Tài liệu Nghiên cứu thu nhận chitosan từ nang mực bằng phương pháp hóa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM --- o0o --- NGUYỄN THỊ GIANG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHITOSAN TỪ NANG MỰC BẰNG PHƢƠNG PHÁP HÓA HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: PGS.TS. TRANG SĨ TRUNG ThS. NGUYỄN CÔNG MINH NHA TRANG, 06/2014 i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp vừa qua, mặc dù đã rất cố gắng nhƣng tôi cũng gặp rất nhiều khó khăn, để hoàn tốt thành tốt đề tài tốt nghiệp, tôi đã nhận đƣợc sự quan tâm, giúp đỡ tận tình từ phía gia đình, thầy cô và bạn bè. Tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn đến: Gia đình đã động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành tốt quá trình học tập trong những năm học qua. Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Nha Trang, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm và các thầy cô đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích trong 4 năm học tập tại trƣờng. Em chân thành cảm ơn thầy Trang Sĩ Trung, thầy Nguyễn Công Minh, thầy Hoàng Ngọc Cƣơng và cô Phạm Thị Đan Phƣợng đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian em thực hiện đề tài tốt nghiệp. Em xin cảm ơn quý thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện tốt nhất để em thuận lợi hoàn thành đề tài của mình, cùng toàn thể các bạn lớp 52TP2 và các bạn trên phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài. Khánh Hòa, tháng 6 năm 2014 Nguyễn Thị Giang ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i MỤC LỤC........................................................................................................................ ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.......................................................................................... iv DANH MỤC BẢNG........................................................................................................ v DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ vi MỞ ĐẦU.......................................................................................................................viii Chƣơng 1. TỔNG QUAN ................................................................................................ 1 1.1. Giới thiệu chung về phế liệu nang mực ............................................................1 1.2. Tổng quan về chitin và chitosan từ nang mực ..................................................1 1.2.1. Chitin từ nang mực .................................................................................... 1 1.2.1.1. Cấu trúc hóa học của chitin ................................................................. 3 1.2.1.2. Đặc điểm, tính chất của chitin ............................................................. 4 1.2.2. Chitosan từ nang mực ................................................................................ 5 1.2.2.1. Cấu trúc hóa học của chitosan ............................................................ 6 1.2.2.2. Đặc điểm, tính chất của chitosan ........................................................ 7 1.2.3. Một số quy trình sản xuất chitin/chitosan từ nang mực ............................ 9 1.2.3.1. Quá trình sản xuất chitin ................................................................... 10 1.2.3.2. Quá trình sản xuất chitosan ............................................................... 13 1.2.3.3. Một số quy trình sản xuất chitossan từ nang mực ............................ 18 1.2.4. Ứng dụng của chitosan ............................................................................ 21 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................. 25 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .....................................................................................25 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................26 2.2.1. Bố trí thí nghiệm tổng quát ...................................................................... 26 2.2.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết .......................................................................... 27 iii 2.2.2.1. Nghiên cứu điều kiện khử protein và khử khoáng nang mực trong quá trình sản xuất β-chitin.............................................................................. 27 2.2.2.2. Nghiên cứu chế độ deacetyl β-chitin để sản xuất chitosan ............... 31 2.2.3. Các phƣơng pháp phân tích ..................................................................... 34 2.2.4. Phƣơng pháp xử lí số liệu ........................................................................ 34 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................................... 35 3.1. Kết quả xác định thành phần hóa học cơ bản của nang mực .........................35 3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến hàm lƣợng protein còn lại của β-chitin trong quá trình khử protein ......................................................................36 3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ khử protein nang mực đến hàm lƣợng protein còn lại của β-chitin ....................................................................................37 3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian xử lý NaOH đến hàm lƣợng protein còn lại của β-chitin. ......................................................................................................39 3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ HCl và thời gian khử khoáng đến hàm lƣợng khoáng còn lại của β-chitin .........................................................................40 3.6. Kết quả đánh giá chất lƣợng của chitin ..........................................................41 3.7. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến chất lƣợng của chitosan .....44 3.8. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ deacetyl của chitosan................45 3.9. Kết quả xác định ảnh hƣởng của thời gian đến DD của chitosan .................46 3.10. Kết quả đánh giá chất lƣợng của chitosan ....................................................48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 52 PHỤ LỤC....................................................................................................................... 55 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu Từ viết tắt A N-acetyl glucosamine D D-glucosamine DD Độ deacetyl h Giờ Mw Phân tử lƣợng RT Nhiệt độ thƣờng v Volume w Weight v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các dung môi thƣờng sử dụng để hòa tan chitosan ....................................7 Bảng 1.2. Tính chất của chitosan ảnh hƣởng bởi có độ deacetyl (Trung, 2006) ........8 Bảng 1.3. Tính chất của một số loại chitosan thƣơng mại (Cho, 1998) .....................9 Bảng 1.4. Các điều kiện để khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ các nguồn phế liệu khác nhau (No và Mayers, 1997) ................................................................11 Bảng 1.5. Các điều kiện deacetyl thƣờng sử dụng đối với các nguồn chitin khác nhau ...........................................................................................................................14 Bảng 1.6. Độ deacetyl hóa của chitosan ở các điều kiện xử lý khác nhau (Trung và cộng sự, 2006) ...........................................................................................................16 Bảng 1.7. Phân tử lƣợng của chitosan ở các điều kiện deacetyl hóa khác nhau (Methacanon và cộng sự, 2003) ................................................................................17 Bảng 1.8. Một số ứng dụng của chitin, chitosan và dẫn xuất trong thực phẩm ........21 Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản cơ bản của nang mực……………………...35 Bảng 3.2. Hàm lƣợng khoáng còn lại trong β-chitin khi khử khoáng ở ................... 40 Bảng 3. 3. Chỉ tiêu chất lƣợng của β-chitin .............................................................. 42 Bảng 3. 4. Bảng đánh giá chất lƣợng của chitosan ................................................... 49 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của chitin (Einbu, 2007)............................................................. 3 Hình 1.2. Sự sắp xếp của chuỗi polyme của α-chitin, β-chitin, γ-chitin .............................. 3 Hình 1.3. Phổ nhiễu xạ tia X của của α-chitin từ vỏ tôm (a) và β-chitin từ xƣơng mực .... 6 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của chitosan (Einbu, 2007) ........................................................ 6 Hình 1.5: Sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất β-chitin, chitosan từ nang mực. ................. 10 Hình 1.6. Quá trình deacetyl................................................................................................... 15 Hình 1.7. Quy trình thu nhận chitosan từ nang mực của Barwin V. và cộng sự, 2011. ... 18 Hình 1.8. Quy trình thu nhận chitosan từ nang mực của Chandumpai, A., 2004 ............. 18 Hình 1.9. Quy trình thu nhận β-chitin của Huang, J., 2012................................................. 19 Hình 1.10. Quy trình thu nhận β-chitin của Methacanon, P., 2003 .................................... 19 Hình 1.11. Quy trình thu nhận β-chitin từ nang mực của Tolaimate, 2000....................... 20 Hình 2.1. Nang mực (Squid pen) ........................................................................................... 25 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát.......................................................................... 26 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ NaOH trong quá trình khử protein. ..................................................................................................................... 27 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của nhiệt độ trong quá trình khử protein .. 28 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của thời gian trong quá trình khử protein . 29 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ HCl trong quá trình khử khoáng............................................................................................................................... 30 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ trong quá trình deacetyl để sản xuất chitosan. ................................................................................................ 32 vii Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian trong quá trình deacetyl để sản xuất chitosan. ................................................................................................ 33 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến hàm lƣợng protein còn lại của β-chitin... 36 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hàm lƣợng protein còn lại của β-chitin ............... 38 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian đến hàm lƣợng protein còn lại của chitin ................. 39 Hình 3.4. Sơ đồ sản xuất β-chitin........................................................................................... 42 Hình 3.5. β-chitin ..................................................................................................................... 42 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến độ deacetyl của chitosan .......................... 44 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ DD của chitosan............................................... 45 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của thời gian đến DD và Mw của chitosan ..................................... 46 Hình 3. 9. Sơ đồ sản xuất chitosan......................................................................................... 48 Hình 3. 10. Chitosan................................................................................................................ 49 viii MỞ ĐẦU Việt Nam một quốc gia có đƣờng bờ biển dài vì vậy nguồn lợi về thủy sản rất phong phú và giàu tiềm năng phát triển. Hằng năm, ngành khai thác và đánh bắt thủy sản đã góp phần không nhỏ vào sự phát triển của nền kinh tế quốc dân, là một trong những ngành kinh tế trọng tâm của nƣớc ta. Lƣợng thủy sản khai thác đƣợc mỗi năm rất lớn vì vậy lƣợng phế liệu cũng không nhỏ, nguồn phế liệu chủ yếu để chế biến thức ăn cho chăn nuôi, một phần lớn thải ra môi trƣờng, nhƣ vậy sẽ rất lãng phí và gây ô nhiễm môi trƣờng. Việc tận dụng nguồn phế liệu từ thủy sản là một vấn đề cấp bách và rất cần thiết hiện nay. Phế liệu từ thủy sản nhƣ tôm, cua, mực là một nguồn dồi dào để sản xuất chitin/chitosan, hiện nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất chitin/chitosan và đã đƣa vào sản xuất. Đó là một giải pháp hiệu quả trong việc tận dụng nguồn phế liệu này, vừa đem lại lợi ích về kinh tế, vừa không gây ô nhiễm môi trƣờng. Hơn nữa chitosan đang đƣợc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nhƣ nông nghiệp, y tế, thực phẩm, mỹ phẩm, chế biến…Chitosan có nhiều hoạt tính tốt nhƣ có khả năng ức chế nhiều chủng vi sinh vật, có tính kháng khuẩn, kháng nấm tốt, an toàn khi sử dụng và đem lại nhiều lợi ích. Chitin/chitosan đƣợc chiết rút từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhƣ: phế liệu thủy sản, vi nấm, vi khuẩn [4]. Tuy nhiên nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin/chitosan là từ phế liệu thủy sản, đặc biệt là từ phế liệu tôm, cua, mực. Trong đó phế liệu mực (nang mực ống) có hàm lƣợng chitin cao nhất [4], nhƣng việc sử dụng nguồn phế liệu từ mực để sản xuất chitosan còn rất hạn chế. Đã có nhiều nghiên cứu về phƣơng pháp thu nhận chitosan từ nang mực ở những điều kiện khác nhau và chitosan thu đƣợc có chất lƣợng không giống nhau đối với mỗi quy trình sản xuất đó. Để tìm hiểu và nghiên cứu rõ hơn về quy trình sản xuất chitosan từ nang mực trên thực tế tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chitosan từ nang mực bằng phƣơng pháp hóa học”, nhằm xác định các chế độ thích hợp để sản xuất chitin/chitosan từ nang mực. ix Mục ích nghiên cứu: Khảo sát quy trình sản xuất chitin/chitosan, từ đó đề xuất quy trình sản xuất chitosan từ nang mực. N i dung nghiên cứu: 1. Xác định thành phần hóa học cơ bản của nang mực. 2. Xác định chế độ khử khoáng, khử protein của nang mực để thu nhận chitin. 3. Xác định chế độ deacetyl chitin để thu nhận chitosan. 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về phế liệu nang mực Trong những năm qua, ngành thủy sản đã đạt đƣợc những thành tựu đáng kể về kim ngạch xuất khẩu, góp phần giải quyết việc làm và tăng trƣởng kinh tế. Theo số liệu thống kê của Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (Vasep) trong năm 2012, Việt Nam xuất khẩu thủy sản sang 156 thị trƣờng với tổng giá trị là 6,13 tỷ USD. Trong đó mặt hàng mực, bạch tuộc chiếm 8% đạt 502 triệu USD. Nang mực ống chiếm tỷ lệ khoảng 1% trọng lƣợng của mực ống nguyên liệu và đƣợc thải ra sau quá trình gia công, chế biến tại các công ty chế biến xuất khẩu thủy sản. Theo số liệu thống kê của của Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Kiên Giang, lƣợng nang mực ống thải ra từ các nhà máy trung bình từ 5 đến 6 tấn/tháng, cho thấy đây là nguồn nguyên liệu tiềm năng cần đƣợc nghiên cứu và sử dụng. Hiện nay nguồn nguyên liệu này chƣa có biện pháp sử dụng hiệu quả, chủ yếu là phơi khô và bán thô cho các nhà máy chế biến thức ăn chăn nuôi hoặc các thƣơng lái sang thị trƣờng Trung Quốc. (Nguồn: Theo số liệu thống kê của Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (Vasep) trong năm 2012). 1.2. Tổng quan về chitin và chitosan từ nang mực 1.2.1. Chitin từ nang mực Chitin đƣợc phát hiện đầu tiên bởi một giáo sƣ ngƣời Pháp H. Braconnot năm 1811 khi ông nghiên cứu về bản chất của các loài nấm [4]. Ông đã mô tả một loại vật liệu không hòa tan trong kiềm từ các loài nấm bậc cao, ông đặt tên là “fungine” [4]. Hai mƣơi năm sau, Odier đã tách chiết đƣợc một đoạn tƣơng tự từ vỏ côn trùng, theo gốc từ Hy Lạp là “chitin” có nghĩa là vỏ bọc [4]. Năm 1859, C. Rouget nghiên cứu cho thấy khi saponin hóa chitin sẽ thu đƣợc chitosan. Năm 1878, G. Ledderhose tìm thấy khi thủy phân chitin sẽ thu đƣợc glucosamin và acid acetic. Nhiều công trình sau đó phát hiện chitin từ nhiều nguồn gốc khác nhau nhƣ: tôm, cua, nhện, mực; các cơ thể sống nhƣ nấm, rong, Protozoa…Quá trình sinh tổng hợp 2 chitin trong tự nhiên rất lớn. Chỉ tính riêng cho các loài giáp xác trong thủy quyển (hydrosphere), ƣớc tính khối lƣợng chitin sinh tổng hợp mỗi năm khoảng 2,3.10 9 tấn (Jeuniaux et al, 1993) [4]. Chitin có thể tìm thấy trong thành phần cấu tạo của nhiều sinh vật dƣới nƣớc, trên mặt đất và trong một số vi sinh vật (Tokura và Tamura 2007). Ngày nay chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng đƣợc thu nhận và nghiên cứu ứng dụng ở quy mô công nghiệp trong nhiều lĩnh vực chủ yếu là từ nguồn phế liệu thủy sản nhƣ vỏ tôm, cua, gh và xƣơng mực (Crestini et al. 1996, Nwe và Stevens 2008). Đóng vai trò là thành phần chính tạo nên độ cứng chắc trong cấu trúc vỏ, khung xƣơng của các loài giáp xác, chân đốt nhƣ tôm, cua, mực, côn trùng, chitin còn có mặt trong vách tế bào nấm (Jooyeoun et al, 2011). Trong tự nhiên chitin ít khi ở dạng tự do mà luôn liên kết với các thành phần khác dƣới dạng phức hợp nhƣ protein, cacbonat canxi và nhiều hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách chiết, thu nhận (Rodrigo et al., 2007; Trung et al, 2010) [4]. Theo Entsar S. (2008) trong xƣơng mực β-chitin chiếm khoảng 49% [10], Ge’raldine (2004) đã công bố thành phần β-chitin chiếm 32,5%, protein chiếm 42,5% và hàm lƣợng khoáng 2,4% trong xƣơng mực [9], Brine và Austin (1981) sau khi phân tích hóa sinh cho thấy hàm lƣợng β-chitin trong xƣơng mực chiếm từ 35-50% trọng lƣợng khô [8]. Tuy nhiên các thông tin chi tiết về nguồn nguyên liệu này còn hạn chế, đây là một rào cản khi tiếp cận với nguồn nguyên liệu xƣơng mực. Nghiên cứu của Muzzarelli và Jeuniaux (1976) cho thấy chitin thu nhận từ vỏ của các loài giáp xác có sự khác nhau về cấu trúc và các tính chất hóa lý với chitin thu nhận từ xƣơng của động vật thân mềm. Nghiên cứu của Kurita (1993) đã sử dụng xƣơng mực Ommastrephes bartramias làm nguyên liệu nghiên cứu và kết luận rằng β-chitin có khả năng hòa tan cao trong một số dung môi khác nhau và phản ứng deacetyl làm thay đổi về cấu trúc hóa học lớn hơn α-chitin [14]. 3 1.2.1.1. Cấu trúc hóa học của chitin Chitin là polyme hữu cơ phổ biến trong tự nhiên. Chitin tồn tại dƣới dạng phức hợp, liên kết với protein, cacbonat canxi và nhiều hợp chất hữu cơ khác, vì vậy việc tách chiết chitin rất khó khăn và phức tạp. Chitin là một polysaccharit có công thức phân tử là (C8H13O5N)n, đƣợc cấu tạo bởi các monosaccharit liên kết với nhau nhờ cầu nối 1,4 – glucosid [4], [17], [24]. Cấu trúc hóa học của chitin: Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của chitin (Einbu, 2007) Dựa vào cấu trúc, chitin đƣợc chia thành ba dạng α-chitin, β-chitin và γchitin. Cấu trúc của chitin ở các dạng trên xuất phát từ nguồn thu nhận, -chitin từ vỏ tôm cua, β-chitin từ xƣơng mực và γ-chitin thu nhận đƣợc từ vi nấm, vi khuẩn (Jooyeoun et al., 2011). Ba dạng chitin nêu trên có sự khác nhau về tính hydrat hóa, kích thƣớc của mỗi đơn vị cấu trúc và số mạch chitin trong mỗi đơn vị cấu trúc (Hình 1.2) [4], [18]. Hình 1.2. Sự sắp xếp của chuỗi polyme của α-chitin, β-chitin, γ-chitin 4 - α-chitin có độ rắn phân tử cao nhất và ở dạng rắn chắc, các mạch chitin sắp xếp song song nhƣng ngƣợc chiều nhau. - β-chitin bao gồm các mạch chitin song song cùng chiều nhau, có độ rắn thấp, tính hydrat hóa cao. - γ-chitin sắp xếp cứ 2 mạch song song cùng chiều thì có một mạch ngƣợc chiều. Trong tự nhiên, α-chitin có mặt nhiều nhất và thƣờng rất cứng. Trong khi βchitin, γ-chitin thì tạo nên tính dai, dẻo [4], [8]. 1.2.1.2. Đặc iểm, tính chất của chitin Chitin là polymer kị nƣớc (Hydrophobic polymer) có cấu trúc hóa học giống cellulose và có thể xem là một dẫn xuất của cellulose với nhóm acetamido ở cacbon số 2, đƣợc cấu tạo bởi các monosaccharit liên kết với nhau bằng cầu nối –1,4– glucosid, có công thức phân tử là (C8H13O5N)n [10 ]. Chitin có màu trắng, có tính kỵ nƣớc cao đặc biệt đối với α-chitin, tính không tan của chitin là do chitin có cấu trúc chặt chẽ, các liên kết trong và liên phân tử mạnh thông qua các nhóm hydroxyl và acetamide. Tuy nhiên, cần lƣu ý là β-chitin không giống nhƣ α-chitin, có tính trƣơng nở với nƣớc cao (Neal S. 2011) [4]. Chitin bền trong môi trƣờng kiềm nhƣng lại kém bền trong môi trƣờng acid. Chitin không tan trong nƣớc, trong môi trƣờng kiềm và trong môi trƣờng acid loãng và trong dung môi hữu cơ nhƣ ête, rƣợu do chitin có cấu trúc chặt chẽ, có liên kết trong và liên phân tử mạnh thông qua các nhóm hydroxyl và acetamide nhƣng nó lại tan trong một số acid vô cơ đậm đặc: H2SO4, HCl, H3PO4 và dimethylacetamide chứa 5% lithium chloride [1], [5]. Chitin là một polysaccharide có nguồn gốc tự nhiên, có hoạt tính sinh học cao, có tính chất hòa hợp sinh học và tự phân hủy trên da. Chitin bị men Lysozym, một loại men chỉ có ở cơ thể ngƣời, phân giải thành monome N-acetyl-Dglucosamine [2], [5], [10]. 5 Chitin kết tinh ở dạng vô định hình, rất khó tan trong dung dịch amoniac (NH3), không hòa tan trong thuốc thử Schueizer - Sacrpamonia. Điều này có thể do sự thay đổi nhóm hydroxy (-OH) tại vị trí C2 bằng nhóm acetamic (NHCOCH3) đã ngăn cản đƣợc sự tạo thành các phức hợp cần thiết [3], [5]. Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc thì chitin sẽ bị khử mất gốc acetyl tạo thành chitosan. Khi đun nóng chitin trong dung dịch acid HCl đậm đặc thì chitin sẽ bị thủy phân tạo thành glucosamine 85,8%, acid acetic 14,5% có hoạt tính sinh học cao [4], [5]. 1.2.2. Chitosan từ nang mực Chitosan là một dẫn xuất của chitin đƣợc hình thành khi deacetyl hoá chitin, tách nhóm acetyl khỏi chitin nên chitosan chứa rất nhiều nhóm amino. Chitosan đƣợc phát hiện lần đầu tiên bởi Rouget vào năm 1859. Chitosan thƣờng ở dạng vẩy hoặc dạng bột có màu trắng ngà. Về cơ bản công thức cấu tạo của chitosan gần giống nhƣ chitin và cellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhóm amin ở cacbon thứ 2 [4], [24]. Chitosan từ nang mực là sản phẩm của quá trình deacetyl β-chitin, nó là một polysaccharide đa năng, tốc độ phản ứng cao hơn so với chitosan từ các động vật giáp xác có nguồn gốc α-chitin [17]. β-chitin bao gồm các mạch chitin song song cùng chiều nhau, có độ rắn thấp, tính hydrat hóa cao và tạo nên tính dai, dẻo [4], So với α-chitosan thì việc nghiên cứu β-chitosan còn hạn chế và chủ yếu từ loài mực Loligo, trọng tâm của quá trình nghiên cứu chủ yếu là việc tối ƣu hóa quá trình deacetyl [11], [23]. Mực ống Jumbo đứng vị trí thứ ba về việc đánh bắt mực ống (12,8% ,406.356 tấn) trên toàn thế giới và một số nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng việc sử dụng β-chitosan từ các loài mực khác về tính chất tạo màng và kháng [5], [12]. Chitin và chitosan có cấu trúc rắn chắc và độ rắn cao so với các polyme sinh học khác, độ rắn biến đổi tùy theo từng loại chitin đƣợc chiết rút từ các nguồn nguyên liệu khác nhau [4]. 6 Hình 1.3. Phổ nhiễu xạ tia X của của α-chitin từ vỏ tôm (a) và β-chitin từ xƣơng mực Phổ nhiễu xạ tia X của của α-chitin từ vỏ tôm (a) và β-chitin từ xƣơng mực cho thấy ở mẫu α-chitin có vòng nhiễu xạ mạnh, ở vòng trong thì không có tính hydrat hóa mạnh. Trong khi ở mẫu β-chitin thì có vòng tƣơng tự nhƣng có vòng nhiễu xạ yếu hơn, và có tính hydrat hóa mạnh [4]. 1.2.2.1. Cấu trúc hóa học của chitosan Chitosan là một polysaccharide có nguồn gốc thiên nhiên từ các phân tử -βD-glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết 1,4- glucozit [4]. Công thức cấu tạo của chitosan: Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của chitosan (Einbu, 2007) 7 1.2.2.2. Đặc iểm, tính chất của chitosan Không giống nhƣ chitin chỉ tan trong một số ít hệ dung môi, chitosan tan tốt trong các acid hữu cơ thông thƣờng nhƣ acid formic, acid acetic, acid propionic, acid citric, acid lactic. Khi hoà tan trong môi trƣờng acid loãng chitosan tạo thành dung dịch keo dƣơng, đây là một điểm rất đặc biệt vì đa số các keo polysaccharit tự nhiên tích điện âm. Chitosan tích điện dƣơng sẽ có khả năng bám dính bề mặt các ion tích điện âm và có khả năng tạo phức với các ion kim loại và tƣơng tác tốt với các polyme tích điện âm. Một số dung môi thƣờng sử dụng để hòa tan chitosan đƣợc trình bày ở Bảng 1.1. Tuy nhiên cần chú ý là chitosan không hoà tan trong nƣớc, kiềm và cồn, tan trong môi trƣờng acid loãng (pH= 6 ÷ 6,5) tạo dung dịch keo nhớt, trong suốt, có hoạt tính sinh học cao, có tính kháng nấm, kháng khuẩn [5]. Bảng 1.1. Các dung môi thƣờng sử dụng ể hòa tan chitosan Dung môi Nồng thƣờng sử dụng (%) Acid acetic 1-2 Acid formic 1-2 Acid lactic 1-2 Acid propionic 1-2 Acid HCl 0,25-0,5 Acid citric 5-10 Acid glutamic 1-3 Acid ascorbic 1-2  Đ deacetyl của chitin và chitosan Độ deacetyl của chitin và chitosan đặc trƣng cho tỉ lệ giữa 2-acetamido-2deoxy-D-glucopyranose với 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose trong phân tử chitin 8 và chitosan. Chitosan có độ deacetyl cao hơn chitin, tức là chứa nhiều nhóm amino hơn [4]. Chitosan có khả năng hút nƣớc tốt, hấp phụ chất màu, kim loại, kết dính với chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm, tính chất của chitosan phụ thuộc rất lớn vào độ deacetyl. Chitosan có độ deacetyl cao thì có khả năng hấp phụ chất màu, tạo phức với kim loại tốt và khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt hơn. Chitosan kháng khuẩn tốt khi độ deacetyl trên 90% [3], [5]. Sự phân bố của các nhóm glucosamine ảnh hƣởng đến tính chất của chitosan. Chitosan phân bố dạng rời rạc thì dễ tan hơn chitosan phân bố dạng khối [4]. Dạng phân bố dạng random (rời rạc) của phân tử chitosan: D-D-A-D-D-A-A-D-D-D-A-D-D-A-D-D-A-ADạng phân bố dạng block (dạng khối) của phân tử chitosan: D-D-D-D-D-D-D-D-D-A-A-A-A-A-A-A-A-ATrong đó: D: D-glucosamine, A: N-acetyl glucosamine. Bảng 1.2. Tính chất của chitosan ảnh hƣởng bởi có Chitosan với deacetyl (Trung, 2006) deacetyl khác nhau Tính chất 75% Độ nhớt (cP) 87% 96% 111,2 ± 9,5 103,4 ± 7,9 107,3 ± 9,6 Tính thấm nƣớc (%) 659 ± 33 472 ± 35 486 ± 29 Độ tan (%) 99,4 ± 0,1 99,6 ± 0, 3 99,5 ± 0,2 Trên thị trƣờng hiện nay có rất nhiều loại chitosan với tính chất và chất lƣợng rất khác nhau, thể hiện rất rõ ở hàm lƣợng protein, khoáng, độ deacetyl và độ nhớt (Bảng 1.3) do đó các tính chất công nghệ cũng rất khác nhau [4]. 9 Bảng 1.3. Tính chất của m t số loại chitosan thƣơng mại (Cho, 1998) Sản phẩm Hàm lƣợng nitơ (%) Hàm lƣợng Đ deacetyl Mật khối Đ nhớt khoáng (%) (%) (g/ml) (cps) 1 7,13 ± 0,00 0,3 ± 0,1 90,6 ± 0,0 0,26 ± 0,02 120 ± 3 2 7,16 ± 0,03 0,2 ± 0,1 89,9 ± 1,1 0,38 ± 0,01 444 ± 6 3 7,14 ± 0,08 1,0 ± 0,2 83,0 ± 0,0 0,28 ± 0,00 1928 ± 11 4 6,91 ± 0,28 0,2 ± 0,1 72,5 ± 0,0 0,38 ± 0,01 72 ± 3 5 7,00 ± 0,05 1,7 ± 0,3 86,9 ± 1,1 0,20 ± 0,01 768 ± 8  Phân tử lƣợng của chitosan Phân tử lƣợng của chitosan quyết định đến tính chất của chitosan nhƣ khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ chất màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật. Chitosan có phân tử lƣợng càng lớn thì có độ nhớt càng cao. Phân tử lƣợng của chitosan nằm trong khoảng từ 100.000 dalton đến 1.200.000 dalton (Li và cộng sự, 1997). Chitosan có phân tử lƣợng thấp thƣờng có hoạt tính sinh học cao hơn, ứng dụng trong nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học. Chitosan có phân tử lƣợng lớn có khả năng tạo màng tốt và màng chitosan tạo thành có sức căng tốt. Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào độ deacetyl, cƣờng độ ion, pH, nhiệt độ và phân tử lƣợng. Chitosan có phân tử lƣợng thấp có độ nhớt từ 30-200 cps và chitosan có phân tử lƣợng lớn hơn 1 triệu dalton có độ nhớt lên đến 3000-4000 cps [4], [6]. 1.2.3. M t số quy trình sản xuất chitin/chitosan từ nang mực Trong quá trình sản xuất chitin cần phải khử các hợp chất phi chitin (protein, chất khoáng, lipid và các hợp chất khác với hàm lƣợng biến đổi tùy theo loại nguyên liệu) ra khỏi chitin. Có nhiều phƣơng pháp để khử các thành phần phi chitin để sản xuất chitin từ phế liệu thủy sản nhƣ: phƣơng pháp hóa học, phƣơng pháp sinh học hoặc phƣơng pháp kết hợp hóa học với sinh học. Hiện nay, quá trình sản 10 xuất chitin đƣợc thực hiện ở quy mô lớn nên chủ yếu sử dụng phƣơng pháp hóa học. Phƣơng pháp hóa học có nhiều ƣu điểm nhƣ nhanh, đơn giản, dễ thực hiện ở qui mô lớn. Tuy nhiên, sản xuất theo phƣơng pháp này sản phẩm chitin, chitosan có phân tử lƣợng thấp, độ nhớt thấp, dƣ lƣợng hóa chất lớn, gây ô nhiễm môi trƣờng, ăn mòn thiết bị [4]. Quy trình sản xuất chitin/chitosan tổng quát từ nang mực đƣợc trình bày ở Hình 1.5. Nang mực Khử protein Khử khoáng β-chitin Deacetyl Chitosan Hình 1.5: Sơ ồ tổng quát quá trình sản xuất β-chitin, chitosan từ nang mực. 1.2.3.1. Quá trình sản xuất chitin Quy trình sản xuất β-chitin từ nang mực bằng phƣơng pháp hóa học gồm các công đoạn khử protein, khử khoáng. Tất cả các công đoạn trên đều đƣợc xử lý bằng hóa chất, tùy theo loại nguyên liệu, công nghệ, và yêu cầu về chất lƣợng sản phẩm chitin mà các điều kiện xử lý sẽ khác nhau [4].  Quá trình khử protein Quá trình khử protein từ nang mực và từ phế liệu thủy sản khác có thể thực hiện với nhiều hóa chất nhƣ: NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, Ca(OH)2.