Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của nấm isaria ...

Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của nấm isaria japonica và phellinus pini ở vùng bắc trung bộ

.PDF
245
80
97

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA NẤM Isaria japonica VÀ Phellinus pini Ở BẮC TRUNG BỘ LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN - 2017 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA NẤM Isaria japonica VÀ Phellinus pini Ở BẮC TRUNG BỘ Chuyên ngành : HOÁ HỮU CƠ Mã số: 62.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS. TS TRẦN ĐÌNH THẮNG 2. GS. TS TIAN-SHUNG WU NGHỆ AN - 2017 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Vinh, ngày 25 tháng 5 năm 2017 Ký tên Nguyễn Ngọc Tuấn 3 LỜI CẢM ƠN Luận án đƣợc thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên đề Hoá hữu cơ khoa Hoá học, phòng thí nghiệm Trung tâm Phân tích thực phẩm và Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Vinh, Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, khoa Công nghệ sinh học, khoa Hóa học - Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến GS. TS Trần Đình Thắng - Trƣờng Đại học Vinh, GS. TS Tian-Shung Wu - Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan là những ngƣời thầy đã giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất, giúp tôi từng bƣớc trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS Nguyễn Hoa Du, PGS. TS Hoàng Văn Lựu đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên tôi trong quá trình làm luận án. Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn PGS. TS Ping-Chung Kuo - Đại học Quốc gia Cheng-Kung, Đài Loan đã giúp đánh giá kết quả. PGS. TS Trần Ngọc Lân - Viện Nghiên cứu và Phát triển vùng - Bộ Khoa học và Công nghệ (MOST) và PGS. TS. Ngô Anh khoa Sinh học, Đại học Khoa học Huế đã giúp chúng tôi định danh các mẫu nấm. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, các phòng ban chức năng, các thầy cô, cán bộ phòng Đào tạo Sau đại học, khoa Hoá học, trƣờng Đại học Vinh, các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình và ngƣời thân đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Nghệ An, ngày 25 tháng 5 năm 2017 Nguyễn Ngọc Tuấn i MỤC LỤC MỤC LỤC .................................................................................................................... i DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................. v DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................. vi DANH SÁCH SƠ ĐỒ ..............................................................................................viii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ........................................ ix MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 Chƣơng 1 ..................................................................................................................... 5 TỔNG QUAN ............................................................................................................. 5 1.1. Các hợp chất chuyển hóa bậc hai phân lập từ nấm kí sinh côn trùng ..................... 5 1.1.1 Các polyketide .................................................................................................... 5 1.1.1.1 Các polyketide không bị khử ............................................................................ 5 1.1.1.2 Các polyketide bị khử không hoàn toàn và bị khử hoàn toàn ............................ 8 1.1.2 Các nonribosomal peptide ................................................................................. 10 1.1.2.1 Các nonribosomal peptide mạch thẳng .......................................................... 11 1.1.2.2 Các nonribosomal (depsi)peptide dạng vòng .................................................. 12 1.1.2.3 Các cyclooligomer (depsi)peptide .................................................................. 15 1.1.3. Các hợp chất chuyển hóa kết hợp polyketide–nonribosomal peptide ................ 15 1.1.4 Terpenoid.......................................................................................................... 17 1.1.5 Một số hợp chất khác ........................................................................................ 20 1.2. Nấm Isaria japonica Yasuda ............................................................................... 20 1.2.1. Đặc điểm.......................................................................................................... 20 1.2.2. Thành phần hóa học của nấm ký sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) ....... 21 1.2.3 Hoạt tính sinh học của nấm kí sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) ............ 22 1.3. Các hợp chất chuyển hóa bậc hai phân lập từ nấm Phellinus ............................... 23 1.3.1 Polysaccharide và protein-polysaccharide ......................................................... 23 1.3.2. Steroid ............................................................................................................. 24 1.3.3. Terpenoid ......................................................................................................... 26 1.3.3.1. Sesquiterpenoid ............................................................................................. 26 1.3.3.2 Diterpenoid .................................................................................................... 29 ii 1.3.3.3. Triterpenoid .................................................................................................. 30 1.3.4. Flavone ............................................................................................................ 31 1.3.5. Styrylpyrone .................................................................................................... 32 1.3.6. Furane .............................................................................................................. 36 1.3.7 Polychlorinat ..................................................................................................... 36 1.3.8 Một số hợp chất khác ........................................................................................ 36 1.4. Nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer ................................................ 36 1.4.1. Đặc điểm loài nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer ........................ 36 1.4.2. Thành phần hóa học của Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer ............... 37 Chƣơng 2 ................................................................................................................... 38 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ........................................... 38 2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 38 2.1.1. Phƣơng pháp lấy mẫu ....................................................................................... 38 2.1.2. Phƣơng pháp chiết xuất, phân lập ..................................................................... 38 2.1.3. Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất..................................................... 38 2.1.4. Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học.................................................................. 38 2.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................. 38 2.2.1. Hoá chất ........................................................................................................... 38 2.2.2. Thiết bị ........................................................................................................... 38 2.2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ................................................................................. 38 2.2.2.2. Sắc ký cột (CC) ............................................................................................. 39 2.2.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)................................................................ 39 2.2.2.4. Phổ tử ngoại (UV) ......................................................................................... 39 2.2.2.5. Phổ hồng ngoại (FT-IR) ................................................................................ 39 2.2.2.6. Phổ khối lƣợng (MS) ..................................................................................... 39 2.2.2.7. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR).............................................................. 39 2.2.2.8. Điểm nóng chảy ............................................................................................ 39 2.2.2.9. Độ quay cực riêng ......................................................................................... 39 2.3. Nghiên cứu các hợp chất từ sợi nấm kí sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) . 40 2.3.1. Quy trình nghiên cứu ....................................................................................... 40 2.3.2. Phƣơng pháp phân lập ...................................................................................... 42 2.3.2.1. Môi trường PDA và phương pháp nuôi cấy ................................................... 42 iii 2.3.2.2. Môi trường lên men lỏng và phương pháp nuôi cấy nấm ............................... 43 2.3.3. Phân lập các hợp chất ....................................................................................... 44 2.3.4. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập đƣợc ........................ 48 2.3.4.1. Hợp chất IJM-1 (Chất mới) ........................................................................... 48 2.3.4.2. Hợp chất IJM-2 ............................................................................................. 48 2.3.4.3. Hợp chất IJM-3 ............................................................................................. 49 2.3.4.4. Hợp chất IJM-4 ............................................................................................. 50 2.3.4.5. Hợp chất IJM-5 ............................................................................................. 50 2.3.4.6. Hợp chất IJM-6 ............................................................................................. 51 2.3.4.7. Hợp chất IJM-7 ............................................................................................. 51 2.3.4.8. Hợp chất IJM-8 ............................................................................................. 51 2.3.4.9. Hợp chất IJM-9 ............................................................................................. 52 2.3.4.10. Hợp chất IJM-10 ......................................................................................... 53 2.3.4.11. Hợp chất IJM-11 ......................................................................................... 53 2.3.4.12. Hợp chất IJM-12 ......................................................................................... 54 2.3.4.13. Hợp chất IJM-13 ......................................................................................... 54 2.3.4.14. Hợp chất IJM-14 ......................................................................................... 54 2.3.4.15. Hợp chất IJM-15 ......................................................................................... 55 2.4. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer ........................................................................................................................ 55 2.4.1. Mẫu nấm .......................................................................................................... 55 2.4.2. Phân lập các hợp chất ....................................................................................... 55 2.4.3. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập đƣợc ........................ 58 2.4.3.1. Hợp chất PPH-1............................................................................................ 58 2.4.3.2. Hợp chất PPH-2............................................................................................ 58 2.4.3.3. Hợp chất PPE-1 ............................................................................................ 59 2.4.3.4. Hợp chất PPE-2 ............................................................................................ 59 2.4.3.5. Hợp chất PPE-3 ............................................................................................ 60 2.5. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng nấm của các hợp chất.......................... 60 Chƣơng 3 ................................................................................................................... 62 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................... 62 3.1. Nấm Isaria japonica Yasuda ............................................................................... 62 iv 3.1.1. Phân lập các hợp chất ....................................................................................... 62 3.1.2. Xác định cấu trúc các hợp chất ......................................................................... 62 3.1.2.1. Hợp chất IJM-1 (chất mới) ............................................................................ 62 3.1.2.2. Hợp chất IJM-2 ............................................................................................. 74 3.1.2.3. Hợp chất IJM-3 ............................................................................................. 78 3.1.2.4. Hợp chất IJM-4 ............................................................................................. 81 3.1.2.5. Hợp chất IJM-5 ............................................................................................. 82 3.1.2.6. Hợp chất IJM-6 ............................................................................................. 83 3.1.2.7. Hợp chất IJM-7 ............................................................................................. 84 3.1.2.8. Hợp chất IJM-8 ............................................................................................. 86 3.1.2.9. Hợp chất IJM-9 ............................................................................................. 89 3.1.2.10. Hợp chất IJM-10 ......................................................................................... 92 3.1.2.11. Hợp chất IJM-11 ......................................................................................... 94 3.1.2.12. Hợp chất IJM-12 ......................................................................................... 95 3.1.2.13. Hợp chất IJM-13 ......................................................................................... 96 3.1.2.14. Hợp chất IJM-14 ......................................................................................... 97 3.1.2.15. Hợp chất IJM-15 ......................................................................................... 98 3.2. Nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer ................................................ 98 3.2.1. Phân lập các hợp chất ....................................................................................... 98 3.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất ......................................................................... 99 3.2.2.1. Hợp chất PPH-1............................................................................................ 99 3.2.2.2. Hợp chất PPH-2.......................................................................................... 107 3.2.2.3. Hợp chất PPE-1 .......................................................................................... 107 3.2.2.4. Hợp chất PPE-2 .......................................................................................... 116 3.2.2.5. Hợp chất PPE -3 ......................................................................................... 118 3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng nấm của các hợp chất .............................. 118 KẾT LUẬN ............................................................................................................. 123 DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................................. 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................ 125 PHỤ LỤC ................................................................................................................ 148 v DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.1. Các hợp chất styrylpyrone từ các loài Phellinus và hoạt tính sinh học của chúng ......................................................................................................................... 32 Bảng 3.1. Các hợp chất phân lập từ sợi nấm Isaria japonica Yasuda ......................... 62 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của IJM-1 ...................................................................... 70 Bảng 3.3: Tính chất lý hóa của IJM-1, IJM-2, beauveriolides I .................................. 72 Bảng 3.4: So sánh số liệu phổ 1H-NMR, 13 C-NMR của các phần cấu trúc leucine, 3- hidroxyl-4-methyloctanoic, alanine của IJM-1 và beauveriolides I............................. 73 Bảng 3.5: Số liệu phổ NMR của hợp chất IJM-2 ........................................................ 77 Bảng 3.6: Số liệu phổ NMR của hợp chất IJM-3 ........................................................ 80 Bảng 3.7: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất IJM-4 .................................................. 82 Bảng 3.8: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất IJM-6 .................................................. 83 Bảng 3.9: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất IJM-7 .................................................. 85 Bảng 3.10: Số liệu phổ NMR của hợp chất IJM-8....................................................... 87 Bảng 3.11: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất IJM-9 ............................................. 90 Bảng 3.12: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất IJM-10 ........................................... 93 Bảng 3.13: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất IJM-11 ........................................... 94 Bảng 3.14: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất IJM-13 ........................................... 96 Bảng 3.15: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất IJM-14 ........................................... 97 Bảng 3.16: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất IJM-15 ........................................... 98 Bảng 3.17: Các hợp chất phân lập từ nấm Phellinus pini .......................................... 99 Bảng 3.18: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất PPH-1........................................... 105 Bảng 3.19: Số liệu phổ NMR của hợp chất PPE-1 ................................................... 115 Bảng 3.20: Số liệu phổ NMR của hợp chất PPE-2 ................................................... 117 Bảng 3.21: Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất ........................ 119 vi DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 Nấm Isaria japonica Yasuda ....................................................................... 21 Hình 1.2 Nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer......................................... 37 Hình 2.1 Nuôi cấy nấm trên môi trƣờng PDA ........................................................... 43 Hình 2.2 Mô tả các bƣớc cấy nấm trên môi trƣờng lỏng............................................ 44 Hình 3.1 Phổ khối lƣợng (HR-ESI-MS và ESI-MS) của hợp chất IJM-1.................... 63 Hình 3.2 Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất IJM-1 ..................................................... 64 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất IJM-1............................................................... 64 Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất IJM-1 ............................................................. 65 Hình 3.5. Phổ DEPT của hợp chất IJM-1 ................................................................... 65 Hình 3.6. Các phần cấu trúc I đến VI của hợp chất IJM-1 .......................................... 66 Hình 3.7. Phổ COSY của hợp chất IJM-1 .................................................................. 66 Hình 3.8. Phần cấu trúc axit amin leucine của hợp chất IJM-1 ................................... 67 Hình 3.9. Phổ HMBC của hợp chất IJM-1 ................................................................. 67 Hình 3.10. Phổ HMBC của hợp chất IJM-1 ............................................................... 68 Hình 3.11. Phổ HSQC của hợp chất IJM-1 ................................................................ 68 Hình 3.12. Phần cấu trúc axit amin tritophan của hợp chất IJM-1 .............................. 69 Hình 3.13. Phần cấu trúc axit amin alanine của hợp chất IJM-1 ................................. 69 Hình 3.14. Phần cấu trúc 3-hydroxyl-4-methyloctanoyl của hợp chất IJM-1 .............. 70 Hình 3.15. Tƣơng quan và tƣơng tác xa của hợp chất IJM-1. ..................................... 72 Hình 3.16. Các phần cấu trúc I đến VI của hợp chất IJM-2 ........................................ 75 Hình 3.17. Phần cấu trúc axit amin phenylalanine của hợp chất IJM-2....................... 76 Hình 3.18. Phần cấu trúc axit amin alanine của hợp chất IJM-2 ................................. 76 Hình 3.19. Phần cấu trúc 3-hydroxyl-4-methyloctanoyl của hợp chất IJM-2 .............. 77 Hình 3.20. Phần cấu trúc vòng A và B của hợp chất IJM-3 ........................................ 79 Hình 3.21. Phần cấu trúc vòng B và C của hợp chất IJM-3 ........................................ 79 Hình 3.22. Phần cấu trúc vòng C và D của hợp chất IJM-3 ........................................ 79 Hình 3.23. Phần cấu trúc vòng D và E của hợp chất IJM-3 ........................................ 80 Hình 3.24. Phần cấu trúc vòng A và B của hợp chất IJM-8 ........................................ 86 Hình 3.25. Phần cấu trúc vòng B và C của hợp chất IJM-8 ........................................ 87 Hình 3.26. Phần cấu trúc vòng C và D của hợp chất IJM-8 ........................................ 87 Hình 3.27. Phần cấu trúc vòng D và mạch carbon dài của hợp chất IJM-8 ................. 87 vii Hình 3.28. Tƣơng tác xa H → C của hợp chất IJM-9 ................................................. 90 Hình 3.29. Phần cấu trúc 5,7-dihydroxy-4H-chromen-4-on của hợp chất IJM-10....... 92 Hình 3.30. Phần cấu trúc 4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl của hợp chất IJM-10 ....... 93 Hình 3.31. Tƣơng tác xa H → C của hợp chất IJM-13 ............................................... 96 Hình 3.32. Phổ khối lƣợng (HR-ESI-MS) của hợp chất PPH-1 .................................. 99 Hình 3.33. Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất PPH-1 ............................................... 100 Hình 3.34. Phổ 1H-NMR của hợp chất PPH-1 .......................................................... 100 Hình 3.35. Phổ 1H-NMR của hợp chất PPH-1 .......................................................... 101 Hình 3.36. Phổ 13C-NMR của hợp chất PPH-1......................................................... 101 Hình 3.37. Phổ 13C-NMR của hợp chất PPH-1......................................................... 102 Hình 3.38. Phần cấu trúc vòng A và B của hợp chất PPH-1 ..................................... 103 Hình 3.39. Phổ HMBC của hợp chất PPH-1 ............................................................ 102 Hình 3.40. Phần cấu trúc vòng B và C của hợp chất PPH-1 ..................................... 103 Hình 3.41. Phổ HMBC của hợp chất PPH-1 ............................................................ 103 Hình 3.42. Phần cấu trúc vòng C và D của hợp chất PPH-1 ..................................... 104 Hình 3.43. Phần cấu trúc vòng D và mạch carbon dài của hợp chất PPH-1 .............. 104 Hình 3.44. Phổ HMBC của hợp chất PPH-1 ............................................................ 104 Hình 3.45. Phổ HMBC của hợp chất PPH-1 ............................................................ 105 Hình 3.46. Phổ khối lƣợng (HR-ESI-MS) của hợp chất PPE-1 ................................ 107 Hình 3.47. Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất PPE-1................................................ 108 Hình 3.48. Phổ 1H-NMR của hợp chất PPE-1 .......................................................... 108 Hình 3.49. Phổ 1H-NMR của hợp chất PPE-1 .......................................................... 109 Hình 3.50. Phổ 13C-NMR của hợp chất PPE-1 ......................................................... 109 Hình 3.51. Phổ 13C-NMR của hợp chất PPE-1 ......................................................... 110 Hình 3.52. Phổ 13C-NMR của hợp chất PPE-1 ......................................................... 111 Hình 3.53. Phần cấu trúc vòng A và B của hợp chất PPE-1...................................... 112 Hình 3.54. Phổ HMBC của hợp chất PPE-1 ............................................................. 111 Hình 3.55. Phần cấu trúc vòng B và C của hợp chất PPE-1 ...................................... 112 Hình 3.56. Phổ HMBC của hợp chất PPE-1 ............................................................. 113 Hình 3.57. Phần cấu trúc vòng C và D của hợp chất PPE-1...................................... 112 Hình 3.58. Phổ HMBC của hợp chất PPE-1 ............................................................. 114 Hình 3.59. Phần cấu trúc vòng D và mạch carbon dài của hợp chất PPE-1............... 113 Hình 3.60. Phổ HMBC của hợp chất PPE-1 ............................................................. 114 viii DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Quy trình nghiên cứu nấm ký sinh trên côn trùng ..................................... 40 Sơ đồ 2.2: Quy trình thu mẫu và phân loại nấm kí sinh côn trùng .............................. 41 Sơ đồ 2.3: Chiết các hợp chất từ môi trƣờng nuôi cấy ............................................... 45 Sơ đồ 2.4: Phân lập các hợp chất từ nấm kí sinh côn trùng ....................................... 45 Sơ đồ 2.5: Phân lập các hợp chất từ nấm thƣợng hoàng........................................ 56 ix DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng anh 13 Carbon-13 C-NMR Tiếng việt Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Spectroscopy 1 H-NMR Proton carbon-13 Resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Magnetic Spectroscopy proton ACN Acetonitrile axetonitrile AHMOD (2S,4S)-2-amino-6-hydroxy-4- Axit (2S,4S) -2- amino -6- methyl-8-oxodecanoic acid hydroxy -4 -methyl -8 - oxodecanoic AIB aminoisobutyric acid Axit-aminoisobutyric AT acyl transferase Chuyển hóa acyl CC Column Chromatography Sắc kí cột CTPT Molecular formula Công thức phân tử Đ.n.c. Melting point Điểm nóng chảy DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer DMSO DiMethylSulfoxide DiMethylSulfoxit DPD (2S)-N,N-dimethlypropane-1-2- (2S)-N,N-dimethly diamine 2-diamin EPF Entomology pathogenic fungi Nấm kí sinh côn trùng EI-MS Electron Impact-Mass Spectroscopy Phổ khối va chạm electron ESI-MS Electron Spray propan-1- Ionzation-Mass Phổ khối lƣợng phun mù Spectroscopy electron FC Flash Chromatography Sắc ký cột nhanh HIV Human Immuno-deficiency Virus Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời HMBC Heteronuclear Multiple nhiều liên kết H→C Correlation HPLC High Bond Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HR-ESI-MS High Relution-Electron Spray Impact Phổ khối lƣợng phân giải cao x Mass Spectroscopy HSQC HSV-1 Heteronuclear Single phun mù electron Quantum Phổ tƣơng tác dị hạt nhân trực Correlation tiếp H→C Herpes simplex virus – 1 Virus gây bệnh ở da, niêm mạc phần trên của cơ thể nhƣ mắt, mũi, miệng IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tƣợng thử nghiệm IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại Hằng số tƣơng tác tính bằng J (Hz) Hz KLPT Molecular weight Khối lƣợng phân tử MDA468 human breast cancer cell line tế bào ung thƣ vú di căn ác tính MeHA (4S,2E)-4-methylhex-2-enoic acid axit (4S,2E)-4-methylhex-2- enoic MePro Methylproline methyl prolin MeOH Methanol metanol MS Mass Spectroscopy Phổ khối lƣợng mTOR mammalian Target Of Rapamycin sự tăng sinh và phát triển tế bào NR PKs Nonreduced polyketides Polyketide không bị khử NRPSs nonribosomal peptide synthetase Enzyme sinh tổng hợp peptide ngoài ribosome PDA Potato Dextrose Agar Môi trƣờng PDA PKs Polyketide polyketit PKSs polyketide synthases enzyme polyketide ppm parts per million Phần triệu PR PKs Partially reducing PKSs Polyketide khử không hoàn toàn RT retention time Thời gian lƣu SDB Saboraud Dextrose Broth Môi trƣờng SDB SNU-1 Gastric carcinoma-1 (Seoul National Ung thƣ biểu mô dạ dày -1 University) xi SNU-354 Gastric carcinoma-354 (Seoul Ung thƣ biểu mô dạ dày -354 National University) SNU-C4 Gastric carcinoma-C4 (Seoul Ung thƣ biểu mô dạ dày –C4 National University) TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng TLTK Reference Tài liệu tham khảo TMS Tetramethylsilan Tetramethylsilan TT Số thứ tự TSB Trypcase Soya Broth Môi trƣờng TSB δC Carbon chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của carbon δ*C Carbon chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của carbon theo tài liệu tham khảo δH Proton chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của proton δ*H Proton chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của proton theo tài liệu tham khảo br s broad singlet singlet tù d Doublet doublet dd doublet of doublet doublet của doublet dt doublet of triplet doublet của triplet m Multiplet multiplet s Singlet singlet t Triplet triplet 1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Nấm là sinh vật không thể thiếu trong đời sống, không có nấm, chu trình tuần hoàn vật chất sẽ bị mất một mắt xích quan trọng trong việc phân hủy chất bã hữu cơ. Nấm là nguồn thực phẩm giàu đạm, đầy đủ các axit amin thiết yếu, hàm lƣợng chất béo ít chủ yếu là những axit béo chƣa bão hòa, giá trị năng lƣợng cao, giàu khoáng chất và các vitamin có tác dụng tốt cho sức khỏe con ngƣời. Ngoài ra, trong nấm còn chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học, góp phần ngăn ngừa và điều trị bệnh cho con ngƣời. Ngày nay, ngày càng nhiều các nhà khoa học tập trung nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài nấm nhằm phát hiện các hoạt chất có dƣợc tính mạnh đối với các căn bệnh nan y nhƣ viêm gan, kháng viêm ung thƣ, HIV… Việc đƣa vào sử dụng rộng rãi các chế phẩm đƣợc tách chiết từ nấm sẽ giúp con ngƣời khỏe mạnh, phòng chống đƣợc nhiều căn bệnh tiềm ẩn, nguy hiểm [1], [2], [5], [6], [13]. Việt Nam là một trong những quốc gia có sự đa dạng sinh học cao trên thế giới với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa, những kiểu sinh thái khác nhau… góp phần tạo nên sự đa dạng của khu hệ nấm Việt Nam. Đến năm 2010, có khoảng 2500 loài nấm đã đƣợc ghi nhận cho lãnh thổ Việt Nam, trong số đó khoảng 1400 loài thuộc 120 chi là những loài nấm lớn [3], [4], [9]. Các loài nấm lớn của Việt Nam có giá trị tài nguyên rất đáng kể về nhiều mặt, có khoảng 50 loài là nấm ăn quý nhƣ: các loài mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấm hƣơng (Lentinula edodes), nấm rơm, nấm mối, nấm thông (Boletus edulis Bull.), nấm chàm (Boletus aff. felleus Bull.), nấm bào ngƣ (Pleurotus spp.), nấm mào gà (Cantherellus cibarius Fr.), nấm ngọc châm (Hypsizigus marmoreus), nấm kim châm (Flammulina velutipes)... [4], [6]. Có khoảng hơn 200 loài nấm dùng làm dƣợc liệu, trong đó có rất nhiều loài là dƣợc liệu quý nhƣ: linh chi (G. lucidum), linh chi sò (G. capense), cổ linh chi (G. applanatum), vân chi (Trametes versicolor), phiến chi (Schizophyllum commune), nấm hƣơng (Lentinula edode), nấm kim châm (Flammulina velutipes), mộc nhĩ, ngân nhĩ, đông trùng hạ thảo (Cordycep sinensis, Cordycep militaris)… [8], [20], [21]. Những nghiên cứu bƣớc đầu về các hợp chất có hoạt tính sinh học của một số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng rất giàu các hợp chất có khối lƣợng phân tử lớn nhƣ polysaccharide, polysaccharide-peptide, lectine… và các chất có khối lƣợng phân tử nhỏ nhƣ các flavonoide, steroide, terpenoide… có tác dụng kháng viêm, tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch, hỗ trợ điều trị các bệnh hiểm nghèo nhƣ ung thƣ, suy giảm miễn dịch, tiết niệu, tim mạch… Khoảng 50 loài nấm có khả năng sản sinh các enzym và 2 một số hoạt chất quý đƣợc ứng dụng trong các lĩnh vực công nghệ sinh học, bảo vệ môi trƣờng… Bắc Trung bộ là khu vực có nhiều vƣờn Quốc gia, khu bảo tồn thiên nhiên nhƣ Phong Nha - Kẻ Bàng, Vũ Quang, Hồ Kẻ Gỗ, Pù Mát, Pù Huống, Pù Hoạt và Bến En. Đây là những vùng đƣợc đánh giá có tính đa dạng sinh học rất cao, hiện nay đây là khu vực bảo tồn đƣợc một nguồn lợi rất lớn về sinh thái và tài nguyên sinh, trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho các ngành công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm… [15], [16], [37], [212], [213]. Các nghiên cứu về nấm ở Việt Nam nói chung và khu vực Bắc Trung bộ nói riêng vẫn còn là một vấn đề khá mới, chƣa nhận đƣợc sự quan tâm đúng mức của các nhà khoa học. Do vậy, việc nghiên cứu về nấm ở vùng Bắc Trung bộ là một yêu cầu bức thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn, góp phần quan trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, về giá trị kinh tế và tầm quan trọng của nguồn dƣợc liệu thiên nhiên của nƣớc ta nói chung và các tỉnh thuộc vùng Bắc Trung bộ nói riêng. Vì lý do đó, chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của nấm Isaria japonica và Phellinus pini ở vùng Bắc Trung Bộ”. 2. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là nấm Isaria japonica Yasuda và quả thể nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer đƣợc thu hái ở vùng Bắc Trung Bộ, Việt Nam. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Chiết hỗn hợp các hợp chất từ nấm Isaria japonica và nấm Phellinus pini. - Sử dụng các phƣơng pháp sắc ký để phân lập các hợp chất từ dịch chiết của hai loại nấm trên. - Xác định cấu trúc của những hợp chất phân lập đƣợc. - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập đƣợc. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về đƣợc rửa sạch, phân lập, nuôi cấy và bảo quản ở nhiệt độ thích hợp. Việc xử lý tiếp các mẫu bằng phƣơng pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu đƣợc nêu ở phần thực nghiệm. - Phƣơng pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: sử dụng các phƣơng pháp sắc ký cột thƣờng (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích, sắc ký cột nhanh 3 (FC) với các pha tĩnh khác nhau nhƣ silica gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích trên các pha đảo, pha silica gel. - Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: cấu trúc hoá học của các hợp chất đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp vật lý hiện đại nhƣ phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lƣợng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau nhƣ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC. - Cấu trúc lập thể tƣơng đối của các hợp chất này đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phổ NMR. - Thăm dò các hoạt tính hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng nấm. 5. Những đóng góp mới của luận án - Đây là nghiên cứu đầu tiên có hệ thống ở Việt Nam về thành phần hóa học của loài nấm Isaria japonica và nấm Phellinus pini ở khu vực Bắc Trung Bộ. - Từ dịch chiết nấm Isaria japonica thu đƣợc 15 hợp chất. Trong đó, hợp chất IJM-1 là isarin là hợp chất mới. Đồng thời, hợp chất 11, 22-dihydroxyhopane (IJM3) lần đầu tiên phân lập và đƣợc xác định cấu trúc bằng phổ 1D- và 2D-NMR chƣa đƣợc công bố ở bất kỳ công trình nào. Ngoài ra, 06 hợp chất bao gồm: beauveriolide I (IJM-2), (17R)-17-methylincisterol (IJM-4), fungisterol ((3,5α,22E)-ergosta-6,8,22trien-3-ol) (IJM-5), 4,4-dimethyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3-ol (IJM-6), 3-Oferulylcycloartenol (IJM-7), tricin (IJM-10) lần đầu tiên phân lập đƣợc từ loài nấm này . - Từ dịch chiết của quả thể nấm Phellinus pini phân lập đƣợc 05 hợp chất bao gồm: 02 hợp chất triterpenoid: gilvsin A (PPH-1) và gilvsin B (PPE-1). Hai triterpenoid PHH-1 và PPE-1 lần đầu tiên phân lập đƣợc từ loài nấm này; 03 hợp chất steroit: ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2), ergosterol (PPH-2) và ergosterol peroxide (PPE-3). Hợp chất PPE-2 là hợp chất này lần đầu tiên đƣợc phân lập từ loài nấm này. - Lần đầu tiên thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và kháng nấm của 12 hợp chất (IJM-1, IJM-2, IJM-3, IJM-5, IJM-6, IJM-10, IJM-11, IJM-13, PPH1, PPE-1, PPE-2, PPE-3). Kết quả cho thầy có 06 hợp chất (IJM-1, IJM-2, IJM-6, IJM-13, PPH-1 và PPE-2) có khả năng kháng với chủng vi sinh vật kiểm định Gr (+) (Staphylococcus aureus subsp. Aureus- ATCC 11632) với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 50 g/ml. 4 6. Cấu trúc của luận án Luận án bao gồm 125 trang với 22 bảng số liệu, 64 hình và 5 sơ đồ với 249 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (33 trang), phƣơng pháp và thực nghiệm (24 trang), kết quả và thảo luận (63 trang), kết luận (1 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (24 trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 161 phổ của một số hợp chất chọn lọc. 5 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1. Các hợp chất chuyển hóa bậc hai phân lập từ nấm kí sinh côn trùng "Nấm kí sinh côn trùng - Entomology pathogenic fungi (EPF) hay nấm côn trùngInsect fungi" là thuật ngữ đề cập về nhóm sinh vật ký sinh gây bệnh cho côn trùng. Theo Evans (1988) [191], nấm ký sinh côn trùng đƣợc chia thành 4 nhóm: (1) Ký sinh trong, tức là nấm ký sinh trong nội quan, khoang cơ thể của côn trùng ký chủ; (2) Ký sinh ngoài tức là nấm phát triển trên lớp vỏ cuticun của cơ thể côn trùng và gây bệnh cho ký chủ; (3) Nấm mọc trên côn trùng tức là những nấm trực tiếp hoặc gián tiếp, hoặc gián tiếp đƣợc chứng minh chúng ký sinh trên côn trùng; (4) Cộng sinh, có nghĩa là cả nấm và côn trùng cùng mang lại lợi ích cho nhau trong mối quan hệ cùng chung sống. Hiện nay, nấm ký sinh côn trùng có khoảng hơn 700 loài thuộc 100 chi, nhƣng nó có giá trị dinh dƣỡng cao trong giới nấm có hơn 80 000 loài đã đƣợc biết đến. Các hợp chất chuyển hóa bậc hai phân lập từ các loài EPF chủ yếu thuộc các lớp chất polyketide, nonribosomal peptide, các hợp chất liên kết giữa polyketide và nonribosomal, terpenoid… 1.1.1 Các polyketide Polyketide (PKs) là một lớp chất với các hợp chất có cấu trúc đa dạng, có phổ hoạt tính sinh học rộng [83], [84]. Các hợp chất polyketide đƣợc sinh tổng hợp bởi quá trình ngƣng tụ Claisen các monome axit carboxylic với sự tham gia của các enzyme polyketide (PKSs), tƣơng tự nhƣ sinh tổng hợp các axit béo. Trong quá trình sinh tổng hợp các polyketide, các PKSs tham gia vào quá trình này có thể khử hoặc không khử các nhóm -carbonyl. Dựa vào đặc điểm sinh tổng hợp các polyketide này có thể chia polyketide thành ba nhóm: các polyketide không bị khử (NR PKS), polyketide bị khử không hoàn toàn và polyketide bị khử hoàn toàn. 1.1.1.1 Các polyketide không bị khử Oosporein (1) là chất có màu đỏ đƣợc sản sinh ra bởi B. bassiana và B. brongniarti [195], [219]. Năm 1944, Oosporein lần đƣợc tiên đƣợc phân lập từ loài Oospora colorans, đƣợc sản xuất làm thuốc nhuộm [246]. Oosporein có khả năng ức chế Ca2+-phụ thuộc các enzyme ATP của màng tế bào hồng cầu ở các nồng độ tƣơng đối cao (200 g ml-1) do rối loạn cấu trúc màng [102]. Các nghiên cứu liên quan đến nguồn gốc oosporein cho thấy đây là hợp chất chuyển hóa từ axit orsellinic trải qua nhiều quá trình trung gian oxy hóa và dimer hóa tạo thành dibenzoquinone [53], [203].
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan