Tài liệu Nghiên cứu tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gen ở nấm sợi aspergillus bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC -------------------- Trần Thị Phƣơng NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ VECTOR NHỊ THỂ DÙNG CHO CHUYỂN GENE Ở NẤM SỢI Aspergillus BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC -------------------- Trần Thị Phƣơng NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ VECTOR NHỊ THỂ DÙNG CHO CHUYỂN GENE Ở NẤM SỢI Aspergillus BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Trần Văn Tuấn TS. Trần Đức Long Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn Thạc sĩ của mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Văn Tuấn - Bộ môn Vi sinh vật học, Trƣởng Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, ngƣời đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn và luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Em cũng xin chân thành cảm ơn TS. Trần Đức Long đã nhiệt tình góp ý, cố vấn cho em trong suốt quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp. Em cũng vô cùng biết ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền học và Khoa Sinh học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức quý báu và giúp đỡ em trong quá trình học tập. Em cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và các thành viên Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và môi trƣờng làm việc để em có thể hoàn thành tốt nghiên cứu của mình. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn tới học viên cao học Đỗ Thị Bình Xuân Lộc đã nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình thực hiện các thí nghiệm. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và các em, các anh chị Phòng Genomic đã khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và trong cuộc sống. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 08 năm 2017 Học viên Trần Thị Phƣơng DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 5-FOA 5 - fluoroorotic acid A. awamori Aspergillus awamori A. nidulans Aspergillus nidulans A. niger Aspergillus niger A. oryzae Aspergillus oryzae A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (biến nạp trung gian/nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) bp base pair CD Czapek Dox DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid GRAS Generally Recognized As Safe (đƣợc công nhận là an toàn) HEPES 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid IM Induction medium (môi trƣờng cảm ứng) kb kilo base pairs LB Left border (biên trái)/ Luria Bertani (môi trƣờng LB) NST Nhiễm sắc thể OD Optical Density (mật độ quang) ORF Open reading frame (khung đọc mở) PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar PEG Polyethylen Glycol PSM Phytase-screening medium (môi trƣờng sàng lọc sinh phytase) RB Right border (biên phải) SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris-acetate-EDTA T-DNA Transfer DNA Ti plasmid Tumor inducing plasmid (plasmid cảm ứng tạo khối u) ura Uracil uri Uridine Vir Virulence region (vùng độc lực) WT Wild-type (chủng tự nhiên) MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3 1.1. Tổng quan về nấm sợi....................................................................................3 1.1.1. Đặc điểm sinh học ......................................................................................3 1.1.2. Vai trò của nấm sợi.....................................................................................5 1.1.3. Giới thiệu chung về chi nấm sợi Aspergillus .............................................5 1.2. Giới thiệu chung về Aspergillus oryzae ............................................................6 1.2.1 Phân loại và đặc điểm sinh học nấm sợi A. oryzae .....................................6 1.2.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae .................................................8 1.2.3. Vai trò của nấm sợi A. oryzae ....................................................................8 1.3. Giới thiệu chung về A. niger ...........................................................................10 1.3.1. Phân loại và đặc điểm sinh học nấm sợi A. niger.....................................10 1.3.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. niger .................................................12 1.3.3. Vai trò của nấm sợi A. niger.....................................................................12 1.4. Các phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi ....................................................14 1.4.1. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation) .........................................14 1.4.2. Chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast) ...........................................15 1.4.3. Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ......15 1.5. Hệ thống marker dùng cho chuyển gen ở nấm sợi .........................................25 1.5.1. Hệ thống marker chọn lọc các thể chuyển gen.........................................25 1.5.2. Hệ thống marker chỉ thị dùng trong chuyển gen ......................................28 1.6. Promoter biểu hiện gen ở nấm sợi ..................................................................30 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..........................................................33 2.1. Nguyên liệu .....................................................................................................33 2.1.1. Chủng vi sinh vật ......................................................................................33 2.1.2. Thiết bị và hóa chất ..................................................................................34 2.1.3. Các môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu ...............................................36 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................38 2.2.1. Thu bào tử nấm.........................................................................................39 2.2.2. Tách chiết DNAtổng số ............................................................................39 2.2.3. Thành phần của các phản ứng PCR..........................................................40 2.2.4. Xử lý enzyme giới hạn .............................................................................41 2.2.5. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen ...........................................43 2.2.6. Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .......................44 2.2.7. Sàng lọc các thể chuyển gen.....................................................................46 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................48 3.1. Lựa chọn chủng nấm dùng cho chuyển gen ...................................................48 3.1.1 Chủng nấm A. niger N402đƣợc lựa chọn để xóa gen ...............................48 3.1.2. Đặc điểm hình thái của chủng nấm A. oryzae VS1 và RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil ......................................................................................................49 3.2. Tạo thành công chủng N402 đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil .....................50 3.2.1. Tạo cấu trúc xóa gen pyrG .......................................................................51 3.2.2. Xóa thành công gen pyrG ở A. niger N402 ..............................................52 3.3. Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil.....58 3.3.1. Tạo vector pEX2A....................................................................................58 3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ uridine/ uracil đến sự phục hồi sinh trƣởng của chủng xóa gen pyrG ...........................................................................................59 3.3.3. Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil ............................................................................................................................61 3.3.4. Đánh giá hiệu quả chuyển gen huỳnh quang DsRed vào A. niger N402 trợ dƣỡng ..................................................................................................................64 3.4. Biểu hiện gen DsRed ở A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng vector pEX2A ...................................................................................................................65 3.4.1. Mức độ tƣơng đồng của gen pyrG ở chi Aspergillus ...............................65 3.4.2. Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi A. oryzae ...............................................66 3.5. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed dƣới sự kiểm soát của promoter glaA từ A. niger .......................................................................................................................72 3.5.1. Tạo vector pEX2C ....................................................................................72 3.5.2. Biểu hiện gen DsRed dƣới sự kiểm soát của promoter glaA thông qua vector pEX2C .....................................................................................................73 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................79 Kết luận ..................................................................................................................79 Kiến nghị................................................................................................................79 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................80 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các chủng vi sinh vật và các vector dùng trong nghiên cứu ....................33 Bảng 2.2. Các cặp mồi dùng cho nghiên cứu ............................................................35 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái của một số loài nấm mốc trên đĩa petri 3 Hình 1.2. Hình thái và cấu trúc hiển vi của A. oryzae 7 Hình 1.3. Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc hiển vi của nấm A. niger 11 Hình 1.4. Cấu trúc của Ti plasmid 17 Hình 1.5. Mô hình vi khuẩn A. tumefaciens với hệ thống vector nhị thể 20 Hình 1.6. Biểu hiện gen huỳnh quang GFP ở nấm sợi A. oryzae 29 Hình 1.7. Biểu hiện gen DsRed ở chủng nấm sợi A. oryzae AUT1-PlD 30 Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của chủng nấm A. niger 47 Hình 3.2. Hình thái và cấu trúc hiển vi của 2 chủng A. oryzae VS1 và 48 RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil Hình 3.3. Tạo cấu trúc xóa gen pyrG ở nấm Aspergillus niger 51 Hình 3.4. Kết quả PCR kiểm tra 3 khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector xóa 52 pyrG A1, A2, A3 Hình 3.5. Quy trình xóa gen pyrG ở nấm sợi A. niger sử dụng phƣơng 53 pháp ATMT Hình 3.6. Kết quả xóa gen trên môi trƣờng chọn lọc CD bổ sung 0,1% 53 uridine, 0,1% uracil và 0,2% 5-FOA Hình 3.7. Kiểm tra khả năng sinh trƣởng của chủng đột biến trên các môi trƣờng khác nhau 54 Hình 3.8. Xác nhận các chủng xóa gen pyrG 55 Hình 3.9. Sơ đồ tạo cấu trúc vector pEX2A 57 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của nồng độ uridine/uracil đến khả năng sinh 59 trƣởng của chủng đột biến xóa gen pyrG Hình 3.11. Kết quả tối ƣu quy trình chuyển gen vào chủng A. niger N402 61 trợ dƣỡng uridine/uracil Hình 3.12. Quy trình tối ƣu chuyển gen vào nấm A. niger N402 trợ dƣỡng 62 bằng vi khuẩn A. tumefaciens Hình 3.13. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed ở chủng A. niger N402 trợ 64 dƣỡng uridine/uracil Hình 3.14. Sự tƣơng đồng của pyrG giữa các loài Aspergillus khác nhau 65 Hình 3.15. Quy trình chuyển gen vào A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil 66 Hình 3.16. Kết quả chuyển gen DsRed vào A. oryzae chủng RIB40 và VS1 67 trợ dƣỡng uridine/uracil Hình 3.17. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed ở chủng RIB40 trợ dƣỡng 68 uridine/uracil Hình 3.18. Xác nhận chuyển gen DsRed vào A. oryzae VS1∆pyrG sử 69 dụng vector pEX2A Hình 3.19. Sơ đồ tạo cấu trúc vector pEX2C 72 Hình 3.20. Kết quả PCR kiểm tra 4 khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector 73 pEX2C theo thứ tự Ag1, Ag2, Ag3, Ag4 Hình 3.21. Kết quả chuyển gen DsRed sử dụng vector pEX2C vào A. niger 73 N402 và A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil Hình 3.22. Biểu hiện gen DsRed ở chủng nấm A. niger N402 trợ dƣỡng 75 uridine/uracil Hình 3.23. Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil 76 MỞ ĐẦU Aspergillus là chi nấm sợi phổ biến trong tự nhiên và có vai trò quan trọng trong sản xuất thực tiễn. Một số loài nấm thuộc chi này đã đƣợc Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn (Generally Regarded as Safe, GRAS) dùng trong sản xuất công nghiệp nhƣ A. oryzae, A. niger, A. awamori, A. sojae, … Trong đó, hai loài A. niger và A. oryzae với khả năng tiết mạnh enzyme vào môi trƣờng nuôi cấy nên đã đƣợc sử dụng nhƣ nhà máy tế bào để sản xuất nhiều loại enzyme thƣơng mại cả ở dạng tự nhiên và tái tổ hợp. Gần đây, hệ gen của A. niger và A. oryzae đã đƣợc giải trình tự hoàn toàn và là tiền đề cho cải biến di truyền nâng cao hiệu suất biểu hiện các gen mong muốn ở hai loài nấm này. Hiện nay, hai phƣơng pháp chuyển gen phổ biến ở nấm sợi là chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast) và chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Phƣơng pháp chuyển gen bằng tế bào trần là khá phức tạp với chi phí cao và hiệu quả không ổn định ở những lần lặp lại. Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT) lần đầu tiên đƣợc áp dụng thành công cho nấm sợi vào năm 1998 với nhiều ƣu điểm nhƣ dễ thực hiện, chi phí thấp và hiệu suất ổn định. Tuy nhiên, phƣơng pháp chuyển gen ATMT vẫn chủ yếu sử dụng các gen kháng kháng sinh nên khó áp dụng vào điều kiện sản xuất thực tế vì nguy cơ phát tán gen kháng thuốc vào môi trƣờng. Chính vì vậy, phát triển hệ thống chuyển gen sử dụng gen trợ dƣỡng (marker trợ dƣỡng) là hƣớng tiếp cận an toàn, hiệu quả về chi phí và có tiềm năng ứng dụng vào sản xuất thực tiễn. Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu quả cao cho nấm sợi Aspergillus sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens và marker trợ dƣỡng, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gene ở nấm sợi Aspergillus bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” với những nội dung chính nhƣ sau: 1 - Tạo chủng A. niger đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen pyrG. - Tạo một số vector nhị thể dùng để chuyển gen và biểu hiện gen ở cả hai loài nấm sợi A. niger và A. oryzae. - Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu cho nấm sợi A. niger sử dụng chủng trợ dƣỡng uridine/uracil và marker trợ dƣỡng pyrG. - Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen sử dụng gen chỉ thị huỳnh quang đỏ DsRed. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về nấm sợi 1.1.1. Đặc điểm sinh học Nấm sợi (nấm mốc) là những vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp sinh bào tử và sống hoại sinh nhờ khả năng tiết enzyme để phân hủy các hợp chất hữu cơ có trong môi trƣờng. Chúng phân bố rộng khắp trên trái đất và đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên cũng nhƣ trong đời sống của con ngƣời. Nấm thƣờng sinh trƣởng trên các bề mặt cơ chất tạo thành các dạng sợi nhƣ lông tơ, mạng nhện hoặc sợi bông đƣợc gọi là hệ sợi [23]. Hình 1.1. Hình thái của một số loài nấm mốc điển hình. (A) Aspergillus fumigatus. (B) Penicillium rubens. (C) Trichoderma sparsum. (D) Aspergillus flavus. (E) Aspergillus oryzae. (F) Aspergillus niger [41, 42, 45, 92, 100] Từ một bào tử nảy mầm, sợi nấm sẽ phát triển và phân nhánh hình thành nên khuẩn lạc nấm. Sợi nấm kéo dài theo hình thức sinh trƣởng ở đỉnh sợi và phân nhánh liên tục để tạo nên hệ sợi nấm (mycelium) xù xì nhƣ bông. Hệ sợi nấm cũng có thể phát triển từ một đoạn sợi nấm sinh dƣỡng. Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt. Tuy nhiên, ở một số loài, hệ sợi nấm tích lũy sắc tố khiến chúng có màu sắc đặc trƣng hoặc hệ sợi tiết ra sắc tố làm đổi màu khu vực nấm phát triển. Một số loài có hiện tƣợng tiết ra các hợp chất hữu cơ tạo nên những tinh thể trên bề mặt hệ sợi 3 [3]. Sợi nấm có cấu tạo đa bào, hình ống, đƣợc bao phủ bởi một lớp thành cứng, bên trong chứa nguyên sinh chất có khả năng di chuyển. Chiều dài của sợi nấm thƣờng không xác định, nhƣng đƣờng kính ống sợi tƣơng đối ổn định từ 2µm - 30µm, tùy thuộc vào loài và điều kiện sinh trƣởng. Trên đĩa petri, hệ sợi nấm lan tỏa ra xung quanh, phủ trên bề mặt thạch với tốc độ ổn định tạo nên các khuẩn lạc nấm dạng tròn, đồng thời ăn sâu vào trong cơ chất [35]. Phần lớn nấm sợi không cần ánh sáng trong quá trình sinh trƣởng. Tuy nhiên, ở một số loài, ánh sáng lại là yếu tố quan trọng trong quá trình hình thành bào tử. Nấm sợi có khoảng giới hạn nhiệt độ tƣơng đối rộng. Giới hạn dƣới của một số loài nấm sợi là từ 2oC - 5oC, giới hạn trên là từ 47oC - 53oC. Một số loài nấm có thể sống sót dƣới điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt ở 0oC và 60oC. Khoảng nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của nấm sợi là từ 22oC - 37oC. Nhìn chung, các loài nấm sợi có thể phát triển trong môi trƣờng axit. Một số loài phát triển tốt ở môi trƣờng pH nhỏ hơn 3, một số ít loài phát triển đƣợc ở điều kiện pH lớn hơn 9, nhƣng hầu hết các loài nấm sợi phát triển tốt nhất ở khoảng pH từ 5 - 6,5. Vì là nhóm sinh vật hiếu khí bắt buộc nên ôxi là yếu tố không thể thiếu trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của nấm sợi [23, 35]. Nấm sợi có hai hình thức sinh sản là sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính. Sinh sản vô tính bao gồm sinh sản sinh dƣỡng bằng đoạn sợi nấm và sinh sản bằng hình thành bào tử đính (conidia). Quá trình sinh sản hữu tính ở một số loài với sự tham gia của giao tử đực và giao tử cái trải qua ba giai đoạn gồm dung hợp nhân, dung hợp tế bào chất và quá trình giảm phân để hình thành bào tử đơn bội [3, 35]. Ngoài ra, ở một số loài nấm sợi còn có hình thức sinh sản cận hữu tính (parasexual). Năm 1956, hình thức sinh sản này lần đầu tiên đƣợc mô tả bởi nhà di truyền học ngƣời Ý Guido Pontecorvo trong các nghiên cứu về Aspergillus nidulans. Chu trình sinh sản cận hữu tính này đƣợc bắt đầu khi một nhân đơn bội dung hợp vào tế bào sinh dƣỡng của hệ sợi sau đó tiếp tục phân chia. Trong chu trình sinh sản cận hữu tính có thể xảy ra trao đổi chéo giữa các vùng tƣơng đồng trên nhiễm sắc thể (NST). 4 Đặc điểm này đƣợc sử dụng để lập bản đồ gen hoặc gắn thêm những gen mới vào trong các nhóm gen liên kết của loài [18]. 1.1.2. Vai trò của nấm sợi Nấm sợi có ý nghĩa quan trọng trong tự nhiên và đời sống của con ngƣời. Nhờ khả năng sinh trƣởng tốt trên cả những môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng và khả năng tổng hợp những hợp chất hữu cơ quan trọng, nấm sợi đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng sản xuất công nghiệp. Các sản phẩm tạo ra từ nấm sợi vô cùng phong phú, từ axit hữu cơ đến các enzyme hay các chất chuyển hóa phức tạp đƣợc ứng dụng nhiều mặt trong cuộc sống. Nấm sợi đƣợc coi là các nhà máy tế bào lý tƣởng cho ngành công nhiệp sản xuất enzyme. Khoảng 40% enzyme thƣơng mại trên thị trƣờng có nguồn gốc từ nấm sợi. Chúng đóng vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp then chốt nhƣ công nghiệp thực phẩm, đồ uống, y dƣợc, may mặc, thức ăn chăn nuôi [10, 15]. Phần lớn các enzyme này đƣợc sản xuất từ các loài thuộc chi Aspergillus và Trichoderma bởi chúng có khả năng tiết một lƣợng lớn enzyme, protein vào môi trƣờng. Nhiều loài nấm mốc đã đƣợc công nhận là an toàn tiêu biểu nhƣ A. oryzae, A. niger, A. awamori, A. sojae [9, 15, 34]. Ngoài các enzyme, nấm sợi còn đƣợc dùng làm nhà máy sản xuất các axit hữu cơ. Các axit hữu cơ chủ yếu đƣợc sinh tổng hợp bởi nấm sợi là axit citric, axit gluconic, axit itaconic với sản lƣợng hàng nghìn tấn mỗi năm. Các axit này đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, đồ uống, dệt may và y dƣợc [15]. Trong các hệ sinh thái, nấm sợi giúp phân hủy các hợp chất hữu cơ và không thể thiếu trong các chu trình chuyển hóa vật chất. Ngoài ra, nấm còn đƣợc sử dụng làm sinh vật mô hình trong di truyền học, hóa sinh học và nhiều lĩnh vực khác. Bên cạnh đó, cũng có một số loài nấm gây hại nhƣ Aspergillus fumigatus gây bệnh cơ hội ở ngƣời, Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin, hay một số loại nấm sợi gây hỏng rau quả sau thu hoạch và gây bệnh cây trồng [14]. 1.1.3. Giới thiệu chung về chi nấm sợi Aspergillus Aspergillus là một chi nấm sợi phổ biến phân bố trên toàn cầu. Hiện Aspergillus có khoảng trên 250 loài với các đại diện tiêu biểu nhƣ A. niger, A. 5 oryzae, A. nidulans, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus…[30]. Các loài trong chi Aspergillus có mức độ tƣơng đồng cao về hình thái nên khó để phân biệt một cách chính xác và đều có khả năng sinh sản vô tính bằng hình thành bào tử. Bào tử Aspergillus nhẹ, xốp có khả năng phát tán dễ dàng trong không khí. Khi gặp bề mặt chất rắn hoặc lỏng, chúng đƣợc giữ lại và sẽ nảy mầm khi gặp điều kiện phù hợp. Chính khả năng này khiến chúng phân bố rộng khắp trên thế giới [14]. Hai đại diện tiêu biểu của chi Aspergillus là A. oryzae và A. niger. A. oryzae đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất tƣơng, soyu, rƣợu sake ở các nƣớc Châu Á, đặc biệt là ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Philippine và Việt Nam. A. niger đƣợc sử dụng phổ biến trong sản xuất axit citric phục vụ cho các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, đồ uống, y dƣợc, dệt may với sản lƣợng 1,6 triệu tấn mỗi năm. Bên cạnh đó, A. oryzae và A. niger cũng đƣợc sử dụng để khai thác enzyme protease, amylase, phytase và một số sản phẩm chuyển hóa thứ cấp quan trọng khác [14, 15]. Các loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus rất phù hợp cho các nghiên cứu về kiểm soát biểu hiện gen và quá trình tiết protein ở tế bào sinh vật nhân thực do có thể dễ dàng phân lập và tạo ra các chủng đột biến [16]. 1.2. Giới thiệu chung về Aspergillus oryzae 1.2.1 Phân loại và đặc điểm sinh học nấm sợi A. oryzae Aspergillus oryzae hay còn có tên gọi khác là nấm Koji. Đây là loài nấm phổ biến của chi Aspergillus đƣợc sử dụng lâu đời trong ngành công nghiệp lên men ở các nƣớc châu Á tiêu biểu là Nhật và Trung Quốc. Aspergillus oryzae thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus trong họ Trichocomaceae. A. oryzae khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch có dạng hệ sợi, màu trắng xám sau đó phát triển chuyển sang màu vàng nhạt đến xanh. Hệ sợi phát triển mạnh, bao gồm những sợi mỏng, trong suốt, đƣờng kính 5 - 7µm, phân nhánh rất nhiều. Từ những sợi nằm ngang này hình thành nên những sợi khí sinh mang cuống sinh bào tử (cơ quan sinh sản vô tính). Cuống sinh bào tử của A. oryzae thƣờng dài từ 1 - 2 mm, phía đầu cuống sinh bào tử phình lên gọi là thể bình, từ thể bình này mọc lên những tế bào nhỏ, thuôn dài 6 đƣợc gọi là tế bào hình chai. Đầu các tế bào chai này phân chia thành những bào tử đính (conidia). Bào tử của A. oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau tạo thành màu đặc trƣng của khuẩn lạc [43, 62] Hình thái và cấu trúc khuẩn lạc của nấm mốc A. oryzae đƣợc mô tả chi tiết ở Hình 1.2. Hình 1.2. Hình thái và cấu trúc hiển vi của A. oryzae [41] (A, B) Hình thái khuẩn lạc trên đĩa CYEA, MEA. (C) Cuống sinh bào tử. (D, E) Hình thái và cấu trúc hiển vi của cuống sinh bào tử. (F) Bào tử A. oryzae A. oryzae phân bố rộng khắp trên toàn thế giới, đặc biệt là các nƣớc nhiệt đới. Vì là sinh vật hiếu khí bắt buộc nên A. oryzae thƣờng đƣợc tìm thấy ở những nơi giàu ôxi, trên bề mặt nhiều loại cơ chất cung cấp dinh dƣỡng cần thiết cho chúng. Chúng có thể sinh trƣởng và phát triển dễ dàng trên nhiều loại cơ chất nhƣ mảnh vụn thực vật, lá cây, gỗ mục, các loại hạt…. Nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng, phát triển của A. oryzae là 30oC - 40oC [49]. 7 1.2.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae Hệ gen đầy đủ của chủng quốc tế A. oryzae RIB40 đƣợc công bố năm 2005, gồm 8 nhiễm sắc thể (NST) và hệ gen ty thể, kích thƣớc ƣớc tính đạt 37,6 Mbp với khoảng 1207 gen, lớn hơn 25% - 30% so với hệ gen của một số loài thuộc cùng chi Aspergillus. So với loài chuẩn dùng trong nghiên cứu phòng thí nghiệm là A. nidulans và loài gây bệnh cơ hội ở ngƣời A. fumigatus thì hệ gen của A. oryzae lớn hơn lần lƣợt là 29% - 34% [63]. Việc mở rộng kích thƣớc hệ gen cũng diễn ra ở các loài có quan hệ gần gũi với A. oryzae là A. niger và A. flavus, đặc biệt là A. flavus có hệ gen tƣơng đồng với A. oryzae đến 99,5%. Hệ gen của A. oryzae lớn hơn là do thu nạp thêm DNA trong quá trình tiến hóa [62, 87]. Theo các nghiên cứu gần đây, các loài A. oryzae, A. fumigatus và A. nidulans chứa lần lƣợt 135, 99, 90 gen mã hóa cho các protease, chiếm khoảng 1% hệ gen (genome). Tất cả những gen mã hóa cho protease có mặt trong hai loài A. fumigatus và A. nudilans đều có mặt trong A. oryzae nhƣng có những gen mã hóa cho một số enzyme chỉ có mặt ở A. oryzae mà không tồn tại ở hai loài còn lại. Ngoài ra, A. oryzae cũng sở hữu một số gen mã hóa cho các protease có khả năng hoạt động trong môi trƣờng axit mà theo dự đoán chúng có thể đƣợc hình thành trong quá trình thuần hóa của con ngƣời [62]. 1.2.3. Vai trò của nấm sợi A. oryzae A. oryzae đƣợc sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm lên men. Ngay từ thời cổ xƣa, các quốc gia châu Á nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản đã sử dụng chúng để tạo nên các sản phẩm lên men nổi tiếng nhƣ nƣớc tƣơng, miso, soyu, rƣợu sake và nhiều sản phẩm khác [50, 104]. A. oryzae đƣợc sử dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm là do đặc tính sinh trƣởng nhanh, tiết lƣợng lớn enzyme thủy phân nhƣ amylase, glucoamylase, protease, … trong quá trình sinh trƣởng và tạo mùi thơm dễ chịu cho sản phẩm. Một ứng dụng đặc biệt của A. oryzae trong công nghệ lên men truyền thống ở Nhật là công nghệ lên men cơ chất rắn (gạo, đậu tƣơng và cám gạo) tạo điều kiện cho sự phát triển hiếu khí của A. oryzae. Độ ẩm thích hợp trong quá trình lên men ở môi 8