Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học trong cao ethyl acetate từ vỏ của rễ cây bần chua (sonneratia caseolaris (l.) engl.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ------------ ĐỖ THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CAO ETHYL ACETATE TỪ VỎ CỦA RỄ CÂY BẦN CHUA (Sonneratia caseolaris (L.) Engl.) LUẬN VĂN ĐẠI HỌC Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC Mã số: CN 262 CẦN THƠ − 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ------------ ĐỖ THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CAO ETHYL ACETATE TỪ VỎ CỦA RỄ CÂY BẦN CHUA (Sonneratia caseolaris (L.) Engl.) LUẬN VĂN ĐẠI HỌC Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC Mã số: TN 262 HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. LÊ THANH PHƯỚC CẦN THƠ − 2012 Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước LỜI CẢM ƠN ------o0o------Để đạt được kết quả như ngày hôm nay, Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc nhất đến TS. Lê Thanh thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn, truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp của mình đồng thời trang bị những kiến thức cho công việc của tôi trong tương lai. Tôi xin gửi lời cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ Hóa Học, khoa Công Nghệ và quý thầy cô trong bộ môn Hóa, khoa Khoa Học Tự Nhiên đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn. Xin gửi lời cảm ơn thân thương đến gia đình và những người thân luôn là chỗ dựa vững chắc cả về vật chất lẫn tinh thần. Xin cảm ơn các anh, chị học viên cao học và những người bạn đã giúp đỡ, đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn!!! Cần Thơ, tháng 4 năm 2012 Đỗ Thị Kim Chi SVTH: Đỗ Thị Kim chi i Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước TÓM TẮT LUẬN VĂN ----o0o---Cây Bần là một loại cây rất quen thuộc có mặt khắp nơi ven sông, ven biển, các bãi bồi,….Các bộ phận của cây Bần được sử dụng làm vị thuốc chữa được nhiều bệnh dân gian như: hoa Bần chữa tiêu viêm chữa tụ máu, sưng tấy, giải nhiệt cảm sốt,…Quả có thể dùng để nấu canh chua, có thể chữa bệnh bong gân, cầm máu,… Trong đề tài luận văn này, tôi đã sử dụng vỏ của rễ cây Bần chua làm nguyên liệu, tiến hành xác định độ ẩm của vỏ rễ cây Bần chua, ngâm vỏ với ethanol 96° sau đó điều chế các cao từ không phân cực petroleum ether đến cao ethyl acetate từ cao ethanol tổng.Giới hạn của đề tài này, được nghiên cứu thành phần hóa học trong cao ethyl acetate từ vỏ của rễ cây Bần chua. Bằng phương pháp sắc ký cột KG 60 F254 (silica gel) kết hợp với sắc ký lớp mỏng, tôi phân lập ra được chất sạch từ cao ethyl acetate. Sử dụng các dữ liệu phổ NMR đã xác định được chất đó là: oleanolic acid. SVTH: Đỗ Thị Kim chi ii Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN TÓM TẮT LUẬN VĂN MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................ 1 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY BẦN CHUA[2] .................................................. 1 1.1.1 Phân loại khoa học ................................................................... 1 1.1.2 Đặc điểm về cây Bần chua........................................................ 2 a Đặc điểm thực vật về cây Bần chua .........................................................2 b Phân bố sinh thái......................................................................................3 1.1.3 Tác dụng dược lý của cây Bần chua ........................................ 4 a Y học dân gian...........................................................................................4 b Y học hiện đại............................................................................................ 5 1.2 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT TỰ NHIÊN[1,5,6] ................................................................................... 5 1.2.1 Nguyên liệu ............................................................................... 5 1.2.2 Dung môi................................................................................... 5 a Dung môi phân cực và không phân cực .................................................5 b Dung môi để chiết tách các hợp chất ra khỏi cây ...................................6 c Lựa chọn dung môi tách chiết..................................................................7 d Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi để tách chiết hợp chất .......7 e Sự hòa tan hợp chất vào dung môi...........................................................8 1.2.3 Các kỹ thuật chiết tách ra khỏi cây ......................................... 9 a Kỹ thuật chiết rắn-lỏng ............................................................................9 SVTH: Đỗ Thị Kim chi iii Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước b Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng......................................................................... 10 1.3 GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ[4-6] .............. 11 1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng............................................... 11 a Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký lớp mỏng.............................. 11 b Ưu điểm sắc ký bản mỏng...................................................................... 12 c Chất hấp thu silica gel ............................................................................ 12 d Dung môi giả ly....................................................................................... 13 e Các công dụng của sắc ký lớp mỏng ...................................................... 14 1.3.2 Phương pháp sắc ký cột ......................................................... 14 a Giới thiệu về phương pháp sắc ký cột ................................................... 14 b Lựa chọn dung môi để khởi đầu giải ly................................................. 14 c Kích thước cột và lượng chất hấp phụ................................................... 15 d Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột......................................................... 16 e Đặt mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký.............................................. 17 f Theo dõi quá trình giải ly cột.................................................................. 18 g Khi nào thay đổi hệ dung môi giải ly cột ............................................... 19 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ...................................... 20 2.1 CÁC PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC BƯỚC TIÊN HÀNH[1,13]............................................ 20 2.1.1 Đặc điểm và thời gian nghiên cứu ......................................... 20 2.1.2 Các phương tiện nghiên cứu .................................................. 20 a Dụng cụ ................................................................................................... 20 b Hóa chất.................................................................................................. 20 2.1.3 Các phương pháp nghiên cứu................................................ 21 a Điều chế cao ............................................................................................ 21 b Tiến hành sắc ký cột............................................................................... 21 2.1.4 Các bước tiến hành................................................................. 21 a Nguyên liệu ............................................................................................. 21 b Quá trình điều chế cao ........................................................................... 21 c Cách phân lập các chất trong rễ Bần..................................................... 25 SVTH: Đỗ Thị Kim chi iv Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước 2.2 QUÁ TRÌNH PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TRÊN CAO THÔ[3,5].................................................................. 25 2.2.1 Quá trình phân lập và tinh chế các chất từ cao thô.............. 25 2.2.2 Khảo sát cao EA bằng sắc ký cột........................................... 26 a Nạp cột sắc ký EA................................................................................... 26 b Theo dõi quá trình giải ly cột................................................................. 27 2.2.3 Khảo sát phân đoạn 2 của cao EA......................................... 29 a Nạp cột sắc ký ......................................................................................... 29 b Theo dõi quá trình giải ly cột................................................................. 30 2.2.4 Xác định các tính chất vật lý đặc trưng và theo cấu trúc của hợp chất vừa phân lập được................................................................... 31 a Các đặc tính của chất PHUOC-CHI-01................................................. 31 b Xác định cấu trúc của chất PHUOC-CHI-01........................................ 32 CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................. 34 3.1 KẾT LUẬN........................................................................... 34 3.2 KIẾN NGHỊ ......................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................... 35 SVTH: Đỗ Thị Kim chi v Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cây Bần ven sông .................................................................................. 2 Hình 2: Hoa Bần ................................................................................................ 2 Hình 3: Thân cây và quả Bần.............................................................................. 2 Hình 4: Cành và quả Bần .................................................................................... 3 Hình 5: Các rễ Bần ............................................................................................. 3 Hình 6: Quả Bần dùng làm món ăn ..................................................................... 4 Hình 7: Cao EA ................................................................................................ 23 Hình 8: TLC cao EA......................................................................................... 26 Hình 9: Sắc ký cột thường cao EA .................................................................... 27 Hình 10: Cột sắc ký phân đoạn 2 ..................................................................... 29 Hình 11: TLC cột sắc ký phân đoạn 2 .............................................................. 29 Hình 12: TLC của PHUOC-CHI-01................................................................. 31 Hình 13: Lọ gửi mẫu đi đo phổ ........................................................................ 31 Hình 14: Cấu trúc của PHUOC-CHI-01 (oleanolic acid)....................................33 SVTH: Đỗ Thị Kim chi v Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Quá trình sắc ký cột trên cao EA đường kính 7 mm. ........................... 28 Bảng 2: Kết quả sắc ký cột phân đoạn 2 của cao EA........................................ 30 Bảng 3: Số liệu thực nghiệm của PHUOC-CHI -01 với số liệu mô phỏng của oleanolic acid................................................................................................................... 32 SVTH: Đỗ Thị Kim chi vi Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT NMR Nuclear Magnetic Resonance 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance  Chemical shift J Coupling constant s Singlet (NMR) d Doublet (NMR) dd Doublet of doublet t Triplet (NMR) m Multiplet Ac Acetone TLC Thin Layer Chromatography PE Petroleum ether (60-90) EA Ethyl acetate ppm Parts per milion Rf Retention factor HPLC High-performance liquid chromatography Di Dichloromethane MeOH Methanol EtOH Ethanol SVTH: Đỗ Thị Kim chi vii Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước LỜI MỞ ĐẦU ----o0o---Từ ngàn xưa, nhân dân ta đã biết sử dụng các loại cây, cỏ có dược tính để chữa bệnh, chúng có tác dụng chữa bệnh tốt, dễ tìm, rẻ tiền, sử dụng tương đối dễ dàng. Tuy nhiên việc sử dụng chỉ dựa vào kinh nghiệm nhân gian, phần lớn chưa được giải thích bằng cơ sở khoa học hiện đại. Ngày nay, khoa học kỹ thuật được phát triển con người đã đi sâu nghiên cứu để có thể giải thích chính xác cho chúng ta biết được trong các loại cây, cỏ có chứa thành phần gì mà chúng có khả năng chữa bệnh. Không dừng ở đó, việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên đã và đang trở thành một lĩnh vực quan trọng của ngành Hóa Học Hữu Cơ ở nước ta. Phần lớn các hợp chất được phân lập từ thực vật hay động vật đều có hoạt tính sinh học, có khả năng chữa một số bệnh cho con người hoặc có tác dụng lên một số vi sinh vật có hại được dung trong nông nghiệp,… Xu hướng hiện nay của ngành dược phẩm là hướng đến các sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên, vì chúng đem lại sức khỏe tốt cho con người và không gây phản ứng phụ như các sản phẩm tổng hợp. Từ nhu cầu thực tế đó nên tôi đã chọn đề tài là “Nghiên cứu thành phần hóa học trong cao ethyl acetate từ vỏ của rễ cây Bần chua”. SVTH: Đỗ Thị Kim chi viii Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY BẦN CHUA[2] Cây Bần phân bố ở rừng ngập mặn Campuchia, Thái Lan, Inđônêxia, Philippin, Bắc châu đại dương,..... Ở Việt Nam cây mọc ở nước lợ gần các cửa sông ngập một mùa trong năm. Cây thường mọc chung với các loài cây khác như Trang, Sú, Giá, Cóc,... Cũng có khi mọc thành rừng gần như thuần loại như ở Hải Phòng, Nghệ An, Hà Tĩnh. Sự phong phú của quần thụ này tùy theo mức nước lợ và chế độ thủy triều. Ở Việt Nam hiện nay họ Bần có khoảng 6 loài, trong đó hết 5 loài là gặp ở vùng rừng ngập mặn hoặc bờ sông có thủy triều, cây có rễ kí sinh thường dùng làm nút chai. 1.1.1 Phân loại khoa học Tên Khoa Học: Sonneratia caseolaris (L.) Engl. Tên đồng nghĩa : Sonneratia acida L, Rhizophora caseolaris Tên Việt Nam: Bần Chua Tên khác: Hải Đồng, Thủy Liễu Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliosida Bộ: Myrtales Họ: Lythraceae Chi: Sonneratia Loài : Sonneratia caseolaris (L.) SVTH: Đỗ Thị Kim chi 1 Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước 1.1.2 Đặc điểm về cây Bần chua a. Đặc điểm thực vật của cây Bần chua Cây Bần thường gặp nhất ven sông, trái chín ăn được, rất chua. Loài Đom đóm thường hay đậu trên lá Bần ban đêm, chớp tắt trông rất đẹp như cây Thông Noel. Hình 1: Cây Bần ven sông Cây gỗ, thân cao 4-5 m hoặc hơn, luôn xanh. Rễ thở tập trung thành khóm ở quanh gốc thân, mọc ngập sâu vào bùn. Cành non có 4 cạnh nhẵn. Lá mọc đối, lá non hình mũi mác dài, lá già hình trái xoan, dài 5-10 cm, rộng 3,5-4,5 cm, gốc thuôn, đầu tù, phiến lá dài và dai, hơi mọng nước, rất giòn, gân lá rõ, thường rụng vào mùa đông; cuống lá và phần gân chính ở gốc có màu đỏ. Hình 2: Hoa và quả Bần SVTH: Đỗ Thị Kim chi Hình 3: Thân và quả Bần 2 Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước Hoa màu trắng, mọc đơn độc ở ngọn thân hoặc kẽ lá; cuốn hoa ngắn và mập; đài có có 6 răng hình tam giác, dày gắn liền ở gốc tạo thành một ống dài 1,5 cm, mặt ngoài màu lục mặt trong màu tím hồng, tràng 6 cánh hình dải, đầu thuôn nhọn; nhị nhiều, chỉ nhị dài, mảnh; bầu hình cầu dẹt. Quả mọng, hình cầu dẹt, đường kính 3 cm, có mũi thuôn nhọn ở đầu; hạt nhiều dẹt, toàn cây nhẵn. Hoa nở vào khoảng tháng 3-5 và mùa quả khoảng tháng 8-10 Bộ phận dùng là: quả, vỏ, thân và cành. Hình 4: Cành và rễ Bần Hình 5: Các rễ Bần b. Phân bố sinh thái Chi sonneratia gồm một số đại diện là cây gỗ hay cây bụi, mọc ở các vùng đất ngập mặn ven biển, ở Đông Phi, nhiệt đới châu Á và các đảo ở Thái Bình Dương. Ở Việt Nam, chi này có 4-5 loài, trong đó Bần là cây gặp khá phổ biến ở các vùng ven biển từ Thủy Nguyên (Hải Phòng) cho đến Rạch Giá (Hà Tiên). Loài này cũng được phân bố rộng rãi ở Ấn Độ, Thái Lan, Campuchia, Indonesia, Philipin, phần biển Đông Bắc Australia và đảo solomon. Bần là loại cây gỗ phân cành nhiều, ưa sáng chịu được mặn nên thường thấy trên các vùng đất bùn nhão ở các cửa sông. Để thích nghi với điều kiện đất bùn nhão và thường xuyên bị ngập nước, cây có hệ thống rễ thở mọc trồi lên khỏi mặt đất. Bần ra hoa hàng năm, thụ phấn nhờ gió, côn trùng và dơi. Hoa Bần là nguồn thức ăn quan trọng của ong mật. Cây còn được trồng thêm nhằm chắn sóng và bảo vệ vùng đất ngập nước ở ven biển. SVTH: Đỗ Thị Kim chi 3 Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước 1.1.3 Tác dụng dược lý của cây Bần chua a. Y học dân gian Lá Bần: ở các nước Đông dương (cũ), lá Bần giã nát với ít muối, đắp tại chổ chữa vết thương bầm tím do đập đụng. Quả Bần: ở Ấn Độ quả Bần được dùng làm thuốc đắp ngoài chữa bong gân sưng tấy, dịch ép lên men từ quả có tác dụng cầm máu. Ở Malaysia, quả già là thuốc diệt giun, còn nước ép từ quả xanh có vị chua, dùng làm tăng mùi vị cho bột cari, còn lúc chín có mùi vị giống bơ, có thể ăn tươi hoặc nấu chín. Hình 6: Quả Bần dùng làm món ăn Hoa Bần: ở Ấn Độ, dịch ép từ hoa là một thành phần trong bài thuốc chữa đái ra máu. Giải nhiệt chữa cảm sốt: quả Bần rửa sạch, nhai với muối, rồi nuốt nước. Cầm máu nhất là chảy máu cam: quả Bần rửa sạch, giã nát, đắp vào vết thương, máu sẽ cầm ngay. Tác dụng này chính là do chất pectin chứa trong dịch quả. Tiêu viêm chữa tụ máu, sưng tấy: quả Bần giã nhỏ, ép lấy dịch, cô thành cao mềm. Lúc cao còn nóng phết lên giấy, khi dùng, hơ thuốc cho mềm rồi đắp lên chổ đau ngày làm một lần. Sử dụng làm thuốc đắp vào chỗ viêm tấy vì bong gân. Ở Ấn Độ, người ta dùng dịch quả lên men làm thuốc ngăn chặn của chứng xuất huyết. Ta dùng lá giã ra, thêm một ít muối, làm thuốc đắp tốt các vết thương đụng giập và vết thương nhẹ. Ở Malayxia, người ta giã lá lẫn với cơm làm thuốc đắp chữa bí tiểu tiện. SVTH: Đỗ Thị Kim chi 4 Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước Gỗ Bần dùng đóng đồ nhỏ, vỏ chứa nhiều tanin có thể dùng thuộc da. Rễ Bần làm nút đóng chai. b. Y học và hóa sinh hiện đại Hiện nay cây Bần chỉ mới được sử dụng làm thuốc theo dân gian, chưa có nghiên cứu khoa học cụ thể nào phục vụ trong y học hiện đại. 1.2 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT TỰ NHIÊN[1,5,6] 1.2.1 Nguyên liệu Để tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học một loại cây cỏ, trong điều kiện cho phép thì nên dùng dược liệu tươi. Nguyên liệu sau khi thu hái được làm khô tự nhiên trong mát có quạt hoặc nơi thoáng gió, tránh sử dụng nhiệt độ cao để làm khô nguyên liệu. Nếu nguyên liệu phải thu hái ở nơi xa, có thể bọc vào túi nhựa sẽ giữ được tươi trong vài ngày. Khi thu hái nguyên liệu phải chú ý loại bỏ sâu bệnh. Đối với các bội phận vỏ thân, rễ chú ý xem xét kỹ, tránh thu hái dược liệu có mang các sinh vật ký sinh. 1.2.2 Dung môi Dung môi dùng để chiết xuất các hợp chất ra khỏi dược liệu. Cơ sở để lựa chọn một dung môi chiết xuất là tính phân cực của hợp chất chứa trong dược liệu và của dung môi. a. Dung môi phân cực và không phân cực Quá trình hình thành một dung dịch là tùy thuộc vào đặc tính của chất tan và dung môi. Để hình thành một dung dịch trước hết là phải có sự phá vỡ các dây nối liên kết trong hợp chất tan và trong dung môi, để hình thành dây nối liên kết mới giữa chất tan và dung môi. Để hiểu về tính phân cực của dung môi, ta có thể so sánh giữa hai dung môi petroleum ether và nước có 3 điểm khác nhau cơ bản: SVTH: Đỗ Thị Kim chi 5 Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước  Hằng số điện môi của nước ở 20°C là 80,4 trong khi của petroleum ether là 4,34.  Nguyên tử H trong phân tử nước có khả năng liên kết với nguyên tử mang điện âm của một hợp chất khác, hình thành dây nối liên kết hydro trong dung dịch nước, trong khi petroleum ether không có sự liên kết này. Dây nối hydro hình thành ảnh hưởng lớn đến tính hòa tan của hợp chất đối với dung môi.  Nước có tác dụng như một acid vừa là một base, còn petroleum ether chỉ là một base rất yếu. Do những đặc tính trên, nước được xem là một dung môi phân cực mạnh còn petroleum ether là một dung môi không không phân cực. b. Dung môi để chiết tách các hợp chất ra khỏi mẫu cây Do cấu tạo của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu có phân tử lớn (polymer, ví dụ như cellulose có trong cây cỏ, nấm mốc, thành tế bào vi sinh vật) tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ, vì thế việc khảo sát hợp chất thiên nhiên là chiết lấy và khảo sát các chất có trong lượng phân tử nhỏ. Thông thường người ta nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có tính ái dầu có mức độ ái cực khác nhau. Tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái nước. Vì vậy, việc tách hợp chất thiên nhiên được thực hiện lần lượt với từng loại dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất ra bằng sử dụng dung môi vạn năng methanol, ethanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên). Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tùy thuộc vào đặc tính của chất có trong cây mà người khảo sát mong muốn tách lấy. Như ta đã biết, hợp chất tự nhiên có cấu trúc hóa học đa dạng, với tính chất phân cực khác biệt nên không thể có một quy trình tổng quát nào có thể áp dụng chung cho tất cả các nhóm, mà mỗi loại nhóm phải có một số quy trình chiết tách đặc trưng, vì vậy, trước khi tiến hành thực nghiệm phải thu thập đầy đủ các tài liệu tảm khảo có liên quan trực tiếp trên cây mới có thể chọn được quy trình phù hợp. SVTH: Đỗ Thị Kim chi 6 Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần trộn dung môi phù hợp, sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng máy chiết Soxhlet,…sau khi chiết phần bã cây hay sinh khối còn lại được loại bỏ, dung môi qua lọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ khoảng 30-40°C. c. Lựa chọn dung môi tách chiết Chọn dung môi phải có đặc tính trung bình, không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi chiết tách xong, dung môi đó có thể được loại bỏ dễ dàng. Hạn chế sử dụng các dung môi độc như benzene hoặc dễ cháy do có nhiệt độ sôi thấp như diethyl ether, carbon tetrachlorua,… Dung môi dùng để chiết cần thỏa mãn các điều kiện sau:  Có nhiệt độ sôi thấp, tuy nhiên nếu thấp quá thì tổn thất dung môi sẽ lớn, dễ cháy nổ.  Không tác dụng hóa học với các chất trong nguyên liệu và không bị thay đổi tính chất khi sử dụng lại.  Có độ nhớt bé để không làm giảm tốc độ khuếch tán.  Có khả năng hòa tan lớn các hoạt chất nhưng rất bé đối với tạp chất.  Không tạo thành hỗn hợp đối với không khí, không được có những tạp chất không bay hơi và khi bay hơn không được để lại các tạp chất có mùi lạ.  Phải tinh khiết, không ăn mòn thiết bị. Không gây mùi lạ đối với sản phẩm và không độc hại đối với người sử dụng.  Dễ tìm và rẻ tiền. d. Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi để chiết tách hợp chất Các dung môi được chưng cất lại và tồn trữ trong các chai lọ thủy tinh do trong dung môi thường hay chứa một số tạp chất bẩn mà thường gặp nhất là chất dẻo hóa. Các chất dẻo lẫn vào dung môi do dung môi thường được chứa trong các thùng bằng nhựa dẻo. Methanol và chloroform thường chứa tạp chất là di(2-ethylhexyl) và chất này thường bị nhiều tác giả nhầm lẫn rằng là hợp chất tự nhiên có chứa trong cây cỏ đang khảo sát. SVTH: Đỗ Thị Kim chi 7 Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước Chloroform, dichloromethane có thể tạo thành phản ứng với các loại alkaloid. Để tạo thành các alkaloid và một vài hợp chất giả tạo khác. Tương tự, các vết HCl có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nước, sự đồng phân hóa cho vài hợp chất hữu cơ. Diethyl ether ít được sử dụng để chiết vì có nhiệt độ sôi thấp dễ cháy, độc có thể gây mê cho người sử dụng và khuynh hướng tạo thành peroxid dễ gây nổ. Peroxid này rất hoạt tính, có thể oxid hóa các hợp chất mang nhiều nối đôi liên hợp như carotenoid. Acetone có thể tạo ra dẫn xuất acetonid nếu hợp chất chiết có chứ nhóm cis-1,2-diol hiện diện trong môi trường acid. Chiết bằng môi trường acid hay kiềm có thể thủy giải các hợp chất glycosid (môi trường acid sẽ cắt đứt glycoside tại nối acetal làm mất đi phần đường) hoặc cắt đứt este (môi trường kiềm) hoặc tạo sự chuyển vị. Sau khi chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cô chân không ở nhiệt độ 30-40°C, chưng cất ở nhiệt độ cao có thể làm hư một số chất kém bền nhiệt. e. Sự hòa tan hợp chất vào dung môi Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết. Trong cao petroleum ether hoặc cao hexane, cao diethyl ether: có thể có các hydrocacbon béo và thơm (như triglyceride, alkane mạch cacbon dài, alcol béo, ester béo, acid béo,…), Các thành phần trong tinh dầu (monoterpen, sesquiterpen, một vài diterpen bay hơi được), các sterol thực vật (phytosterols), các chất màu thực vật như carotene,… Trong cao chloroform hoặc cao ethyl acetate: có thể có các sesquiterpen, diterpen, coumarin, quinon, các aglycon do hợp chất glycosid bị thủy giải, các monoglycosid (chỉ mang một phân tử đường), một số alkaloid loại base yếu. Trong cao methanol hoặc cao nước: có thể có các chất màu thực vật như clorophyl, các glycoside (saponin), các alkaloid ở dạng muối tứ cấp, kết hợp với các acid hữu cơ, các muối amine, các tannin, các hydrat cacbon có trọng lượng phân tử nhỏ như monosacarid, các protein thực vật, các muối vô cơ, một số polysacarid như: pectin, chất nhầy, chất gôm,… SVTH: Đỗ Thị Kim chi 8 Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS. Lê Thanh Phước 1.2.3 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi cây Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ. Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính lỏng-lỏng và rắn-lỏng. a. Kỹ thuật chiết rắn-lỏng  Kỹ thuật chiết ngấm kiệt Dụng cụ : gồm một bình ngấm kiệt bình thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để của dung chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết. Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để dung môi tinh khiết. Phương pháp thực hiện: bột cây được xay khô, lọc được qua lỗ rây 3 mm. Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc. Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình. Đậy bề mặt lớp bông bằng một tờ giấy lọc và chặn trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm sáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt, có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội. Để yên một thời gian, thường là 12-24 giờ. Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mởi khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình. Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem có còn để lại vết gì trên mặt kiếng hay không, nếu không còn vết gì là chiết kiệt.  Kỹ thuật chiết ngâm dầm Kỹ thuật chiết ngâm dầm cũng tương tự kỹ thuật chiết ngâm kiệt nhưng không đòi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây. Dụng cụ: bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ, hình trụ đứng, có nắp đậy. Phương pháp thực hiện: bột cây được đặt vào bình, rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm SVTH: Đỗ Thị Kim chi 9