Nghiên cứu thu nhận enzyme α-amylase từ trực khuẩn bacillus subtilis

  • Số trang: 100 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 17 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI BAN ðÀO TẠO SAU ðẠI HỌC ------  ------ TRƯƠNG THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME α - AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN Bacillus subtilis. LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 60.42.02.01 Giảng viên hướng dẫn : 1. PGS.TS. LƯƠNG ðỨC PHẨM 2. TS. NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI - 2013 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn luận văn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Trương Thị Nguyệt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn, giúp ñỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô cùng toàn thể cán bộ bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ vi sinh – khoa Công nghệ Sinh học – Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến quý thầy cô trường Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội, ñặc biệt là những thầy cô ñã tận tình dạy bảo cho tôi suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến thầy giáo PGS.TS. Lương ðức Phẩm và TS. Nguyễn Văn Giang ñã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn tới cùng các thầy cô trong bộ môn, các bạn sinh viên, gia ñình và bạn bè ñã tạo rất nhiều ñiều kiện ñể tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Mặc dù tôi ñã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận ñược những ñóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn. Hà Nội, Ngày 24 tháng 06 năm 2013 Học viên Trương Thị Nguyệt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii MỤC LỤC Lời cam ñoan Lời cảm ơn i ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix Danh mục biểu ñồ x 1 MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2. Nội dung ñề tài 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 3 2.1.1 ðặc ñiểm chung vi khuẩn Bacillus 3 2.1.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis 4 2.1.3 Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên 8 2.2 Enzyme α - amylase 10 2.2.1 Cấu tạo α - amylase 10 2.2.2 Tính chất 11 2.2.3 Cơ chế xúc tác 12 2.2.4 14 Nguồn thu nhận enzyme α - amylase 2.2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng ñến sinh tổng hợp α - amylase của vi sinh vật 16 2.2.6 Tách và làm sạch enzyme 18 2.2.7 Ứng dụng enzyme α - amylase 18 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu 21 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii 3.1.1 ðối tượng 21 3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 21 3.1.3 Hóa chất 21 3.2 Các môi trường ñược sử dụng 21 3.2.1 Môi trường phân lập và nuôi Bacillus 21 3.2.2 Môi trường cảm ứng sinh tổng hợp amylase của Bacillus 22 3.2.3 Môi trường thử hoạt tính amylase 22 3.3 22 Các phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp phân lập các chủng Bacillus từ ñất vườn qua trung gian cỏ khô 22 3.3.2 Phương pháp giữ giống cấy chuyền 22 3.3.3 Phương pháp nuôi cấy bề sâu 23 3.3.4 Một số phương pháp nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học của Bacillus 23 3.3.5 Thử các phản ứng sinh hoá 26 3.3.6 Phương pháp ñếm khuẩn lạc 29 3.3.7 Phương pháp ño ñộ ñục 29 3.3.8 Phương pháp xác ñịnh sự sinh trưởng của vi khuẩn theo mật ñộ quang 30 3.3.9 Phương pháp nghiên cứu khả năng phân hủy tinh bột. 30 3.3.10 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase theo Heinkel, 1956 31 3.3.11 Phương pháp nghiên cứu xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy tối ưu 33 3.3.12 Phương pháp nhiên cứu ñộng học 34 3.3.13 Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy 35 3.3.14 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme amylase từ dịch chiết enzyme thô bằng các tác nhân kết tủa 35 3.3.15 Xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase của chế phẩm enzyme thu ñược từ các tác nhân tủa 37 3.3.16 Xác ñịnh ñộ bền α - amylase thủy phân nguyên liệu nếp trắng. 37 3.3.17 Xác ñịnh ñường khử theo phương pháp acid initrosalicylic(DNS) 39 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng trực khuẩn có hoạt tính amylase cao 4.2 41 41 Xác ñịnh sự sinh trưởng và hoạt ñộ α - amylase của 3 chủng LB ñã chọn 46 4.2.1 Xác ñịnh sự sinh trưởng của 3 chủng LB 46 4.2.2 Xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase của 3 chủng LB 47 4.3 47 Một số ñặc ñiểm sinh học của chủng LB3 4.3.1 ðặc ñiểm hình thái tế bào chủng LB3 47 4.3.3 Khả năng hình thành bào tử của chủng LB3 48 4.3.4 Nghiên cứu khả năng sinh enzyme catalase 49 4.4 Khảo sát các ñặc ñiểm sinh hóa của vi khuẩn LB3 50 4.5 Nghiên cứu các ñiều kiện ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp α – amylase của chủng B. subtilis LB3. 51 4.5.1 Loại cơ chất 51 4.5.2 Ảnh hưởng nồng ñộ tinh bột tan. 53 4.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ. 53 4.4.4 Ảnh hưởng của pH ban ñầu 54 4.4.6 Ảnh hưởng của các loại muối. 55 4.4.7 Nồng ñộ NaCl cao nhất ức chế sinh trưởng. 56 4.5 Nghiên cứu ñộng học của quá trình lên men trong bình tam giác 1 lít. 4.6 58 Tách enzyme từ dịch nuôi cấy, xác ñịnh hoạt ñộ và ñộ bền của enzyme. 4.6.1 Tách enzyme từ dịch nuôi cấy với các tác nhân tủa khác nhau. 59 59 4.6.2 Hoạt ñộ α – amylase của CPE amylase thu ñược bởi các tác nhân kết tủa. 59 4.6.3 Xác ñịnh nhiệt ñộ tối thích của α - amylase 60 4.6.4 Xác ñịnh pH tối thích của α - amylase 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 4.7 Thử nghiệm khả năng thủy phân enzyme α – amylase trên nguyên liệu gạo nếp trắng. 62 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 5.1 Kết luận 64 5.2 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT B. : Bacillus CPE : Chế phẩm enzyme OD : Giá trị mật ñộ quang dOD : Hiệu số giá trị mật ñộ quang v/p : Vòng/phút Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis 2.2 ðộ bền nhiệt của - amylase từ các nguồn khác nhau 12 3.1 ðặc ñiểm hình thái khuẩn lạc các chủng phân lập 41 3.2 ðặc ñiểm tế bào của khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường 44 3.3 ðường kính vòng phân giải tinh bột của 3 chủng LB 45 3.4 So sánh hoạt ñộ α - amylase của 3 chủng LB 47 3.3 Tóm tắt một số ñặc ñiểm của chủng LB3 49 3.4 Các phản ứng sinh hoá của LB3 50 3.5 Sự sinh trưởng của chủng LB3 trên các loại cơ chất 51 3.6 Nồng ñộ tinh bột tan ảnh hưởng ñến hoạt ñộ α - amylase 53 3.7 Ảnh hưởng của nồng ñộ muối NaCl ñến hoạt ñộ α - amylase 56 3.8 Ảnh hưởng của nồng ñộ muối CaCl2 ñến hoạt ñộ α - amylase 58 3.9 Hiệu suất thu nhận CPE α - amylase từ các tác nhân tủa 59 3.10 Hoạt ñộ α – amylase thu ñược bởi các tác nhân kết tủa 60 3.11 Nhiệt ñộ tối thích của CPE α - amylase 60 3.12 pH tối thích của CPE α - amylase 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 6 viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Tế bào Bacillus subtilis....................................................................... 5 2.2 Cấu trúc không gian của α - amylase. ............................................... 11 2.3 Vị trí cắt của α - amylase trên phân tử tinh bột ................................. 14 4.1 Vòng phân giải tinh bột của 3 chủng LB3, LB4, LB8....................... 47 4.2 Hình thái tế bào chủng LB3 .............................................................. 48 4.3 Bào tử của chủng LB3 ...................................................................... 48 4.4 Hình ảnh thử catalase của chủng LB3............................................... 49 4.5 Một số phản ứng sinh hóa của chủng LB3 ........................................ 51 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix DANH MỤC BIỂU ðỒ STT Tên biểu ñồ Trang 3.1 Sự sinh trưởng của 3 chủng LB phân lập .......................................... 46 3.2 Ảnh hưởng loại cơ chất ñến hoạt ñộ α – amylase.............................. 52 3.3 Nhiệt ñộ ảnh hưởng ñến hoạt ñộ α - amylase ................................... 54 3.4 Ảnh hưởng pH ban ñầu ñến hoạt ñộ α - amylase.............................. 55 3.5 Nồng ñộ NaCl cao nhất ức chế sinh trưởng....................................... 57 3.6 ðộng học quá trình nuôi cấy B. subtilis LB3 sinh α - amylase ....................................................................................... 59 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… x 1. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Vi sinh vật trong tự nhiên rất ña dạng và phong phú. Ngày nay vi sinh vật mang lại cho con người nguồn lợi to lớn trong các lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, công nghệ sinh học… Các chủng vi sinh vật nói chung và vi khuẩn Bacillus nói riêng ñang ñược ứng dụng rộng rãi trong các ngành sản xuất là nhờ khả năng sinh các loại enzyme thủy phân của chúng. Enzyme là những chất xúc tác sinh học có hiệu suất xúc tác cao, ñang ngày càng ñược áp dụng rộng rãi trong thực tế với quy mô ngày càng lớn. Ngày nay α - amylase là nhóm enzyme ñược sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp như sản xuất rượu, bia, ñường glucose, lên men bánh mỳ, làm thức ăn gia súc …Với khả năng ứng dụng rộng rãi như vậy nên nhu cầu chế phẩm enzyme này hiện nay rất lớn (ðồng Thị Thanh Thu, 2004). Amylase có thể ñược thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như vi khuẩn, nấm mốc, thực vật và ñộng vật. Tuy nhiên, các chế phẩm α - amylase thương mại ñược ứng dụng nhiều trong công nghiệp chủ yếu ñược sản xuất từ Bacillus sp... ðã có nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu thu nhận chế phẩm α - amylase từ Bacillus sp. Dharani Aiyer (2004) ñã công bố việc sản xuất α - amylase bởi B. licheniform. B. subtilis là loài có tiềm năng lớn về các enzyme ngoại bào. Nhiều trong số các enzyme ngoại bào này là những enzyme thủy phân các phân tử hữu cơ lớn như amylase, protease....Nguồn enzyme α - amylase sử dụng trong nước ta hiện nay chủ yếu nhập khẩu của hãng NOVO ðan Mạch. Vấn ñề thu nhận và tinh sạch enzyme α - amylase từ các loài B. subtilis chưa ñược quan tâm ñúng mức. Có thể ứng dụng enzyme α - amylase sinh tổng hợp bởi loài này sẽ làm giảm ñáng kể chi phí sản xuất. Xuất phát từ thực tế ñó chúng tôi ñã tiến hành nghiên cứu ñề tài "Nghiên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 cứu thu nhận enzyme α - amylase từ Bacillus subtilis”. 1.2. Nội dung ñề tài 1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus từ ñất có hoạt tính amylase mạnh. 2. Xác ñịnh sinh trưởng, sinh tổng hợp enzyme α - amylase của các chủng tuyển chọn. 3. Nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh học của chủng tuyển chọn. 4. Nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh hóa của chủng tuyển chọn. 5. Khảo sát các ñiều kiện nuôi cấy tối ưu ñể thu ñược dịch enzyme α - amylase có hoạt ñộ cao. 5. Tách chiết enzyme α – amylase từ dịch lên men, nghiên cứu ñộ nhiệt ñộ và pH tối thích của enzyme α – amylase. 6. Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột của enzyme α – amylase thu nhận trên nguyên liệu gạo nếp trắng. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1. ðặc ñiểm chung vi khuẩn Bacillus Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong ñất, nước, không khí do chúng có khả năng hình thành bào tử và sống hiếu khí tùy tiện. Phần lớn các chủng thuộc các loài của giống này ñều có khả năng sinh ra nhiều amylase và protease kiềm, có một số chủng sinh ra cenlulase. Bacillus là vi khuẩn Gram dương, hình que có kích thước khác nhau (0,5-2,5) x (l,2-10) µm. Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di ñộng. Chúng sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện. Bacillus là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng, hoại sinh thu năng lượng nhờ oxi hóa các hợp chất hữu cơ, chúng sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện. Bacillus có khả năng sinh bào tử. Thông thường bào tử ñược tạo ra khi tế bào ñã trải qua giai ñoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dưỡng. Mỗi tế bào dinh dưỡng sinh ra một bào tử. Khi bào tử trưởng thành tế bào dinh dưỡng tự phân giải, bào tử ñược giải phóng ra khỏi tế bào mẹ. Các tế bào Bacillus ñặc trưng là sinh bào tử mà vẫn giữ hình dáng trực khuẩn khi mang bào tử, trong một số trường hợp tế bào vi khuẩn chỉ phình to một ít khi chứa bào tử. Tùy loài mà bào tử có thể nằm chính tâm, lệch tâm hay gần ñầu tế bào. Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều ñộc tố, vì chúng có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm. Bào tử của vi khuẩn không phải là một hình thức sinh sản mà chúng chỉ là một hình thức thích nghi ñể giúp vi khuẩn vượt qua những ñiều kiện sống bất lợi của môi trường. Bào tử ở dạng tự do không có quá trình trao ñổi chất, khi gặp ñiều kện thuận lợi mỗi bào tử cho ra một tế bào sinh dưỡng (www.answers.com/ topic/bacillus-1). ða số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số Bacillus phù hợp với pH = 9 - 10 như B. alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 như B. acidocaldrius. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 3 Nhiều chủng Bacillus ưa nhiệt ñộ cao (45°C - 75°C), hay ưa lạnh (5°C - 25°C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt ñộ 34°C - 37°C. Hầu hết Bacillus không gây bệnh cho người và ñộng vật. Một số loại gây bệnh cho côn trùng như B.thuringiensis, B.polliae, B. lentimorrbus, B. cereus, B. antharacis…ña số trong tự nhiên là có ích (http://www.amitech.co.kr/customer/img/img_08.jpg). Vi khuẩn thuộc chủng Bacillus có tiềm năng lớn về các enzyme ngoại bào. Nhiều trong số các enzyme ngoại bào này là những enzyme thủy phân các phân tử hữu cơ lớn như amylase, protease.... Vi khuẩn thuộc chi Bacillus ñã, ñang và ngày càng trở thành những vi sinh vật hàng ñầu về mặt ứng dụng. Các ứng dụng của chúng bao gồm hàng loạt lĩnh vực từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống ñến công nghệ lên men hiện ñại ñến sinh học phân tử, y – dược học, mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc từ các phế liệu. 2.1.2. Vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1.1. Lịch sử phát triển B. subtilis ñược phát hiện lần ñầu tiên trong phân ngựa bởi Tổ chức y học Nazi của ðức (1941). Lúc ñầu, chủ yếu ñược sử dụng ñể phòng bệnh lị cho các bệnh nhân ðức chiến ñấu ở Bắc Phi. Việc sử dụng ñể ñiều trị bệnh ñược áp dụng những năm 1949 - 1957 khi Henry, Albot và các cộng sự tách ñược các chủng thuần khiết của B. subtilis. Từ ñó, “subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra ñời trị các chứng viêm ruột, viêm ñại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn B. subtilis ñược sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi, y học, thực phẩm….(www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html). 2.1.1.2. ðặc ñiểm phân loại Theo khoá phân loại của Bergey, vi khuẩn B. subtilis thuộc Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 4 Loài: B. subtilis 2.1.1.3. ðặc ñiểm phân bố Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở ñường ruột, chúng ñược phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, ñất nước…. Phần lớn chúng tồn tại ở trong ñất, thông thường ñất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. ðất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, ñất hoang thì B. subtilis rất hiếm. Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào sinh dưỡng B. subtilis (.www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages) 2.1.1.4. ðặc ñiểm hình thái B. subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện, thường ñược tìm thấy trong ñất, cỏ khô. Có khả năng di ñộng, sinh nội bào tử. Tế bào sinh dưỡng có dạng hình que, kích thước chiều rộng từ 0,7 – 0,8 µm, chiều dài từ 2,0 – 3,0 µm, không kết thành chuỗi, bắt phẩm nhuộm ñồng ñều, không tạo bao nang. Hình 2.1. Tế bào Bacillus subtilis (URL: http://www.ami-tech.co.kr/customer/img/img_08.jpg) Một trong những ñặc ñiểm quan trọng của B. subtilis là khả năng tạo bào tử trong những ñiều kiện nhất ñịnh. B. subtilis có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp ñiều kiện bất lợi như dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ, nhiệt ñộ quá cao…(Tô Minh Châu, 2000). Bào tử B. subilis có dạng ellip ñến hình cầu, kích thước chiều rộng 0,6 - 0,9 µm, chiều dài 1,0 – 1,5 µm, nằm giữa hay trong khoảng trung tâm ñến Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 5 gần cuối tế bào, phần lớn ñược tạo thành sau 48 giờ. Mỗi cá thể chỉ tạo một bào tử, bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm. Khi nuôi cấy trên môi trường thạch ñĩa khuẩn lạc tròn, không ñều hay phân tán. ðường kính khuẩn lạc từ 3 – 5 mm, màu trắng ñục hoặc vàng xám, rìa có hình răng cưa. Sau1 – 4 ngày bề mặt khuẩn lạc nhăn, màu hơi nâu. 2.1.1.5. ðặc ñiểm sinh hoá Trong môi trường lỏng sinh khối tạo màng mỏng có lớp bao phủ. Do bào tử chịu nhiệt cao nên B. subtilis có thể gây hư hỏng một số thực phẩm hộp tạo mùi vị khó chịu. B. subtilis sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và mannitol nhưng không tạo khí (sử dụng nguồn nitơ là muối amonium). Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrit từ nitrate. Trong ñiều kiện kỵ khí, không sinh khí từ môi trường lỏng chứa nitrate. Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis Phản ứng sinh hóa Kết quả Sinh Indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử Nitrate + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Nguyễn Lân Dũng, 1976). Nhiệt ñộ tối thích của B. subtilis vào khoảng 36 – 50 oC. Nhiều loài vẫn phát triển ñược ở 60oC. Nồng ñộ muối ăn làm ngừng phát triển là 10 – 15% (Lương ðức Phẩm, 2010). B. subtilis có tập tính “ăn lẫn nhau” (cannibalism). Chúng dùng cách Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 6 này như một phương pháp ñơn giản ñể thoát khỏi những trường hợp ñiều kiện sống giới hạn. B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như: subtilin, subtilosin A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillanene, difficidin… B. subtilis phân bố trong ñất, các chất hữu cơ bị phân hủy và là một ñối tượng dùng trong nghiên cứu khả năng lây bệnh trong phòng thí nghiệm. B. subtilis không ñược xem là mầm bệnh gây bệnh cho người. Chúng thường có trong thực phẩm nhưng hiếm khi gây ngộ ñộc thực phẩm (www.foodnews.ch/ Begriffsglossar_B.html ). 2.1.1.6 Ứng dụng của B. subtilis Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc, B. subtilis là một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lượng khá lớn (15-20%) từ tinh bột. Trong y dược, B. subtilis ñược ñóng thành ống thuốc Subtilis 10 ml trị bệnh tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn Coliform gây ra, bệnh dường ruột do lị trực tràng, ñắp các vết thương lở loét ngoài da. B. subtilis ñược dùng sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae,... Người ta thấy rằng sự phát triển của B. subtilis trong cây làm tăng khả năng tổng hợp các peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ (Rhizobacterium). Khả năng này ñược ứng dụng trong kiểm soát sinh học. B.subtilis ñược ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) bổ sung trong thức ăn nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trưởng; giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc; bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi. Hệ enzyme của B. subtilis ñược sử dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa. Chúng có thể biến ñổi các dạng chất thải ñộc hại thành những dạng hợp chất vô hại của nitrogen, carbon dioxide, và nước. Một chủng B. subtilis ñược biết trước ñây là B. natto ñược dùng trong Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 7 sản xuất thực phẩm thương mại của Nhật tương tự như thực phẩm cheonggukjang của Hàn Quốc. B. subtilis tái tổ hợp ñược sử dụng trong sản xuất polyhydroxyalkanoates (PHA) và chúng có thể sử dụng malt phế thải như là nguồn cacbon, nhờ vậy chi phí sản xuất PHA giảm. 2.1.3. Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên 2.1.3.1. Bacillus mesentericus B. mesentericus còn ñược gọi là trực khuẩn khoai tây do chúng có mặt chủ yếu trên khoai tây. Chúng gần giống B. subtilis, khuẩn lạc ăn sâu và bám chặt vào môi trường thạch, bề mặt nhăn, khô, không mọc lan ra môi trường, màu xám nhạt – trắng, hoặc hơi vàng nâu, hoặc hồng như B. rubber hoặc ñen như B. niger. B. mesentericus sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt ñộ 36 - 45 o C, tối ña 50 – 55 oC, pH = 4,5 - 5 thì ngừng phát triển. B. mesentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn B. subtilis nhưng lên men ñường lại kém hơn. B. mesentericus và B. subtilis rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các loại thực phẩm chứa nitơ và các sản phẩm giàu ñường (bánh kẹo, hoa quả…). Ngoài ra chúng còn sinh một loại hợp chất có tính kháng một số vi khuẩn khác gọi là bacterioxin, ở B. subtilis gọi là subtilin. 2.1.3.2. Bacillus cereus Vi khuẩn này có mối quan hệ gần gũi với vi khuẩn B. anthracis, B. mycodes, B.thurigiensis. Bào tử của chúng có hình bầu dục, kích thước khoảng 0.9 * (1.2 – 1.5) µm, nằm lệch tâm, phát tán khắp nơi, trong ñất, trong không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ñộc tố làm cho thực phẩm hư hỏng và gây ngộ ñộc thực phẩm. Tế bào của B. cereus dầy, kích thước (1 – 1,5 * 3 – 5) µm có khi dài hơn, ñứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. Khuẩn lạc của B. cereus phẳng, hơi lõm, nề Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 8 mặt hơi xù xì (dạng bột, hoặc hạt nhỏ) trắng ñục, mép lồi lõm. 2.1.3.3. Bacillus megaterium Tế bào B. megaterium khá lớn, kích thước (1,2 – 1,5) * (3 – 12) µm. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dự trữ (hạt mỡ, glycogen). Bào tử lớn, hình oval hay bầu dục, kích thước 1,5 * (0,7 – 1) µm, chúng nằm lệch tâm hướng theo chiều ngang hoặc chiều xiên của tế bào. Khuẩn lạc tròn ñều, lồi nhẵn nhưng thường có vòng viền quanh khuẩn lạc hoặc các vòng ñồng tâm trên bề mặt, không thùy, không nếp, mép tròn ñều hay lượn sóng, màu trắng sữa hay ñục, có khi có màu nâu nhạt. B. megaterium sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng ñơn giản không cần thêm bất cứ yếu tố dinh dưỡng nào khác. 2.1.3.4. Bacillus pumilus Bào tử phát tán rộng, có mặt trong ñất nhiều hơn B. bacillus. Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của nó gần giống tế bào B. subtilis. 2.1.3.5. .Bacillus polymyxa Kích thước tế bào khoảng (0,6 - 1) * (2 - 7) µm, ñứng riêng rẽ hoặc xếp thành ñôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào sẽ phồng lên hình quả chanh. Bào tử hình bầu dục kéo dài khoảng (1,7 – 2,6) µm, trên bề mặt cắt ngang như hình sao, nằm giữa tế bào, chúng phát tán rộng. Khuẩn lạc của B. polymyxa không màu, phẳng hoặc lồi, trơn, lan dần ra xung quanh, mép ñôi khi có thùy. Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật ñang bị hỏng. Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. chúng là nguồn ñể sản xuất kháng sinh polymyxin. 2.1.3.6. Bacillus simplex Tế bào B. simplex nhỏ bé, kích thước (2 - 5) * 0,6 µm, thường ñứng riêng rẽ, không xếp thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục có kích thước 0.6 * 0.9 µm, nằm lệch tâm. Khuẩn lạc B. simplex giống khuẩn lạc B. cereus, chỉ khác là khuẩn lạc B. simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 9
- Xem thêm -