Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của nấm Isaria jap...

Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của nấm Isaria japonica và Phellinus pini ở vùng Bắc Trung Bộ

.PDF
28
621
106

Mô tả:

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA NẤM Isaria japonica VÀ Phellinus pini Ở BẮC TRUNG BỘ CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 62. 44. 01. 14 TÓM TẮT UẬN ÁN TI N S HÓA HỌC NGHỆ AN – 2017 2 C P ệ C T N H ơ, ọ V H ọ , ọ GS TS T T 2. GS. TS. Tian Shung-Wu P ệ PGS TS ặ P ệ GS TS H P ệ GS TS N ệ 8 00 C , N ọ Q H ễ H N H T 12 ă 03 t ọ 017 ệ 1. T ệ Q T T ọ Vinh Vệ N T ệ N ễ T H –T 1 MỞ ẦU ý ọ Nấm là sinh vật không thể thiếu trong đời sống, không có nấm, chu trình tuần hoàn vật chất sẽ bị mất một mắt xích quan trọng trong việc phân hủy chất bã hữu cơ. Nấm là nguồn thực phẩm giàu đạm, đầy đủ các axit amin thiết yếu, hàm lƣợng chất béo ít chủ yếu là những axit béo chƣa bão hòa, giá trị năng lƣợng cao, giàu khoáng chất và các vitamin có tác dụng tốt cho sức khỏe con ngƣời. Ngoài ra, trong nấm còn chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học, góp phần ngăn ngừa và điều trị bệnh cho con ngƣời. Ngày nay, ngày càng nhiều các nhà khoa học tập trung nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài nấm nhằm phát hiện các hoạt chất có dƣợc tính mạnh đối với các căn bệnh nan y nhƣ viêm gan, kháng viêm ung thƣ, HIV…Việc đƣa vào sử dụng rộng rãi các chế phẩm đƣợc tách chiết từ nấm sẽ giúp con ngƣời khỏe mạnh, phòng chống đƣợc nhiều căn bệnh tiềm ẩn, nguy hiểm [1], [2], [5], [6], [13]. Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học cao trên thế giới với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa, những kiểu sinh thái khác nhau… đã góp phần tạo nên sự đa dạng của khu hệ nấm Việt Nam. Đến năm 2010, có khoảng 2500 loài nấm đã đƣợc ghi nhận cho lãnh thổ Việt Nam, trong số đó khoảng 1400 loài thuộc 120 chi là những loài nấm lớn [3], [4], [9]. Các loài nấm lớn của Việt Nam có giá trị tài nguyên rất đáng kể về nhiều mặt, có khoảng 50 loài là nấm ăn quý nhƣ: các loài mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấm hƣơng (Lentinula edodes), nấm rơm, nấm mối, nấm thông (Boletus edulis Bull.), nấm chàm (Boletus aff. felleus Bull.), nấm bào ngƣ (Pleurotus spp.), nấm mào gà (Cantherellus cibarius Fr.), nấm ngọc châm (Hypsizigus marmoreus), nấm kim châm (Flammulina velutipes) ... [4], [6]. Có khoảng hơn 200 loài nấm dùng làm dƣợc liệu, trong đó có rất nhiều loài là dƣợc liệu quý nhƣ: linh chi (G.lucidum), linh chi sò (G.capense), cổ linh chi (G.applanatum), vân chi (Trametes versicolor), phiến chi (Schizophyllum commune), nấm hƣơng (Lentinula edode), nấm kim châm (Flammulina velutipes), mộc nhĩ, ngân nhĩ, đông trùng hạ thảo (Cordycep sinensis, Cordycep militaris)…[8], [20], [21]. Những nghiên cứu bƣớc đầu về các hợp chất có hoạt tính sinh học của một số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng rất giàu các hợp chất có khối lƣợng phân tử lớn nhƣ polysaccharit, polysaccharitpeptit, lectin… và các chất có khối lƣợng phân tử nhỏ nhƣ các flavonoit, steroit, terpenoit… có tác dụng chống viêm, tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch, hỗ trợ điều trị các bệnh hiểm nghèo nhƣ ung thƣ, suy giảm miễn dịch, tiết niệu, 2 tim mạch… Khoảng 50 loài nấm có khả năng sinh enzym và một số hoạt chất quý có thể đƣợc ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trƣờng. Bắc Trung bộ là khu vực có nhiều vƣờn Quốc gia, khu bảo tồn thiên nhiên nhƣ Phong Nha - Kẻ Bàng, Vũ Quang, Hồ Kẻ Gỗ, Pù Mát, Pù Huống, Pù Hoạt và Bến En. Đây là những vùng đƣợc đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao, tại đây có chứa đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học, trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho các ngành công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm… [15], [16], [37], [212], [213]. Các nghiên cứu về nấm ở Việt Nam nói chung và khu vực Bắc Trung bộ nói riêng vẫn còn là một vấn đề khá mới, chƣa nhận đƣợc sự quan tâm đúng mức của các nhà khoa học. Do vậy, việc nghiên cứu về nấm ở vùng Bắc Trung bộ là một yêu cầu bức thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn, góp phần quan trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, về giá trị kinh tế và tầm quan trọng của nguồn dƣợc liệu thiên nhiên của nƣớc ta nói chung và tỉnh vùng Bắc Trung bộ nói riêng. Vì lý do đó chúng tôi đã chọn đề tài: “N ứ ọ s ủ Isaria japonica và Phellinus pini ở ù B T B ”. ứ Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là sợi nấm Isaria japonica Yasuda và quả thể nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer đƣợc thu hái ở vùng Bắc Trung Bộ Việt Nam. N ệ ụ ứ - Chiết hỗn hợp các hợp chất từ sợi nấm Isaria japonica Yasuda và quả thể nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer; - Sử dụng các phƣơng pháp sắc ký để phân lập các hợp chất từ dịch chiết của hai loại nấm trên; - Xác định cấu trúc của những hợp chất phân lập đƣợc; - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập đƣợc. 4 P ơ ứ - Phƣơng pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về đƣợc rửa sạch, phân lập, nuôi cấy và bảo quản ở nhiệt độ thích hợp. Việc xử lý tiếp các mẫu bằng phƣơng pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu đƣợc nêu ở phần thực nghiệm. - Phƣơng pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: sử dụng các phƣơng pháp sắc ký cột thƣờng (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích và điều chế, sắc ký cột nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau nhƣ silica gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích trên các pha đảo, pha silica gel. 3 - Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: cấu trúc hoá học các hợp chất đƣợc phân lập đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp vật lý hiện đại nhƣ phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lƣợng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau nhƣ 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC. - Cấu trúc lập thể tƣơng đối của các hợp chất này đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phổ NMR. - Thăm dò các hoạt tính hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng nấm. 5 N ủ - Đây là nghiên cứu đầu tiên có hệ thống ở Việt Nam về thành phần hóa học của loài nấm Isaria japonica và nấm Phellinus pini ở khu vực Bắc Trung Bộ. - Từ dịch chiết nấm Isaria japonica thu đƣợc 15 hợp chất. Trong đó, hợp chất IJM-1 là isarin là hợp chất mới. Đồng thời, hợp chất 11, 22dihydroxyhopane (IJM-3) lần đầu tiên phân lập và đƣợc xác định cấu trúc bằng phổ 1D- và 2D-NMR chƣa đƣợc công bố ở bất kỳ công trình nào. Ngoài ra, 06 hợp chất bao gồm: beauveriolide I (IJM-2), (17R)-17-methylincisterol (IJM-4), fungisterol ((3,5α,22E)-ergosta-6,8,22-trien-3-ol) (IJM-5), 4,4dimethyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3-ol (IJM-6), 3-O-ferulylcycloartenol (IJM-7), tricin (IJM-10) lần đầu tiên phân lập đƣợc từ loài nấm này . - Từ dịch chiết của quả thể nấm Phellinus pini phân lập đƣợc 05 hợp chất bao gồm: 02 hợp chất triterpenoid: gilvsin A (PPH-1) và gilvsin B (PPE-1). Hai triterpenoid PHH-1 và PPE-1 lần đầu tiên phân lập đƣợc từ loài nấm này; 03 hợp chất steroit: ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2), ergosterol (PPH-2) và ergosterol peroxide (PPE-3). Hợp chất PPE-2 là hợp chất này lần đầu tiên đƣợc phân lập từ loài nấm này. - Lần đầu tiên thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và kháng nấm của 12 hợp chất (IJM-1, IJM-2, IJM-3, IJM-5, IJM-6, IJM-10, IJM-11, IJM-13, PPH-1, PPE-1, PPE-2, PPE-3). Kết quả cho thầy có 06 hợp chất (IJM-1, IJM-2, IJM-6, IJM-13, PPH-1 và PPE-2) có khả năng kháng với chủng vi sinh vật kiểm định Gr (+) (Staphylococcus aureus subsp. AureusATCC 11632) với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 50 g/ml. 6 C ủ n Luận án bao gồm 125 trang với 22 bảng số liệu, 64 hình và 5 sơ đồ với 249 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (33 trang), phƣơng pháp và thực nghiệm (24 trang), kết quả và thảo luận (63 trang), kết luận (1 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (24 trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 140 phổ của một số hợp chất chọn lọc. 4 CH NG T NG QUAN Luận án đã tiến hành tổng quan tài liệu các nội dung: 1. Các hợp chất chuyển hóa bậc hai phân lập từ nấm kí sinh côn trùng - Giới thiệu về các hợp chất chuyển hóa bậc hai: các polyketide, polyketide không bị khử, polyketide bị khử không hoàn toàn và bị khử hoàn toàn, các nonribosomal peptide, nonribosomal peptide mạch thẳng, nonribosomal (depsi)peptide dạng vòng, cyclooligomer (depsi)peptide, các hợp chất chuyển hóa kết hợp polyketide–nonribosomal peptide , terpenoid… 2. Nấm Isaria japonica Yasuda - Giới thiệu về đặc điểm và sự phân bố loài nấm Isaria japonica - Thành phần hóa học của nấm ký sinh côn trùng Isaria japonica - Hoạt tính sinh học của nấm kí sinh côn trùng Isaria japonica 3. Các hợp chất chuyển hóa bậc hai phân lập từ nấm thuộc chi Phellinus - Giới thiệu về các hợp chất chuyển hóa bậc hai: polysaccharide và proteinpolysaccharide, steroid, terpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid, flavone, styrylpyrone, furanone, polychlorinat… 4. Nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer - Giới thiệu về đặc điểm và sự phân bố loài nấm Phellinuspini - Thành phần hóa học của Phellinuspini CH P ơ NG PH NG PHÁP VÀ TH C NGHIỆM ứ P ơ : Mẫu nấm đƣợc thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm. Mẫu tƣơi sau khi lấy về đƣợc rửa sạch, để nơi thoáng mát, tiến hành phân lập và nuôi cấy, bảo quản ở điều kiện thích hợp dùng để thí nghiệm. P ơ ế x , ,x ị : Sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột thƣờng (CC); sắc ký cột nhanh (FC); sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); các phƣơng pháp kết tinh. P ơ s : Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lƣợng (ESI-MS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tƣơng của các hợp chất này đƣợc xác định các phƣơng pháp phổ NMR. 5 4 P ơ ử s ọ Quá trình thử hoạt tính ở Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp Skehan, Likhitwitayawuid, Vander, Vlietlinck, McKane. H ế ị 2.2.1. H : Các dung môi để ngâm chiết mẫu nấm đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). T ế ị: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột (CC); sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (FT-IR); phổ khối lƣợng (MS); phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR); điểm nóng chảy; độ quay cực riêng N Yasuda) Q ứ ừs s ù (Isaria japonica ứ Thu thập mẫu Định loại Nhân giống trên PDA Nhân giống trên môi trƣờng lỏng Cao chiết Phân tích thành phần hóa học Đánh giá hoạt tính sinh học Sơ - Nội dung quy trình Phƣơng pháp lẫy mẫu, phân lập Cách nuối cấy trên môi trƣờng PDA Cách nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng Cách chiết dịch nuôi cấy và sợi nấm Phƣơng pháp sắc ký cột và phƣơng pháp sắc ký bản mỏng Phƣơng pháp xác định cấu tạo hợp chất Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính sinh học Quy trình nghiên cứu nấm ký sinh trên côn trùng 2.3.2. Ph ơ Mẫu nấm kí sinh công trùng đƣợc thu thập vào tháng 11 năm 2013 tại Vƣờn Quốc gia Pù Mát, đƣợc PGS. TS Trần Ngọc Lân giám định tên khoa học và lƣu giữ tại khoa Hóa học, trƣờng Đại học Vinh. Mẫu đƣợc xem xét và đánh giá dƣới kính hiển vi điện tử theo phƣơng pháp Lacey và Brooks, phân lập sử dụng theo phƣơng pháp của Goettel và Inglis, phân lập các bào tử đơn dựa theo phƣơng pháp của Choi, cấy chuyển sang môi trƣờng Potato Dextrose Agar (PDA) theo phƣơng pháp của Samson. 6 Đặc điểm hình thái của bào tử, sợi nấm, cấu trúc qủa thể và một số đặc điểm sinh học khác đƣợc đánh giá, nhận dạng các loài nấm ký sinh côn trùng theo phƣơng pháp của Luangsaard. P ơ Mẫu nấm kí sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) sau khi đƣa về phòng thí nghiệm của khoa Hóa học, thuộc trƣờng Đại học Vinh, Nghệ An đƣợc tiến hành nghiên cứu và nhân nuôi. Tiếp đến, Isaria japonica Yasuda đƣợc đƣa đi phân tích thành phần hoá học, đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng PDA và sau đó nhân nuôi số lƣợng lớn trong môi trƣờng lỏng. P Nấm kí sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng PDA, ở nhiệt độ 240C trong 15 ngày, cấy chuyền sang môi trƣờng lỏng (đƣờng glucose, nƣớc dừa, dịch trích từ củ khoai tây, dứa, giá, tằm) trong vòng 7 ngày, ở nhiệt độ 250C, đƣợc lọc, rửa bằng phễu lọc chân không. Phần sợi nấm sau khi lọc chiết với methanol, quay cất chân không thu đƣợc dịch dầu thô (25 g). 10,7 lit môi trƣờng nuôi- Phân bố trong nƣớc, lọc 12 lit dịch nƣớc Ngâm chiết với 5 lit etylacetat Dịch chiết ethyl acetate Chƣng cất thu hồi dung môi Cao ethyl acetate 12 gam 530 gam sợi nấm Ngâm trong 5 lit methanol, 7 ngày Dịch chiết methanol Chƣng cất thu hồi dung môi Cao methanol 25 gam Sơ Chiết các hợp chất từ môi trƣờng nuôi cấy Cao methanol đƣơc hòa tan trong nƣớc, chiết phân bố với dung môi ethyl acetate, cất thu hồi dung môi thu đƣợc cao ethyl acetate (15 g) và dịch nƣớc (10 g). Tiến hành phân tích định tính thành phần hóa học của của cao ethyl acetate bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC/UV) chọn các điều kiện chạy máy là: dung dịch pha động MeOH:ACN (85:15 v/v ), thể tích bơm mẫu: 20 μl, nhiệt độ cột RP 18: 300C, detector UV (VWD): λ= 210 nm, tốc độ dòng: 1,0 ml/min và áp suất cột: 71 bar. 7 Cao methanol (25 g) ethyl acetate, Cao ethyl acetate ị ( g) Cao ethyl acetate (15g) C ị n (10g) CC, Silica gel Hexane:acetone (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) CHCl3-MeOH (10:1, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1) IJM1 1,6 (g) IJM2 (2,4g) IJM3 (1,2g) IJM4 (1,4g) (8,6 g) (g) (g) (g) CC, Silica gel Hexane:acetone (15:1) IJM-8 (123mg) (1g) IJM-10 (15mg) CC, Silica gel (8,6 g)Hexane:etylaxetat (100:1-1:1) CC, Silica gel (8,6 g)CHCl3:MeOH (100:0, 50:1, 10:1, 2:1, 1:1) CC, Silica gel Hexane:acetone (7:3) IJM34 IJM33 IJM32 IJM22 CC, Silica gel CHCl3:MeOH (30:1) IJM-13 (13mg) IJM-1 (13mg) (8,6 g) CC, Silica gel CHCl3:MeOH (100:0, 50:1, 10:1, 2:1,1:1 1:1) CC, Silica gel (8,6 g) Hexane:acetone (9:1-2:1) IJM41 IJM43 IJM42 IJM51 CC, Silica gel CC, Silica gel CC, Silica gel CC, Silica gel CC, Silica gel Hexane:acetone Hexane:acetone CHCl3:MeOH CHCl3:MeOH Hexane:acetone (4:1) (7:3) (9:1) (10:1) (15:1, 9:1) IJM-11 (38mg) IJM-4 (9,5mg) IJM5 (1,8g) IJM-5 (5,7mg) IJM-2 (25mg) (1g) (1g) (1g) IJM-7 (7mg) IJM-9 (31mg) CC, Silica gel CC, Silica gel Hexane:acetone CHCl :MeOH 3 (7:3) (30:1,25:1) IJM-6 (8.0mg) IJM-12 (30mg) IJM-14 (16,5mg) (1g) Sơ (1g) 4: Phân lập các hợp chất từ nấm kí sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) (1g) (1g) (1g) CC, Silica gel CHCl3:MeOH (15:1) IJM-15 (14,5mg ) IJM-3 (6,4mg) (1g) (1g) IJM53 IJM52 (1g) (1g) (1g) 8 4 N ứ ừ q Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer 4 M Mẫu nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer đƣợc thu hái ở Vƣờn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An vào tháng 10 năm 2013. Mẫu đƣợc định danh bởi PGS.TS Ngô Anh (Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế), tiêu bản đƣợc lƣu giữ tại khoa Hóa học, trƣờng Đại học Vinh. 4 P Mẫu nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer (5,0 kg) phơi khô, nghiền nhỏ và ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phòng, thu dịch chiết và cất thu hồi dung môi dƣới áp suất thấp đƣợc cao methanol (580,0 g). Phân bố dịch chiết vào nƣớc và chiết bằng hexane, ethyl acetate, sau đó cất thu hồi dung môi thu đƣợc cao hexane PPH (54,0 g), cao ethyl acetate PPE (170,0 g) và dịch nƣớc. Tiến hành phân tích định tính thành phần hóa học của của cao hexane và cao ethyl acetate bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC/UV) chọn các điều kiện chạy máy là: dung dịch pha động MeOH:ACN (85:15 v/v ), thể tích bơm mẫu: 20 μl, nhiệt độ cột RP 18 : 30 0C, detector UV (VWD) : λ = 205 nm, tốc độ dòng: 1,0 ml/min và áp suất cột: 71 bar. 5 T ử s ủ Hợp chất mới Isarin (IJM-1) và các hợp chất IJM-2, IJM-3, IJM-5, IJM6, IJM-10, IJM-11, IJM-13, PPH-1, PPE-1, PPE-2, PPE-3 đƣợc tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật với các dòng vi khuẩn: khuẩn Gr (-) (Escherichia coli-ATCC25922; Pseudomonas aeruginosa- ATCC25923); khuẩn Gr (+) (Bacillus subtillis- ATCC11774; Staphylococcus aureus subsp. Aureus- ATCC 11632) Hoạt tính kháng nấm với các chủng nấm: nấm sợi (Aspergillus nige- 439; Fusarium oxysporum- M42); nấm men (Cadida albicans- ATCC 7754; Saccharomyces cerevisiae- SH 20). Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đƣợc tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của mẫu chất sạch đƣợc thực hiện trên phiến vi lƣợng 96 giếng theo phƣơng pháp hiện đại của Vander Bergher, Vlietlinck và McKane. Giống nấm men và nấm sợi đƣợc duy trì và bảo tồn trong môi trƣờng tiêu chuẩn: Saboraud Dextrose Broth (SDB-Sigma), vi khuẩn đƣợc duy trì và bảo tồn trong môi trƣờng Trypcase Soya Broth (TSB-Sigma). 9 Q (5 ) Ngâm chiết với methanol (3x10l) Cao methanol (580 g) Chiết lần lƣợt với Hexane, Ethyl acetat, Nƣớc Cao hexane (54g) C Cao ethyl acetat (170g) ị n (10g) CC, Silica gel Hexane:acetone (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) CHCl3-MeOH (10:1, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1) PPH1 PPH2 PPH3 PPH4 PPH5 (8,6 g) (g) (g) (g) (g) (8,6 g) Sơ (8,6 g) CC, Silica gel (8,6 g) hexane:acetone (15:1) PPH-2 (302mg) PPH-1 (25mg) (1g) (1g) (8,6 g) PPE1 PPE2 PPE3 PPE4 PPE5 (g) (g) (g) (g) (8,6 g) (8,6 g) (8,6 g) CC, Silica gel hexane:ethyl acetat (15:1, 9:1) (8,6 g) CC, Silica gel (8,6 g) hexane:etyl axetat (9:1, 7:1) PPE-2 (13mg) PPE-3 (135mg) PPE-1 (30mg) 5 Phân lập các hợp chất từ nấm thƣợng hoàng (Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer) (1g) (1g) (1g) 10 CH N s NG K T QU VÀ TH O UẬN ù (Isaria japonica Yasuda) P Quá trình phân lập các chất từ sợi nấm kí sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) đƣợc trình bày cụ thể ở phần thực nghiệm. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi nghiên cứu thành phần hoá học từ dịch chiết methanol của sợi nấm kí sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) bằng cách kết hợp các phƣơng pháp chiết, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột silica gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích với các hệ dung môi rửa giải khác nhau phù hợp với từng phân đoạn. Kết quả của quá trình nghiên cứu đƣợc thể hiện ở bảng 3.1. B . Các hợp chất phân lập từ sợi nấm kí sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) S Ký Tê C ứ K T ệ ử T (mg) 1 IJM-1 Isarin C29H42N4O5 13,0 2 IJM-2 Beauveriolide I C27H41N3O5 25,0 3 IJM-3 11, 22-dihydroxyhopan C30H52O2 6,4 4 IJM-4 (17R)-17-methylincisterol C22H34O3 9,5 5 IJM-5 Fungisterol ((3,5α,22E)-ergosta-6,8,22C28H44O 5,7 trien-3-ol) 6 IJM-6 4,4-dimethyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3-ol C30H50O 8,0 7 IJM-7 3-O-ferulylcycloartenol C40H58O4 7,0 8 IJM-8 Ergosterol C28H44O 123,0 9 IJM-9 Ergosterol peroxide C28H44O3 31,0 10 IJM-10 Tricin C17H14O7 15,0 11 IJM-11 Adenosin C10H13N5O4 38,0 12 IJM-12 Uracil C4H4N2O2 30,0 13 IJM-13 Axit 2-hydroxyl-3-phenylpropanoic C9H10O3 13,0 14 IJM-14 D-mannitol C6H14O6 16,5 15 IJM-15 Axit 3-amino butanoic C4H9NO2 14,5 X ị 3.1.2.1. Hợp chất IJM-1 (chất mới) Phổ khối lƣợng phân giải cao của hợp chất IJM-1 (hình 3.1) cho thấy pic ion giả phân tử m/z 549,3023 [M+Na]+, theo tính toán tƣơng ứng với công thức phân tử C29H42N4O5Na m/z 549,3053. Do đó, có thể kết luận công thức phân tử của IJM-1 đƣợc xác định là C29H42N4O5. Mặt khác, phổ khối lƣợng của hợp chất IJM-1 (hình 3.1) cho pic ion giả phân tử m/z 549 [M+Na]+ cũng cho thấy công thức phân tử tƣơng tƣơng ứng của IJM-1 là C29H42N4O5. Độ bất bão hòa của hợp chất IJM-1 là 11. 11 (a) (b) Hình 3.1 Phổ khối lƣợng (a) HR-ESI-MS và (b) ESI-MS của hợp chất IJM-1 Phổ hồng ngoại (IR) (hình 3.2) cho thấy các tín hiệu hấp thụ cực đại tại 3383, 3316, 3298, là đặc trƣng cho nhóm NH, các tín hiệu còn lại 1677, 1534 và 1532 cm-1 đặc trƣng cho các nhóm C=O. Phổ 1H-NMR của hợp chất IJM-1 cho thấy tín hiệu của tổng cộng 42 proton, trong đó có sự xuất hiện của các proton amide NH (H 10,69, 8,23, 8,11 ppm), năm proton của nhóm methyl (H 1,16, 0,88, 0,88, 0,87, 0,81 ppm) và ba tín hiệu proton gắn với nhóm NH (H 4,41, 4,23, 3,93 ppm). Ngoài ra, phổ 1HNMR của hợp chất IJM-1 xuất hiện tín hiệu của bốn proton thơm (H 7,51, 7,33, 7,05, 6,97 ppm), điều này có thể rút ra kết luận xuất hiện vòng benzene thế tại vị trí 1,2 và một tín hiệu proton thơm ghép cặp với NH (H 7,08 ppm). Hình 3.2. Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất IJM-1 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất IJM-1 12 Phổ 13C-NMR và DEPT (hình 3.4 và 3.5) cho thấy hợp chất IJM-1 có chứa 29 carbon, trong đó bao gồm bốn carbon carbonyl (C 170,5, 171,1, 169,8, 169,3 ppm), tám carbon thơm (C 109,7, 127,0, 111,1, 118,0, 120,7, 118,0, 136,0, 123,2 ppm), một carbon oxygenat (C 75,5 ppm), năm carbon nhóm methine, sáu carbon nhóm methylene và năm carbon nhóm methyl. Hơn nữa, độ dịch chuyển hóa học của tín hiệu bốn carbon carbonyl cho thấy sự tồn tại của ba liên kết peptide và một nhóm ester. Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất IJM-1 Hình 3.5. Phổ DEPT của hợp chất IJM-1 Phố COSY (hình 3.6 và 3.7) của hợp chất IJM-1 cho phép xác định đƣợc sáu phần cấu trúc I đến VI. Hình 3.6. Các phần cấu trúc I đến VI của hợp chất IJM-1 13 Hình 3.7. Phổ COSY của hợp chất IJM-1 Phổ HSQC (hình 3.11) của hợp chất IJM-1 cho thấy tín hiệu của proton tại H-1 [H 4,41(1H, dt, J = 7,0, 7,0 Hz)] tƣơng quan với C-1 (C 52 ppm), là nhóm methine liên kết trực tiếp NH [H 8,24 (1H, d, J = 7,0 Hz)]; tín hiệu H-2 [H 1,46 (2H, m)] tƣơng quan với C-2 (C 40,8 ppm); tín hiệu H-3 [H 1,53 (1H, m)] tƣơng quan với C-3 (C 40,8 ppm); tín hiệu H-4, H-5 [H 0,88 (6H, m)] tƣơng quan lần lƣợt với C-4 (C 15,2 ppm) và C-5 (C 15,1 ppm). Ngoài ra, phổ HMBC (hình 3.9 và 3.10) cho thấy tín hiệu tƣơng tác xa của H-1 với C2/C-6 (C 169,3 ppm); H-2 với C-1/C-3/C-5/C-6; H-3 với C-1/C-4; H-4 với C2/C-3/C-5; và H-5 với C-4, có thể kết luận phần cấu trúc I chính là một phần của cấu trúc axit amin leucine có trong hợp chất IJM-1. Mặt khác, từ các số liệu phổ trên và so sánh tài liệu của axit amin leucine [105], [155] cho thấy trong hợp chất IJM-1 có chứa phần cấu trúc axit amin leucine (hình 3.8). Hình 3.8. Phần cấu trúc axit amin leucine của hợp chất IJM-1 14 Hình 3.9. Phổ HMBC của hợp chất IJM-1 Hình 3.10. Phổ HMBC của hợp chất IJM-1 15 Hình 3.11. Phổ HSQC của hợp chất IJM-1 Phổ H-NMR (hình 3.3) của hợp chất IJM-1 xuất hiện tín hiệu proton đặc trƣng cho nhóm amide 25-NH [H 10,69 (1H, br s)] và một tín hiệu proton thơm H-25 [H 7,10 (1H, s)] ghép cặp với 16-NH (H 7,08 ppm). Thêm vào đó, phổ HSQC (hình 3.11) của hợp chất IJM-1 xuất hiện các tín hiệu tại H-20 [H 7,51 (1H, d, J = 8,0 Hz)], H-21 [H 6,97 (1H, t, J = 7,5 Hz)], H-22 [H 7,05 (1H, d, J = 7,5 Hz)], H-23 [H 7,33 (1H, d, J = 8,0 Hz)], là tín hiệu proton của 4 nhóm methine thuộc vòng thơm bị thế ở vị trí 1,2 tƣơng quan lần lƣợt với C20 (H 118,0 ppm), C-21 (H 118,1 ppm), C-22 (H 120,7 ppm), C-23 (H 111,1 ppm). Ngoài ra, phổ HMBC (hình 3.9) cho thấy các tƣơng tác xa của H-17 với C-18/C-19/C-25/C-26; H-20 với C-22/C-24; H-21 với C-23/C-19; H-22 với C21/C-24; và H-23 với C-21/C-19, chứng tỏ phần cấu trúc V hiện diện trong phần cấu trúc axit amin tryptophan của hợp chất IJM-1. Từ các số liệu trên kết hợp so sánh với số liệu phổ của tryptophan [160], có thể kết luận trong cấu trúc của hợp chất IJM-1 có chứa một phần cấu trúc của axit amin tryptophan. 1 Hình 3.12. Phần cấu trúc axit amin tritophan của hợp chất IJM-1 Phổ 1H-NMR của hợp chất IJM-1 xuất hiện tín hiệu đặc trƣng của nhóm 27-NH tại [H 8,11 (1H, d, J = 7,0 Hz)]. Theo phổ 13C-NMR của hợp chất IJM-1 xuất hiện tín hiệu tại C-29 (C 170,5 ppm) là tín hiệu carbon carbonyl. Kết hợp với phổ HSQC xuất hiện tín hiệu tƣơng quan giữa proton H-27 [H 16 3,94 (1H, t, J = 7,0 Hz)], H-28 [H 1,16 (3H, d, J = 7,5 Hz)] lần lƣợt với C27(C 48,2 ppm), C-28 (C 15,1 ppm). Thêm vào đó, phổ HMBC của hợp chất IJM-1 cho phép xác định các tƣơng tác xa của H-28 với C-27/C-29; và H-27 với C-29, chứng tỏ trong phần cấu trúc VI thuộc phần cấu trúc của một alanine. So sánh số liệu phổ trên của IJM-1 với tài liệu của axit amin alanine [46] có thể kết luận một phần cấu trúc của axit amin alanine có trong hợp chất IJM-1. Hình 3.13. Phần cấu trúc axit amin alanine của hợp chất IJM-1 Ngoài 3 carbon carbonyl của 3 axit amin trên, trong phổ 13C-NMR, DEPT của hợp chất IJM-1 còn xuất hiện tín hiệu tại C-15 (C 171,1 ppm) là tín hiệu carbon carbonyl và C-7 (C 75,5 ppm) là tín hiệu của một carbon oxygenat. Các tƣơng tác xa khác của phổ HMBC bao gồm H-14 với C-7/C-15; H-8 với C-7; H-9 với C-7/C-8/C-10; H-10 với C-9 cho phép xác định phần cấu trúc II gắn trực tiếp với phần cấu trúc III. Hơn nữa, các tƣơng tác xa H-11 với C-12/C-13; H-12 với C-13; và H-13 với C-12/C-11 xác nhận sự liên kết của phần cấu trúc III liên kết trực tiếp với phần cấu trúc IV. Do đó, các phần cấu trúc liên kết với nhau theo trật tự II-III-IV đã hình thành cấu trúc của 3hydroxy-4-methyl-octanoyl. Từ sự phân tích dữ liệu phổ trên và kết hợp với so sánh với tài liệu [46] thì đây là phần cấu trúc 3-hydroxyl-4-methylheptanoyl trong phân tử hợp chất IJM-1. Hình 3.14. Phần cấu trúc 3-hydroxyl-4-methyloctanoyl của hợp chất IJM-1 Mặt khác, phổ HMBC của hợp chất IJM-1 cho thấy tƣơng tác xa của H-1 với C-29 và độ chuyển dịch hóa học của C-1 chứng tỏ sự tồn tại của liên kết amide ester giữa alanyl-leucinyl. Tƣơng tác xa của H-1 và H-7 với C-6 và độ chuyển dịch hóa học của C-7 cho thấy phần cấu trúc leucine còn lại liên kết với axit 3-hydroxy-4-methyl-octanoylic dƣới dạng liên kết ester. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của hai nguyên tử carbon C-16 và C-27 chứng tỏ giữa hai nguyên tử carbon này liên kết với nhau bởi một liên kết amide ester. Do đó, cấu trúc của hợp chất IJM-1 có khung carbon dạng vòng. Nhƣ vậy, phần cấu trúc axit amin tryptophan nằm giữa alanine và 3hydroxy-4-methyl-octanoyl, cấu trúc dạng vòng này cũng đáp ứng đƣợc độ bất bão hòa rút ra từ công thức phân tử. Cấu hình tƣơng đối của hợp chất IJM-1 giống nhƣ cấu hình của IJM-2 (Beauveriolide I) [159]. 17 P Leucine 3-hidroxyl-4methyloctanoic B : Số liệu phổ NMR của IJM-1 Carbon C(ppm) H (ppm) 1-NH 8,24 (1H, d, J = 7,0 Hz) C-1 52,0 4,41(1H, dt, J = 7,0, 7,0 Hz) C-2 40,8 1,46 (2H, m) C-2, C-6 C-1, C-3, C-5, C-6 C-4 C-3, C-5 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 24,2 15,2 15,1 169,3 75,5 C-8 C-9 34,7 15,2 C-10 30,5 C-11 C-12 C-13 C-14 28,5 22,1 13,5 35,5 C-15 16-NH C-16 171,1 C-17 25,5 7,05 (1H, m) 4,23 (1H, dd, J = 9,5, 7,0 Hz) 3,15 (1H, dd, J =14,0, C-18, C-19, 6,5 Hz) C-25, C-26 3,06 (1H, dd, J =14,5, 7,5 Hz) C-18 C-19 C-20 C-21 C-22 C-23 C-24 109,7 127,0 118,0 118,1 120,7 111,1 136,0 7,05 (1H, t, J = 8,0 Hz) 7,51 (1H, d, J = 8,0 Hz) 6,97 (1H, t, J = 7,5 Hz) 7,05 (1H, d, J = 7,5 Hz) 7,33 (1H, d, J = 8,0 Hz) 55,7 Tryptophan 1,53 (1H, m) 0,88 (3H, m) 0,88 (3H, m) HMBC 4,87 (1H, ddd, J =10,0, 4,5, 4,0 Hz) 2,09 (1H, m) 0,81 (3H, d, J =7,0 Hz) 1,06 (1H, m) 1,40 (1H, m) 1,23 (1H, m) 1,30 (2H,m) 0,87 (3H, t, J = 6,5 Hz) 2,46 (1H, dd, J =18,5, 4,0 Hz) 2,36 (1H, dd, J =14,0, 8,0 Hz) C-7 C-7, C-8 C-10 C-12, C-13 C-13 C-12 C-7, C-15 C-24, C-22 C-19, C-23 18 25-NH 10,69 (1H, br s) C-25 123,2 7,10 (1H, s) C-26 169,8 27-NH 8,11 (1H, d, J = 7,0 Hz) Alanine C-27 48,2 3,94 (1H, t, J = 7,0 Hz) C-29 C-28 15,1 1,16 (3H, d, J = 7,5 Hz) C-27, C-29 C-29 170,5 H (Đo ở 500 MHz trong DMSO-d6), C (Đo ở 125 MHz trong DMSO-d6) 1 H-1H COSY , HMBC: H C Hình 3.15. Tƣơng quan và tƣơng tác xa của hợp chất IJM-1. B : Tính chất lý hóa của IJM-1, IJM-2, beauveriolides I IJM-1 IJM-2 Beauveriolide I [159] Trạng thái Chất bột không Chất bột màu trắng Chất bột màu màu trắng CTPT C29H42N4O5 C27H42N3O 5 C27H42N3O 5 + + ESI-MS (m/z) 549 [M+Na] 510 [M+Na] 510 [M+Na]+ HR-ESI-MS (m/z) Thực tế 549,3023 [M+Na]+ 486,2940 [M-H]488,3112 [M+H]+ Tính toán 549,3053 [M+Na]+ 486,2968 [M-H]488,3124 [M+H]+ Đ.n.c 250-2510C 248-2490C 248-2500C [α]D25 (c 0,4, -250 -210 -210 CHCl3-MeOH) 207, 258, 290 215 UV max (MeOH) nm 1724, IR (KBr) max 3383, 3316, 3298, 3674, 3650, 3628, 3298, -1 1723, 1677, 1534, 3567, 1722, 1681, 1684, 1641, (cm ) 1532 1641, 1538 1535 Tan trong dung EtOH, CH3CN, EtOH, CH3CN, EtOH, CH3CN, môi CH3OH, CHCI3, CH3OH, CHCI3, CH3OH, CHCI3,
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan