Nghiên cứu thành phần và hiệu quả xử lý nước thải nhà máy bia của chế phẩm sinh học BIO - PB

  • Số trang: 52 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 21 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHẠM THẾ VIỆT NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ HIỆU QUẢ XỬ LÝ NƢỚC THẢI NHÀ MÁY BIA CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC BIO - PB Chuyên ngành : Vi Sinh Vật Học Mã số : 60 42 01 03 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.PHÍ QUYẾT TIẾN Hà Nội – 2014 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Việt Nam là nước có nền kinh tế phát triển nhanh, kéo theo đó là sự phát triển của nhiều ngành công nghiệp chế biến, sản xuất và dịch vụ gia tăng. Việc phát triển nhanh của các ngành này đã tạo ra một lượng lớn các chất thải và nước thải, nếu không được xử lý đúng cách sẽ dẫn đến ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm và ảnh hưởng nghiêm trọng đến cuộc sống của người dân, sự phát triển kinh tế và diện mạo của đất nước. Đối với chất thải và nước thải của các ngành sản xuất thực phẩm như bia, rượu, chế biến sản phẩm đồ hộp…, thành phần chủ yếu là hỗn hợp các hợp chất hydocacbon, protein, lipit. Đây là các thành phần dễ phân hủy bởi vi sinh vật, nếu không xử lý triệt để sẽ gây ra ô nhiễm nghiêm trọng. Có thể xử lý nước thải theo nhiều cách, một trong những biện pháp xử lý hiệu quả là sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy nhanh, đặc hiệu với các loại hợp chất hữu, có giá thành thấp, ổn định và không gây tác động xấu đến môi trường. Trong tự nhiên, vi sinh vật với những đặc tính ưu việt sẵn có vẫn hàng ngày, hàng giờ phân hủy các chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất trung gian và những hợp chất đơn giản hơn. Do vậy, hệ vi sinh vật tự nhiên có thể xem như là một nhà máy xử lý ô nhiễm khổng lồ. Các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu để khai thác và ứng dụng những lợi thế của vi sinh vật và tạo điều kiện tốt nhất cho chúng phát triển trong những điều kiện và quy mô có kiểm soát, từng bước bắt chúng phục vụ cho hoạt động sống của con người [9; 11]. Hệ vi sinh vật sử dụng trong quá trình xử lý nước thải gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn… trong đó vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất. Trong các bể xử lý sinh học, vi khuẩn đóng vai trò hàng đầu và chịu trách nhiệm chính trong phân hủy các thành phần hữu cơ trong nước thải. Theo nhiều học giả, trong bùn hoạt tính có nhiều vi sinh vật thuộc các chi khác nhau như: Actinomyces, Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Deslfotomacillium, Micrococcus, Pseudomonas, Sarcina,… Nhóm nấm men cũng xuất hiện trong xử lý nước thải với vai trò chuyển hóa đường đơn thành rượu, bao gồm các chi Saccharomyces, Pichia…và giúp hạn chế sự phát triển của các nhóm vi khuẩn kỵ khí khác [14; 16]. Trong các hệ thống xử lý nước thải công nghiệp bằng phương pháp sinh học, hệ vi sinh vật sử dụng trong xử lý nước nước thải có khả năng phân hủy các hợp chất gây 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ô nhiễm đã được nhiều nhóm nghiên cứu trong và ngoài nước nghiên cứu từ lâu. Tuy nhiên, trong một số hệ thống quá trình xử lý xảy ra bằng bùn yếm khí có sẵn hoặc bùn hoạt tính chưa thể xử lý triệt để nguồn ô nhiễm hoặc thời gian xử lý kéo dài. Vì vậy, bổ sung vi sinh vật hữu ích trong quá trình xử lý chất thải sẽ không gây ảnh hưởng xấu tới môi trường và giúp cho quá trình xử lý diễn ra nhanh hơn, tiết kiệm chi phí và thời gian xử lý [14; 17] Thị trường chế phẩm sinh học ở Việt Nam và nhu cầu sử dụng chế phẩm sinh học rất lớn và đã được áp dụng thành công ở một số nhà máy sản xuất thực phẩm và công nghiệp. Tuy nhiên, với chế phẩm thương mại ngoài thị trường rất phong phú và đa dạng, việc đánh giá chế phẩm sinh học sản xuất trong nước hay nhập khẩu cần phải kiểm tra và đánh giá tiêu chuẩn. Xuất phát từ yêu cầu của nhà máy bia Hà Nội trong việc thử nghiệm một loại chế phẩm sinh học Bio-BP nhập ngoại nhằm tăng cường hiệu quả xử lý nước thải trong hệ thống xử lý sẵn có của nhà máy, yêu cầu đánh giá thành phần của chế phẩm và hiệu quả sử dụng là hết sức cần thiết. Ngoài ra, trong giai đoạn sản xuất vào mùa hè, mùi hôi từ hệ thống xử lý nước thải gây ra có thể làm ô nhiễm nguồn không khí đối với nhà máy và khu vực dân cư lần cận. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần và hiệu quả xử lý nước thải nhà máy bia của chế phẩm Bio-PB” với các nội dung nghiên cứu chính: - Nghiên cứu thành phần của chế phẩm sinh học Bio-PB - Nghiên cứu đặc điểm các chủng vi sinh vật trong chế phẩm Bio-PB - Đánh giá hiệu quả hỗ trợ xử lý nước thải của chế phẩm sinh học trong giai đoạn xử lý vào mùa hè 2013 Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ của Viện nghiên cứu Gia Dày - Bộ Công Thương và Phòng Công nghệ lên men - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHẦN I. TỔNG QUAN 1.1 . Tình hình nghiên cứu xử lý nƣớc thải hữu cơ trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.1. Tình hình nghiên cứu xử lý nƣớc thải hữu cơ trên thế giới Sự phát triển của phương pháp thứ cấp để xử lý nước thải trong những năm đầu thế kỷ XX được cho là cải tiến đáng kể nhất đối với y tế công cộng và môi trường trong suốt thời gian này, đó là việc phát minh ra "bùn hoạt tính" cho quy trình xử lý nước thải. Fowler và cộng sự tại Đại học Manchester được tiến hành tại Trạm Thí nghiệm Lawrence ở Massachusetts liên quan đến việc sục khí vào nước thải trong bình đã được phủ một lớp tảo [13]. Các đồng nghiệp của Fowler, Edward Ardern và Lockett, những người đã triển khai nghiên cứu cùng với Văn phòng công ty đường sông Manchester ở công trình xử lý nước thải Davyhulme. Thí nghiệm trên được thực hiện trong một lò phản ứng bằng cách hút ra và thu vào, việc xử lý cho hiệu quả cao hơn. Họ sục khí liên tục cho nước thải trong khoảng một tháng và kết quả đạt được là nitrat hóa hoàn toàn các nguyên liệu mẫu [13]. Điều đó chỉ ra rằng bùn đã hoạt hóa các chất (một cách tương tự như than hoạt tính) quá trình được đặt tên là bùn hoạt tính. Kết quả đã được công bố trong công trình tại Hội thảo 1914, và lần đầu tiên một hệ thống quy mô đầy đủ với dòng chảy liên tục được lắp đặt tại Worcester hai năm sau đó. Do hậu quả của chiến tranh thế giới thứ nhất phương pháp xử lý mới được truyền bá nhanh chóng, đặc biệt là Hoa Kỳ, Đan Mạch, Đức và Canada [13]. Vào cuối những năm 1930, việc xử lý nước thải bằng bùn hoạt tính là quá trình chủ yếu được sử dụng trên toàn thế giớ : Actinomyces, Arthrobacer, Bacillus, Bacterium, Corynebacterium, Desulfotomacillium, Micrococcus, Pseudomonas, Sarcina … [16]. Ở Mỹ, hàm lượng nitơ trong nước thải thường dao động trong khoảng 20 đến 85 mg/l trong đó nitơ ở dạng hợp chất hữu cơ trung bình từ 8 đến 35 mg/l, hàm lượng NH3 từ 12 đến 50 mg/l [32]. Hàm lượng photphate trong nguồn nước không ô nhiễm nhỏ hơn 0,01 mg/l. Theo quy định của Hà Lan, tiêu chuẩn của Việt Nam, hàm lượng photphate trong nước uống không được vượt quá 6 mg/l. Theo tiêu chuẩn của cộng đồng chung châu Âu, trong nước sinh hoạt, hàm lượng photphate không được vượt quá 2,18 mg/l [30]. 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Xử lý nước thải của quá trình chế biến rau quả các nhà khoa học Thái Lan đã sử dụng chủng nấm men Candida utilis CBS1517 có khả năng đồng hóa tốt các loại đường và axit hữu cơ có nhiều trong thành phần nước thải, kết quả thu được cho thấy sau 96 giờ xử lý trong điều kiện phòng thí nghiệm là COD giảm 89,9% và pH tăng từ 3,5 lên 8,5 [20 [13]: hiệu quả xử lý COD và T-N của quá trình SBR cấp nước một lần đạt khá cao, tương ứng là khoảng 93% và 88 ÷ 93%. Tải trọng COD và T-N cũng đạt cao lần lượt là 0,37 kg/(m3.ngày) và 0,13 kg/(m3.ngày) , của COD là 57%, T-N là 91% [14]. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu xử lý nƣớc thải hữu cơ ở Việt Nam Xử lý nước thải hiện nay luôn là vấn đề thời sự nóng bỏng và nổi cộm ở Việt Nam hiện nay, theo dự báo của Tổ chức Kinh tế thế giới thì Việt Nam sẽ là một trong những nước có tốc độ phát triển kinh tế vào loại nhanh trên thế giới với tốc độ tăng trưởng được dự báo là 7% trong thập kỷ tới. Tuy nhiên, việc tăng trưởng kinh tế một cách nhanh chóng và mạnh mẽ cũng đồng thời tạo nên những thách thức áp lực tác động về mặt môi trường, trong đó, tác động của chất thải rắn và nước thải đang là vấn đề bức xúc ở Việt Nam. Hiện nay, ô nhiễm môi trường là vấn đề đang được quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia trên thế giới. Theo báo cáo môi trường Quốc gia năm 2010 của Bộ Tài Nguyên và Môi Trường, từ năm 2007 đến năm 2009, ô nhiễm môi trường nước mặt ở tất cả các chỉ số đều vượt quá tiêu chuẩn cho phép theo QCVN 40:2011/BTNMT. Các chỉ số COD, BOD đều vượt quá tiêu chuẩn từ 5 đến 10 lần. Hàm lượng NH4+ trong môi trường nước mặt của sông Nhuệ, sông Đáy và sông Cầu đều vượt quy chuẩn cho phép QCVN 40:2011/BTNMT cho nước mặt phù hợp với việc bảo tồn động thực vật thủy sinh là là 0,2 mg/l. Nước thải chăn nuôi là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm nguồn nước. Hàm lượng nitơ tổng số nước thải chăn nuôi nằm trong khoảng từ 512 đến 594 mg/l, trong đó NH3 từ 304 đến 471 mg/l, hàm lượng photpho tổng số từ 13,8 ÷ 62 mg/l [7]. Ngày nay, cùng với sự phát triển của dân số, rác thải sinh hoạt ngày một gia tăng, nước rỉ rác từ các hố chôn lấp tại khu xử lý rác thải gây ảnh hưởng rất lớn đến 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ đời sống của người dân xung quanh, gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nước ngầm quanh khu vực. Tổng hàm lượng nitơ trong nước thải rỉ rác dao động trong khoảng từ 200 ÷ 2000 mg/l, hàm lượng amoni cao, trung bình 200 mg/l, trong khi đó tiêu chuẩn cho phép là 0,2 mg/l [6]. Với xu hướng hội nhập nền kinh tế quốc tế, đặc biệt từ khi Việt Nam gia nhập WTO, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của quá trình công nghiệp hoá đất nước, chất thải công nghiệp cũng đang ngày một gia tăng về khối lượng, đa dạng về chủng loại và đang là vấn đề cấp bách của xã hội, đòi hỏi phải có nhận thức đúng đắn và đầu tư thích đáng cho vấn đề xử lý nước thải. Hiện nay công nghệ xử lý nước thải bị ô nhiễm các hợp chất hữu cơ trên thế giới và Việt Nam chủ yếu là sử dụng các biện pháp sinh học, trong đó phương pháp xử lý hiếu khí và xử lý kị khí là phổ biến nhất, với nguồn nước thải có mức độ ô nhiễm cao thông thường người ta xử lý kết hợp kị khí và hiếu khí. Kết quả nghiên cứu của Vũ Thúy Nga và các cộng sự cho thấy có thể cải thiện chất lượng nước thải chế biến tinh bột sắn bằng chế phẩm vi sinh vật [11]. Để nhằm khắc phục tình trạng ô nhiễm do nước thải chế biến tinh bột sắn, công trình nghiên cứu tập trung tuyển chọn bộ giống vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao, sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật để nâng cao hiệu quả xử lý nước thải sau biogas của nhà máy chế biến tinh bột sắn. Kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn được 3 chủng vi sinh vật gồm Bacillus velezensis, Streptomyces fradiae và Nitromonas sp. có khả năng chuyển hóa tốt hợp chất hữu cơ trong nước thải chế biến tinh bột sắn [11]. Nghiên cứu về ứng dụng vi khuẩn tích lũy poly-photphat trong xử lý nước thải của Lê Quang Khôi và các cộng sự cho thấy các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P được tuyển chọn có hiệu suất loại bỏ photphat hòa tan cao [8]. Hai dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens TGT013L và Kurthia sp.TGT025L có hiệu quả loại bỏ PO43- cao nhất trong môi trường tổng hợp sau 25 giờ thí nghiệm. Sự loại bỏ PO43được thực hiện bởi hoạt động của gen ppk 1 dạng IIA trong quá trình chuyển hóa photphat thành dạng poly-P tích lũy trong tế bào. Kết quả nghiên cứu mang lại nhiều triển vọng ứng dụng 2 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P trên để xử lý photpho hòa tan trong nước thải chăn nuôi [8]. Với mục đích nghiên cứu phát triển công nghệ xử lý hiệu quả đồng thời hữu cơ và chất dinh dưỡng trong nước thải ngành chăn nuôi lợn, trong nghiên cứu của 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Phạm Thị Hải Thịnh và đồng tác giả, đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện vận hành như tỷ lệ COD/T-N (tỉ lệ giữa nhu cầu oxy hóa học và tổng nitơ) và chế độ sục khí đến hiệu quả xử lý COD và T-N của quá trình SBR đối với nước thải chăn nuôi đã qua xử lý kị khí. Với chế độ hai chu trình thiếu - hiếu khí thích hợp, hiệu quả xử lý COD và T-N đạt khá cao, tương ứng là khoảng 90% và 80 ÷ 85% [13]. Tuy nhiên nồng độ T-N trong nước thải chăn nuôi lợn là rất cao và thay đổi trong khoảng khá rộng, vì vậy nghiên cứu nâng cao hiệu quả xử lý nitơ của quá trình nhằm đáp ứng một cách ổn định các quy chuẩn xả thải là rất cần thiết. Theo Phan Đỗ Hùng và cộng sự cho thấy ảnh hưởng của tỉ lệ cấp nước thải đến hiệu quả xử lý của quá trình SBR hai chu trình thiếu - hiếu khí cấp nước hai lần và so sánh với chế độ cấp nước một lần. Với quá trình SBR hai chu trình thiếu-hiếu khí, cấp nước hai lần là một giải pháp để nâng cao hiệu quả xử lý T-N của quá trình. Thực nghiệm cho thấy, khi tăng tỉ lệ cấp nước (tỉ lệ giữa lượng nước thải cấp lần thứ nhất và tổng lượng nước thải xử lý trong một mẻ), lúc đầu hiệu suất xử lý T-N sẽ tăng, tuy nhiên đến một giới hạn nhất định hiệu suất xử lý T-N sẽ giảm trở lại. Hiệu suất xử lý T-N ở cả ba tỉ lệ cấp nước nghiên cứu đều khá cao, trong đó ở tỉ lệ 2/3 đạt cao nhất, trong khoảng 85 ÷ 90%. Hiệu suất xử lý T-N thực nghiệm ở các tỉ lệ cấp nước thấp 1/2 và 2/3 khá phù hợp với hiệu suất lý thuyết. Hiệu suất xử lý COD ở chế độ cấp nước hai lần cũng khá cao, 85 ÷ 90% ở tỉ lệ cấp nước 2/3, xấp xỉ với trường hợp cấp nước một lần [7]. 1.2. Sơ lƣợc về tình hình phát thải và xử lý nƣớc thải của nhà máy bia Hà Nội Tổng công ty Bia – Rượu – Nước giải khát Hà Nội (Habeco) có trụ sở chính tại 183 Hoàng Hoa Thám, Ba Đình, Hà Nội được thành lập ngày 16 tháng 5 năm 2003 theo Quyết định số 75/2003/QĐ – BCN của Bộ trưởng Bộ Công nghiệp (nay là Bộ Công Thương) trên cơ sở sắp xếp lại Công ty Bia Hà Nội và các đơn vị thành viên; chính thức chuyển sang tổ chức và hoạt động theo mô hình công ty mẹ - công ty con tại Quyết định số 36/2004/QĐ-BCN ngày 11/05/2004 của Bộ trưởng Bộ Công nghiệp. Ngành nghề chủ yếu của Tổng công ty gồm: sản xuất, kinh doanh bia, rượu, nước giải khát và bao bì; xuất nhập khẩu nguyên liệu, vật tư, thiết bị, phụ tùng, phụ liệu, hoá chất; dịch vụ khoa học công nghệ, tư vấn đầu tư, tạo nguồn vốn đầu tư, tổ chức vùng nguyên liệu, kinh doanh bất động sản, các dịch vụ và ngành nghề khác theo luật định. 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Nước thải của nhà máy bao gồm nước thải sản xuất, nước thải làm lạnh và nước mưa. Nước thải sản xuất bao gồm các loại sau: - Nước thải quá trình tách đại mạch sau khi đã phân huỷ bột - Nước thải rửa thiết bị lọc - Nước rửa chai và téc - Nước rửa nhà, phòng lên men, phòng tang trữ bia - Nước thải từ nồi hơi - Nước vệ sinh * Nước thải đầu vào của công ty có các thông số trung bình: - Lưu lượng: 50 m3/giờ - Nhu cầu Oxy hóa học (COD) : 2.400 mg/l - Nhu cầu Oxy sinh học (BOD) : 1600 mg/l - Tổng chất rắn lơ lửng (TSS): 1.030 mg/l * Sơ đồ đơn giản quy trình xử lý hiện tại: Bể điều hòa (70 m3) Bể ổn định lưu lượng Bể cân bằng (điều chỉnh pH, 900 m3) Bể hiếu khí 1 (550 m3) Bể yếm khí (550 m3) Bể lắng Bể yếm khí (550 m3) Bể hiếu khí 2 (550 m3) Tuần hoàn bùn Hình 1.1. Sơ đồ quy trình xử lý nước thải Habeco Yêu cầu nước thải đầu ra của nước thải nhà máy bia Hà Nội - Nhu cầu Oxy hóa học COD < 100 mg/l - Nhu cầu Oxy sinh học BOD < 50 mg/l - Tổng chất rắn lơ lửng TSS < 100mg/l 9 Dòng thải Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Quy trình vận hành tại các bể tại nhà máy bia Hà Nội - Bể điều hòa: nhằm thu gom và hòa trộn các nguồn nước thải và lưu lượng ổn định. - Bể ổn định lưu lượng: điều chỉnh lưu lượng thích hợp. - Bể cân bằng: điều chỉnh pH và nguồn dinh dưỡng bổ sung trước khi đưa vào xử lý. - Bể yếm khí: thực hiện quá trình xử lý yếm khí nhằm giảm 60 ÷ 70 % giá trị COD và BOD trong nước thải. - Bể hiếu khí 1, bể hiếu khí 2: được cung cấp đủ lượng oxy cần thiết cho các phản ứng sinh hóa xảy ra trong bể cấp khí liên tục (cho xử lý hiếu khí và xử lý thiếu khí) giữ cho bùn hoạt tính (chứa các vi sinh vật) ở trạng thái lơ lửng trong nước thải xử lý và loại bỏ các thành phần hữu cơ ô nhiễm. Bể lắng: Bổ sung chất trợ lắng PAC (Poly aluminium chloride) nhằm lắng các chất lơ lửng còn lại trong nước thải dưới tác dụng của trọng lực. 1.3. Nguyên lý xử lý chất thải hữu cơ trong nƣớc thải bằng phƣơng pháp sinh học Những chất gây ô nhiễm nghiêm trọng thường có cấu trúc cấu thành từ các nguyên tử cacbon, nitơ, lưu huỳnh, photpho hay kim loại nặng. Quá trình phân giải hợp chất cacbon và nitơ là quá trình sinh hoá phức tạp thông qua hoạt động sống của vi sinh vật, nhờ đó mà một số lượng lớn các chất hữu cơ cao phân tử sẽ được phân giải thành các chất có khối lượng phân tử thấp, từ đó các vi sinh vật khác nhau chuyển hóa thành sinh khối tế bào, các khí (CO2, H2S, N2, NH4…) [14]. Các hợp chất hydratcacbon bao gồm (xenluloza, tinh bột, dextrin…) có nhiều trong nước thải của các cơ sở chế biến lương thực hay sản xuất rượu bia sẽ được những nhóm vi sinh vật đặc thù đảm nhận phân giải thành những tiểu phần nhỏ hơn để tế bào vi sinh vật có thể sử dụng cho các mục đích khác nhau, bao gồm: tạo sinh khối vi sinh vật, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất và các chất khí (N2, CO2)…, các axit hữu cơ như axit focmic, axit axetic, axit lactic… Để phân giải xenluloza, nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh ra các enzym hỗ trợ xúc tác quá trình phân giải xenluloza [20]. Cơ chế phân giải xenluloza như sau: xenlulaza Xenluloza → xenlobiaza Đường tan (xenlobioza) → Glucoza Tinh bột là chất dự trữ chủ yếu của thực vật, nó có mặt trong các hạt hòa thảo, củ, thân cây và lá cây. Tinh bột gồm 2 cấu tử chính là amyloza (25%) và amylopectin 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ (75%) có nhiều trong nước thải của các cơ sở chế biến tinh bột, của các nhà máy bia, rượu... Dưới tác dụng của một số loại vi sinh vật có khả năng sinh ra hệ enzym như amylaza, amylo–1,6–glucosidaza, glucoamylaza, tinh bột bị phân giải thành những chất đơn giản, chủ yếu là đường đơn và axit hữu cơ. Quá trình phân huỷ đường đơn tiếp theo có thể được thực hiện theo những hướng sau: Phân huỷ đường đơn nhờ nhóm vi sinh vật lên men kỵ khí: Dưới tác dụng của một phức hệ enzym vi sinh vật, đặc biệt là của nấm men, các monosaccharit bị chuyển hoá thành rượu, axit lactic, glixerin… như sau: Lên men rượu Glucoza → Ethanol + CO2 Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện, khi có đủ oxy chúng hô hấp và quá trình lên men bị ức chế, dẫn tới sự tiêu thụ glucoza, hàm lượng etanol và CO2 giảm và sinh khối tăng lên. Quá trình được diễn ra theo phương trình: C6H12O6 + 6 O2 = 6 CO2 + 6 H2 O + Q Ngược lại khi không có đủ O2 hoặc ở điều kiện yếm khí, nấm men lên men mạnh nhưng lượng sinh khối không tăng nhiều. Hoạt động của nấm men gây ra sự biến đổi cơ bản của quá trình chuyển hoá đường, chủ yếu là glucoza và fructoza thành rượu: C6H12O6 = 2 C2H5OH + 2 CO2 + 33 kcal Chính quá trình sinh ra rượu của nấm men đã hạn chế sự phát triển của nhóm vi sinh vật gây hại có trong nước thải, đồng thời rượu là nguồn dinh dưỡng cho nhóm vi sinh vật lên men lactic và axetic tạo ra môi trường pH axit hạn chế sự phát triển của nhóm vi sinh vật gây bệnh. Các quá trình lên men rượu còn có sự tạo thành diaxetil, axetoin, glyxerin và các chất thơm. Các hợp chất chứa nhóm cacbonnyl của sản phẩm lên men như aldehyt, xeton, axit cacboxylic, các este, đó là những nhân tố tạo hương thơm giúp làm giảm bớt mùi thối sinh ra nhóm vi khuẩn phân hủy protein. Do vậy, tại những nơi xử lý chất thải có mặt của những nhóm vi sinh vật này sẽ giúp cho quá trình giảm mùi khó chịu rất rõ ràng. Ngoài ra, glucoza còn được nhóm vi khuẩn lactic sử dụng, chuyển hóa theo con đường tổng quát: Lên men lactic Glucoza → 11 Axit lactic Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Vi khuẩn lactic là tên gọi của những vi khuẩn sinh ra axit lactic như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hoá cacbonhydro. Trong tự nhiên, các vi khuẩn lactic phân bố rất rộng rãi, chúng có mặt trong phân, rác, xác động thực vật; trên niêm mạc miệng và niêm mạc ruột của người, gia súc, gia cầm; trên bề mặt rau, củ, quả, thịt, cá, tôm. Đặc biệt trong các sản phẩm muối chua như dưa cà muối, mắm tôm chua, sữa chua, nem chua… có rất nhiều vi khuẩn lactic. Vì vậy, vi khuẩn lactic tồn tại trong hệ thống xử lý nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm và nông sản khác [18]. Quá trình lên men hiếu khí phân giải triệt để hydratcacbon, glucoza và các monosaccharit khác tạo sản phẩm cuối cùng là sinh khối, CO2 và H2O. Sự phân huỷ các chất hữu cơ khác (nitơ, photpho, lưu huỳnh): + Phân huỷ nitơ: các hợp chất hữu cơ chứa nitơ bao gồm protein, các đoạn peptide, các axit amin… có mặt nhiều trong nước thải của các cở sở chế biến thủy hải sản, sản xuất đồ uống…Quá trình phân giải protein thành axit amin là giai đoạn đầu của chuyển hóa với sự tham gia của các nhóm vi sinh vật sinh có khả năng sinh proteaza như Bacillus, Pseudomonas... Tiếp đến quá trình amon hoá các axit amin thành dạng NH4+ hoặc NH3-. Lượng NH3- dư không dùng hết cho việc xây dựng tế bào được vi khuẩn Nitromonas chuyển thành nitrit (NO2-) và từ NO2- chuyển thành nitrat (NO3-) nhờ vi khuẩn Nitrobacter. Sau đó các vi khuẩn phản nitrat hoá chuyển NO3thành nitơ phân tử (N2) bay vào không khí. + Phân huỷ photpho: cho đến nay cơ chế của quá trình phân giải các hợp chất chứa photpho (photpho hữu cơ và photpho vô cơ) ở trong cơ thể vi sinh vật có nhiều con đường khác nhau, tùy thuộc vào từng nhóm vi sinh sinh vật. Các hợp chất photpho khó tan dưới tác dụng của vi sinh vật sẽ bị chuyển hoá thành những chất dễ tan. Quá trình chuyển hóa trên được thực hiện bởi vi sinh vật có khả năng tiết ra các enzym đặc hiệu sử dụng các hợp chất photpho làm nguồn dinh dưỡng và chuyển hoá chúng từ dạng khó phân huỷ thành dạng dễ tan. + Phân huỷ lưu huỳnh: trong điều kiện kỵ khí hay vi hiếu khí, vi sinh vật thường phân huỷ các hợp chất chứa lưu huỳnh (có trong protein, axit amin, muối vô cơ) và giải phóng H2S. Đồng thời, H2S cũng được sinh ra do hoạt động của các vi khuẩn khử sulfat. 1.4. Ứng dụng vi sinh vật trong công nghệ xử lý nƣớc thải 12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Phương pháp xử lý nước thải, chất thải dựa trên hoạt động sống của các vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất hữu cơ hoặc vô cơ làm nguồn năng lượng để thực hiện quá trình sinh trưởng phát triển của tế bào. Các vi sinh vật xử lý nước thải, chất thải bao gồm cả nhóm tự dưỡng và dị dưỡng, có thể tiến hành trong điều kiện hiếu khí, thiếu khí hay yếm khí [16]. Quá trình xử lý nước thải, chất thải gồm ba giai đoạn [11; 15]: - Di chuyển chất gây ô nhiễm từ pha lỏng (nước) tới bề mặt tế bào vi sinh vật nhờ khuếch tán đối lưu và khuếch tán phân tử. - Di chuyển các chất từ mặt ngoài tế bào qua màng bán thấm bằng khuếch tán do sự chênh lệch nồng độ ở trong và ngoài tế bào. - Quá trình chuyển hóa các chất ở trong tế bào vi sinh vật với sự sản sinh năng lượng và quá trình tổng hợp các chất mới của tế bào nhờ hấp thụ dinh dưỡng và năng lượng. Xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học chủ yếu dựa vào hoạt động sống của các vi sinh vật dị dưỡng có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ. Các vi sinh vật dị dưỡng có thể chia thành ba nhóm nhỏ: vi sinh vật hiếu khí, vi sinh vật kỵ khí và vi sinh vật vi hiếu khí. Hệ vi sinh vật sử dụng trong quá trình xử lý nước thải gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn… trong đó vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất. Trong các bể xử lý sinh học, vi khuẩn đóng vai trò hàng đầu và chịu trách nhiệm chính trong phân hủy các thành phần hữu cơ trong nước thải. Tế bào vi sinh vật sống cùng với các chất mang quyện lại với nhau tạo thành dạng keo tụ - bùn hoạt tính. Theo nhiều học giả, trong bùn hoạt tính có nhiều vi sinh vật thuộc các chi khác nhau như: Actinomyces, Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Deslfotomacillium, Micrococcus, Pseudomonas, Sarcina,… Nhóm nấm men cũng xuất hiện trong xử lý nước thải với vai trò chuyển hóa đường đơn thành rượu, bao gồm các chi Saccharomyces, Pichia…và giúp hạn chế sự phát triển của các nhóm vi khuẩn kỵ khí sinh hơi khác. Trong số các vi sinh vật nói trên, số lượng nhiều nhất xuất hiện trong quá trình xử lý nước thải là các loài vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas. Các vi sinh vật trên oxy hóa các gốc rượu, axit béo, parafin, hydrocacbon thơm và các hợp chất khác nhờ sinh tổng hợp các enzym thủy phân và oxy hóa khác nhau [6; 21]. Vi khuẩn chiếm tỷ lệ lớn trong khu hệ vi sinh vật xử lý nước thải và đóng vai trò chủ yếu trong quá trình phân hủy các chất hữu cơ làm sạch nước. Vi khuẩn là nhóm vi 13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ sinh vật có cấu tạo đơn bào, cấu trúc tế bào đơn giản. Vi khuẩn có nhiều hình thái khác nhau như: hình cầu, hình que, hình xoắn, hình dấu phẩy… Đường kính vi khuẩn phần lớn nằm trong khoảng 0,2 ÷ 2 µm, chiều dài khoảng 2 ÷ 8 µm. Vi khuẩn xử lý nước thải chủ yếu là các loài thuộc nhóm vi sinh vật hoại sinh thuộc các chi: Pseudomonas, Bacillus, Alcaligenes, Flavobacterium, Cytophaga, Micrococcus, Lactobacillus, Achromoabacter, Sporochaeta,… Trong số đó, Pseudomonas và Bacillus thường gặp ở hầu hết các loại nước thải, chúng có thể đồng hóa được hầu hết các chất hữu cơ kể cả những chất hữu cơ tổng hợp và tồn tại khá lâu trong môi trường nước [14; 27]. 1.5. Đặc điểm các chế phẩm sinh học hỗ trợ xử lý nƣớc thải Nước thải mới thường ít vi sinh vật, đặc biệt là nước thải công nghiệp đã qua công đoạn xử lý nhiệt, có khi lúc đầu hầu như không có vi sinh vật. Nước thải trong hệ thống thoát nước sau một thời gian, dù rất ngắn, cũng đủ điều kiện để vi sinh vật thích nghi, sinh sản và phát triển tăng sinh khối (trừ những nước thải có chất độc, chất ức chế hoặc diệt vi sinh vật, như các loại nước thải có hàm lượng các kim loại nặng, các chất hữu cơ và vô cơ có tính độc, …). Sau một thời gian sinh trưởng, chúng tạo thành quần thể vi sinh vật có ở trong nước, đồng thời kéo theo sự phát triển của các giới thủy sinh [14]. Việc bổ sung chế phẩm sinh học ở các loại nước thải là không giống nhau. Mỗi loại nước thải có hệ vi sinh vật thích ứng. Song, nói chung vi sinh vật trong nước thải đều là vi sinh vật hoại sinh và dị dưỡng. Chúng không thể tổng hợp được các chất hữu cơ làm vật liệu tạo tế bào mới, trong môi trường sống của chúng cần phải có mặt các chất hữu cơ để chúng phân hủy, chuyển hóa thành vật liệu xây dựng tế bào, đồng thời chúng cũng phân hủy các hợp chất nhiễm bẩn nước đến sản phẩm cuối cùng là CO2 và nước hoặc tạo thành các loại khí khác (CH4, H2S, Indol, mercaptan, scatol, N2, …) [14]. Trong nước thải, các chất nhiễm bẩn chủ yếu là các chất hữu cơ hòa tan, ngoài ra còn có các chất hữu cơ ở dạng keo và phân tán nhỏ ở dạng lơ lửng. Các dạng này tiếp xúc với bề mặt tế bào vi khuẩn (trong nước thải vi khuẩn chiếm đa số trong hệ vi sinh vật) bằng cách hấp phụ hay keo tụ sinh học, sau đó sẽ xảy ra quá trình dị hóa và đồng hóa. Quá trình dị hóa là quá trình phân hủy các chất hữu cơ có khối lượng phân tử lớn, có cấu trúc phân tử là mạch dài thành các hợp chất có mạch ngắn, có khối lượng thấp hoặc thành các đơn vị cấu thành, có thể đi qua được màng vào trong tế bào để chuyển 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vào quá trình phân hủy nội bào (hô hấp hay oxy hóa tiếp) hay chuyển sang quá trình đồng hóa [6]. Quá trình tự làm sạch trong nước xảy ra rất phức tạp. Có 3 quá trình tự làm sạch trong nước: tự làm sạch vật lý, tự làm sạch hóa học và tự làm sạch sinh học. Quá trình tự làm sạch sinh học xảy ra thường xuyên và mạnh mẽ nhất, quá trình này quyết định mức độ tự làm sạch toàn diện của nước. Quá trình tự làm sạch sinh học xảy ra do động vật, thực vật và cả vi sinh vật, trong đó vi sinh vật đóng vai trò quan trọng nhất. Như vậy, quá trình làm sạch nước thải gồm 3 giai đoạn [22]: - Các hợp chất hữu cơ tiếp xúc với bề mặt tế bào vi sinh vật. - Khuếch tán và hấp thụ các chất ô nhiễm nước qua màng bán thấm vào trong tế bào vi sinh vật. - Chuyển hóa các chất này trong nội bào để sinh ra năng lượng và tổng hợp các vật liệu mới cho tế bào vi sinh vật. Các giai đoạn này có mối liên quan rất chặt chẽ. Kết quả là nồng độ các chất nhiễm bẩn nước giảm dần, đặc biệt là vùng gần tế bào vi sinh vật nồng độ chất hữu cơ ô nhiễm thấp hơn ở vùng xa. Đối với sản phẩm do tế bào vi sinh vật tiết ra thì ngược lại. Phân hủy các chất hữu cơ chủ yếu xảy ra trong tế bào vi sinh vật. Quá trình chuyển hóa vật chất trong tế bào vi sinh vật gồm hàng loạt các phản ứng hóa sinh với 2 quá trình đồng hóa và dị hóa, chủ yếu là các phản ứng oxy hóa khử. Mỗi phản ứng oxy hóa đều có enzym xúc tác thích ứng. Phản ứng dị hóa cắt các chất hữu cơ mạch dài, phân chia các chất hữu cơ phức tạp thành các đoạn đơn giản hơn kèm theo sự giải phóng năng lượng sinh học. Phản ứng đồng hóa thành các chất hữu cơ phức tạp từ các chất hợp phần đơn giản (các sản phẩm trung gian của quá trình dị hóa) và cần cấp năng lượng sinh học (thường lấy từ năng lượng được giải phóng của các phản ứng dị hóa) [22; 30; 31]. 1.6. Sự tăng trƣởng của tế bào vi sinh vật Sự sinh trưởng của vi sinh vật là quá trình sinh sản (tăng số lượng, kích thước tế bào) và tăng sinh khối (tăng khối lượng) quần thể vi sinh vật. Hiệu quả của sự dinh dưỡng (đồng thời là sự giảm BOD, COD, ...) là quá trình tổng hợp các bộ phận của cơ thể tế bào và sự tăng sinh khối. Tất cả những biến đổi về hình thái, sinh lý trong cơ thể được tổng hợp thành khái niệm “Phát triển”. 15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Trong quá trình xử lý nước thải sự sinh trưởng cũng là sự tăng số lượng tế bào, và sự thay đổi kích thước tế bào được phản ánh qua sự tăng sinh khối của vi sinh vật. Tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào điều kiện bên ngoài, đặc tính sinh lý và trạng thái tế bào. Vi sinh vật sinh sản chủ yếu bằng cách phân đôi tế bào. Thời gian để tăng gấp đôi số lượng vi sinh vật tối thiểu được gọi là thời gian sinh trưởng/ thời gian thế hệ thường từ 20 phút đến vài ngày. Khi các chất dinh dưỡng cạn kiệt, pH và nhiệt độ… của môi trường thay đổi ngoài các trị số tối ưu thì quá trình sinh sản bị dừng lại [6; 14]. 1.7. Giới thiệu về chế phẩm Bio - BP Theo hướng dẫn của nhà sản xuất chế phẩm sinh học Bio-PB là 100% tự nhiên, phân hủy sinh học và an toàn cho sử dụng hàng ngày trong phạm vi gia đình, thương mại và công nghiệp. Trong xử lý nước thải, Bio-PB là một giải pháp xử lý nước cách mạng giúp tăng tốc tiêu hủy sinh học các chất dinh dưỡng có hại có trong nước như amoniac và nitrit. Ứng dụng đã được minh chứng bao gồm phục hồi ao, hồ và đập nước, kiểm soát tảo, xử lý nước thải, quản lý dinh dưỡng, kiểm soát mùi hôi và mang lại những lợi ích quan trọng trong sản xuất. - Cách sử dụng chế phẩm Bio-PB: Chuẩn bị 2 thùng để pha chế (thể tích các bể phụ thuộc vào tính toán đầu vào), một thùng để kích hoạt chế phẩm, thùng còn lại để xả chế phẩm vào hệ thống xử lý. Kích hoạt và xả dung dịch được thực hiện như sau: Xả đầy nước sạch vào thùng kích hoạt, và cho lượng Bio-PB theo tính toán vào. Giữ nhiệt độ trong quá trình kích hoạt và các thùng xả trong khoảng 10 oC tới 40 oC. Thùng kích hoạt được sục khí với loại máy đơn giản như máy sục bể cá. Kích hoạt Bio-PB trong vòng 24 giờ một chu kỳ. Sau 24 giờ kích hoạt, bơm hoặc xả dung dịch sang thùng xả. Bắt đầu xả từ thùng xả vào hệ thống tại hai điểm như hướng dẫn, đồng thời lặp lại quá trình kích hoạt tại thùng kích hoạt. - Thành phần vi sinh trong chế phẩm Bio – PB: Pediococcus sp. 106 CFU/g; Bacillus sp. 106 CFU/g - Phương pháp bảo quản 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Bảo quản nơi khô ráo thoáng mát, tránh ánh nắng mặt trời. Khi đã mở bao gói, sản phẩm phải được bảo quản trong hộp kín để tránh bị kích hoạt. 17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Chế phẩm sinh học và mẫu nƣớc thải - Các mẫu Bio-PB được cung cấp bởi Nhà máy bia Hà Nội và sử dụng cho phân tích thành phần chế phẩm và đánh giá hiệu quả xử lý nước thải tại nhà máy bia Hà Nội - Các mẫu nước thải được lấy tại nhà máy bia Hà Nội trước, trong và sau quá trình xử lý với hỗ trợ của chế phẩm Bio-BP trong giai đoạn 1 tháng từ 30/6/2013 – 30/7/2014. 2.1.2. Hoá chất - Cao thịt (Merk, Đức) - Cao nấm men ( Merk, Đức) - Các hoá chất thông dụng khác (Trung Quốc). - Các đoạn mồi do Invitrogen (Hồng Kông) cung cấp. - Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Invitrogen (Mỹ). Các hóa chất, dung môi sử dụng của hãng Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Invitrogen (Mỹ) và một số hãng khác. 2.1.3. Thiết bị sử dụng - Kính hiển vi quang học (Model CHD, Olympius, , Nhật Bản) - Máy đo pH (Mettler Toledo, Thụy Sỹ) - Cân điện tử ( Mettler Toledo, Thụy Sỹ) - Nồi hấp khử trùng (ALP MC-40DP, Nhật Bản) - Tủ ấm (Trung Quốc) - Máy li tâm (Eppendorf, Đức) - Máy Vortex (Rotolab OSI, Mỹ) - Tủ lạnh sâu (Sanyo, Nhật Bản) - Bể ổn nhiệt (Teche OSI, Mỹ) - Máy lắc ổn nhiệt (Hàn Quốc) - Máy PCR (Applied Biosystem AC9700, Mỹ) - Máy soi gel (BIO-RAD, Mỹ) - Tủ cấy vô trùng (ESCO, Pháp) 2.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật Môi trường MPA (g/l): cao thịt 3; pepton 10; agar 20; nước 1.000 ml 18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Môi trường MRS (g/l): peptone: 10; cao thịt: 10; cao men: 5; CH3COONa: 5; glucose: 20; amonicitrat: 2; K2HPO4: 2; MgSO4.7H2O: 0,2; MnSO4.7H2O: 0,04; tween 80: 1ml. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Xác định số lƣợng vi sinh vật theo phƣơng pháp pha loãng tới hạn Đối với mẫu chế phẩm: Hòa tan 10 gam mẫu chế phẩm vào 90 ml nước muối sinh lý 0,85% và lắc ở 30oC trong 30 phút. Dịch thu được đã có độ pha loãng là 10-1. Hút 1 ml dịch này chuyển vào một ống nghiệm sạch đã chứa 9 ml nước muối sinh lý khử trùng, được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng cho tới khi đạt độ pha loãng 10-6 hoặc cao hơn. Bên cạnh đó, mẫu chế phẩm được xử lý nhiệt ở 85oC trong thời gian 15 ÷ 20 phút nhằm phân lập nhóm Bacillus [4]. Đối với mẫu nước: Từ các mẫu nước hút 1 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý 0,85% khử trùng, lắc đều. Dịch thu được đã có độ pha loãng là 10-1. Hút 1 ml dịch này chuyển vào một ống nghiệm sạch đã chứa 9 ml nước muối sinh lý khử trùng được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng cho tới khi đạt độ pha loãng 10-6 hoặc cao hơn. Dịch đã pha loãng ở mỗi nồng độ được cấy vô trùng và chang đều trên các đĩa Petri đã có sẵn môi trường thích hợp. Các đĩa Petri được giữ trong tủ ấm 30 ÷ 37oC trong 3 ngày. Trên mỗi mẫu, lựa chọn các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái tương đồng cao với vi khuẩn thuộc chi Bacillus, Pediococcus. Cấy các khuẩn lạc riêng rẽ vào 1 ống nghiệm với môi trường thạch nghiêng thích hợp. Khi chủng đã phát triển tốt, làm tiêu bản vết bôi, nhuộm màu và quan sát dưới kính hiển vi. Lặp lại thao tác thêm một số lần cho tới khi tách được chủng thuần khiết và bảo quản ở 4 oC cho các nghiên cứu tiếp theo. 2.2.2. Quan sát hình thái tế bào Các chủng vi sinh vật trong nghiên cứu được nuôi trong môi trường lỏng MPA, MRS ở nhiệt độ 30oC và 37oC trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 18 20 giờ. Tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy được cố định trên tiêu bản để nhuộm Gram và quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi quét. * Phương pháp nhuộm Gram [3] Cách tiến hành: 19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ + Làm tiêu bản vi sinh vật. + Cố định vết bôi. + Nhuộm bằng tím gential (gential violet) bằng cách nhỏ tím gential lên vết bôi. Giữ trong 1 2 phút. + Đổ hết thuốc nhuộm đi, nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản và để trong 1 phút. + Đổ hết thuốc nhuộm đi rồi nhúng vào cồn 95oC trong 30 40 giây. + Rửa lại bằng nước. + Làm khô vết bôi. + Nhuộm bổ sung bằng Fushin loãng trong 1 2 phút. + Rửa lại bằng nước đợi khô sau đó đem quan sát. Nếu là chủng Gram (+) sẽ có màu tím, chủng Gram (-) có màu hồng. 2.2.3. Khả năng sinh tổng hợp enzym ngoại bào của các chủng nghiên cứu Để xác định khả năng sinh enzym ngoại bào, các chủng vi sinh vật trong nghiên cứu được cấy chấm điểm trên đĩa Petri chứa môi trường khoáng có bổ sung các cơ chất khác nhau trong thời gian 1 ÷ 3 ngày ở 37oC như sau: + Bổ sung 0,2% carboxyl metyl xelluloza (CMC) để xác định hoạt tính CMCaza. Hiện màu bằng dung dịch Lugol (KI 5% (w/v) và I2 10% (w/v)), đo đường kính vòng phân giải trên đĩa Petri thạch. + Bổ sung 0,5% tinh bột tan để xác định hoạt tính amylaza. Hiện màu bằng dung dịch Lugol, đo đường kính vòng phân giải trên đĩa Petri thạch. + Bổ sung 0,5% casein để xác định hoạt tính proteaza. Hiện màu bằng dung dịch axit tricloacetic 50% (w/v), đo đường kính vòng phân giải trên đĩa Petri thạch. 2.2.4. Phân loại vi sinh vật nhóm vi khuẩn Bacillus sử dụng kit API 50 CHB Chủng vi khuẩn được lựa chọn sau khi xác định đặc điểm hình thái cho kết quả là các chủng vi khuẩn Gram (+), tạo bào tử. Để nghiên cứu đặc tính sinh hóa của chủng, bộ kit API 50CHB (BioMérieux, Pháp) dùng cho vi khuẩn Gram (+) được sử dụng trong nghiên cứu. Trình tự các bước thí nghiệm: - Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường MPA sau 24 giờ. - Hòa tan một vòng que cấy chứa sinh khối vi khuẩn vào trong 2,0 ml nước muối sinh lý 0,85%. 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hút 1,0 ml dịch huyền phù vi khuẩn bổ sung vào môi trường khoáng kèm theo bộ kit. - Hút dịch từ ống môi trường khoáng có chứa vi khuẩn bổ sung vào các giếng thử của bộ kit. - Dùng dầu parafin phủ kín lên bề mặt các giếng thử. - Đậy bộ kít thử và nuôi ở nhiệt độ 37oC. - Đọc kết quả quả sau 24 và 48 giờ. - So sánh kết quả đánh giá phân loại trong bảng chuẩn phân loại API để định tên sơ bộ vi khuẩn. 2.2.5. Phân loại vi khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA - Tách DNA tổng số của vi khuẩn: Quy trình tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn được tiến hành theo phương pháp CTAB/NaCl [1;12] (1) Vi khuẩn nuôi trong 24 giờ trên môi trường thạch thu sinh khối hòa trong 1,5 ml nước khử trùng. (2) Cặn tế bào được thu bằng cách ly tâm lạnh trong ở tốc độ 5000 vòng/5 phút để thu sinh khối. (3) Cặn tế bào hòa trong 567 µl TE, 5 µl lyzozym mix đều ủ 37oC trong 20 phút. (4) Bổ sung 3 µl proteaza K, 30 µl SDS 10% vào dung dịch trên mix đều ủ 37oC trong 30 phút. (5) Sau đó bổ sung 100 µl NaCl 5 M, mix đều, bổ sung tiếp 80 µl dung dịch CTAB/NaCl (10% cetyltrimethylammoium bromide, 0.7 M NaCl) mix đều ủ 65oC/10 phút. (6) Chiết 1 V hỗn hợp chloroform : isoamyl (24 : 1), vortex. (7) Ly tâm 12000 vòng/phút thu dịch nổi (lặp lại chiết dung môi hai lần). (8) Bổ sung 10 µl Na – acetat 3 M, mix đều, bổ sung tiếp 2 V cồn 100% (lạnh) hoặc 0,7 V isopropanol (lạnh), mix đều. (9) Để lạnh ở -20oC ít nhất 4 giờ. (10) Ly tâm 12000 vòng/20 phút thu cặn. (11) Rửa tủa bằng 500 µl cồn 70o, ly tâm 12000 vòng/10 phút, thu cặn. (12) Làm khô. (13) Hòa cặn trong 40 ÷ 60 µl TE - ARNaza, ủ ở 37oC/ 1 giờ. (14) Kiểm tra độ tinh sạch của ADN bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm. CADN (protein) = A260 (280) x 50 x độ pha loãng mẫu. Tỉ lệ ADN/protein > 1,8 là mẫu sạch. (15) Điện di kiểm tra trên gel agaroza 1%, điện thế 100 V. Nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromit 1%/ 10 phút. - Khuếch đại gen 16S rDNA: Trình tự gen mã hóa 16S rRNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F và 14R có trình tự như trong bảng 2.1 với các bước thể hiện như sau: 21
- Xem thêm -