Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học cây cỏ mực (Eclipta Prostrata L., Asteraceae)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------***-------------- Nguyễn Thị Thơi NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CỎ MỰC (ECLIPTA PROSTRATA L., ASTERACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2011 1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------***-------------- Nguyễn Thị Thơi NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CỎ MỰC (ECLIPTA PROSTRATA L., ASTERACEAE) Chuyên ngành: Hóa Học Hữu Cơ Mã số: 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. Phan Minh Giang Hà Nội – 2011 2 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... …….1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN ................................................................................. …….2 1.1 Khái quát về Eclipta prostrata L. (syn. Eclipta alba L.) (Asteraceae) .... …….2 1.1.1 Đặc điểm thực vật ............................................................................... …….2 1.1.2 Ứng dụng trong Y học cổ truyền Việt Nam ....................................... …….3 1.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Eclipta prostrata ................. …….3 1.3 Hoạt tính sinh học của Eclipta prostrata và các hợp chất thành phần ..... …….8 Chƣơng 2: NHIỆM VỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... …...11 2.1. Nhiệm vụ của Luận văn........................................................................... …...11 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................... …...11 2.2.1 Các phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất.11 2.2.2 Các phƣơng pháp xác định cấu trúc ................................................... …...14 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ …...14 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................. …...14 3.2. Điều chế các phần chiết hữu cơ từ cây Cỏ mực ...................................... …...14 3.3. Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết thân cây Cỏ mực ............. …...15 3.3.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết thân cây Cỏ mực.............. …...15 3.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (EA1) .................................................. …...16 3.3.3 Phân tách phần chiết điclometan (EA2) ............................................. …...16 3.3.4 Phân tách phần chiết etyl axetat (EA3) .............................................. …...16 3.3.5 Phân tách phần chiết nƣớc (EA4) ....................................................... …...17 3.4 Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết phần trên mặt đất cây Cỏ mực (EP)………………………………………………………………………………….19 3.4.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết phần trên mặt đất cây Cỏ mực (EP) …......................................................................................................................19 3.4.2 Phân tách phần chiết điclometan (EP2)………………………………….19 3.4.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (EP3)............................................... …...19 7 3.4.4 Phân tách phần chiết nƣớc (EP4) ....................................................... …...20 3.5. Xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập ................................. …...22 Chƣơng 4: THỰC NGHIỆM............................................................................. …...31 4.1. Thiết bị và hóa chất ................................................................................. …...31 4.2. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................. …...32 4.3. Điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực .................................................. …...32 4.4. Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết EA………………………………32 4.4.1. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết n-hexan (EA1) ....................... …...32 4.4.2. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EA2) .................. …...34 4.4.3. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EA3) ................... …...34 4.4.4. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết nƣớc (EA4) ............................ …...34 4.5. Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết EP ........................................ …...35 4.5.1. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EP2) .................. …...35 4.5.2 Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EP3)..................... …...36 4.5.3. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết nƣớc (EP4) ............................ …...36 4.6. Phân tách sắc ký các phần chiết EA ........................................................ …...37 4.6.1 Phần chiết n-hexan (EA1) .................................................................. …...37 4.6.2 Phần chiết điclometan (EA2) ............................................................. …...38 4.6.3 Phần chiết etyl axetat (EA3) ............................................................... …...38 4.6.4 Phần chiết nƣớc (EA4) ....................................................................... …...39 4.7. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ EA .. …...39 4.8. Phân tách sắc ký các phần chiết EP ........................................................ …...40 4.8.1 Phần chiết điclometan (EP2) .............................................................. …...40 4.8.2 Phần chiết etyl axetat (EP3) ............................................................... …...41 4.8.3 Phần chiết nƣớc (EP4)........................................................................ …...41 4.9. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ EP……..42 KẾT LUẬN ....................................................................................................... …...45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. …...46 8 CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng CC (Column Chromatography): Sắc kí cột thường FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh Mini-C (Mini-column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế 1 H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR (Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 DEPT (Distortionless Enhancement by Polarition Transfer): Phổ DEPT ESI-MS (Electrospray Ionization-Mass Spectrometry): Phổ khối lượng phun bụi điện tử 4 MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ Hình 1: Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae) Bảng 1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực Bảng 2: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết n-hexan (EA1) Bảng 3: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EA2) Bảng 4: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EA3) Bảng 5: Phân tích TLC các phân đoạn của phần chiết nước (EA4) Bảng 6: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EP2) Bảng 7: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EP3) Bảng 8: Phân tích TLC các phân đoạn của phần chiết nước (EP4) Sơ đồ 1: Chiết và phân tách sắc ký phần thân cây Cỏ mực (EA) Sơ đồ 2: Chiết và phân tách sắc ký phần trên mặt đất cây Cỏ mực (EP) 5 MỤC LỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của Metyl gallat (II) Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR và DEPT của Metyl gallat (II) Phụ lục 3: Phổ ESI-MS của Eclalbasaponin I (III) Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR của Eclalbasaponin I (III) Phụ lục 5: Phổ 13C-NMR và DEPT của Eclalbasaponin I (III) Phụ lục 6: Phổ ESI-MS của Eclalbasaponin II (IV) Phụ lục 7: Phổ 1H-NMR của Eclalbasaponin II (IV) Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR và DEPT của Eclalbasaponin II (IV) Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR của Norwedelolacton (V) Phụ lục 10: Phổ 13C-NMR và DEPT của Norwedelolacton (V) Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR của Hesperidin (VI) Phụ lục 12: Phổ 13C-NMR và DEPT của Hesperidin (VI) 6 LỜI MỞ ĐẦU Trong các nghiên cứu y dược hiện đại các hợp chất thiên nhiên từ các cây thuốc bao gồm các flavonoit, tecpenoit và ancoloit tiếp tục là nguồn cung cấp các hợp chất có tiềm năng cho các thử nghiệm hoạt tính sinh học. Eclipta prostrata L., syn. Eclipta alba L. (Asteraceae) là cây thuốc dùng phổ biến trong Y học cổ truyền Việt Nam và một số nước trên thế giới. Các nghiên cứu hóa học các loài Eclipta prostrata của Trung Quốc, Nhật Bản và Ấn Độ đã xác định được các nhóm hợp chất tritecpen (oleanan và taraxastan) glycozit, các flavonoit, các coumarin, các ancaloit-steroit và các thiophen polyacetylen trong các bộ phận của cây Eclipta prostrata. Dựa trên các kiến thức dược lý học dân tộc và các hoạt tính sinh học của các phần chiết nhiều hoạt chất có tác dụng chống ung thư, kháng viêm và chống HIV của các chất được phân lập từ Eclipta prostrata đã được phát hiện. Sự đa dạng về các nhóm cấu trúc lý thú của Eclipta prostrata, sự tương quan của các cấu trúc này với nhiều hoạt tính sinh học quan trọng và ý nghĩa khoa học và thực tiễn của việc đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae) của Việt Nam đã thúc đẩy chúng tôi tiếp tục nghiên cứu một cách hệ thống về hóa thực vật của cây Cỏ mực. Luận văn này đặt mục tiêu nghiên cứu phân lập sắc ký và xác định cấu trúc các thành phần hóa học đặc biệt là các hợp chất phân cực từ phần trên mặt đất của cây Cỏ mực của Việt Nam. Các kết quả nghiên cứu theo hướng này sẽ là các bước đầu tiên trong các chương trình hiện đại hóa Y học cổ truyền Việt Nam. Các hợp chất phân cực chưa được xác định trong một số nghiên cứu trước đã được phân lập trong nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sắc ký hiện đại. 9 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. Khái quát về Eclipta prostrata L. (syn. Eclipta alba L.) (Asteraceae) 1.1.1. Đặc điểm thực vật [1] Họ Cúc (danh pháp khoa học: Asteraceae hay Compositae), còn gọi là họ Hướng dương, họ Cúc tây, là một họ thực vật có hoa hai lá mầm. Họ Asteraceae phân bố rộng khắp thế giới, nhưng phổ biến nhất tại các khu vực ôn đới và miền núi nhiệt đới. Các chi trong họ này được chia thành 13 tông. Chỉ có một trong số 13 tông này là Lactuceae, có thể là có đủ khác biệt để có thể coi là một phân họ (phân họ Cichorioideae), các tông còn lại, phần lớn là chồng ghép lẫn nhau, được đưa vào phân họ Asteroideae. Các loài thuộc về họ Cúc có các đặc trưng sau: cụm hoa dạng đầu, bao phấn hữu tính, tức là với các nhị hoa kết hợp lại với nhau tại các gờ của chúng bởi các bao phấn, tạo thành ống, bầu nhụy với sự phân bổ cơ bản của các noãn hoa, các noãn hoa trên một bầu nhụy, mào lông (chùm lông trên quả), quả là loại quả bế (tạo thành từ một lá noãn và không nẻ ra khi chín). Eclipta prostrata L. (syn. Eclipta alba L.), họ Cúc (Asteraceae), có tên thông dụng ở Việt Nam là Cỏ mực, Cỏ nhọ nồi, Nhọ nồi, hạn liên thảo, mặc hạn liên, kim lăng thảo. Hình 1: Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae) 10 Cỏ mực thuộc loại cây thân thảo hằng niên, cao từ 10-60 cm, mọc bò hoặc có khi gần như thẳng đứng, có lông trắng, cứng, thưa. Thân màu lục hay màu nâu nhạt hay hơi đỏ tía. Lá mọc đối, phiến lá dài và hẹp cỡ 2,5  1,2 cm. Mép lá nguyên hay có răng cưa cạn, hai mặt đều có lông. Hoa trắng tập hợp thành đầu ở nách lá hay đầu cành, các hoa cái hình lưỡi ở ngoài, các hoa lưỡng tính hình ống ở giữa. Qủa bế dẹt có 3 cạnh, có cánh dài 3 mm. Vùng phân bố của cây Cỏ mực trên thế giới khá rộng vì nó là loài cây nhiệt đới, mọc hoang ở chỗ ẩm mát. 1.1.2. Ứng dụng trong Y học cổ truyền Việt Nam [1] Cỏ mực được dùng để điều trị các bệnh như: nôn ra máu từ dạ dày, chảy máu cam, đái ra máu, xuất huyết tử cung, viêm gan mãn tính, viêm ruột, lỵ, trẻ em suy dinh dưỡng, ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh, nấm da, ezecma, vết loét, bị thương, chảy máu, viêm da. Ngoài ra Cỏ mực còn được dùng làm thuốc sát trùng trong bệnh ho lao, viêm cổ họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc. Cách dùng: dùng tươi hay giã lấy nước uống, hoặc sao cháy đen với liều 1530 g sắc uống. Dùng riêng hoặc phối hợp với ngó sen, lá trắc bá. Trong trường hợp sát trùng cũng dùng sắc uống hoặc giã tươi lấy nước uống, bã đắp. Có thể dùng tươi xoa tay chữa rát do vôi, chữa nấm ngoài da và nhuộm tóc có màu tím đen. Viện chống lao Trung ương và Bệnh viện lao K71 đã pha chế thành thuốc tiêm cầm máu, tiêm bắp thịt, mỗi ngày 1-3 ống (2 ml). Có nơi đã sản xuất thành công dạng cao nén thành viên dùng cầm máu. 1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Eclipta prostrata Năm 1966: F. Bolhman và cộng sự (Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin, Đức) đã phân lập từ lá khô Eclipta alba 2 dẫn xuất thiophen 1 và 2 và polyacetylen 3 [5]. H3C-C C (C S 1 11 C)2 CH=CH2 C S C-CH=CH2 CH3- (C S C)5-CH=CH2 2 3 Sau đó năm 1966, N. R. Krishnaswamy và cộng sự (Đại học Delhi, Ấn Độ) đã xác định được cấu trúc của một polythienyl, α-terthienyl methanol (4) từ Eclipta alba [5]. CH2OH S S S 4 Năm 1985: P. Sing và cộng sự (Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin, Đức) đã phân lập được một thành phần dithienyl acetylen (5) từ rễ và phần trên mặt đất cây Eclipta erecta (một tên gọi khác của Eclipta prostrata) [10]. ValH2C C S CCH2CH2OVal S 5 Phân tách sắc kí cột phần trên mặt đất và rễ cây Eclipta erecta cho một hợp chất dithienyl acetylen, 5-isovalennyloxymetylen-2-(4-isovalennyloxy-but-3-inyl) dithiophen (6) và 5-angeloyloxy-methylen-2-(but-3-en-1-ynyl)-dithiophen (7); stigmasterol (8) và sitosterol (9) là các thành phần từ phần trên mặt đất [8]. Năm 1985: T. R. Govindachari và M. S. Premila đã phân lập từ Eclipta alba wedelolacton (10), norwedelolacton (11) và axit norwedelic (axit 5,6-dihydroxy2(2,4,6-trihydroxyphenyl)-benzofuran-3-carboxylic) (12) [4]. O HO COOH OH R2O O HO R2O R1 O 10 11 O O HO OR2 R1=Me, R2=H R1=R2=H 12 12 OH Năm 1992: P. Sihgh và S. Bhagrava (Đại học Rajasthan, Ấn Độ) đã phân lập được một hợp chất từ phần rễ Eclipta erecta [9]. O O O-CH2 C S C-CH-CH2-O S 13 Năm 1997: S. Yahara và cộng sự (Đại học Kumamoto, Nhật Bản) đã phân lập từ cây khô Eclipta alba ở Trung Quốc bốn taraxastan triterpen glycozit, các eclalbasaponin VII-IX (14-17) cùng với các eclalbasaponin I-VI. Cấu trúc của các eclalbasaponin đã xác định được là 3β,20β,16β- và 3β,20β,28-trihydroxytaraxastan glycozit và các saponin sulfat của chúng [15]. OH OH H H OH H H OH HO HO O O O O OH OH OH OH OR OR 14 16 R=H R=SO3H 15 17 R=H R=SO3 Năm 1998: M. S. Kader và cộng sự (Đại học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ) đã phân lập từ phần chiết metanol Eclipta alba tám hoạt chất ancaloit có khung steroit 18-25. Ancaloid chính được phân lập là (20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22(N)dien-3β-ol (verazin, 20); và các hợp chất khác là 20-epi-3-dehydro-4,5dehydroverazin (18), 20-epi-verazin (19), ecliptabin (21), 20-epi-4β-hydroxyverazin (22), 4β-hydroxylverazin (23), 20-epi-25β-hydroxyverazin hydroxyverazin (25) [3]. 13 (24) và 25β- HO N N HO 18 21 R2 R2 N N HO R1 HO R1 19 22 24 R1=R2=H R1=OH, R2=H R1=H, R2=OH 20 23 25 R1=R2=H R1=OH, R2=H R1=H, R2=OH Năm 2008: M. K. Lee và cộng sự (Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã phân lập được một flavonoit, diosmetin (26) và hai isoflavonoit, 3hydroxybiochanin (27) và 3-O-methylorobol (28) từ phần chiết metanol Eclipta prostrata [7] OH HO OH HO O O R1 OH OH O R2 O 26 27 28 14 R1=OH, R2=OCH3 R1=OCH3, R2=OH Năm 2008: M. K. Lee và cộng sự (Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã phân lập từ dịch chiết metanol phần trên mặt đất của Eclipta prostrata năm oleanan tritecpenoit, axit echinocystic (29) và các dẫn xuất glycozit của 29, eclalbasaponin I (30), eclalbasaponin II (31), eclalbasaponin III (32) và eclalbasaponin V (33) [6]. H3C H3C CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 COOR2 CH3 COOH OH CH3 CH3 OH O HO HO H3C H3C CH3 O CH3 HO HO R1O 29 30 31 32 33 R1=H, R2=GlC R1=H, R2=H R1=GlC, R2=GlC R1=SO3, R2=H Năm 2011: Sáu hợp chất đã được S. Tewtrakul và cộng sự (Đại học Prince of Songkla, Thái Lan) phân lập từ Eclipta prostrata là 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)terthyenyl tiglat (34), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl angelat (35), 5hydroxymethyl-(2,2:5,2)-terthyenyl acetat (36), ecliptat (37), orobol (38) và wedelolacton (39) [13]. O O S S S S O S CH3 S O CH3 CH3 CH3 34 35 15 O S S S S O S S CHO CH3 36 37 O HO HO O O OH OH HO O O HO OH 38 OCH3 39 1.3 Hoạt tính sinh học của Eclipta prostrata và các hợp chất thành phần 1.3.1 Hoạt tính ức chế HIV-1 của các terthienyl, orobol và wedelolacton Sáu hợp chất đã được phân lập từ phần chiết toàn cây Eclipta prostrata trong một nghiên cứu phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học trong thử nghiệm ức chế enzym HIV-1 integrase (IN) [12]. Các hợp chất này đã được xác định là 5hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl tiglat (34), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)- terthyenyl angelat (35), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl acetat (36), ecliptat (37), orobol (38) và wedelolacton (39). Wedelolacton (39) đã được xác định là có hoạt tính mạnh nhất đối với HIV-1 IN với IC50 là 4,0 ± 0,2 µm, tiếp đó là hợp chất 38 (IC50 = 8,1 ± 0,5 µm), các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính với IC50 > 100 µm. Đối với hoạt tính ức chế HIV-1 protease (PR) hợp chất 34 thể hiện hoạt tính chống lại HIV-1 PR với IC50 = 58,3 ± 0.8 µm, hợp chất 37 (IC50 = 83,3 ± 1.6 µm) và hợp chất 36 (IC50 = 93,7 ± 0,8 µm) trong khi các hợp chất 33, 38 và 39 không thể hiện hoạt tính (IC50 > 100 µm). Các tác dụng ức chế HIV-1 IN của wedelolacton, một dẫn xuất coumarin và orobol, một dẫn xuất isoflavon là các hoạt tính đáng chú ý của nghiên cứu này. 16 1.3.2 Hoạt tính kháng viêm của các terthienyl, orobol và wedelolacton Phần chiết toàn cây Eclipta prostrata và các hợp chất terthienyl, 5hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-terthienyl tiglat (34), 5-hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)terthienyl angelat (35), 5-hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-terthienyl acetat (36), ecliptal (37) cùng với falvonoit orobol (38) và coumestan wedelolacton (39) được phân lập từ cây này đã được thử nghiệm hoạt tính kháng viêm trong nghiên cứu ức chế sự sản sinh nitơ oxit (NO), prostaglandin E2 (PGE2) và TNF-α trong các tế bào RAW264.7 gây bởi lipopolisaccarit (LPS) [13]. Orobol (38) đã được phát hiện là có hoạt tính mạnh nhất với NO ở IC50 = 4,6 µm, các hợp chất 34, 35 và 37 cho các giá trị IC50 lần lượt là 12,7, 14,9 và 19,1 µm. Hợp chất 38 ức chế PGE2 với IC50 = 49,6 µm trong khi không có hoạt tính với TNF-α với IC50 > 100 µm. Cơ chế tác dụng của orbol đã được xác định là ức chế enzym iNOs và sự biểu hiện của COX-2 mRNA. 1.3.3 Hoạt tính kháng nấm của các ancaloit khung steroit Các hợp chất ancaloit khung steroit (18-25) được phân lập từ lá cây Eclipta alba ở Suriname đã được thử nghiệm với bốn chủng vi nấm Saccharomyces cerevisiae và một chủng vi nấm Candida albicans [2]. Các hợp chất 19-21 và 25 có hoạt tính kháng nấm mạnh nhất. Hợp chất 25 có khả năng kháng nấm Candida albicans và giá trị MIC của hợp chất này (< 3,1 g/ml) chỉ hơi yếu hơn các thuốc kháng nấm đang được sử dụng lâm sàng là amphotericin B và ketoconazole. Các chất còn lại có khả năng yếu chống tế bào độc hại M-109. Các hợp chất này được xác định là có hoạt tính chủ yếu là kháng nấm do thử nghiệm hoạt tính gây độc dòng tế bào M-109 của tất cả các hợp chất này đều cho giá trị IC50 > 10 g/ml. 1.3.4 Hoạt tính chống tăng sinh của các tritecpenoit Phần chiết metanol phần trên mặt đất của Eclipta prostrata đã được phân lập theo định hướng hoạt tính chống tăng sinh của các tế bào HS (Hepatic Stellate) in vitro [5]. Các tế bào HS được biết đến là có vai trò chìa khóa trong sự phát sinh bệnh xơ hóa. Năm oleanan tritecpenoit, axit echinocystic (29) và các dẫn xuất glycozit của 29, eclalbasaponin I (30), eclalbasaponin II (31), eclalbasaponin III (32) và eclalbasaponin V (33) đã được phân lập. Axit echinocystic và 17 eclalbasaponin II đã được phát hiện là có khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh của các tế bào HS. Nghiên cứu đã cho thấy nhóm axit cacboxylic tự do ở vị trí C-28 của các dẫn xuất glycozit của axit echinocystic đối với hoạt tính chống u xơ. Trên cơ sở nghiên cứu này hoạt tính chống u xơ của Eclipta prostrata và các tritecpenoit thành phần có thể cho giả thiết về triển vọng điều trị sự u xơ gan. 18 Chƣơng 2: NHIỆM VỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nhiệm vụ của luận văn Đối tượng nghiên cứu hóa học của Luận văn này là phần trên mặt đất cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae), một cây thuốc phổ biến trong y học cổ truyền Việt Nam và trên thế giới. Mặc dù đã có một số nghiên cứu được công bố trên thế giới về các hợp chất hữu cơ từ cây Eclipta prostrata cho đến này chưa có các nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa học cây thuốc này của Việt Nam, đặc biệt là về các hợp chất phân cực. Tiếp tục các hướng nghiên cứu hóa thực vật của thế giới về E. prostrata, Luận văn này đặt mục tiêu nghiên cứu các qui trình phân tách sắc ký đặc biệt là đối với các hợp chất phân cực, phân lập các hợp chất thành phần và xác định cấu trúc của chúng bằng các phương pháp phổ. Các nhiệm vụ được đưa ra trong Luận văn này là: - Xây dựng quy trình chiết các hợp chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae); - Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết để định tính các phần chiết và xác định các hệ dung môi sắc ký điều chế thích hợp với chất hấp phụ silica gel; - Phân tách sắc ký và phân lập các hợp chất thành phần chính đặc biệt là các hợp chất phân cực bằng các phương pháp sắc ký điều chế; - Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất được phân lập bằng phương pháp phổ. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Các phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất Sắc kí lớp mỏng (TLC) Sắc kí lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các hỗn hợp chất, định hướng phân tách sắc ký, kiểm tra các quá trình phân tách và phân lập sắc ký, đặc trưng các hợp chất (TLC so sánh và co-TLC) và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất được phân lập. Sắc kí cột thường (CC) 19 Sắc kí cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi và được sử dụng để phân tách các phần chiết phân lập các hợp chất thiên nhiên. Sắc ký cột CC được thực hiện trên silica gel theo cơ chế sắc kí hấp phụ. Sắc kí cột (CC) gradient trên nhựa polyme pha đảo có kích thước lỗ cao Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals, Nhật Bản) theo cơ chế sắc ký phân bố được sử dụng để phân tách sơ bộ các hợp chất phân cực trong phần chiết nước. Sắc ký cột nhanh (FC) Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp lực không khí nén trên silica gel theo cơ chế sắc kí hấp phụ. Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được sử dụng để tinh chế các hợp chất hữu cơ. Chất hấp phụ là silica gel có kích thước hạt nhỏ. Chiết pha rắn trên pha đảo (RP-SPE) Chiết pha rắn trên pha đảo (RP-SPE) được sử dụng để tinh chế các hợp chất phân cực. Chiết pha rắn trên pha đảo là quá trình chuyển chất tan (chất cần phân tích) từ pha lỏng sang pha rắn. Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu, làm giàu và làm sạch mẫu phân tích. Pha rắn là loại chất hấp phụ kỵ nước kiểu silica biến cải (C-18) có kích thước 40 µm với đường kính lỗ xấp xỉ 60 Ao liên kết với nhóm octadecylsilan, pha động là dung môi phân cực thường là MeOH-H2O. Sắc ký cột loại trừ theo kích thước (SEC) Sắc ký cột loại trừ theo kích thước được thực hiện theo chế độ CC dưới trọng lực của dung môi với chất hấp phụ cho sắc ký là Sephadex LH-20 (cỡ hạt 25-100 µm). Sắc kí cột loại trừ theo kích thước phân tử được sử dụng để tinh chế các hợp chất phenolic. Phương pháp kết tinh Phương pháp kết tinh để phân lập và tinh chế các chất rắn. 2.2.2. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc Cấu trúc của hợp chất được phân lập được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp phổ. Phổ khố lượng (MS) cho các thông tin để xác định được khối lượng phân tử và các con đường phân mảnh. Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) vị trí của các tín hiệu NMR (nghĩa là các tần số cộng hưởng) được gọi là độ 20 chuyển dịch hóa học . Các giá trị của độ chuyển dịch hóa học H và C trên các phổ 1 H-NMR và 13C-NMR cho các thông tin về các phần cấu trúc và các nhóm chức có trong các phân tử được nghiên cứu. Các hằng số tương tác giữa các proton cho phép nhận biết các proton liên kết với nhau từ đó có thể xây dựng được các phần của phân tử. Phổ DEPT cho tính bội của các nguyên tử cacbon. Các kỹ thuật phổ được sử dụng trong Luận văn: Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT. 21