Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (Cylas formicarius)

  • Số trang: 71 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 77 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ XUÂN THAO NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ KHOAI LANG CHUYỂN GEN CRY3 KHÁNG SÂU NON BỌ HÀ (Cylas formicarius) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ XUÂN THAO NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ KHOAI LANG CHUYỂN GEN CRY3 KHÁNG SÂU NON BỌ HÀ (Cylas formicarius) Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 40 42 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Phạm Bích Ngọc Hà Nội - 2012 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................ I DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................II BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... III MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................... 2 3. Nội dung của đề tài........................................................................................... 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. Vai trò và giá trị của cây khoai lang .............................................................. 3 1.1.1. Sơ lƣợc về cây khoai lang ....................................................................... 3 1.1.2. Giá trị dinh dƣỡng và giá trị kinh tế cây khoai lang ................................. 3 1.2. Bọ hà hại khoai lang (Cylas formicarius)....................................................... 7 1.2.1. Đặc điểm sinh học của bọ hà hại khoai lang ............................................ 7 1.2.2. Tập tính sống và gây hại của bọ hà .......................................................... 8 1.3. Kỹ thuật chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogens và ứng dụng ......... 9 1.3.1. Giới thiệu vi khuẩn A. rhizogens ............................................................. 9 1.3.2. Hệ vector nhị thể ................................................................................... 11 1.3.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ ........................................................................ 13 1.3.4. Yếu tố ảnh hƣởng lên quá trình chuyển gen nhờ Agrobacterium ........... 17 1.4. Gen có hoạt tính gây độc ở Bacillus thuringiensis (Bt) ................................ 18 1.4.1. Sơ lƣợc về Bt ........................................................................................ 18 1.4.2. Phân loại gen mã hoá độc tố của Bt ....................................................... 20 1.4.2.1 Các gen nội độc tố cry...................................................................... 20 1.4.2.2. Các gen ngoại độc tố khác ............................................................... 21 1.4.3. Cấu trúc và cơ chế tác động của protein cry gây độc cho côn trùng ....... 23 1.4.4. Một số thành tựu tạo cây khoai lang chuyển gen ................................... 25 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 27 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ........................................................................ 27 2.1.1. Vật liệu ................................................................................................. 27 2.1.2. Hóa chất ................................................................................................ 27 2.1.3. Thiết bị.................................................................................................. 27 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 28 2.2.1. Chuyển gen thông qua Agrobacterium .................................................. 28 2.2.1.1. Tạo dịch huyền phù Agrobacterium ................................................ 28 2.2.1.2. Nhiễm vi khuẩn với mảnh lá ........................................................... 28 2.2.2. Đánh giá cây trồng chuyển gen qua biểu hiện tạm thời của gen gus....... 29 2.2.3. Tách, tinh sạch DNA tổng số ................................................................. 29 2.2.4. Kiểm tra gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR ............................................. 29 2.2.5. Điện di sản phẩm PCR trên agarose, nhuộm Ethidium Bromide và đọc kết quả trên máy soi gel .................................................................................. 31 2.3. Tách protein tổng số thực vật....................................................................... 32 2.4. Xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford............................ 32 2.5. Xác định hoạt lực diệt côn trùng của protein lên sâu non bọ hà.................... 33 2.5.1. Nuôi sâu non bọ hà................................................................................ 33 2.5.2. Thức ăn nhân tạo cho sâu non bọ hà ...................................................... 34 2.5.3. Đánh giá hoạt lực của protein lên sâu non bọ hà .................................... 34 2.6. Phƣơng pháp sử lý số liệu............................................................................ 34 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 35 3.1. Kết quả phân tích biểu hiện tạm thời của gen gus ........................................ 35 3.1.2. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp ............ 36 3.1.3. Ảnh hƣởng của mật độ tế bào vi khuẩn đến khả năng biến nạp .............. 37 3.1.4. Ảnh hƣởng của chất cảm ứng (AS) đến khả năng biến nạp .................... 39 3.2. Kết quả chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogens .. 41 3.2.1. Sơ bộ đánh kết quả chuyển gen thông qua A. rhizogens mang vector pIBT/cry3 ....................................................................................................... 42 3.2.2. Kết quả tinh sạch DNA khoai lang tổng số ............................................ 45 3.2.3. Kết quả chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua A. rhizogens ........... 45 3.3. Kết quả tách protein tổng số ........................................................................ 48 3.4. Kết quả kiểm tra hoạt lực diệt côn trùng của protein biến nạp...................... 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 52 Kết Luận ............................................................................................................ 52 Kiến nghị ........................................................................................................... 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 53 PHỤ LỤC.............................................................................................................. 62 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tình hình sản xuất khoai lang trong nƣớc theo địa phƣơng ......... 6 Bảng 1.2. Phân loại độc tố cry .................................................................. 21 Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR ....................................................... 30 Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ............................................... 31 Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian lây nhiễm đến khả năng biến nạp ...... 36 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp ...... 37 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng mật độ tế bào vi khuẩn đến khả năng biến nạp ....... 38 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng nồng độ chất cẩm ứng AS đến khả năng biến nạp .. 40 Bảng 3.5. Hàm lƣợng protein trong các dòng KB1 ................................... 48 Bảng 3.6. Hoạt lực diệt côn trung của protein lên sâu non bọ hà ............... 49 i DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Bọ hà trƣởng thành .................................................................. 7 Hình 1.2. Cấu trúc plasmid Ri của A. rhizogenes ................................... 11 Hình 1.3. Hình ảnh tạo khối u gây ra do A. tumefaciens và rễ tơ do A. rhizogenes ............................................................................................. 13 Hình 1.4. Nuôi cấy rễ tơ G.glabra ......................................................... 15 Hình 1.5. Một số ứng dụng của rễ tơ ..................................................... 17 Hình 1.6. Bào tử và tinh thể độc ở Bacillus thuringiensis ...................... 19 Hình 1.7. Cấu trúc của độc tố Cry3A..................................................... 23 Hình 1.8. Mô hình hoạt động của protein Cry gây độc đối với côn trùng .............................................................................................................. 25 Hình 3.1. Kết quả biến nạp A. rhizogens mang vector pPTN289/Gus .... 39 Hình 3.2. Kết quả biến nạp A. rhizogens mang vector pPTN289/Gus .... 41 Hình 3.3. Rễ tơ ở các mô chuyển gen .................................................... 43 Hình 3.4. Kết quả biến nạp gen cry3 vào khoai lang KB1 ..................... 44 Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra tách DNA tổng số ............................ 45 Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR các dòng rễ khoai lang với cặp mồi cry3 .............................................................................................................. 46 Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR các dòng rễ khoai lang với cặp mồi virC .............................................................................................................. 47 Hình 3.8. Kết quả thử hoạt tính protein độc lên sâu non bọ hà ............... 51 ii BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A.rhizogenes Agrobacterium rhizogenes ATCC American Type Culture Collection Bt Bacillus thuringiensis Cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid Gus β-glucuronidase Km Kanamycin MS Murashige and Skoog OD Optical Density PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction Ri plasmid Root inducing plasmid TL – DNA T Left - DNA TR – DNA T Right - DNA WPM Woody Plant Medium X-Gluc -D-glucuronide Cyclohexylamine iii MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Khoai lang (Ipomoea batatas) là cây lƣơng thực quan trọng ở vùng nhiệt đới và một số khu vực ôn đới bao gồm các vùng phía nam của châu Âu và châu Mỹ. Củ khoai lang tích lũy lƣợng tinh bột khá cao. Khoai lang giàu năng lƣợng, vitamin, cũng nhƣ hàm lƣợng protein từ 2% đến 10% khối lƣợng chất khô [73]. Bên cạnh đó khoai lang tím có polyphenol chứa anthocyamin có tác dụng kháng ôxy hoá rất mạnh, có khả năng kiềm chế đột biến các tế bào ung thƣ, hạ huyết áp, phòng ngừa bệnh tim mạch, có công năng làm đẹp, giàu chất xơ thực phẩm có tác dụng thông tiện, tác dụng tốt đối với những ngƣời mắc bệnh tiểu đƣờng. Cây khoai lang có sắc tố có thể bào chế chất nhuộm màu thực phẩm thiên nhiên thay sắc tố tổng hợp nhân tạo. Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc đã đánh giá khoai lang là thực phẩm bổ dƣỡng tốt của thế kỷ 21, đang đƣợc thị trƣờng thế giới rất ƣa chuộng. Ở nƣớc ta, khoai lang là cây trồng chiếm một vị trí quan trọng trong sản xuất lƣơng thực, đứng thứ 3 sau lúa và ngô. Với ƣu thế tạo ra sinh khối lớn trong thời gian ngắn và các bộ phận của cây đều đƣợc sử dụng, cây khoai lang đã và đang đƣợc chú ý thâm canh. Tổng diện tích trồng khoai lang cả nƣớc là 150 800 ha, đạt sản lƣợng 1 317 200 tấn (Tổng cục thống kê, 2010). Năng suất khoai lang bình quân ở nƣớc ta là 8,73 tấn/ha, thấp hơn so với năng suất bình quân của các quốc gia ở châu Mỹ và một số nƣớc châu Á. Năng suất thấp ngoài các nguyên nhân về giống khoai lang địa phƣơng đã thoái hóa, việc canh tác khoai lang chƣa thực hiện đúng quy trình kỹ thuật... thì nguyên nhân chủ yếu là do tổn thất vì sâu bệnh , đă ̣c biê ̣t là do bọ hà hại khoai. Ở Việt Nam, các vùng khô hạn miền núi phía Bắc, các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên củ khoai lang bị bọ hà gây hại rất nặng, nhất là trong các vụ hè thu tỷ lệ củ bị hại có thể lên đến 30 – 50%, thậm chí lên đến 100% [18]. Thiệt hại chủ yếu xảy ra do sâu non bọ hà đục ăn thịt củ và thải phân ngay trong đƣờng đục làm cho củ khoai xuất hiện những vết thâm, mùi hắc và vị đắng khi ăn. Hiện nay, đã có nhiều biện pháp để phòng trừ bọ hà khoai lang nhƣ sƣ̉ du ̣ng các biện pháp trừ sâu hóa học ; Biện pháp sƣ̉ du ̣ng chấ t dẫn du ̣ sinh học ; Biện pháp 1 canh tác; Sử dụng kẻ thù tự nhiên; Hoặc sử dụng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau trong phòng trừ bọ hà… Tuy nhiên các phƣơng pháp trên đang gặp phải một số vấn đề nhƣ an toàn sinh học, thủ công nên mất nhiều thời gian và nhân công, khó đáp ứng cho nhu cầu sản xuất trên quy mô lớn ở các vùng chuyên canh và cơ giới hóa trong sản xuất. Ngày nay cùng với sự phát triển của Công nghệ sinh học, đặc biệt là Công nghệ chuyển gen đã mở ra nhiều hƣớng đi mới đầy tiềm năng trong phòng trừ sâu bệnh cho cây trồng nói chung và phòng trừ bọ hà cho khoai lang nói riêng. Phƣơng pháp này sẽ giải quyết triệt để các hạn chế của các phƣơng pháp truyền thố ng. Việc chuyển gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoai lang thông qua hệ thống chuyển gen ở thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium đang là hƣớng đi mới. Tuy nhiên, cho tới nay, tạo cây khoai lang chuyển gen gặp nhiều khó khăn. Do vậy tối ƣu hóa quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium, cũng nhƣ thử nghiệm hoạt động của cấu trúc gen biến nạp thông qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ là rất cần thiết. Với mục đích làm cơ sở cho việc nghiên cứu tạo giống khoai lang kháng bọ hà, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phƣơng pháp khả thi, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ―Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (Cylas formicarius)‖ 2. Mục tiêu của đề tài - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen vào khoai lang thông qua vi khuẩn Agrobacterium. - Tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen mang gen cry3 thông qua Agrobacterium rhizogens sử dụng làm mô hình đánh giá hoạt động cấu trúc của gen chuyển. 3. Nội dung của đề tài - Tối ƣu một số yếu tố trong quy trình chuyển gen vào khoai lang KB1 nhờ vi khuẩn A.rhizogens thông qua biểu hiện của gen gus. - Chuyển gen cry3 vào khoai lang KB1 thông qua vi khuẩn A. rhizogens và kiểm tra biểu hiện của cấu trúc gen chuyển trong các dòng rễ tơ. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vai trò và giá trị của cây khoai lang 1.1.1. Sơ lược về cây khoai lang Khoai lang (Ipomoea batatas), là cây hai lá mầm, thuộc chi khoai lang (Ipomoea), họ bìm bìm (Convolvulaceae), bộ cà (Solanales). Khoai lang trồng ở vùng nhiệt đới cây thân thảo sống lâu năm, trồng ở vùng ôn đới, thƣờng có dạng bụi. Lá hình tim, nguyên hay có khía. Hoa trắng, vàng hay tím, hình phễu. Củ hình thoi do rễ phồng lên, chứa tinh bột và đƣờng, vỏ củ màu trắng, vàng hay đỏ tím, thịt củ trắng, vàng hay tím nhạt tùy theo giống. Chúng là cây giao phấn, ngày ngắn, không ra hoa khi ngày dài quá 13 giờ 30 phút, do đó ít khi ra hoa ở những vùng có vĩ độ ôn đới trên 30 độ Bắc hay Nam. Ở vùng nhiệt đới, dễ ra hoa, có hạt, có sức sống, nhƣng thƣờng chỉ trồng bằng các đoạn dây gọi là hom, trong trƣờng hợp gây giống có thể trồng bằng mầm nẩy từ củ. Khoai lang là cây lục bội thể (hexaploid 2n = 6x = 90), nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới châu Mỹ, đƣợc con ngƣời trồng cách đây trên 5000 năm, lan truyền rất sớm sang các quần đảo Thái Bình Dƣơng và từ đó sang các nƣớc Châu Á, đƣợc C.Colombo đƣa về Châu Âu và ngƣời Bồ Đào Nha đƣa sang Châu Phi. Hiện nay, khoai lang đƣợc trồng ở khắp các vùng nhiệt đới và một số vùng cận nhiệt đới, ôn đới [16]. 1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cây khoai lang Về giá trị dinh dƣỡng, trong 100g củ khoai lang tƣơi trung bình có 68g nƣớc; 0,8g protein; 0,2g lipid; 28,5g glucid (24,5g tinh bột, 4g glucoza) và 1,3g cellulose, có thể cung cấp cho cơ thể khoảng 122 calo. Ngoài ra trong khoai lang tƣơi còn có nhiều vitamin và muối khoáng (34mg canxi, 49,4mg photpho, 1mg sắt, 0,3mg caroten, 0,05mg vitamin B1, 0,05mg vitamin B2, 0,6mg vitamin PP, 23mg vitamin C...). Tuy nhiên hàm lƣợng nƣớc và chất khô phụ thuộc vào các yếu tố nhƣ giống, nơi trồng, khí hậu, độ dài ngày, loại đất, kỹ thuật trồng trọt. Khi phơi khô rút gần hết nƣớc, giá trị dinh dƣỡng của khoai còn cao hơn. Trong 100g khoai lang khô có 3 11g nƣớc, 2,2g protein, 0,5g lipid, 80g glucid, 3,6g cellulose, nhiều loại vitamin và muối khoáng. Trong 100g rau khoai lang có 91,9g nƣớc, 2,6g protein, 2,8g glucid, 1,4g cellulose canxi, 54mg PP, 11mg vitamin C ... [73]. Khoai lang đƣợc xem nhƣ nguồn cung cấp năng lƣợng là chủ yếu, nó cho năng lƣợng 113Cal/100g cao hơn ở khoai tây là 75Cal/100g [12]. Ở các nƣớc trồng khoai lang trên thế giới, khoai lang đƣợc sử dụng rộng rãi với mục đích làm lƣơng thực, thực phẩm, cung cấp rau cho ngƣời, chế biến thành nhiều sản phẩm khác nhau. Tinh bột khoai lang đƣợc sử dụng chế biến thành sản phẩm tinh bột biến tính, các sản phẩm lên men thuỷ phần đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, dệt, giấy, vật liệu xây dựng, cao su nhân tạo... là nguyên liệu lý tƣởng để sản xuất thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học có giá thành cạnh tranh, thân thiện với môi trƣờng, góp phần phát triển năng lƣợng tái tạo thay thế năng lƣợng hoá thạch. Ngoài ra, khoai lang còn là vị thuốc có tác dụng nhuận tràng, bổ tì vị [9]. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lƣơng Thực và Nông Nghiệp của Liên Hợp Quốc, trên thế giới 77% khoai lang sử dụng làm lƣơng thực, 13% làm thức ăn gia súc, 3% làm nguyên liệu chế biến thành nhiều sản phẩm khác nhau [9], [12]. Phần loại bỏ đi rất ít chiếm 6%, phần thân lá ngọn vừa đƣợc sử dụng làm rau xanh cho con ngƣời đồng thời là nguồn thức ăn tốt cho chăn nuôi gia súc. Tuy nhiên việc sử dụng khoai lang nhiều vào mục đích nào phụ thuộc vào trình độ phát triển của các nƣớc trồng. Ở các nƣớc phát triển lƣợng khoai lang củ đƣợc sử dụng làm lƣơng thực chiếm 55%, trong khi đó sử dụng làm nguyên liệu chế biến tăng đến 25% [87]. Ở Việt Nam từ xƣa nông dân đã có truyền thống sử dụng khoai lang làm lƣơng thực thực phẩm và thức ăn gia súc. Tuy nhiên 90% sản phẩm khoai lang sử dụng chủ yếu ở vùng nông thôn, trong đó 60% sản lƣợng khoai lang đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc dƣới dạng củ tƣơi. [12], [10]. Do giá trị dinh dƣỡng cao, thuận tiện trong chế biến với nhiều mục đích khác nhau, ngày nay cây khoai lang ngày càng khẳng định giá trị của mình trong nền kinh tế. Cho đến nay khoai lang đƣợc trồng phổ biến trên cả nƣớc (Bảng 1.1). Tuy nhiên do có những hạn 4 chế về năng suất, bảo quản chế biến sau thu hoạch nên những năm gần đây diện tích trồng giảm, năng suất thấp và chƣa ổn định. 5 Bảng 1.1. Tình hình sản xuất khoai lang trong nƣớc theo địa phƣơng Sản lƣợng (1000 tấn) Diện tích (1000ha) Năng suất (tạ/ha) Vùng 2006 2007 2008 2009 2010 2006 2007 2008 2009 2010 2006 Cả nƣớc 181,2 175,5 162,6 146,4 150,8 1460,9 1437,6 1325,6 1207,6 1317,2 80,6 81,9 81,5 82,5 87,3 Đồng bằng sông Hồng 39,0 36,5 32,3 22,8 27,0 327,2 327,6 291,8 194,7 247,0 89,0 89,8 90,3 85,4 91,5 44,7 44,2 41,4 38,2 39,0 278,3 285,1 267,5 238,2 256,2 62,3 64,5 64,6 62,4 65,7 69,8 66,7 61,1 55,1 54,0 426,3 407,6 374,7 328,9 341,0 61,1 61,1 61,3 59,7 63,1 Tây Nguyên 12,3 12,3 13,0 14,1 14,0 125,0 125,2 131,1 151,0 150,7 101,6 101,8 100,8 107,1 107,6 Đông Nam Bộ 2,0 2,0 2,1 2,5 2,0 12,6 12,6 17,4 20,7 15,8 63,0 63,0 82,9 82,8 79,0 13,4 13,8 12,7 13,7 14,8 271,5 279,5 243,1 274,1 306,5 202,6 202,5 191,4 200,1 207,1 2007 2008 2009 2010 Trung du và miền núi phía Bắc Bắc trung bộ và duyên hải miền Trung Đồng bằng song Cửu Long Nguồn: Tổng cục thống kê 6 1.2. Bọ hà hại khoai lang (Cylas formicarius) 1.2.1. Đặc điểm sinh học của bọ hà hại khoai lang Bọ hà khoai lang, Cylas formicarius, thuộc chi Ipomea, có nguồn gốc từ Indonesia, và đƣợc mô tả bởi Fabricius vào năm 1798 [90]. Về hình thái bên ngoài, bọ hà trƣởng thành mình thon, chân dài, trông tựa nhƣ kiến, nhƣng phân biệt nhờ có cái ‗‗vòi dài―. Đầu đen, mắt kép hình bán cầu hơi lồi ra hai bên đầu. Râu đầu 10 đốt. Ngực, đốt cuối râu và mắt màu đỏ. Bụng và cánh màu xanh đen bóng. Đốt cuối râu bọ đực trƣởng thành hình ống dài, của con cái có hình trứng. Ngực trƣớc có chiều dài gấp đôi chiều rộng, đốt đùi nở to. Bọ hà trƣởng thành dài 6-8,5mm [52]. Hình 1.1. Bọ hà trƣởng thành (nguồn: http://www.caripestnetwork.org/photogallery/?level=picture&id=165) Tuỳ thuộc vào điều kiện nhiệt độ mà vòng đời của bọ hà có thể kéo dài từ 4-6 tuần, trung bình mỗi con cái đẻ khoảng 200-250 trứng. Trứng bọ hà có màu trắng đục, mềm, hình bầu dục, kích thƣớc 0,70,5mm, thƣờng đƣợc đẻ đơn độc trong những hố nhỏ do bọ hà cái đục trên bề mặt dây gốc hoặc củ khoai. Pha trứng kéo dài từ 5-8 ngày. Sau khi nở ra, sâu non đục ngay vào trong dây hoặc củ khoai. Sâu non khi nở ra có màu trắng, cơ thể có 7 kích thƣớc 6mm1,6mm. Ở điều kiện nhiệt độ 300C thời gian phát dục của sâu non bọ hà là 15-20 ngày [19], [90]. Nhộng có kích thƣớc 5,0  1,6mm, lúc đầu màu trắng, sau chuyển dần sang màu nâu. Thời gian phát dục của pha nhộng là 5-7 ngày. Sau khi vũ hoá, bọ hà trƣởng thành nằm trong đƣờng đục 6-9 ngày. Trong thời gian đó màu sắc cơ thể bọ hà biến đổi dần từ trắng ngà sang nâu, cuối cùng có màu xanh đen đặc trƣng của loài, bọ hà có thể cho từ 5-8 thế hệ trong mộ năm. Khi bọ hà trƣởng thành chui ra khỏi củ khoai, ăn thêm và tiến hành giao phối. Sau 2-3 ngày bọ hà trƣởng thành bắt đầu đẻ trứng. Thời gian sống của bọ hà trƣởng thành có thể kéo dài từ 70-90 ngày [52]. 1.2.2. Tập tính sống và gây hại của bọ hà Tập tính gây hại của bọ hà có những đặc thù riêng biệt so với các loài sâu hại khoai lang khác. Bọ hà trƣởng thành ăn phần biểu bì của lá, cuộng, dây và củ khoai khiến cho cây héo và chết. Nhƣng điều này ít khi xảy ra nên không ảnh hƣởng gì đến sản lƣợng củ. Thiệt hại chủ yếu xảy ra do sâu non bọ hà đục ăn thịt củ và thải phân ngay trong đƣờng đục. Những củ khoai bị bọ hà gây hại, dù chỉ ở một phần nhỏ cũng thấy xuất hiện những vết thâm, mùi hắc và vị đắng khó chịu. Để phản ứng lại sự gây hại của bọ hà, củ khoai sinh ra chất độc có mùi đặc biệt. Chất độc này có thể gây hại đối với phổi và tim của ngƣời và gia súc khi ăn củ bị hà. Bọ hà trƣởng thành có thể hoạt động cả ban ngày và ban đêm, tuy nhiên mọi hoạt động diễn ra mạnh mẽ nhất vào lúc chiều tối. Do ƣa ánh sáng tán xạ nên những ruộng khoai tốt, dây lá um tùm thƣờng bị phá hoại nặng hơn những ruộng cây thƣa dây lá. Bọ hà trƣởng thành có thể bay rất xa, nhƣng chúng hiếm khi bay, sự lây lan của chúng từ vùng này sang vùng khác chủ yếu là do con ngƣời. Bọ hà xâm nhập và đẻ trứng vào củ khoai qua các kẽ nứt của đất, vì vậy vùng khô hạn, tỷ lệ gây hại của bọ hà thƣờng cao hơn so với những vùng đất ẩm thấp [15]. Theo nghiên cứu của nhiều tác giả, bọ hà khoai lang có một vài kí chủ cùng họ với khoai lang, ví dụ nhƣ cây Ipomoea aquatica còn gọi là cây rau muống. Các cây này có thể là nơi trú ngụ của bọ hà giữa các vụ trồng và là nguồn lây nhiễm bọ hà khi cây khoai lang mới đƣợc trồng [42]. 8 1.3. Kỹ thuật chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogens và ứng dụng 1.3.1. Giới thiệu vi khuẩn A. rhizogens Agrobacterium là các loài vi khuẩn đất, thuộc vi khuẩn Gram âm, yếm khí, khi xâm nhập qua vết thƣơng, các loài vi khuẩn này gây ra các triệu chứng bệnh trên thực vật nhƣ tạo khối u hay lông rễ. Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium có 4 loài chính: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogens, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi. Trong đó A. tunefaciens và A. rhizogenes là hai loài đƣợc nghiên cứu nhiều nhất gây ra bệnh khối u (crown gall) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thƣơng của thực vật hai lá mầm (Hình 1.3). Agrobacterium rhizogenes (tên cũ Phytomonas rhizogenes) đƣợc định danh lần đầu tiên cách đây hơn 70 năm [77]. Tác nhân gây bệnh của hai loài vi khuẩn A. tumefaciens, A. rhizogenes đƣợc xác định là do sự có mặt của Ti (tumour inducing) ở A. tumefaciens và Ri (root-inducing) ở A. rhizogenes [29]. Khi tế bào thực vật bị thƣơng, sẽ tiết ra các polyphenol hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây nó chuyển đoạn T-DNA (Transfer DNA) từ T-plasmid hay R-plasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ. Nhìn chung, cơ chế của quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển TDNA vào tế bào vật chủ của hai loài vi khuẩn này đƣợc chính minh là tƣơng tự nhau [83]. Tuy nhiên, sự hình thành khối u ở vi khuẩn A. tumefaciens do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin quy định. Trong khi đó các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn A. rhizogenes có vai trò rất nhỏ trong quá trình hình thành rễ tơ ở thực vật [32], [83]. Giống nhƣ Ti-plasmid, Ri-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, có trọng lƣợng phân tử lớn, từ 200 - 800 kb, gồm hai vùng chính là T-DNA và vir (virulence). Dựa vào khả năng sinh tổng hợp các opine ở rễ tơ - nguồn cacbon và nitơ cho vi khuẩn. Ri-plasmid đƣợc chia làm hai nhóm chính: agropine (đại diện là plasmids pRiA4, pRi1855, pRiHRI, pRi15834, pRiLBA9402) 9 và mannopine (đại điện plasmid pRi8196), một số nhóm phụ đƣợc tìm thấy và phân loại sau này nhƣ: cucumopine và mikimopine. Mikimopine và cucumopine là các stereo-isomer, nhƣng không tìm thấy sự tƣơng đồng giữa các gen sinh tổng hợp opine ở mức độ nucleotide. Trong đó các chủng thuộc nhóm agropine (A4, 15834, LBA9402, 1855) đƣợc chứng minh là độc hơn so với các chủng thuộc nhóm mannopine (8196, TR7, TR101) và các chủng này đƣợc sử dụng chủ yếu trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật [17], [77], [83]. T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm hai vùng chính là vùng biên trái TL-DNA và biên phải TR-DNA. TL-DNA và TR-DNA đƣợc chuyển vào độc lập với bộ gen của tế bào chủ thực vật, trong khi quá trình chuyển TL-DNA lại cần thiết cho sự cảm ứng hiện tƣơng tạo rễ tơ, quá trình chuyển TR-DNA không gây ra sự hình thành rễ tơ từ mẫu nuôi cấy chuyển gen [60], [80]. Hai vùng này đều có kích thƣớc khoảng 15 - 20 kb và đƣợc xen kẽ bởi một đoạn DNA, đoạn DNA xen kẽ không đƣợc chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ. Vùng TR-DNA mang các gen mã hóa tổng hợp DNA (tms1 và tms2), vùng T LDNA bao gồm 18 khung đọc mở (ORFs) trong đó có bốn locus 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rol A, B, C và D (root locus). Các Ri-plasmid của các chủng A. rhizogenes thuộc nhóm mannopine, cucumopine và mikimopine chứa vùng TDNA đơn, có cấu trúc giống nhƣ vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm agropine nhƣng khuyết gen rolD [26], [32]. TR-DNA chứa các gen tƣơng đồng cao đối với T-DNA của Ti plasmid ở A. tumefaciens Các gen rolA, rolB và rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của ba gen này gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Các rễ tơ đặc điểm sinh trƣởng, phân nhánh mạnh và phát triển nhanh hơn rất nhiều so với rễ bình thƣờng [79]. Trong 3 gen rol trên, gen rolB đóng vai trò quan trọng hơn cả, thậm chí khi một mình gen rolB đƣợc biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ, ngƣợc lại khi bất hoạt gen rolB mô thực vật không tạo kiểu hình rễ tơ [26]. 10 Hình 1.2. Cấu trúc plasmid Ri của A. rhizogenes [70] 1.3.2. Hệ vector nhị thể Kích thƣớc quá lớn của Ri-plasmid và Ti-plasmid (200 đến 800kb) gây nhiều khó khăn trong quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium và trong các thao tác sử dụng để thiết kế gen vào các vector này. Mặt khác các enzyme giới hạn có thể cắt DNA của Ti-plasmid ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi công nghệ gen lại cần những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzyme giới hạn. Thêm vào đó, ở A.tumefaciens, một số gen mã hóa sinh tổng hợp auxin đƣợc sử dụng làm chỉ thị chọn lọc có tính trội nhƣng lại cản trở quá trình tái sinh bình thƣờng ở thực vật. Với các lí do trên đây, các nhà khoa học đã cải tiến Tiplasmid thành một hệ vector nhị thể gồm có vector chuyển gen (mang cấu trúc 11 T-DNA) và vector bổ trợ (mang các gen vir) đảm nhiệm chức năng vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật [15]. - Vector chuyển gen: Có cấu trúc từ Ti-plasmid với đoạn T-DNA đƣợc cắt bỏ hết các gen không cần thiết nhƣ gen onc và gen tổng hợp opine ở giữa hai trình tự biên trái (T-border left) và biên phải (T-border right), gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới gồm: + Các replicon để DNA plasmit có thể vừa tự nhân trong cả E. coli và Agrobacterium; + Các gen chọn lọc: Do không phải toàn bộ các tế bào và các mẫu chuyển gen đều mang gen chuyển nên nhất thiết phải tiến hành sàng lọc các tế bào chuyển gen. Dựa vào các gen chọn lọc đƣợc thiết kế trong vector chuyển gen mà ngƣời ta sử dụng các kháng sinh phù hợp để thu đƣợc các tế bào, mẫu mang gen chuyển. Gen chọn lọc điển hình là các gen mã hóa cho các loại enzyme có khả năng khử độc đối với kháng sinh nhƣ kanamycine (nptII), hygromycine (hyg), gentamycine (gent),… hoặc chất diệt cỏ glyphosate hay basta (bar),… Chỉ những tế bào mang gen biến nạp có thể sống sót trên môi trƣờng chứa chất kháng sinh hoặc chất diệt cỏ [3]. Các loại vector này đã đƣợc ứng dụng và mang lại thành công trong việc chọn lọc nhiều đối tƣợng cây trồng chuyển gen nhƣ cây đu đủ, cây hồng, cây lúa, cây bông vải, cây thuốc lá, … [2], [6], [7], [14], [19]. + Gen đánh dấu: Có thể nhuộm hóa tế bào để khẳng định sự của mặt của sản phẩm thông qua gen chỉ thị đƣợc sử dụng phổ biến trong chuyển gen thực vật là gen gus hay gen uidA. Gen gus nằm ở locus uid của vi khuẩn E. coli và mã hóa cho enzyme β-glucuronidase. Đây là một enzyme hydrolase có khả năng phân hủy các hợp chất có gốc β- glucuronide tạo thành chất trung gian, khi chất này bị oxi hóa sẽ có màu xanh đậm đặc trƣng. Do đó, enzyme này đƣợc xác định rất dễ dàng và thuận tiện bằng hợp chất indole- β-glucuronide. + Vùng đa hình các điểm cắt của các enzim giới hạn nằm ở giữa hai trình tự biên trái (T-border left) và biên phải để chèn gen mong muốn. 12 - Vector bổ trợ: cấu trúc gồm các gen vir đƣợc tách và đƣa vào chung một plasmit đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmit này đƣợc cải biến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, những vẫn duy khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật. Vector chuyển gen trong hệ vector nhị thể ở A. tumefaciens có thể sử dụng để chuyển gen thông qua A. rhizogenes. Khi nhiễm A. rhizogenes với thực vật sẽ làm chuyển T-DNA từ vector chuyển gen cùng với T-DNA của A. rhizogenes vào genome thực vật [9]. Sự tái sinh thành cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A. rhizogenes có thể xảy ra thông qua sự phát triển phôi soma hoặc sự phát sinh cơ quan từ rễ. Tuy nhiên, thực vật tái sinh từ lông rễ thƣờng bị biến đổi hình thái: lá bị gấp nếp, hệ thống rễ ăn nghiêng, sinh trƣởng cằn cỗi và khả năng sinh sản kém. Hình 1.3. Hình ảnh tạo khối u gây ra do A. tumefaciens (trái) và rễ tơ do A. rhizogenes (phải) 1.3.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ Tế bào thực vật nói chung và rễ tơ nói riêng với ƣu thế nuôi cấy dễ dàng, môi trƣờng nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng sản xuất một lƣợng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọng hơn cả tế bào thực vật không mang các mầm bệnh cho ngƣời, đƣợc xem là một trong những xu hƣớng hiện nay đƣợc 13
- Xem thêm -