Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây bảy lá một hoa paris polyphylla var. chinensis franchet thu thập tại việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------------------------------------------ Nguyễn Thị Duyên NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA - PARIS POLYPHYLLA VAR. CHINENSIS FRANCHET THU THẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------------------------------------------ Nguyễn Thị Duyên NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA - PARIS POLYPHYLLA VAR. CHINENSIS FRANCHET THU THẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 62.44.01.17 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Đỗ Thị Hà 2. GS. TS. Phạm Quốc Long Hà Nội, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi với sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Đỗ Thị Hà và GS.TS. Phạm Quốc Long. Các kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác. Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Duyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đỗ Thị Hà và GS.TS. Phạm Quốc Long - những người Thầy (cô) đã giao đề tài và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn các Thầy cô Trường Đại học Công nghiệp, Đại học Bách Khoa và Đại học Khoa học Tự nhiên - Hà Nội và các nhà khoa học Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã giảng dậy các môn học chuyển đổi, các chuyên đề và cho tôi đính hướng nghiên cứu hiệu quả. Tôi xin chân thành cảm ơn các chị em công tác tại khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu đã nhiệt tình giúp đỡ tôi và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình làm thực nghiệm tại khoa. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Trần Thị Hiền tại Phòng Thực nghiệm Dược học Đại học Lund - Thụy Điển đã nhiệt tình giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu về hoạt tính sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Vũ Xuân Phương, TS. Nguyễn Thế Cường, ThS. Bùi Hồng Quang - Viên Sinh thái Tài nguyên - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Ths. Nguyễn Quỳnh Nga - Khoa Tài Nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu đã giúp tôi giám định tên khoa học. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã hỗ trợ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện Luận án. Luận án này được hỗ trợ kinh phí và thực hiện trong khuôn khổ đề tài cơ sở Viện Dược liệu do Ths. Nguyễn Thị Duyên làm chủ nhiệm, Quỹ L'oreal National Fellowship2016 và đề tài cấp Bộ Y tế năm 2017 do PGS. TS. Đỗ Thị Hà làm chủ nhiệm. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Nguyễn Thị Duyên MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN.......................................................................................... 3 1.1. Phân loại và đặc điểm thực vật chi Paris............................................................ 3 1.2. Công dụng của một số loài thuộc chi Paris........................................................ 4 1.3. Thành phần hóa học chi Paris............................................................................. 5 1.3.1. Các hợp chất saponin................................................................................. 5 1.3.1.1. Các hợp chất saponin steroid.......................................................... 5 1.3.1.2. Các hợp chất saponin triterpenoid.................................................. 16 1.3.2. Các flavonoid............................................................................................. 16 1.3.3. Các hợp chất khác...................................................................................... 17 1.4. Tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Paris.................................................. 18 1.4.1. Tác dụng chống ung thư............................................................................ 18 1.4.2. Tác dụng điều hòa miễn dịch..................................................................... 21 1.4.3. Tác dụng cầm máu và tan máu.................................................................. 21 1.4.4. Tác dụng chống oxy hóa............................................................................ 22 1.4.5. Tác dụng kháng virus, kháng nấm và chống ký sinh trùng....................... 23 1.4.6. Tác dụng trên thần kinh............................................................................. 24 1.4.7. Tác dụng trên dạ dày.................................................................................. 24 1.5. Những nghiên cứu về cây bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinenesis Franchet).................................................................................................................... 24 1.5.1. Phân loại và đặc điểm hình thái bảy lá một hoa........................................ 24 1.5.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của bảy lá một hoa................................................................................................................. 25 1.5.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học................................................. 25 1.5.2.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học................................................... 26 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 28 2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 28 2.2. Các phương pháp hóa học................................................................................... 28 2.2.1. Phương pháp phân lập các chất.................................................................. 28 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất............................................. 28 2.2.3. Phương pháp dấu vân tay hóa học............................................................. 29 2.3. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học............................................................ 30 2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào........................................ 30 2.3.2. Sử dụng kỹ thuật phân tích luciferase Renilla để xác định hoạt độ của hai yếu tố NF-κB và AP-1................................................................................... 31 2.3.3. Sử dụng kỹ thuật Western blot trong phát hiện biểu hiện của các protein trong tế bào ung thư vú MCF-7........................................................................... 32 CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM.................................................................................. 33 3.1. Chiết tách các phân đoạn và phân lập các chất................................................... 33 3.1.1. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ phần dưới mặt đất............................ 33 3.1.2. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ phần trên mặt đất............................. 34 3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ PPC............... 38 3.3. Xây dựng dấu vân tay hóa học............................................................................ 44 3.4. Hoạt tính sinh học............................................................................................... 46 3.4.1. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư bằng phương pháp MTT........ 46 3.4.2. Xác định tác dụng của chất paris II lên hoạt tính của hai yếu tố NF-κB và AP1.................................................................................................................. 47 3.4.3. Xác định tác dụng của chất paris II lên sự biểu hiện của các protein trong tế bào ung thư vú MCF-7........................................................................... 48 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 49 4.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ thân rễ bảy lá một hoa PPC............ 49 4.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ phần trên mặt đất bảy lá một hoa PPC..... 49 4.3. Biện giải cấu trúc của các hợp chất phân lập từ PPC......................................... 50 4.3.1. Biện giải cấu trúc chất mới AB17 (PE29)................................................. 50 4.3.2. Biện giải cấu trúc chất AE6 (PE27)........................................................... 56 4.3.3. Biện giải cấu trúc các chất diosgenin steroid ............................................ 59 4.3.4. Biện giải cấu trúc các chất pennogenin steroid ......................................... 81 4.3.5. Biện giải cấu trúc của một số sterol khác.................................................. 95 4.3.6. Biện giải cấu trúc các hợp chất flavonoid.................................................. 97 4.3.7. Biện giải cấu trúc chất AE11 (thymidin)................................................... 102 4.4. Xây dựng dấu vân tay hóa học các mẫu thuộc chi Paris.................................... 105 4.4.1. Xây dựng dấu vân tay bằng phương pháp TLC......................................... 105 4.4.2. Xây dựng dấu vân tay bằng phương pháp HPLC..................................... 109 4.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học............................................................................ 111 4.5.1. Tác dụng gây độc tế bào ung thư của cao chiết tổng, cao phân đoạn và một số hợp chất tinh khiết phân lập từ PPC......................................................... 111 4.5.2. Ảnh hưởng của hợp chất Paris II lên hoạt độ của hai yếu tố NF-κB và AP-1 bằng kỹ thuật phân tích luciferase Renilla................................................. 115 4.5.3. Kết quả đánh giá thay đổi mức độ biểu hiện của các protein trong tế bào ung thư vú MCF-7 dưới tác dụng của hợp chất Paris II bằng kỹ thuật Western Blot......... 116 KẾT LUẬN..................................................................................................................... 120 KIẾN NGHỊ.................................................................................................................... 122 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN................................................................................................................................123 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................. 124 DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu NMR Tiếng Anh Nuclear Magnetic Resonance Diễn giải Phổ cộng hưởng từ hạt Proton Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy Carbon 13 Nuclear Magnetic nhân Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt Resonance spectroscopy Heteronuclear Multiple Bond Correlation nhân cacbon Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân trực tiếp H→C 1 1 1 H-NMR 13 C-NMR HMBC H-1HCOSY DEPT DMSO H-1H chemical Shift Correlation Spectroscopy Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Dimethyl sulfoxide Mp Hight Resolution Electron Spray Ionization Mass Spectrometry Electron Spray Ionization Mass Spectra Melting point MeOH EtOAc DCM EtOH Methanol Ethyl acetate Diclo methane Ethanol IC50 Inhibitory Concentration at 50% EGF NF-κB Epidermal growth factor Nuclear factor kappa B HR-ESI-MS ESI-MS Phổ tương tác proton Phổ DEPT (CH3)2SO Phổ khối ion hóa phun mù điện tử phân giải cao Phổ khối lượng ion hóa phu mù điện tử Điểm chảy Nồng độ ức chế 50% đối tượng thực nghiệm Yếu tố tăng trưởng biểu bì Yếu tố phiên mã NF-κB AP1 Activator protein 1 MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl-tetrazolium bromide LPS Lipo polysaccharides A549 Human lung cancer cells Human promyelocytic leukemia cells HL-60 Yếu tố phiên mã AP1 Dòng tế bào ung thư phổi Dòng tế bào ung thư bạch cầu Dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela Cervical adenocarcinoma cells Caco-2 Heterogeneus human epithelial colorectal adenocarcinoma cells MCF-7 Human breast cancer cells PPC Paris polyphylla var. chinensis PPCW Wild Paris polyphylla var. chinensis PV Paris vietnamensis PPP Paris polyphylla var. polyphylla PC PPY Paris caobangensis Paris polyphylla var. yunnanensis δH Proton chemical shift δC Carbon chemical shift s: Singlet d: Doublet m: Multiplet Dòng tế bào ung thư trực tràng Dòng tế bào ung biểu mô vú Loài bảy lá một hoa được trồng tại Sapa - Lào Cai Loài bảy lá một hoa thu hái tự nhiên tại Sapa Lào Cai Độ chuyển dịch hóa học của proton t: Triplet Độ chuyển dịch hóa học của cacbon overlap: Overlapped dd: doublet doublet DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Các saponin sterol phân lập từ chi Paris............................................ 10 Bảng 1.2: Cấu trúc của các flavonol phân lập từ chi Paris.............................. 17 Bảng 3.1: Mẫu thực vật chi Paris sử dụng trong nghiên cứu dấu vân tay hóa học............................................................................................................. Bảng 3.2: Chương trình chạy HPLC của phần trên và dưới mặt đất các loài Paris................................................................................................................. 45 46 Bảng 4.1: Dữ liệu phổ của hợp chất AB17 (500MHz, DMSO-d6).................. 53 Bảng 4.2: Dữ liệu phổ hợp chất AE6 (500MHz, MeOD)................................ 58 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ của hợp chất RE1 (CDCl3, 500Hz)............................. 61 Bảng 4.4: Dữ liệu phổ của hợp chất AE16...................................................... Bảng 4.5: Dữ liệu phổ của hợp chất AE15...................................................... 64 67 Bảng 4.6: Dữ liệu phổ của hợp chất RE3 và gracillin..................................... Bảng 4.7: Dữ liệu phổ của hợp chất AB18...................................................... Bảng 4.8: Bảng dữ phổ của hợp chất AB19 và paris saponin II...................... 71 75 80 Bảng 4.9: Dữ liệu phổ của hợp chất RE4 (500MHz, DMSO-d6).................... Bảng 4.10: Dữ liệu phổ của hợp chất RE5 và paris saponin H....................... 85 89 Bảng 4.11: Dữ liệu phổ của hợp chất AB20 (500MHz, DMSO-d6)................ Bảng 4.12: Dữ liệu phổ của hợp chất AE12 (500MHz, MeOD) và resveratrol.. Bảng 4.13: Dữ liệu phổ của hợp chất AE13 và viniferin................................. Bảng 4.14: Dữ liệu phổ của hợp chất AE11 và thymidin................................ Bảng 4.15: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao tổng và cao phân đoạn....... 93 100 102 104 111 Bảng 4.16: Giá trị IC50 của 8 hợp chất phân lập được PPC trên 4 dòng tế bào ung thư................................................................................................... 112 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sự chuyển hóa của các saponin steroid trong chi Paris....................... 6 Hình 1.2: Cấu trúc của các saponin spirostan phân lập từ chi Paris................... 7 Hình 1.3: Cấu trúc của các saponin furostan phân lập từ chi Paris.................... 8 Hình 1.4: Cấu trúc của các saponin pregna phân lập từ chi Paris...................... 8 Hình 1.5: Một số cấu trúc saponin khác được phân lập từ chi Paris.................. 9 Hình 1.6: Cấu trúc saponin polyhydroxyl hóa và kryptogenin........................... 10 Hình 1.7: Cấu trúc hóa học của các saponin triterpen......................................... 16 Hình 1.8: Một số hợp chất khác phân lập từ chi Paris........................................ 17 Hình 1.9: Cây bảy lá một hoa - Paris polyphylla var. chinensis Franchet được trồng tại Sapa - Lào Cai...................................................................................... 25 Hình 2.1: Mô phỏng hệ thống sắc ký HPLC....................................................... 30 Hình 3.1: Sơ đồ chiết cao phân đoạn thân rễ bảy lá một hoa.............................. 33 Hình 3.2: Sơ đồ phần lập các hợp chất từ cao phân đoạn etyl axetat phần thân rễ cây Bảy lá một hoa.................................................................................. 34 Hình 3.3: Sơ đồ chiết cao phân đoạn phần trên mặt đất bảy lá một hoa............. 35 Hình 3.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn etyl axetat phần trên mặt đất........................................................................................................... 36 Hình 3.5: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn butanol phần trên mặt đất.......................................................................................................... 37 Hình 4.1: Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ phần dưới mặt đất..... 49 Hình 4.2: Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ phần trên mặt đất.......................................................................................................... 50 Hình 4.3: Phổ khối HR-ESI-MS của hợp chất AB17......................................... Hình 4.4. Phổ NMR của hợp chất AE 17............................................................ Hình 4.5: Tương tác các anome trong phân tử đường của hợp chất AE 17........ Hình 4.6: Các tương tác HMBC (→) hợp chất AE 17........................................ 51 52 53 55 Hình 4.7: Công thức cấu tạo của hợp chất AE 17............................................... 55 Hình 4.8: Phổ 1H-NMR của hợp chất AE6......................................................... 56 Hình 4.9: Phổ 13C-NMR của hợp chất AE6........................................................ 57 Hình 4.10: Phân mảnh phổ ESI-MS hợp chất AE6............................................ 57 Hình 4.11: Tương tác HMBC trong cấu trúc phân tử hợp chất AE6.................. 58 Hình 4.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất AE6................................................. 59 Hình 4.13: Phổ 1H, DEPT và 13C-NMR của hợp chất RE1................................ 60 Hình 4.14: Cấu trúc hóa học của hợp chất RE1.................................................. 61 Hình 4.15: Phổ 13C-NMR của hợp chất AE16.................................................... 62 Hình 4.16: Tương tác các anome trên phổ HMBC của hợp chất AE16............ 63 Hình 4.17: Phổ COSY của hợp chất AE16......................................................... 63 Hình 4.18: Cấu trúc của hợp chất AE16 và tương tác HMBC (→) và COSY (−) phần đường ................................................................................................... 65 Hình 4.19: Phổ NMR hợp chất AE15................................................................. 66 Hình 4.20: Cấu trúc hóa học của hợp chất AE15................................................ 68 Hình 4.21: Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 3................................................. 69 Hình 4.22: Tương tác của anome phần đường của hợp chất 3............................ 70 Hình 4.23: Phổ COSY của hợp chất 3................................................................ 70 Hình 4.24: Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 và tương tác HMBC và COSY..... 72 Hình 4.25: Phổ 1H-NMR và tương tác HMBC của nhóm metyl trong hợp chất 18.......................................................................................................... 73 Hình 4.26: Phổ 13C-NMR của hợp chất 18......................................................... 74 Hình 4.27: Phổ giãn HMBC và HSQC của hợp chất 18..................................... 74 Hình 4.28: Phổ COSY của hợp chất 18.............................................................. 75 Hình 4.29: Cấu trúc hóa học của hợp chất 18 và tương tác HMBC và COSY trong phần đường.................................................................................................. 77 Hình 4.30: Phổ 1H-NMR giãn và tương tác nhóm methy trên phổ HMBC của hợp chất 19.......................................................................................................... 77 Hình 4.31: Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 19.......................................... 78 Hình 4.32: Phổ giãn HSQC và phổ giãn HMBC của hợp chất 19...................... 79 Hình 4.33. Công thức hóa học của hợp chất 19 và tương tác HMBC phần đường................................................................................................................... 81 Hình 4.34: Phổ 1H-NMR của hợp chất 8............................................................. 82 Hình 4.35: Phổ 13C-NMR của hợp chất 8........................................................... 82 Hình 4.36: Công thức cấu tạo của hợp chất 8..................................................... 83 Hình 4.37: Phổ giãn 1H-NMR và tương tác của nhóm metyl trên phổ HMBC của hợp chất 4..................................................................................................... 83 Hình 4.38: Phổ giãn DEPT của hợp chất 4......................................................... 84 Hình 4.39: Tương tác của các anome trên phổ HSQC và HMBC của hợp chất 4... 85 Hình 4.40: Tương tác HMBC trong phân tử của hợp chất 4............................... 85 Hình 4.41: Cấu trúc hóa học của hơp hợp chất 4............................................... 87 Hình 4.42: Phổ giãn NMR của hợp chất 5.......................................................... 88 Hình 4.43: Cấu trúc hóa học của hợp chất 5 và tương tác HMBC trong phần đường.......................................................................................................... 90 Hình 4.44: Phổ 1H-NMR và DEPT của hợp chất 20........................................... 91 Hình 4.45. Phổ giãn HMBC tương tác của anome.............................................. 92 Hình 4.46: Cấu trúc hóa học của hơp hợp chất 20 và tương tác HMBC trong cấu trúc phần đường.............................................................................................. 94 Hình 4.47: Phổ 1H-NMR của hợp chất 7............................................................. Hình 4.48: Phổ 1H-NMR của hợp chất 9.............................................................. Hình 4.49: Phổ DEPT của hợp chất 9................................................................. Hình 4.50: Phổ 1H-NMR của hợp chất 14........................................................... 96 97 98 98 Hình 4.51: Phổ DEPT của hợp chất 14............................................................... 99 Hình 4.52: Cấu trúc hóa học của hợp chất 14..................................................... 99 Hình 4.53: Phổ 1H-NMR của hợp chất 13........................................................... 101 Hình 4.54: Phổ 13C-NMR và HSQC của hợp chất 13......................................... 101 Hình 4.55: Công thức cấu tạo của hợp chất 13................................................... 102 Hình 4.56: Phổ DEPT của hợp chất 11............................................................... Hình 4.57: Phổ COSY, HMBC của hợp chất 11................................................. Hình 4.58: Cấu trúc hóa học của hợp chất 11..................................................... Hình 4.59: Sắc ký đồ bản mỏng các mẫu phần trên mặt đất chi Paris............... Hình 4.60: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) các mẫu phần 103 103 104 105 dưới mặt đất chi Paris (Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (2/1/0,01) )............. 106 Hình 4.61: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) các mẫu phần dưới mặt đất chi Paris (Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (14/6/1)) ................ 107 Hình 4.62: Sắc ký đồ trên silica gel 60 RP-18 F254 (Merck, 20x10 cm) các mẫu phần dưới mặt chi Paris (Hệ dung môi: MeOH/H2O (20/3)) .................... 107 Hình 4.63: Sắc ký đồ HPLC các mẫu phần trên mặt đất thuộc chi Paris........... 109 Hình 4.64: Sắc ký đồ HPLC các mẫu phần dưới mặt đất thuộc chi Paris.......... 110 Hình 4.65: Ảnh hưởng của cao tổng, các cao phân đoạn, và các hợp chất spirostan steroid đến mức độ tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7..................... 114 Hình 4.66: Ảnh hưởng của paris II đến mức độ tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7.... 115 Hình 4.67: Ảnh hưởng của hợp chất paris II đến mức độ hoạt độ của NF-B và Ap-1 gây bởi LPS trong đại thực bào RAW264.7......................................... 115 Hình 4.68: Tác dụng của paris II lên mức độ biểu hiện nhóm protein tham gia vào chu trình tế bào............................................................................................. 117 Hình 4.69: Tác dụng của paris II lên mức độ biểu hiện nhóm protein tham gia vào quá trình apotosis ......................................................................................... 118 MỞ ĐẦU Đất nước Việt Nam có dạng hình chữ S gồm phần đất liền trải dài theo vĩ độ Bắc từ 8030’ đến 23022’, có 4/5 diện tích là đồi núi, khí hậu nhiệt đới gió mùa. Những yếu tố địa lý và khí hậu như trên là điều kiện thuận lợi để các sinh vật phát triển đa dạng về số lượng, phong phú về chủng loại. Theo ước tính, Việt Nam có khoảng 11.000 loài thực vật bậc cao có mạch, 800 loài rêu, 600 loài nấm và hơn 2000 loài tảo. Trong đó, có nhiều loài được dùng làm thuốc. Đặc biệt, năm 2016 Viện Dược liệu đã công bố 5117 loài cây thuốc trong Danh mục Cây thuốc Việt Nam. Căn cứ theo hệ thống phân loại mới nhất APG năm 2011 (dựa trên những dẫn liệu về sinh học phân tử) chi Paris thuộc họ Hắc dược hoa - Melanthiaceae gồm 26 loài với 13 thứ, phân bố ở vùng cận nhiệt ôn đới hoặc ôn đới ẩm Bắc bán cầu. Kết quả nghiên cứu tài liệu cho thấy các loài thuộc chi Paris có hoạt tính đáng quý như: tác dụng chống ung thư, tác dụng điều hòa miễn dịch, tác dụng cầm máu và tan máu, tác dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng virus, kháng nấm và chống ký sinh trùng, tác dụng trên dạ dày, tác dụng hạ sốt, giảm đau, an thần. Về thành phần hóa học, các hợp chất đã được phân lập từ một số loài Paris bao gồm saponin, flavonol, sphingolipid và các glycosid khác. Trong đó, nhóm cấu trúc saponin được nghiên cứu nhiều nhất là saponin steroid (có trên 120 hợp chất) từ 22 loài thuộc chi Paris đã được công bố. Ở Việt Nam, chi Paris là chi hiếm gặp và phân bố chủ yếu ở một số tỉnh miền núi phía bắc và vùng núi cao Tây Nguyên - nơi có khí hậu mát, độ ẩm cao. Hiện nay, ở nước ta có 8 loài và 2 thứ thuộc chi Paris gồm: Paris dunniana H.Lév., Paris fargesii Franch., Paris vietnamensis (Takht.) H.Li, Paris caobangensis Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, Paris cronquistii (Takht.) H.Li, Paris xichouensis (H. Li) Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, Paris delavayi Franch., Paris polyphylla Sm., Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. - Mazz., và Paris polyphylla var. chinensis (Franch.) H.Hara.). Trong y học cổ truyền Việt Nam, thân rễ của một số loài thuộc chi Paris với tên thường gọi bảy lá một hoa (hay thất diệp nhất chi hoa) được dùng để chữa sốt, sốt rét cơn, giải độc nhất là khi bị rắn cắn, chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, sốt rét, ho lao, ho lâu ngày, hen suyễn. Dùng ngoài với tác dụng sát trùng những nơi bị sưng đau, vết rắn cắn, tràng nhạc, mụn lở, nhọt [1]. 1 Mặc dù có nhiều công bố về chi Paris ở nước ngoài, nhưng chủ yếu tập trung trên đối tượng Paris polyphylla var. yunnanensis, các nghiên cứu trên đối tượng Paris polyphylla var. chinensis còn khá khiêm tốn chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây bảy lá một hoa Paris polyphylla var. chinensis Franchet thu thập tại Việt Nam” góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu khoa học về loài này ở Việt Nam. Đề tài thực hiện với 2 mục tiêu chính như sau: 1. Nghiên cứu thành phần hóa học Paris polyphylla var. chinensis Franchet trồng tại Lào Cai: - Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được. - Bước đầu xây dựng dấu vân tay hóa học để phân biệt một số loài thuộc chi Paris. 2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư và sơ bộ cơ chế tác dụng của hợp chất paris saponin II trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7. 2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Phân loại và đặc điểm thực vật chi Paris Về phân loại thực vật: Hiện nay, hệ thống phân loại thực vật chi Paris chưa có sự thống nhất. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi Paris thuộc phân giới thực vật bậc cao; ngành Ngọc lan (Magnoliophyta); phân lớp Hành (Liliopsida); phân lớp Loa kèn (Lilidae); bộ Củ nâu (Dioscoreales); họ Bảy lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae) [2]. Theo hệ thống phân loại mới nhất APG III dựa trên những dẫn liệu về sinh học phân tử, chi Paris được xếp vào họ Hắc dược hoa (Melanthiaceae) [116] với tổng số 26 loài và 13 thứ. Chi Paris L. là một chi nhỏ, phân bố ở vùng cận nhiệt đới hoặc ôn đới ẩm Bắc bán cầu trong đó Trung Quốc được coi là trung tâm đa dạng của các loài Paris. Thực vật chí Trung Quốc đã mô tả hình thái và xếp chi Paris vào họ Loa kèn (Liliaceae) với 22 loài và 17 thứ (var.) trong đó có 12 loài đặc hữu. Đồng thời các nhà thực vật Trung Quốc cũng phân loại loài Paris polyphylla thành 10 thứ bao gồm Paris polyhylla var. polyphylla, P. polyphylla var. yunnanensis, P. polyphylla var. chinensis, P. polyphylla var. nana, P. polyphylla var. alba, P. polyphylla var. stenophylla, P. polyphylla var. minor, P. polyphylla var. latifolia, P. polyphylla var. pseudothibetica và P. polyphylla var. kwantungensis [67]. Ở Việt Nam chi Paris hiếm gặp, phân bố chủ yếu ở một số tỉnh miền núi phía bắc và vùng núi cao Tây Nguyên là những nơi có khí hậu mát, độ ẩm cao từ 800-1600m, nhiệt độ trung bình năm 15-21OC, lượng mưa 1500 mm/năm. Năm 1999, Phạm Hoàng Hộ được xem là người đầu tiên có những thống kê và mô tả đơn giản 5 loài thuộc chi Paris nhưng chưa có khóa phân loại. Tác giả Nguyễn Thị Đỏ nghiên cứu về chi Paris đầy đủ hơn với mô tả chi tiết và có khóa phân loại kèm hình vẽ của 6 loài là Paris delavayi, P. polyphylla, P. dunniana, P. yunnanensis, P. chinensis, P. fargisii [2]. Trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu phân loại một số loài thuộc chi Paris (họ Trilliaceae) ở Việt Nam sử dụng đặc điểm hình thái và chỉ thị PCR -RFLP” 2013-2015 [6], Nguyễn Quỳnh Nga và cộng sự (2015) đã bổ sung thêm 2 loài cho hệ thực vật Việt Nam là Paris cronquistii (Takht.) H.Li và Paris xichouensis (H. Li) Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, đồng thời tách Paris vietnamensis (Takht.) H.Li thành loài riêng theo quan điểm của H. Li (1984) vốn được Nguyễn Thị Đỏ (2007) coi là synonym của loài Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. – Mazz. Như vậy, theo kết quả nghiên cứu Nguyễn Quỳnh Nga và cs tại Việt Nam có 8 loài và 2 thứ là: Paris dunniana 3 H.Lév., Paris fargesii Franch., Paris vietnamensis (Takht.) H.Li, Paris caobangensis Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, Paris cronquistii (Takht.) H.Li, Paris xichouensis (H. Li) Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, Paris delavayi Franch., Paris polyphylla Sm., Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. - Mazz., Paris polyphylla var. chinensis (Franch.) H.Hara. [5], [86], [87]. Ở Việt Nam, nhiều loài thuộc chi Paris là những cây thuốc quý hiếm, có nguy cơ tuyệt chủng. Nạn phá rừng làm thu hẹp môi trường sống và tình trạng thu gom bán qua biên giới trong thời gian dài là nguyên nhân gây suy giảm mạnh nguồn cung cấp dược liệu này. Hiện nay, loài Paris polyphylla var. yunnanensis Smith đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam (2007) và danh mục cây thuốc Việt Nam (2006). Đặc điểm thực vật của chi Paris L. Cây thảo nhiều năm; thân rễ thường hình trụ, nạc, nằm ngang; phần thân trên mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh hoặc hiếm khi phân nhánh, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông. Lá mọc vòng trên thân, 4-10 lá; phiến lá màu lục, có vệt tím hoặc không, hình mũi giáo, hình thuôn, hình trứng ngược, mềm, gân bên rõ, không có cuống hoặc có cuống dài hoặc ngắn. Hoa thường đơn độc hoặc hiếm khi có một vài hoa mọc ở đỉnh, to, màu lục, đều, lưỡng tính, mẫu 3-5-7, cuống dài, thẳng đứng. Đài (2)3-5(10), rời nhau, hình mũi giáo, màu xanh lục, thường to hơn cánh hoa xếp lợp hoặc hơi vặn. Cánh hoa (2)3-5(10), dạng dải hoặc hình trứng, màu sắc khác nhau, bằng nhau. Nhị 3-22 chiếc; chỉ nhị dẹp, ngắn, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, trung đới kéo dài tạo thành hình cầu hoặc hình sợi hoặc rất ngắn. Bầu trên, tròn hoặc có cạnh, 1 ô, nhiều noãn, đính noãn bên; vòi nhụy rời hoặc dính nhau phần gốc; đầu nhụy xẻ 3-5-7 thùy. Quả mọng hoặc quả nang, mở ở lưng ô. Hạt hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nước hoặc không, nội nhũ rắn chắc hoặc nạc [2, 6]. Năm 2015, Nguyễn Quỳnh Nga và cộng sự đã nghiên cứu về đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Paris ở Việt Nam và đã khẳng định các loài thuộc chi Paris đã ghi nhận ở Việt Nam đều thuộc nhóm bầu 1 ô, noãn đính bên thuộc dưới chi Daiswa theo quan điểm của Li Heng [5], [6], [86], [87]. 1.2. Công dụng của một số loài thuộc chi Paris [1] Bộ phận dùng: Thân rễ, thu hái quanh năm nhưng tốt nhất vào mùa thu đông, rửa sạch phơi khô [1]. Tính vị và công năng: vị đắng, hơi cay, tính hơi hàn, hơi độc, vào kinh can, có tác dụng xổ hạ, lợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt giải độc [1]. 4 Tác dụng chủ yếu là thanh nhiệt giải độc, bình suyễn, chỉ khái, tức phong, định kinh, tiêu viêm chỉ thống, hoạt huyết tán ứ, tiêu thũng [1]. Công dụng: Thân rễ bảy lá một hoa chữa sốt, sốt rét cơn, kinh giản, giải độc, nhất là khi bị rắn độc cắn, chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, sốt rét, ho lao, ho lâu ngày, hen suyễn [1]. Liều dùng: ngày uống 4-12 g thân rễ dưới dạng thuốc sắc. Dùng ngoài với tác dụng sát trùng, tiêu sưng, giã thân rễ đắp lên những nơi sưng đau, vết rắn cắn, tràng nhạc, mụn lở, nhọt [1]. Ở Trung Quốc, các loài thuộc chi Paris được sử dụng chữa gẫy xương, chứng co giật, cầm máu, điều tiết miễn dịch và sử dụng như là thuốc giảm đau, thuốc chống viêm, thuốc hạ sốt, thuốc ho, thuốc kháng sinh, thuốc động kinh, thuốc thanh lọc cơ thể [46, 110, 129, 135]. Ở Ấn Độ thân rễ loài P. polyphylla sử dụng trị giun sán và làm thuốc bổ [39]. Tại Nê Pan, các loài thuộc chi Paris được thu hái tự nhiên dùng làm thuốc trị giun sán, bệnh dạ dày, làm long đờm [11]. 1.3. Thành phần hóa học chi Paris Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Paris bắt đầu từ năm 1938 bởi Dutt và cs [33] đã phân lập được 2 hợp chất parid và paristyphnin từ loài P. quadrifolia. Sau đó năm 1983 [85] Nakano và Chen (1995) [20] công bố các hợp chất saponin, flavonoid glycosid, sterol [14], [19] β-phytoecdyson và polysaccharid được công bố lần lượt bởi Singh [104] và Zhou [135]. Cho đến nay có trên 100 saponin (xem hình 1.1) được phân lập từ các loài thuộc chi Paris gồm P. axialis, P. polyphylla var. yunnanensis, P. polyphylla var. chinensis, P. delavayi Franch., P. vietnamensis, P. dunniana, P. luquanensis, Paris polyphylla var. pseudothibetica, P. quadrifolia. Cấu trúc của phần aglycon của các saponin phân lập được có khung steroid được mô tả như hình 1.1. Hầu hết các aglycon liên kết với phần đường tại vị trí C-3, một số ít liên kết với C-1. 1.3.1. Các hợp chất saponin 1.3.1.1. Các hợp chất saponin steroid a. Các hợp chất saponin spirostan Các saponin nhóm này thường có phần aglycon là diosgenin hoặc pennogenin hoặc là các dạng bị hydroxyl hóa của hai dạng trên ở vị trí C-23, C-24 hoặc C-27. Các saponin này có từ 1 đến 4 đường và thường liên kết với phần aglycon tại C-3. Một số saponin pennogenin bị hydroxyl hóa tại vị trí C-23, C-24 và C-27 được phân lập bởi Chen và cs [14-19], [22] từ loài P. axialis và PPY. Theo thống kê đến thời điểm này có trên 60 hợp chất nhóm này được phân lập từ chi Paris ký hiệu từ 1-63 (xem hình 1.2). 5 Hình 1.1: Sự chuyển hóa của các saponin steroid trong chi Paris b. Các saponin furostan Các saponin furostan (xem hình 1.3) có cấu trúc tương tự như các saponin spirostan nhưng bị phản ứng bởi enzym mở vòng ở vòng F và bị đường hóa tại C-26. Cấu trúc dạng này lần đầu tiên phân lập từ Paris bởi Matsuda và cs năm 2003 [77] là protogracillin. Ngoài ra một số saponin furostan có thể chứa C-20 không no tại khung E. 6