ethanol 50% : đỗ đen lên men là 6 lít / kg được lựa chọn sử dụng cho quá trình chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sóng siêu âm là phù hợp, cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt Hình 3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ 84,63 ± 1,41 % sau 6 phút chiết xuất dung môi ethanol và đỗ đen lên men ở nhiệt độ 600C, siêu âm cường độ đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 8W/cm2 ở tần số 20 kHz. (%) của dịch chiết đỗ đen lên men 3.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men: Kết quả nghiên cứu (Hình 3.22) cho thấy chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sóng siêu âm ở 600 C là phù hợp (cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao (84,65 ± 2,41%) và có IC50 mạnh nhất là 260,92 ± 11, 37µg/ml sau 6 phút chiết xuất tỷ lệ Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ dung môi ethanol 50% : bột đỗ đen đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase là 6/1, siêu âm cường độ 8W/cm2 ở (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men tần số 20 kHz). 3.4.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6: KQ Hình 3.23 cho thấy cho thấy năng lượng sóng siêu âm đem lại hiệu quả khả năng chiết xuất chất AGIs, tăng cường độ sóng siêu âm phần lớn tăng khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men. Xác định được mức thời gian 10 phút siêu âm chiết xuất ở cường độ siêu âm 8 W/cm2 cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao (89,85 ± 0,97%) và IC50 mạnh (230,00 ± 4,47µg/ml) được lựa chọn phù hợp nhất cho chiết xuất chất AGIs từ đỗ đen lên men. Kết quả (Bảng 3.3) cho thấy chiết xuất bằng sóng siêu âm cường độ 8W/cm2 với tần số 20 kHz ở nhiệt độ 60 ± 1,00C trong 10 phút cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase là 89,85 ± 0,97%, IC50 là 230,00 ± 4,47 µg/ml và lượng chất khô thu được 2,28 ± 0,042%, phương pháp chiết xuất không sử dụng sóng siêu âm, chiết ở nhiệt độ 60 ± 1,00C trong 10 phút cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 58,54 ± 16 0,84%, IC50 là 608,18 ± 5,03 µg/ml và lượng chất khô thu được 1,49 ± 0,031%, chiết xuất không sử dụng sóng siêu âm ở nhiệt độ 800C trong 120 phút (2 giờ) cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 78,20 ± 1,06 %, IC50 là 516,15 ± 6,21 µg/ml và lượng chất khô thu được 5,12 ± 0,43%. Cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase chiết xuất đều thấp hơn và hoạt lực kìm hãm α-glucosidase có IC50 đều yếu hơn so với chiết xuất ở cường độ siêu âm 8w/ cm2 ở thời gian 10 phút hoạt tính kìm hãm α-glucosidase bằng sóng siêu âm cường độ 8W/cm2 cao hơn 11,65 % so với chiết xuất không có siêu âm trong 2 giờ ở nhiệt độ 800C và giảm đáng kể nhiệt độ chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bởi A.oryzae T6 từ nhiệt độ 800C ở quá trình chiết xuất thông thường để giảm nhiệt độ chiết xuất ở nhiệt độ 600C trong quá trình sử dụng sóng siêu âm, giảm khoảng 25% nhiệt độ chiết xuất. Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian, cường độ sóng siêu âm đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men Kết quả cho thấy điều kiện thích hợp chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6 cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao là 17 89,85 ± 0,97%, hoạt lực kìm hãm α-glucosidase cho IC50 mạnh là 230 ± 4,47 µg/ml ở cường độ siêu âm 8 W/cm2 sau 10 phút siêu âm ở điều kiện: Tỷ lệ dung môi ethanol 50% : bột đỗ đen lên men là 6 lít / kg, siêu âm cường độ 8W/cm2 với tần số 20 kHz / dung tích 20 lít ở nhiệt độ chiết xuất ở nhiệt độ 600C Bảng 3.3 So phương pháp chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sử dụng sóng siêu âm và không sử dụng sóng siêu âm Chỉ tiêu Đơn vị Dung môi ethanol 50%: Đỗ đen nguyên liệu Nhiệt độ chiết xuất Thời gian IC50 Lượng chất khô so với đỗ đen lên men Hoạt tính kìm hãm αglucosidase ở dịch chiết l / kg 0 C phút µg/ml (%) % Chiết xuất - siêu âm cường độ 8W/cm2 ở tần số 20 kHz 6 Chiết xuất không sử dụng sóng siêu âm 6 6 60 ± 1,0 10 230 ± 4,47 2,28 ± 0,042 60 ± 1,0 10 608,18 ± 5,03 1,49 ± 0,031 80 ± 1,0 120 516,15 ± 6,21 5,12 ± 0,43 89,85 ± 0,97 58,54 ± 0,84 78,20 ± 1,06 3.5. Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6 3.5.1. Khảo sát dung môi để tinh sạch sơ bộ AGIs: Chế phẩm AGIs chiết xuất từ đỗ đen lên men sau khi kết tủa bằng các dung môi methanol, ethanol và isopropyl alcohol (Hình 3.24) cho thấy, hoạt tính kìm hãm αglucosidase tập trung chủ yếu ở phần tan trong dung môi, còn phần kết tủa rất thấp. Phần tan có Hình 3.24 So sánh giá trị IC50 của giá trị IC50 theo thứ tự: methanol, AGIs thu được ở phần kết tủa và phần tan isopropyl alcohol và ethanol lần khi sử dụng methanol, ethanol và lượt là 0,072; 0,064 và 0,058 isopropyl alcohol mg/ml, mạnh hơn nhiều so với đối chứng (chế phẩm AGIs chiết xuất có IC50 là 0,23 mg/ml). Như vậy, cả ba loại dung môi khảo sát đều có thể sử dụng để tinh sạch AGIs sơ bộ, trong đó ethanol cho khả năng tinh sạch sơ bộ với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao nhất. 18 3.5.2. Khảo sát nồng độ ethanol để tinh sạch sơ bộ AGIs: KQ Hình 3.25 cho thấy khả năng tủa tạp chất để tinh sạch AGIs phụ thuộc vào nồng độ ethanol. Lượng chất khô hòa tan ở trường hợp sử dụng ethanol 90% (14,04 % chất khô) lớn hơn ở trường hợp sử dụng ethanol 95% (13,95 % chất khô). Nồng độ chất tan ở hai nồng độ Hình 3.25 So sánh giá trị IC50 của chất 90% và 95% ethanol chênh lệc khô ở phần tủa và phần tan khi sử dụng không đáng kể. Do đó có thể lựa các nồng độ ethanol khác nhau để làm chọn nồng độ ethanol 90% để tinh sạch chế phẩm AGIs chiết xuất từ đỗ đen sạch sơ bộ AGIs. lên men 3.5.3. Tinh sạch AGIs: Để chứng minh bản chất của chất có hoạt tính kìm hãm αglucosidase từ đỗ đen lên men, từ chế phẩm AGIs tinh sạch sơ bộ, xử lý bằng các enzyme thủy phân khác nhau theo phương pháp của a) Min-Gu-Kang và cộng sự, năm 2013. Các dịch có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase từ đỗ đen lên men được xử lý thủy phân lần lượt bằng pepsin, trypsin, pancreatin, αamylase và maltase ở điều kiện phản ứng tối b) Hình 3.26 Sắc ký đồ có píc ưu cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của AGIs (a). Hình dạng píc tăng sau khi xử lý (IC50 trước khi xử lý là của AGIs (b) 57,84 µg/ml và sau xử lý là 41,5 µg/ml). Điều này cho thấy AGIs chiết từ đỗ đen lên men không bị thủy phân bởi các enzyme này. Kết quả này phù hợp so với công bố của Min–Gu Kang và cộng sự (2013) về AGIs từ đỗ tương lên men bằng A.oryzae N159-1 có bản chất là peptide.Chế phẩm AGIs chiết xuất sau khi tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90% và xử lý bằng pepsin đã được phân tích hoạt tính kìm hãm αglucosidase cho IC50 là 41,52 µg/ ml. Dịch chiết này được tách phân đoạn bằng RP - HPLC. Các phân đoạn thu được bằng chương trình gradient. Sau đó, từng phân đoạn được kiểm tra lại độ tinh sạch bằng RP - HPLC và phân tích hoạt tính kìm hãm α-glucosidase. Kết quả thu được cho thấy chỉ có một phân đoạn có pic như trên sắc ký đồ tại khoảng thời gian 23,5 đến 24 phút (Hình 3.26a), có bước sóng ở chân đỉnh là 232 nm, đỉnh là 266 nm (Hình 3.26b) cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao nhất (IC50 là 8,21 µg/ml) và có một píc duy nhất so với các phân đoạn còn lại (Hình 3.27c). Kết quả 1750 mAU 23.58/ 1.00 1500 1250 256 1000 232 750 500 200 300 400 500 600 700 775 719 727 0 678 603 622 640 644 250 nm mAU 280nm,4nm (1.00) 100 75 50 25 0 23.5 24.0 24.5 min 19 (Bảng 3.4) cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tăng lên ở các bước tinh sạch lần lượt là chiết đỗ đen lên men (IC50 là 230 µg/ml), tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90% (IC50 là 57,84 µg/ml), xử lý pepsin (IC50 là 41,52 µg/ml) và cao nhất ở bước tinh sạch bằng RP - HPLC (IC50 là 8,12 µg/ml). Ở nghiên cứu này, cho thấy AGIs tinh sạch từ đỗ đen lên men bằng A.oryzae T6 có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao hơn so với AGIs từ A.oryzae N159-1 (IC50 là 3,1 mg /mL), thấp hơn so với AGIs của nấm linh chi (có IC50 của SKG-3 là 4,6 µg/ml), chiết từ vỏ cây thông (IC50 là 5 μg/ml) đã được công bố. a) 4000 b) c) mAU 280nm,4nm (1.00) mAU 280nm,4nm (1.00) mAU 125 280nm,4nm (1.00) 1500 3500 3000 1250 100 1000 75 750 50 2500 2000 1500 1000 500 25 500 250 0 0.0 0 0.0 -500 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min 0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min Hình 3.27 Sắc ký đồ môi trường đỗ đen xanh lòng trước khi lên men (a). Sắc ký đồ dịch sau khi lên men, trước tinh sạch (b). Sắc ký đồ AGIs sau khi tinh sạch (c) Kết quả ở Hình 3.27 cho thấy: Sắc ký của mẫu đỗ đen sau lên men, trước tinh sạch (Hình 3.27 b) thu được một số pic mới so với sắc ký đồ của mẫu đỗ đen trước khi lêm men (Hình 3.27 a) không có và kết quả sắc ký đồ ở mẫu sau khi tinh sạch có một píc ở thời gian khoảng 24 phút (Hình 3.27c) có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, píc này trùng với píc mới ở sắc ký đồ dịch sau khi lên men, trước tinh sạch (Hình 3.27 b). Kết quả này cho thấy nguồn gốc của peptide AGIs là được hình thành bằng lên men A.oryzae T6 trên môi trường đỗ đen xanh lòng. 3.5.4. Xác định khối lượng phân tử và trình tự axit amin của peptide AGIs tinh sạch từ đỗ đen bằng khối phổ: Mẫu chế phẩm AGIs tinh sạch được phân tích bằng thiết bị MALDI-TOF/TOF mass spectrometer theo phương pháp của Bringans và cộng sự 2008, thực hiện bằng khối phổ cho thấy chất tinh sạch này có khối lượng phân tử 926,4861 Da tương ứng là một đoạn peptide có trình tự axit amin là YIYEIAR. Khi so sánh với ngân hàng giữ liệu của LudwigNR thì không thấy có sự trùng lặp nào của đoạn peptide này trong các protein đã được công bố. Ngược lại, bằng sử dụng dữ liệu của SwissPro cho thấy chất tinh sạch AGIs này là một Hình 3.28 Khối lượng phân tử và trình tự axit amin của peptide AGIs tinh sạch được thực hiện bằng khối phổ. R.YLYEIAR.R 20 đoạn peptide, có trình tự axit amin YIYEIAR trùng với trình tự axit amin trong đoạn peptide của FETA_BOVIN (Alpha-fetoprotein từ huyết thanh bào thai bò) là R.YIYEIAR.R (Hình 3.28 và Phụ lục KQ KP) Nghiên cứu này cho thấy peptide AGIs tinh sạch từ đỗ đen lên men cho khối lượng phân tử lớn hơn so với peptide AGIs thu được từ dịch lên men lỏng bằng A.oryzae N159-1 (360,1 Da) đã được công bố. 3.5.5. Định lượng peptide AGIs của đỗ đen lên men: AGIs sau khi tinh sạch, dùng peptide AGIs này làm chất chuẩn để định lượng peptide AGIs trong mẫu đỗ đen lên men bằng RP - HPLC thông qua diện tích píc thu được. Định lượng được peptide AGIs trong đỗ đen sau lên men bằng A.oryzae T6 là 1,83 mg/g (0,183%). Kết quả xác định hiệu suất tinh sạch AGIs của sản phẩm sau các bước tinh sạch được trình bày ở Bảng 3.4. Sau khi tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90%, hiệu suất đạt 87,81 %, sau khi xử lý bằng pepsin – đạt 86,46 % và tinh sạch bằng RP - HPLC - hiệu suất 57,92 %. Các sản phẩm sau các bước tinh sạch có độ tinh sạch tăng dần, hàm lượng lần lượt là: 50,216; 56,501 và 99,99 % peptide AGIs. Bảng 3.4 Đánh giá sản phẩm sau các bước tinh sạch AGIs từ đỗ đen lên men Bước tinh sạch Hoạt lực AGIs (IC50 µg/ml) - Lượng chất khô(%) 100 Hiệu suất (%) - Độ tinh sạch Chiết xuất đỗ đen lên men 230,00 2,28 100 8,026 Tinh sạch sơ bộ bằng ethnol 90% Xử lý pepsin Tinh sạch bằng RP-HPLC 57,84 0,32 87,81 41,52 8,12 0,28 0,106 86,45 57,92 Đỗ đen lên men (% peptide AGIs) 0,183 50,216 56,501 99,99 3.6. Ứng dụng AGIs. 3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs: Bảng 3.5 cho thấy nhiệt độ 60 ± 20C là tối ưu để cô sấy tạo chế phẩm AGIs cho hiệu quả cao về chất lượng cảm quan sản phẩm và thời gian sấy (điểm cảm quan cao nhất đạt 29,5 điểm). Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô sấy chân không đến chất lượng cảm quan, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase và thời gian cô đến chất lượng chế phẩm AGIs Nhiệt độ cô sấy (0C) (IC50 (µg/ml)) Thời gian (phút) 50 ± 2 60 ± 2 70 ± 2 80 ± 2 90 ± 2 100 ± 2 231,72 ± 0,12 231,57 ± 0,21 231,31 ± 0,35 231,22 ± 0,28 231,12± 0,31 229,07± 0,38 270 155 125 110 95 65 Màu sắc 7,5 7,5 7,0 7,0 6,5 5,5 Mùi 8 7,5 7,0 6,5 6,5 6 Cảm quan Vị Trạng thái 7 7 7,5 7 7 7 6,5 7 7 6,5 6,5 6,5 Tổng điểm 29,5 29,5 28 27 26,5 24,5