Tài liệu Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------------------- HOÀNG THỊ NƢƠNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VANCOMYCIN TỪ MÔI TRƢỜNG LÊN MEN CHỦNG XẠ KHUẨN S. orientalis LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ----------------------- HOÀNG THỊ NƢƠNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VANCOMYCIN TỪ MÔI TRƢỜNG LÊN MEN CHỦNG XẠ KHUẨN S. orientalis LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60420201 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Nguyễn Phƣơng Nhuệ THÁI NGUYÊN – 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 9 năm 2015 Tác giả Hoàng Thị Nƣơng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Phương Nhuệ - phó trưởng phòng Công nghệ lên men - Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn những tình cảm quý báu đó. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Khoa Khoa học Sự Sống, Trường Đại học Khoa học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bạn bè, những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 9 năm 2015 Tác giả Hoàng Thị Nƣơng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu....................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3 1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh vancomycin ................................................. 3 1.1.1. Lịch sử phát triển và ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomycin... 3 1.1.2. Cấu trúc phân tử và đặc tính hóa lý của vancomycin ......................... 4 1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của vancomycin................................................... 7 1.1.4. Sinh tổng hợp vancomycin ở xạ khuẩn ................................................. 8 1.2. Nguồn nguyên liệu có ở Việt Nam dùng cho lên men sinh vancomycin . 12 1.2.1. Nguồn bột đao ..................................................................................... 12 1.2.2. Nguồn cao nấm men ........................................................................... 12 1.3. Tối ƣu hóa môi trƣờng .............................................................................. 13 1.3.1. Khái niệm về tối ưu môi trường .......................................................... 13 1.3.2. Phương pháp bề mặt đáp ứng............................................................. 14 1.4. Phƣơng pháp tách chiết vancomycin ........................................................ 15 1.4.1. Tách chiết bằng dung môi hữu cơ ...................................................... 15 1.4.2. Tách chiết bằng hấp phụ..................................................................... 16 1.4.3. Tách chiết bằng trao đổi ion ............................................................... 18 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 22 2.1. Vật liệu ...................................................................................................... 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.1.1. Đối tượng ............................................................................................ 22 2.1.2. Hóa chất .............................................................................................. 22 2.1.3. Dụng cụ ............................................................................................... 22 2.2. Môi trƣờng nghiên cứu ............................................................................. 22 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................... 24 2.3.1. Phương pháp bảo quản giống ............................................................ 24 2.3.2. Nhận biết đặc điểm sinh học của chủng S. orientalis 4912................ 24 2.3.3. Phương pháp lên men ......................................................................... 25 2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh ...................................... 27 2.3.5. Phương pháp tách chiết vancomycin .................................................. 28 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 32 3.1. Nhận biết đặc điểm sinh học của chủng Streptomyces orientalis 4912.... 32 3.1.1. Đặc điểm hình thái .............................................................................. 32 3.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .................................................................. 33 3.2. Lựa chọn môi trƣờng lên men ................................................................... 35 3.3. Ảnh hƣởng của các thành phần trong môi trƣờng lên men ...................... 36 3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp vancomycin của chủng S. orientalis 4912 .................................................... 36 3.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp vancomycin của chủng S. orientalis 4912......................................................................... 38 3.4. Tối ƣu hoá thành phần môi trƣờng lên men sinh tổng hợp vancomycin từ chủng S. orientalis 4912 theo phƣơng pháp bề mặt đáp ứng........................... 40 3.5. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp vancomycin của chủng S. orientalis 4912 trên môi trƣờng tối ƣu ............................................................. 44 3.6. Nghiên cứu chế độ lên men vancomycin .................................................. 46 3.6.1. Chế độ lên men vancomycin theo mẻ.................................................. 46 3.6.2. Chế độ lên men bán liên tục ............................................................... 48 3.7. Tách chiết vancomycin từ dịch lên men bằng dung môi .......................... 49 3.7.1. Khả năng tách chiết vancomycin của các loại dung môi khác nhau . 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 3.7.2. Tỉ lệ phối trộn dung môi và dịch lên men phù hợp cho tách chiết vancomycin ................................................................................................... 52 3.7.3. Xác định thời gian tách chiết .............................................................. 54 3.8. Tách chiết vancomycin từ dịch lên men bằng phƣơng pháp hấp phụ ...... 55 3.8.1. Khả năng hấp phụ vancomycin của một số chất hấp phụ .................. 55 3.8.2. Nồng độ than hoạt tính và dung môi sử dụng để nhả hấp phụ........... 55 3.8.3 Xác định pH và thời gian nhả hấp phụ ................................................ 57 3.8.4. Xác định tỷ lệ hỗn hợp dung môi ........................................................ 58 3.9. Tách chiết vancomycin từ dịch lên men bằng phƣơng pháp trao đổi ion . 60 3.9.1. Tách chiết vancomycin với một số chất trao đổi ion .......................... 60 3.9.2. Kiểm tra vancomycin tách chiết được từ dịch lên men ...................... 63 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 65 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT PG B. subtilis ATCC 6633 Peptidoglycan Bacillus subtilis ATCC6633 E. coli Escherichia coli MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus S. orientalis 4912 Streptomyces orientalis 4912 DLM Dịch lên men KSC Kháng sinh chuẩn HPLC Sắc kí lỏng cao áp CKS Chất kháng sinh RSM Reponse Surface methodology HTKS Hoạt tính kháng sinh ĐKVVK Đƣờng kính vòng vô khuẩn VVK Vòng vô khuẩn SKU Sinh khối ƣớt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Số Tên bảng Trang hiệu 1.1 Phổ kháng khuẩn của vancomycin 6 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của chủng S.orientalis 3.1 4912 32 3.2 Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng của chủng S.orientalis 4912 32 3.3 Khả năng đồng hoá đƣờng của chủng S. orientalis 4912 34 Khả năng sinh tổng hợp vancomycin của chủng S. orientalis 3.4 4912 trên một số môi trƣờng 35 Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp 3.5 vancomycin của chủng S. orientalis 4912 36 Ảnh hƣởng của các nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp 3.6 vancomycin của chủng S. orientailis 4912 39 Các yếu tố biến đổi của thành phần môi trƣờng lên men Bố trí thí nghiệm và kết quả tối ƣu hóa môi trƣờng sinh tổng hợp vancomycin từ chủng S. orientalis 4912 theo RSM-CCD 41 Bảng phân tích hồi quy mô hình tối ƣu Kết quả kiểm chứng sự tƣơng thích của mô hình với thực 3.10 nghiệm 3.11 HTKS của chủng S. orientalis 4912 khi lên men theo mẻ 42 3.12 Hiện tƣợng trộn dịch lên men với các dung môi Hoạt tính kháng khuẩn của các dung môi khác nhau sau quá 3.13 trình tách chiết từ dịch lên men Hoạt tính kháng khuẩn của dung môi n – Butanol tách chiết tỉ lệ 3.14 2/1 ở các khoảng thời gian khác nhau 50 3.15 Khả năng hấp phụ chất kháng sinh của một số chất hấp phụ Ảnh hƣởng của nồng độ than hoạt tính tới khả năng hấp phụ 3.16 chất kháng sinh 55 3.17 Ảnh hƣởng của dung môi tới khả năng nhả hấp phụ vancomycin Ảnh hƣởng của pH và thời gian đến quá trình nhả hấp phụ 3.18 vancomycin Ảnh hƣởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi tới quá trình nhả hấp 3.19 phụ vancomycin 56 3.20 Khả năng tách chiết vancomycin với một số chất trao đổi ion 60 3.7 3.8 3.9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 41 44 47 52 54 56 58 59 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình và đồ thị Trang 1.1 Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của vancomycin 4 3.1 Khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 trên MT thạch 48 Hình dạng khuẩn ty và chuỗi bào tử của chủng S. orientalis 4912 Hoạt tính vancomycin của chủng S. orientalis 4912 trên các môi trƣờng lên men khác nhau Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp vancomycin của chủng S. orientalis 4912 Ảnh hƣởng của nồng độ bột đao đến khả năng sinh tổng hợp vancomycin của chủng S. orientalis 4912 Ảnh hƣởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng sinh tổng hợp vancomycin của chủng S. orientalis 4912 33 43 3.8 Vùng tối ƣu của cặp yếu tố ảnh hƣởng bột đao – cao nấm men Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp vancomycin của chủng S. orientalis 4912 trên môi trƣờng tối ƣu 3.9 Hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis lên men theo mẻ 48 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 34 36 37 38 40 46 3.10 HTKS của chủng S. orientalis lên men bán liên tục 48 3.11 Kết quả tách chiết vancomycin bằng các dung môi khác nhau Hoạt tính kháng khuẩn của dung môi 2 - Butanol sau khi chiết 3.12 vancomycin từ dịch lên men Hoạt tính kháng khuẩn của dung môi n - Butanol sau khi chiết 3.13 vancomycin từ dịch lên men Hoạt tính kháng MRSA của dung môi n – Butanol tách chiết tỉ 3.14 lệ 2:1 ở các khoảng thời gian khác nhau Nhả hấp phụ vancomycin từ than hoạt tính với các dung môi 3.15 khác nhau 3.16 Kết quả sắc ký giấy chất kháng sinh vancomycin 51 3.17 Sơ đồ tách chiết vancomycin trên cột trao đổi ion 3.18 Sơ đồ quy trình tách chiết vancomycin bằng nhựa trao đổi ion Sắc kí đồ HPLC của vancomycin sau khi đã làm tinh khiết từ 3.19 dịch lên men chủng S. orientalis 4912 61 62 3.20 Sắc đồ HPLC của vancomycin chuẩn (Merck) 63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 53 53 54 57 59 63 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong suốt tiến trình phát triển của nhân loại, trên con đƣờng hoàn thiện mình, loài ngƣời luôn phải đấu tranh để vƣợt qua mọi trở ngại, thách thức khác nhau. Bệnh tật chính là một trong số các trở ngại đó và rất nhiều bệnh có nguyên nhân do vi sinh vật gây ra. Với phát minh vĩ đại về penicillin, cùng với việc phát triển và hoàn thiện của công nghệ lên men hiện đại đã tạo ra cho nhân loại các chất kháng sinh, công cụ hữu hiệu mới để đấu tranh chống lại các bệnh nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong những thập kỷ vừa qua đã dẫn đến sự xuất hiện của rất nhiều chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh và tạo nên một mối nguy cơ toàn cầu trầm trọng đe dọa nền y học hiện đại. Để khắc phục hiện tƣợng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh, việc nghiên cứu, sản xuất các chất kháng sinh đã biết với các đặc tính ƣu việt hơn và việc tìm kiếm phát hiện các kháng sinh mới vẫn luôn là vấn đề mang tính thời sự và rất cấp thiết, đặt ra không chỉ ở thời điểm hiện tại mà ngay cả trong tƣơng lai. Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm glycopeptit có tác dụng tích cực trong điều trị nhiều loại bệnh, từng đƣợc coi là thần dƣợc hay là phƣơng thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị đƣợc các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do nhóm vi khuẩn Staphylococcus (nhóm này có khả năng kháng lại penixillin và methixillin) gây nên. Vancomycin đã đƣợc đƣa vào chữa bệnh từ hơn 40 năm qua, nhƣng ngày nay vẫn đƣợc coi là kháng sinh quan trọng do hiệu quả chữa bệnh cao khi dùng một mình hoặc khi phối hợp với các thuốc kháng sinh khác, chống lại các vi khuẩn đã nhờn với các thuốc kháng sinh thông dụng. Hiện nay, vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis đã đƣợc đƣa ra sản xuất ở quy mô công nghiệp nhƣng hiệu suất còn thấp và giá thành của chất kháng sinh này còn cao. Vì vậy, nghiên cứu lên men vancomycin và nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất chất kháng 1 sinh ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần làm giảm lƣợng kháng sinh nhập khẩu từ nƣớc ngoài, đáp ứng đƣợc phần lớn nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho ngƣời dân, tiết kiệm hàng nghìn tỷ đồng tiền thuốc nhập khẩu. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Thu nhận đƣợc chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng lên men vancomycin từ nguồn nguyên liệu trong nƣớc. - Nghiên cứu các chế độ lên men vancomycin theo mẻ và lên men bán liên tục. - Nghiên cứu tách chiết vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh vancomycin 1.1.1. Lịch sử phát triển và ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomycin Vancomycin là một chất kháng sinh tiêu biểu nhất thuộc nhóm kháng sinh glycopeptit, đƣợc Eli Lilly và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1956, do chủng xạ khuẩn S. orientalis phân lập từ đất ở Indonexia và Ấn Độ sinh tổng hợp ra [27]. Nhiễm trùng Staphylococcus aureus là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng máu trong bệnh viện và cộng đồng trên toàn thế giới với tỉ lệ mắc bệnh và tử vong tƣơng đối lớn, đặc biệt là khi không đƣợc điều trị phù hợp. Với sự xuất hiện của methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) trong năm 1960 kháng lại các kháng sinh là một thách thức lớn đối với việc điều trị nhiễm trùng nghiêm trọng, đặc biệt là nhiễm trùng endovascular. Đến nay, hầu hết các chủng MRSA kháng với nhiều loại kháng sinh và không thể đƣợc điều trị bằng βlactams thông thƣờng, làm cho glycopeptide (Vancomycin hoặc Teicoplanin) là giải pháp điều trị duy nhất đƣợc lựa chọn [14]. Trong những năm gần đây, sự xuất hiện của chủng MRSA giảm nhạy cảm với glycopeptide đã nhấn mạnh sự cần thiết cho các loại thuốc mới có hiệu quả hơn. Thuốc mới antistaphylococcal nhƣ linezolid, đó là các kháng sinh oxazolidinone đầu tiên đƣợc chấp thuận của Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm (FDA), đã phát triển và cho thấy hiệu quả tƣơng đƣơng với vancomycin trong điều trị viêm phổi và nhiễm trùng mô mềm. Tuy nhiên, linezolid đã không đƣợc sử dụng vì giá mua cao hơn cũng nhƣ thiếu các thử nghiệm lâm sàng và kinh nghiệm so với vancomycin. Do đó, vancomycin vẫn đƣợc duy trì nhƣ một dòng thuốc ƣu tiên của quốc phòng trong điều trị nhiễm trùng MRSA [14]. Kể từ khi đƣợc phát hiện, cấu trúc phân tử và đặc tính của vancomycin đã luôn lôi cuốn sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học thuộc nhiều chuyên ngành khác nhau. Kháng sinh này đã đƣợc xem nhƣ cấu trúc sinh học 3 chủ yếu, từ đó biển đổi bằng cách bán tổng hợp hoặc bằng công nghệ sinh học tạo ra những chất thay thế với những đặc tính ƣu việt [24]. 1.1.2. Cấu trúc phân tử và đặc tính hóa lý của vancomycin Vancomycin có công thức phân tử C66H75Cl2N9O24, trọng lƣợng phân tử của vancomycin là 14449.3 Da. Vancomycin có 3 hệ thống vòng, 2 nhóm cacbonhydrat, 5 vòng thơm, 9 nhóm –OH trong đó có 3 nhóm phenol, 7 liên kết amit và 2 liên kết amin, điểm đẳng điện pI 7.2. Vancomycin khác với các kháng sinh khác thuộc nhóm glycopeptit bởi cấu trúc phức tạp, đặc biệt sự khác biệt đó là bởi trong cấu trúc của vancomycin chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, là vị trí cho phép gắn phân tử ngoại lai để tạo nên các vancomycin bán tổng hợp hoạt tính cao và bền vững với các tác nhân kháng. Đây là hƣớng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu nhằm mở ra một thế hệ kháng sinh mới có hoạt tính cao và chọn lọc [9], [28]. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của vancomycin Các phân tử vancomycin thƣờng không kết hợp với nhau nên vancomycin là chất vô định hình, không màu sắc và có tính chất lƣỡng tính. Nó hòa tan trong 4 nƣớc trong vùng pH axit và bazơ, hòa tan ít hơn trong điều kiện trung tính, bền vững ở dạng rắn và dung dịch nƣớc hòa tan của nó có vùng pH từ 2.5 – 9. Nó thƣờng hòa tan nhiều trong các rƣợu bậc thấp và hầu nhƣ không hòa tan trong các dung môi hữu cơ khác [24]. Vancomycin có bản chất lƣỡng tính nên phản ứng với các axit vô cơ ví dụ nhƣ HCl, H2SO4, H3PO4 và các axit khác và tạo thành dạng muối để thuận tiện trong việc thu hồi. Vancomycin chlohydride (Vancomycin HCl) là một dạng muối bền vững của vancomycin. Vancomycin HCl bền ở dạng rắn và trong dung dịch nƣớc ở nhiệt độ trên 70oC trong vùng pH 2.5 – 9. Giá trị pKa của vancomycin là: 2,9; 7,2; 8,6; 9,6; 10,5 và 11,7. Vancomycin HCl là một hợp chất màu trắng hòa tan trong nƣớc, ít hòa tan trong ethanol và methanol, hầu nhƣ không hòa tan trong các dung môi khác nhƣ là chloroform, ether, ethyl acetate. Khả năng hòa tan trong nƣớc ở pH 7.0 là khoảng 1 mg/ml và nó hòa tan nhiều trong nƣớc ở giá trị pH thấp và giá trị pH trên 8.5 – 9 [24]. Theo những phân tích cơ bản đã chỉ ra rằng phân tử vancomycin chứa khoảng 1,17% nitơ và khoảng 4,26% Cl. Vancomycin bền trong nƣớc ở pH = 3,0-7,0 và nhiệt độ 37°C trong 6 ngày, nếu nhiệt độ thấp hơn thì hoạt tính giảm dần theo thời gian. Nếu pH nằm trong khoảng từ 7-12 và nhiệt độ đƣợc nâng nhẹ (trên 22oC) thì sự phân huỷ có thể quan sát đƣợc. Bảng 1.1 cho thấy phổ kháng khuẩn của vancomycin. Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (µg/ml) là nồng độ vancomycin nhỏ nhất làm ức chế sự sinh trƣởng của vi sinh vật kiểm định sau một khoảng thời gian, cụ thể là 24 giờ, 48 giờ ở 37oC. Theo bảng này thì vancomycin chủ yếu hoạt động chống lại vi khuẩn gram dƣơng, bị hạn chế trong việc chống lại mycobacteria và không có hoạt tính chống lại các vi khuẩn gram âm sử dụng trong thử nghiệm trên. Khi tiêm tĩnh mạch ở chuột trắng theo chuẩn dƣợc, liều gây chết của vancomycin HCl biểu hiện ở LD50 tìm thấy ở khoảng 435,7 ± 4,22 mg/kg [20]. Chế phẩm vancomycin cần đạt 1007 U/mg, nghĩa là một đơn vị vancomycin bao gồm 0,993 mcg vancomycin sunfat. 5 Bảng 1.1. Phổ kháng khuẩn của vancomycin Nồng độ Nồng độ ức ức chế tối Vi sinh vật thiểu Vi sinh vật kiểm định (µg/ml) kiểm định chế tối thiểu (µg/ml) 24 48 24 48 giờ giờ giờ giờ Achromobacter Bacillus brevis 3.13 3.13 Bacillus cereus 3.13 3.13 Aerobacter aerogenes fischeri Brucella >100 >100 >100 >100 Bacillus licheniformis 0.78 0.78 Bacillus polymyxa 0.39 0.39 Escherichia coli >100 >100 Bacillus subtilis 0.39 0.39 Klebsiella pneumonia >100 >100 Corynebacterium diphtheriae bronchiseptica 0.00 0.78 Mycobacterium avium Micrococcus pyogenes var. aureus (kháng lại Pseudomonas 0.78 0.78 aeruginosa penixillin) Micrococcus pyogenes var. aureus H Mycobacterium phiei Mycobacterium smegmatis Sarcina lutea Shigella 1.56 1.56 12.5 paradysenteriae Saccharomyces 25 carlsbergensis >100 >100 100 100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 0.00 3.13 Aspergillus niger >100 >100 0,78 0.70 Trichophyton rubrum >100 >100 6 1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của vancomycin Hoạt tính kháng vi sinh vật của vancomycin và các kháng sinh khác thuộc nhóm glycopeptit đạt đƣợc từ việc ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn. Vancomycin ức chế giai đoạn cuối của quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan (PG) [25], [31], lớp cơ bản để vi khuẩn chống lại các điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Nếu không có lớp này hoặc vì một lý do nào đó mà lớp PG bị phá huỷ thì tế bào vi khuẩn trở nên cứng nhắc, không linh động và kết quả là tế bào bị chết [29]. Quá trình ức chế này xảy ra qua 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: Vancomycin không xâm nhập vào tế bào chất mà chỉ hoạt động ở bên ngoài màng tế bào chất, ức chế các chất bên ngoài màng tế bào. Giai đoạn 2: Khi không có mặt vancomycin, các peptit cơ chất đƣợc glycosyl hóa nhờ enzym transglycosylaza tạo thành các disacaryl pentapeptit sau đó liên kết chéo peptit đƣợc tạo thành giữa các cơ chất này nhờ transpetidaza để tạo nên PG thành tế bào vi khuẩn. Đích tác dụng của vancomycin là gắn với các peptit cơ chất, ngăn cản chúng liên kết với vị trí hoạt động của enzym. Khi đó, phân tử vancomycin có dạng hình chiếc cốc liên kết ái lực cao nhờ bề mặt lõm của nó tạo năm liên kết hydro với đoạn cuối N-acyl-D-Alanyl-D-Alanin của cầu liên kết chéo peptit chƣa nối với pentapeptit. Giai đoạn 3: Vancomycin không tấn công disacaryl pentapeptit mà làm giảm các liên kết đồng hoá trị, giảm tính bền cơ học của lớp PG và làm cho tế bào vi khuẩn dễ dàng bị phân giải do thay đổi áp suất thẩm thấu, dẫn đến vi khuẩn bị tiêu diệt [29], [31]. Vancomycin có hiệu quả cao trong việc chống lại các vi khuẩn Gram (+) nhƣ: Enterococcus, Streptococcus và Staphylococcus nhƣng không chống lại đƣợc hoặc chống lại yếu vi khuẩn Gram (-) nhƣ: E. coli hoặc Salmonella typhimurium… Điều này đƣợc giải thích bởi hai nguyên nhân: một là do sự khác biệt giữa cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-). Trong tế bào vi khuẩn Gram (-), lớp PG và lớp màng bên trong đƣợc bao bọc bởi một 7 lớp màng ngoài ngăn chặn sự tiếp cận của kháng sinh với đoạn cuối PG-DAlanyl-D-Alanin trong tế bào chất, từ đó ngăn cản sự khuếch tán của các kháng sinh glycopeptit đến lớp PG. Ngƣợc lại, lớp PG của vi khuẩn Gram (+) đƣợc xác định trên bề mặt ngoài của thành tế bào và do đó nó mẫn cảm với các kháng sinh glycopeptit. Hai là, phân tử glycopeptit là những phân tử lớn, chúng không thể hoà tan lớp lipit của màng tế bào vi khuẩn Gram (-), do đó mà khó có thể xâm nhập đƣợc vào lớp bên trong của thành tế bào [29]. Ngoài ra, vancomycin còn có tác dụng ức chế quá trình sinh tổng hợp ARN. Có thể do cơ chế tác động kép này mà sự kháng vancomycin ít xảy ra. Những vi sinh vật nhạy cảm với vancomycin và kể cả những chủng kháng methixillin thƣờng bị tiêu diệt ở nồng độ vancomycin từ 1-5 g/ml [31]. Các nhà khoa học thuộc Trung tâm Công nghệ nano London (LCN) đang sử dụng một phƣơng pháp nano để nghiên cứu hoạt động của vancomycin. Nhóm nghiên cứu nhận định rằng khi kháng sinh này tự gắn vào vi khuẩn, nó tạo ra một áp lực bề mặt lên vi khuẩn, áp lực này góp phần phá vỡ thành tế bào và giết chết vi khuẩn. Nhóm nghiên cứu so sánh sự tƣơng tác của vancomycin với loại vi khuẩn không kháng và vi khuẩn kháng kháng sinh. Những “siêu vi khuẩn” kháng lại kháng sinh vì một đột biến đơn giản xóa kết nối hyđro khỏi cấu trúc thành tế bào của chúng. Thay đổi nhỏ này làm sự tiếp xúc và thâm nhập vi khuẩn của kháng sinh trở nên khó khăn gấp hàng nghìn lần việc phá vỡ cấu trúc tế bào gần nhƣ không thể [34]. 1.1.4. Sinh tổng hợp vancomycin ở xạ khuẩn 1.1.4.1. Con đường sinh tổng hợp vancomycin ở xạ khuẩn Trong nhóm xạ khuẩn có tới 60-70% số loài có khả năng sinh CKS. Chất kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra có thể là kháng sinh ngoại bào hoặc kháng sinh nội bào. Có nhiều nhóm CKS khác nhau đã đƣợc tìm thấy ở xạ khuẩn nhƣ: streptomyxin, tetraxyclin, enthromyxin.... Cho đến thời điểm hiện nay, đã có rất nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh cao đã tìm thấy nhƣ: Streptomyces, 8 Micromonospora… nhƣng Streptomyces là loài sản xuất kháng sinh lớn nhất trong giới vi sinh vật. Sự tổng hợp kháng sinh vancomycin là quá trình tổng hợp từ các axit amin cơ bản với quá trình liên kết theo những con đƣờng chlorination, hydroxylation, sulfonation hoặc glycosylation. Quá trình tổng hợp chịu sự chi phối của nhiều gen, các gen này quyết định sự tổng hợp vancomycin theo con đƣờng riêng, khác con đƣờng tổng hợp axit amin để hình thành nên protein. Trong khoảng 20 axit amin cơ bản đƣợc tạo thành trong tổng hợp protein thì có 3 axit amin là phydroxyphenylglyxin, hydroxytyrozin và 3,5 di-hydroxyphenyl-glyxin  và  là các thành phần chính của kháng sinh. Quá trình hình thành vòng heptapeptit không xảy ra tại riboxom. Để thay thế riboxom, các mạch peptit đƣợc tổng hợp nhờ enzym NRPSs (nonribosomal protein synthaza). NRPSs là một enzym có khối lƣợng phân tử lớn, cấu tạo gồm 4 vùng: vùng A (adenyl hóa), vùng C (ngƣng tụ hoặc kéo dài), vùng E (epime hóa) và T (thioesteraza). Tại các vùng tổng hợp, NRPSs chịu trách nhiệm phát hiện, loại bỏ các axit amin có những sai khác, chỉ sử dụng các axit amin có hoạt tính, ATP (Adenozintriphotphat) đƣợc dùng làm năng lƣợng cho hoạt động của enzym. Vùng A có trách nhiệm cung cấp các axit amin liên tục cho quá trình liên kết và chuyển đến vùng E. Vùng E ngay lập tức thực hiện phản ứng epime hoá các axit amin. Kết thúc ở vùng C các liên kết peptit đƣợc hình thành giữa các axit amin hoạt tính. Sự tổng hợp này hình thành nên các mạch heptapeptit thẳng, sau đó, vancomycin phải trải qua một loạt các biến đổi tiếp theo nhờ hoạt động của 8 enzym nhƣ oxy hóa liên kết chéo, quá trình glycozyl hóa… để trở thành phân tử có hoạt tính sinh học. Quá trình hình thành kháng sinh glycopeptit còn chịu sự chi phối của rất nhiều gen, mỗi gen hoạt động lại chịu sự chi phối của rất nhiều yếu tố [26, 27]. 1.1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn Đa số chất kháng sinh đƣợc dùng hiện nay là do xạ khuẩn sinh ra. Sự sinh tổng hợp CKS ở xạ khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ thành phần môi trƣờng, điều kiện lên men… 9 * Thành phần môi trường Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố nhƣ pH, nhiệt độ… và thành phần của môi trƣờng lên men. Để đảm bảo cho xạ khuẩn có thể phát triển tốt cần đảm bảo trong môi trƣờng có đầy đủ nguồn cacbon, nguồn nitơ và các nguyên tố vi lƣợng. Mỗi một chủng xạ khuẩn khác nhau cần một nguồn cơ chất khác nhau, tuy nhiên tỉ lệ C/N đóng vai trò quyết định đến sự tổng hợp kháng sinh [4]. 1. Nguồn cacbon : Nguồn cacbon có ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình sinh trƣởng cũng nhƣ sinh tổng hợp CKS của chủng S. orientalis do nguồn cacbon không những tham gia vào cấu tạo thành tế bào mà còn tham gia vào quá trình hình thành cấu trúc của sản phẩm. Nguồn cacbon thƣờng sử dụng là các nguồn đƣờng đơn nhƣ glucoza, fructoza…, các loại đƣờng kép nhƣ maltoza, lactoza, saccaroza…, ngoài ra có thể sử dụng rỉ đƣờng. Trong đó nguồn đƣờng glucoza là nguồn cacbon dễ sử dụng nhất, tuy nhiên nếu sử dụng nhiều nguồn đƣờng này thì hiệu suất của quá trình lên men sẽ giảm đi. Nguyên nhân do glucoza làm tăng lƣợng axit hữu cơ trong môi trƣờng đồng thời cũng làm tăng các chất hữu cơ và axit nucleic trong khuẩn ty làm thay đổi hoạt tính các enzym phân giải glucoza… Tuy nhiên, có thể khắc phục đƣợc hiện tƣợng này bằng cách liên tục bổ sung một cách định kì một lƣợng nhỏ glucoza để không xảy ra sự tích luỹ các chất trao đổi ức chế. Bên cạnh đó, tinh bột và dextrin là các nguyên liệu lên men kháng sinh tốt đối với các chủng vi sinh vật có hoạt tính enzym amylaza cao [4]. 2. Nguồn nitơ: Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn đòi hỏi cung cấp đầy đủ nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp thƣờng sử dụng là cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tƣơng…, còn nguồn nitơ vô cơ thƣờng sử dụng là các muối amon, muối nitrat. 3. Khoáng chất: Vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng rất cần chất khoáng trong quá trình trao đổi chất của chúng. Một lƣợng nhỏ các nguyên tố vi lƣợng cũng có ảnh hƣởng nhất định đến sự hình thành CKS của xạ khuẩn. Sự có 10