Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hạt vải (Semen Litchi)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ THANH NGA NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HẠT VẢI (SEMEN LITCHI) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ THANH NGA NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HẠT VẢI (SEMEN LITCHI) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. PGS.TS.Nguyễn Mạnh Tuyển 2. DS. Phạm Thị Anh Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược học cổ truyền Hà Nội - 2013 LỜI CẢM ƠN Với tất cả tấm lòng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Mạnh Tuyển. Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, hỗ trợ về mọi mặt trong quá trình thực hiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn DS. Phạm Thị Anh đã hướng dẫn, đóng góp, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu để khóa luận được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền, trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Xin cảm ơn chân thành tới các anh chị khoa Hóa phân tích, Dược lý- Viện Dược Liệu đã giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian qua. hân d p này t i c ng in gửi ời cảm ơn đ n thầy c giáo trường ại học ược à n giám hiệu c ng toàn thể các i đã dạy dỗ và tạo mọi điều iện thuận ợi cho t i trong thời gi n t i học tập tại trường. à cuối c ng à ời cảm ơn t i gửi tới gi đình và bạn b đã đ ng vi n, giúp đỡ t i trong suốt thời gi n thực hiện hó uận. o thời gi n àm thực nghiệm c ng như i n th c c ch , hó uận này c n có nhiều thi u sót. bản thân c n nhiều hạn i rất mong nhận được sự góp ý c thầy c , bạn b để hó uận được hoàn thiện hơn. i in chân thành cảm ơn Hà N i ngày 20 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Hồ Thanh Nga các MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................. 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 2 1.1. THỰC VẬT HỌC .................................................................................................. 2 1.1.1. Vị trí phân loại .................................................................................................... 2 1.1.1.1. Đặc điểm thực vật của họ Bồ hòn (Sapindaceae) ............................................ 2 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Litchi Sonn ............................................................ 3 1.1.1.3. Đặc điểm thực vật của cây vải Litchi chinensis Sonn...................................... 3 1.1.2. Phân bố của cây vải Litchi chinensis Sonn ......................................................... 3 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC .................................. 4 1.2.1. Thành phần hóa học ............................................................................................ 4 1.2.2. Tác dụng sinh học trong y học cổ truyền ............................................................ 4 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HẠT VẢI HIỆN NAY............................................ 5 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...................................................................... 5 1.3.1.1. Thành phần hóa học ......................................................................................... 5 1.3.1.2. Tác dụng sinh học ............................................................................................ 6 1.4.1.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ....................................................................... 7 1.4.1.1. Tác dụng hạ đƣờng huyết ................................................................................. 7 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 9 2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU ................... 9 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ...................................................................................... 9 2.1.2. Trang thiết bị ....................................................................................................... 9 2.1.3. Hóa chất, dung môi ............................................................................................. 10 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................................. 10 2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm vi học................................................................................ 10 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học .......................................................................... 10 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học ............................................................................. 11 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 11 2.3.1.Chuẩn bị mẫu ....................................................................................................... 11 2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm vi học................................................................................ 11 2.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học .......................................................................... 11 2.3.3.1. Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải ............................................. 11 2.3.3.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt vải ..................................................... 12 2.3.4. Nghiên cứu tác dụng sinh học ............................................................................. 14 2.3.4.1. Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH .................................................................... 14 2.3.4.2. Thử nghiệm dọn gốc tự do superoxid .............................................................. 15 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN ............................................... 17 3.1. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VI HỌC ................................................................... 17 3.2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC ......................................................... 18 3.2.1. Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải ................................................ 18 3.2.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt Vải ....................................................... 25 3.2.2.1. Xác định độ ẩm ................................................................................................ 25 3.2.2.2. Chiết xuất ......................................................................................................... 25 3.2.2.3. Định lƣợng các phân đoạn bằng phƣơng pháp cân .......................................... 26 3.2.2.4. Định tính các phân đoạn ................................................................................... 27 3.3. NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC ............................................................ 32 3.3.1. Chuẩn bị cao ethanol toàn phần .......................................................................... 32 3.3.2.Thử nghiệm dọn gốc DPPH ................................................................................. 32 3.3.2.1. Chuẩn bị mẫu thí nghiệm ................................................................................. 32 3.3.2.2. Chuẩn bị dung dịch DPPH ............................................................................... 32 3.3.2.3. Tiến hành .......................................................................................................... 32 3.3.3. Thử nghiệm dọn gốc superoxid .......................................................................... 34 3.3.3.1. Chuẩn bị mẫu thí nghiệm ................................................................................ 34 3.3.3.3. Tiến hành ......................................................................................................... 34 3.4. BÀN LUẬN .......................................................................................................... 36 3.4.1. Đặc điểm vi học .................................................................................................. 36 3.4.2. Thành phần hóa học ............................................................................................ 36 3.4.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học ............................................................................ 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BuOH n- butanol DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EtOAC etyl acetat EtOH ethanol IC50 The half maximal inhibitory concentration NADH Nicotinamide adenine dinucleotide NBT Nitroblue tetrazolium PMS Phenazine methosufate DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả định tính hạt Vải bằng phản ứng hóa học ....................................... 24 Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm hạt Vải ................................................................... 25 Bảng 3.3. Kết quả định lƣợng các phân đoạn ............................................................... 27 Bảng 3.4. Kết quả định tính cắn các phân đoạn bằng phản ứng hóa học ..................... 28 Bảng 3.5. Bảng giá trị Rf của các vết ở phân đoạn n-hexan ........................................ 30 Bảng 3.6. Bảng giá trị Rf tƣơng ứng của các vết ở phân đoạn ethyl acetat .................. 31 Bảng 3.7. Bảng giá trị Rf tƣơng ứng của các vết ở phân đoạn n-butanol ..................... 32 Bảng 3.8. Hỗn hợp phản ứng ........................................................................................ 33 Bảng 3.9. Kết quả hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của dịch chiết hạt Vải, quercetin ... 33 Bảng 3.10. Hỗn hợp phản ứng ...................................................................................... 35 Bảng 3.11. Kết quả hoạt tính dọn gốc tự do superoxid của dịch chiết hạt Vải và superoxid dismutase ............................................................. 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Bản đồ phân bố cây Vải (Litchi chinensis) trên thế giới .............................. 4 Hình 2.1. Hình ảnh hạt Vải ........................................................................................... 9 Hình 3.1. Ảnh chụp các đặc điểm bột hạt Vải dƣới kính hiển vi ................................. 17 Hình 3.2. Tinh thể hình kim ......................................................................................... 21 Hình 3.3.Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn dịch chiết hạt Vải ........................................ 26 Hình 3.4. Sắc ký đồ của phân đoạn n-hexan ................................................................ 29 Hình 3.5. Sắc ký đồ của phân đoạn ethyl acetat ........................................................... 30 Hình 3.6. Sắc ký đồ của phân đoạn n-butanol .............................................................. 31 Hình 3.7. Biểu đồ hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của dịch chiết hạt Vải và quercetin34 Hình 3.8: Biểu đồ hoạt tính dọn gốc tự do superoxid của dịch chiết hạt vải (A) và superoxid dismutase (B) ................................................................................................ 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Bên cạnh đó Việt Nam còn được thừa hưởng một nền y học cổ truyền phát triển từ rất lâu đời. Vì vậy, nguồn dược liệu dồi dào cùng với vốn kinh nghiệm sử dụng của các dân tộc chính là một nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá cho các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên, cũng như những nghiên cứu về hoạt tính sinh học theo hướng hiện đại. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các nhà khoa học đã chứng minh sự có mặt của gốc tự do trong hệ thống sinh học [23]. Các gốc tự do sinh ra trong cơ thể gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng như gây ra các bệnh: ung thư, bệnh tim mạch, tiểu đường, các bệnh thoái hóa thần kinh, viêm khớp dạng thấp, lão hóa [25], [32], [43]. Chính vì vậy, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện các chất có khả năng phân hủy, loại bỏ các gốc tự do, chúng được gọi là các chất chống oxy hóa như: các enzym (superoxid dismutase, glutathione peroxidase, catalase…), acid ascorbic, α-tocopherol, glutathione, carotenoid, flavonid,… Theo hướng nghiên cứu đó, hiện nay đã có nhiều công bố về tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, tác dụng hạ đường huyết [39], [41] của dược liệu hạt Vải (Semen Litchi). Trong y học cổ truyền Việt Nam, hạt Vải đã được sử dụng để điều trị nhiều chứng bệnh như: chữa đau dạ dày, chữa răng sưng đau có sâu…Tuy nhiên, các đề tài nghiên cứu về dược liệu hạt Vải ở Việt Nam còn hạn chế. Để góp phần tăng thêm sự hiểu biết về nguồn thực vật làm thuốc của Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hạt Vải ( Semen Litchi ) với 2 mục tiêu: 1. Nghiên cứu thành phần hóa học hạt Vải (Semen Litchi) 2. Khảo sát tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết toàn phần hạt Vải trên in vitro. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. THỰC VẬT HỌC 1.1.1. Vị trí phân loại Cây Vải thuộc chi Litchi Sonn., một chi thuộc họ Bồ hòn (Sapindaceae). Vị trí phân loại của chi Litchi Sonn được tóm tắt theo sơ đồ sau [1], [2], [8]. Ngành ngọc lan (Magnoliophyta). Lớp ngọc lan (Magnoliopsida). Phân lớp hoa hồng (Rosidae). Liên bộ cam (Rutanae). Bộ bồ hòn (Sapindales). Họ bồ hòn (Sapindaceae). Chi Litchi Sonn. 1.1.1.1. Đặc điểm thực vật của họ Bồ hòn (Sapindaceae) Cây gỗ hoặc cây bụi. Lá thường kép lông chim, mọc so le hoặc lá kép hình chân vịt, hiếm khi là lá đơn. Phần lớn không có lá kèm. Lá chét mọc so le hoặc mọc đối [1], [2], [20]. Mép lá có răng cưa hoặc nếp cuộn. Hoa nhỏ, tập hợp thành cụm hoa hình chùy, mọc ở kẽ lá bắc. Hoa đơn tính, hiếm khi lưỡng tính, đối xứng hai bên hoặc đối xứng tỏa tròn. Đài hoa 4, 5 hoặc 6, kích thước đồng đều hoặc không đồng đều, dính liền hoặc tách rời. Tràng 4, 5 hoặc 6, tách rời hoặc dính liền nhau, mặt trong cánh hoa thường có những vẩy hoặc chùm lông, dính với đĩa mật, đôi khi hoa không có cánh. Đĩa mật hình vòng khuyên, ở bên ngoài vòng nhị. Nhị hoa 5-10 thường là 8, dính vào đế hoa, nhị thò ra ngoài, tách rời hoặc dính liền, bao phấn đính liền nứt dọc. Bộ nhụy 1, 3 hoặc 4 lá noãn, mỗi lá noãn chứa 1, 2 hoặc một số noãn, kiểu đính noãn trung trụ; bầu có 1-4 ô, chỉ có một ô phát triển. Quả nang chia ngăn hoặc quả mọng hoặc quả hạch. Hạt có 1, 2 hoặc nhiều hơn tách rời nhau, vỏ ngoài hạt màu đen hoặc nâu, phôi cong uốn nếp, không có nội nhũ 2n = 20 - 36, giàu tinh bột, lipid, có hoặc không có áo hạt [20]. Họ Bồ hòn (Sapindacae) có 135 chi, 1500 loài phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt ở nhiệt đới Đông Nam Á [20]. Ở Việt Nam có 3 70 loài, thuộc 25 chi: Allophylus, Amesiodendron, Aryteta, Blighia, Cardiospermum, Delavaya, Dimocarpus, Dodonaea, Glennila, Guioa, Hurpullia, Koelreuteria, Lepisanthes, Litchi, Mischocarpus, Nephelium, Paranephelium, Pavieasia, Pometia, Sapindus, Scheleichera, Sinoradlkofera, Sisyrolepis, Xerospermum, Zollingerio [1]. 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Litchi Sonn. Cây gỗ. Lá kép lông chim mọc so le. Cụm hoa hình chùy. Hoa đơn tính cùng gốc, mọc ở kẽ lá bắc, đối xứng tỏa tròn. Đài 4-5 thùy, mở nắp, không có cánh hoa. Nhị 6-8 có lông, chỉ nhị thò ra ngoài. Bộ nhụy có 2- 3 lá noãn, mỗi lá noãn chứa 1 noãn, bầu nhụy hình tim ngược. Quả đơn có áo hạt hình trứng hoặc gần hình cầu, vỏ quả mỏng, có vết rạn, đôi khi gần như trơn. Hạt hình trứng, vỏ hạt màu nâu, phôi thẳng 2n = 28 hoặc 30 [20]. Chi Litchi Sonn chỉ có một loài trên thế giới là Litchi chinensis Sonn [20], [12], với 3 loài phụ [8]: - ssp. chinensis : Được trồng nhiều ở Việt Nam và Nam Trung Quốc. - ssp. philippinensis: Mọc hoang dại ở Philippin. - ssp. javensis: Chỉ mới thấy trồng ở phía tây đảo Java (Indonesia) và Nam Đông Dương (Campuchia và Nam Việt Nam) [12]. 1.1.1.3. Đặc điểm thực vật của cây vải Litchi chinensis Sonn. Cây nhỡ hoặc cây to, cao khoảng 8-15 m, vỏ màu xám đen. Cành tròn, vỏ màu nâu sẫm, tán lá rộng. Lá kép lông chim, mọc so le, cuống lá dài 10-15 cm. Lá chét dày 2, 3, hoặc 4 cặp, cuống lá chét dài 7-8 mm, phiến lá hình mũi mác hoặc hình trứng mác, gốc tròn, đầu nhọn [20]. Hoa xếp thành hình chùy ở ngọn cành, 5 lá đài đính nhau, có lông [12], [14], [20]. Hoa không có tràng. Nhị 6-7 đôi khi là 8, dài 4mm [20]. Bộ nhụy có 2 lá noãn, mỗi lá chứa 1 noãn, bầu 2 ô [8], nhụy có lông [20]. Quả màu đỏ nâu, hình cầu hoặc gần hình cầu. Hạt màu nâu, hình cầu [20]. Mùa hoa: tháng 3-4, mùa quả: tháng 5-6 [20]. 1.1.2. Phân bố của cây vải Litchi chinensis Sonn. Bản địa: Trung Quốc, Malaysia, Việt Nam. 4 Di thực: Úc, Brazil, Honduras, Hong Kong, Ấn Độ, Israel, Madagascar, Mauritius, Mexico, Myanmar, New Zealand, Reunion, Bắc Châu Phi, Đài Loan, Tỉnh thuộc Trung Quốc, Thái Lan, Zanzibar [34]. Hình 1.1. Bản đồ phân bố cây Vải (Litchi chinensis) trên thế giới 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 1.2.1. Thành phần hóa học Hạt Vải (lệ chi hạch) chứa tanin, chất béo, saponosid, α- metylen cyclopropyglycin [8], [12], [14]. 1.2.2. Tác dụng sinh học trong y học cổ truyền Theo y học cổ truyền, hạt Vải có vị ngọt chát, tính ôn, quy kinh can thận, có tác dụng ôn trung lý khí, chỉ thống [8], [12], [14]. Công dụng chữa đau dạ dày, thoát vị bẹn, đau kinh, tinh hoàn sưng đau. Liều dùng 3-6g/ ngày, thường dùng phối hợp với trần bì, mộc hương [14]. Một số bài thuốc có hạt Vải: Bài 1: Bài thuốc chữa tinh hoàn sưng đau [12], [14]. Hạt vải 49 hạt Trần bì 36g Lưu hoàng 16g Tất cả 3 vị tán nhỏ, dùng nước cơm làm thành viên bằng hạt đậu xanh. 5 Cách dùng: dùng rượu chiêu thuốc, lúc nào đau uống 9 viên. Bài 2: Bài thuốc chữa đau bụng kinh hoặc sau khi đẻ [8]. Hạt vải đốt tồn tính 20g Hương phụ 40g Tán nhỏ, trộn đều. Cách dùng: Uống với nước muối nhạt hoặc nước cơm, ngày dùng 2- 3 lần, mỗi lần 8g. Bài 3: Bài thuốc chữa đau dạ dày [14]. Hạt vải 3g Mộc hương 2g Nghiền thành bột. Cách dùng: Uống với nước, ngày 3 thang. Bài 4: Bài thuốc chữa răng sưng đau có sâu [8]. Hạt vải sấy khô, tán bột, xát vào răng bị đau nhiều lần trong ngày. 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HẠT VẢI HIỆN NAY 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.3.1.1. Thành phần hóa học Từ dịch chiết ethanol 95%, đã phân lập 7 flavonoid glycoside: Litchioside D, pinocembrin 7-O-neohesperidoside, pinocembrin 7-O-rutinoside , taxifolin 40-O-β-Dglucopyranoside , kaempferol 7-O-neohesperidoside, tamarixetin 3-O-rutinoside, phlorizin [42] và 4 chất sesquiterpene glucosides: Litchiosides A, litchiosides B, pumilaside A, funingensin A [41]. Một nghiên cứu khác phân lập được một số anthocyanidin: 2α,3α-epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-(4β-8-catechin); 2α, 3αepoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-(4β-8-epicatechin); 2β,3β-epoxy-5,7,30,40-tetra- hydroxyflavan-(4α-8-epicatechin) và một số acid hữu cơ: 2,5-dihydroxy-hexanoic acid; coumaric acid, protocatechui acid [30]. 6 Từ dịch chiết ethanol 50% của hạt vải, đã phân lập 5 hợp chất phenolic: gallic acid, procyanidin B2, α-gallocatechin , α-epicatechin, α-epicatechin-3-gallate [27]. 1.3.1.2. Tác dụng sinh học Tác dụng chống oxy hóa Từ dịch chiết ethanol 95% của hạt Vải, đã phân lập được một số anthocyanidin, sau đó thử tác dụng chống oxy hóa trên in vitro với thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH, TEAC. Kết quả cho thấy 3 chất: 2α,3α-epoxy-5,7,30,40tetrahydroxyflavan-(4β-8-catechin); 2α, 3α-epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-(4β-8epicatechin); 2β,3β-epoxy-5,7,30,40-tetra-hydroxyflavan-(4α-8-epicatechin) có tác dụng chống oxy hóa ở mức độ trung bình [30]. 7 Một nghiên cứu khác thử tác dụng chống oxy hóa trên in vitro với thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH, ức chế lipid peroxydation, đối với các dịch chiết hạt Vải: ethanol 90%, ethanol 50%, methanol, methanol 50%, nước. Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol 50% có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất [27]. Tác dụng chống ung thư Từ dịch chiết ethanol 95% của hạt Vải, đã phân lập được: Litchioside D (1), taxifolin-4-O-β-glucopyranoside (2), kaemferol 7-neohesperidoside (3), pulmilaside A (4). Sau đó thử tác dụng gây độc trên in vitro đối với các dòng tế bào A549, LAC, Hep-G2, HeLa bằng thử nghiệm đo màu MTT ở bước sóng 570nm, chất đối chiếu admycin. Kết quả cho thấy chất (1), (2), (3), (4) đều có tác dụng ức chế các dòng tế bào thử nghiệm [41], [42]. Tác dụng hạ đường huyết Từ dịch chiết ethanol 50% của hạt Vải, chiết phân đoạn với chloroform, nbutanol; phần n-butanol chia thành 2 phần: phần tan trong nước (WS), phần không tan trong nước (WI). Sau đó thử nghiệm tác dụng ức chế α-glucosidase trên in vitro đối với dịch chiết ethanol 50%, các phân đoạn, phần WS, WI. Kết quả cho thấy: dịch chiết ethanol 50% có tác dụng mạnh, phân đoạn n-butanol có tác dụng mạnh nhất so với các phân đoạn, WI tác dụng mạnh hơn WS [39]. Từ dịch chiết ethanol 70% của hạt Vải, đã phân lập được α(methylenecyclopropyl) glycine, sau đó thử tác dụng trên chuột thấy có tác dụng hạ đường huyết, giảm nồng độ glycogen ở gan [19]. Tác dụng ức chế tyrosinase Thử nghiệm tác dụng ức chế tyrosinase trên in vitro đối với các dịch chiết từ hạt Vải: ethanol, ethanol 50%, methanol, methanol 50%, nước. Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol 50% có tác dụng mạnh nhất [27]. 1.4.1.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 1.4.1.1. Tác dụng hạ đường huyết Từ cao chiết ethanol 50% của hạt Vải, thử tác dụng hạ đường huyết trên mô hình gây tăng đường huyết bằng alloxan ở chuột nhắt trắng với liều uống 1,5g và 3g 8 cao/ kg thể trọng/ ngày (tương đương với 10g và 20g dược liệu khô), trong 8 ngày liên tục, tác dụng hạ đường huyết ở liều 1,5g cao/ kg thể trọng/ ngày có tác dụng mạnh hơn [10]. 9 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu Hạt của cây Vải Thiều (Hình 2.1) được thu hái ở Thanh Hà - Hải Dương vào tháng 5 - 6 năm 2012. Mẫu cây được TS. Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, giám định tên khoa học là: Litchi chinensis Sonn., Họ Bồ hòn (Sapindaceae). Tiêu bản được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội. Mã tiêu bản: HNIP/17853/13 (Phụ lục 1). Dược liệu sau khi làm sạch, được phơi khô, bảo quản trong túi nilon kín để nơi khô ráo. Hình 2.1. Hình ảnh hạt Vải 2.1.2. Trang thiết bị - Bếp cách thủy Memmert. - Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Sartorius. - Tủ sấy Memmert, Shellab. - Máy cô quay chân không Buchi R – 200. - Hệ thống chấm mẫu Linomat 5, đèn soi tử ngoại 2 bước sóng 254 nm và 365 nm (CAMAG). - Máy siêu âm Wise clean (Hàn Quốc). 10 - Máy li tâm PLC-012E. - Máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems (Đức). - Kính hiển vi. - Máy chụp ảnh kỹ thuật số 10.0 mega pixels (Panasonic). - Thuyền tán. - Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm. 2.1.3. Hóa chất, dung môi  Hóa chất sử dụng cho chiết xuất, nghiên cứu hóa học - Chloroform, ethanol, ethylacetat, n-hexan, n-butanol, methanol, aceton, toluen, acid formic, acid acetic, acid sulfuric,…được mua tại các công ty hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích. - Cồn 96% thực phẩm (Việt Nam). - Bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 của hãng Merck. - Các hóa chất, thuốc thử dùng cho định tính sơ bộ thành phần hóa học được pha chế theo Dược Điển Việt Nam IV (các chuyên luận thuốc thử).  Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm sinh học - 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) của hãng Sigma (Mỹ). - Quercetin của hãng Sigma (Mỹ). - Superoxid dismutase của hãng Sigma (Mỹ). - Phenazine methosufate (PMS). - Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH). - Nitroblue tetrazolium (NBT). - Các hóa chất thông thường khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích. 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm vi học Nghiên cứu đặc điểm bột hạt Vải. 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học Định tính xác định các nhóm hợp chất trong hạt Vải. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt Vải. 11 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro của dịch chiết toàn phần hạt Vải với 2 thử nghiệm: - Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH. - Thử nghiệm dọn gốc tự do superoxid. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1.Chuẩn bị mẫu  Mẫu dƣợc liệu dùng để nghiên cứu đặc điểm vi học Hạt Vải sấy ở 600C, để nguội, tán nhỏ bằng thuyền tán, rây qua rây số 125, phần trên rây được tán nhỏ và rây tiếp, lặp lại vài lần cho đến khi toàn bộ dược liệu thành bột mịn [4]. Bột mịn được cho vào lọ, dán nhãn dùng để soi bột.  Mẫu dƣợc liệu dùng để nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học. Hạt Vải sấy ở 600C, để nguội, xay thành bột thô (1400/355), cho vào túi nilon bảo quản nơi khô ráo. 2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm vi học Mỗi dược liệu có những mô học đặc trưng, được thể hiện một phần ở đặc điểm bột dược liệu. Nghiên cứu vi học bằng cảm quan và kính hiển vi nhằm tìm ra một số đặc điểm đặc trưng nhằm định danh, xác định độ tinh khiết của dược liệu. - Quan sát cảm quan: Nhận định màu sắc, mùi, vị, - Quan sát bằng kính hiển vi: + Quan sát mô tả đặc điểm điển hình (vỏ hạt, phôi, nội nhũ,…). + Chọn chất lỏng lên tiêu bản nhằm làm cho đối tượng nghiên cứu trở nên sáng hơn, rõ hơn [4], [13]. 2.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học 2.3.3.1. Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải a. Nguyên tắc