Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Nghiên cứu tạo một số chế phẩm sinh học từ chitin tách chiết từ vỏ tôm bằng phươ...

Tài liệu Nghiên cứu tạo một số chế phẩm sinh học từ chitin tách chiết từ vỏ tôm bằng phương pháp thuỷ phân axit

.PDF
87
178
64

Mô tả:

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 TRẦN THỊ HOA LÝ NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ CHITIN TÁCH CHIẾT TỪ VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN AXIT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Văn Thiết HÀ NỘI, 2011 -1- 2 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi tới thầyPGS. TS. Nguyễn Văn Thiết đã giao đề tài và trực tiếp hướng dẫn để em hoàn thành khóa luận này. Đồng kính gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn Nguyễn Thị Hạnh, người đã cùng tôi làm đề tài và các thầy cô làm việc tại Phòng Hóa Sinh Thực VậtViện Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện khóa luận này. Em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến các thầy, các cô trong khoa, các thầy, các cô trường THPT Lạng Giang số 3 nơi mà tôi đang công tác, các bạn lớp K13 cao học sinh học thực nghiệm, gia đình và người thân đã luôn bên tôi trong suốt thời gian qua! Hà nội, ngày 26 tháng 5 năm 2011 Học viên Trần Thị Hoa Lý -2- 3 LỜI CAM DOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc . Hà nội, ngày 26 tháng 5 năm 2011 Học viên Trần Thị Hoa Lý -3- 4 MỤC LỤC Trang 1 Mở đầu 5 Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Giới thiệu về chitin/chitosan 5 1.2. Các phương pháp tách chiết chitin 8 1.2.1. Thuỷ phân chitin và chitosan bằng acid 9 1.2.2. Các biến đổi hóa học của monosaccharide dưới tác động của acid 10 1.2.3. Tạo thành furfurol và các chất họ hàng 12 1.3. Các tính chất hấp phụ của chitin/chitosan 13 1.3.1. Khả năng hấp phụ các kim loại nặng, các hợp chất hữu cơ 13 1.3.2. Tính kháng khuẩn của chitosan 14 1.4. Các sản phẩm sinh học từ chitin/chitosan 17 1.5. Ứng dụng trong nông nghiệp, y học 20 23 Chương 2: Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu 23 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 23 23 2.1.2. Hóa chất 2.1.3. Thiết bị 23 2.2. Các phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1. Phương pháp tách chiết chitin từ đầu-vỏ tôm 23 2.2.2. Xác định trọng lượng phân tử trung bình của chitin bằng phương 24 pháp đo độ nhớt 2.2.3. Phương pháp chuyển chitin thành chitosan 27 2.2.4. Phương pháp thuỷ phân chitin bằng acid 27 2.2.5. Các phương pháp xác định đường khử [19] 27 2.2.6. Các phương pháp thu hồi và làm sạch sản phẩm 29 2.2.7. Phương pháp xác định sản phẩm phụ của phản ứng thuỷ phân acid 30 2.2.8. Phương pháp xác định độ độc cấp tính của chế phẩm SP2 30 31 Chương 3: Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả tách chiết chitin từ vỏ tôm 31 3.1.1. Kết quả tách chiết chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học 31 33 3.1.2. Chuyển hóa chitin thành chitosan 3.1.3. Đánh giá chất lượng các mẫu chitin và chitosan thu được 34 3.2. Kết quả nghiên cứu thuỷ phân chitin bằng acid khác nhau 38 3.2.1. Kết quả nghiên cứu sơ bộ khả năng thuỷ phân chitin bằng các acid 39 khác nhau 3.3.1.1. Đánh giá khả năng thủy phân chitin bằng các acid khác nhau thông 40 qua xác định lượng polysaccharide còn lại sau phản ứng 3.3.1.2. Đánh giá khả năng thủy phân chitin bằng các acid khác nhau thông 41 qua xác định lượng đường khử trong dịch phản ứng 3.3.1.3. Đánh giá khả năng thủy phân chitin thông qua xác định lượng sản 43 phẩm phụ của phản ứng -4- 5 3.2.2. Nghiên cứu mối phụ thuộc của lượng đường khử tạo thành trong phản ứng thuỷ phân chitin bằng acid vào nhiệt độ thuỷ phân 3.2.3. Kết quả nghiên cứu thủy phân chitin bằng acid H2SO4 3.2.4. Kết quả thuỷ phân chitin bằng acid HCl 3.2.5. Kết quả thuỷ phân chitin bằng acid H3PO4 3.3. So sánh và đánh giá chung kết quả thuỷ phân chitin bằng các acid khác nhau 3.4. Nghiên cứu độ độc cấp tính của chế phẩm SP2 Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4.1. Kết luận 4.2. Kiến nghị Tài liệu tham khảo Phần phụ lục -5- 47 49 53 56 59 62 66 66 67 68 79 6 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ DD Độ deacetyl hóa ĐC Đối chứng GlcN Glucosamine GlcNAc N-Acetyl-glucosamine HH Mẫu chitosan được tách chiết từ chitin bằng phương pháp hóa học. HQ Hàn Quốc Mr Phân tử lượng của polymer NANO Nanochitin OLG Oligochitosaccharide SP Sản phẩm TN Thí nghiệm -6- 7 MỞ ĐẦU 1.Lí do chọn đề tài Chitin là biopolymer thứ 2 trong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose về lượng. Đây là loại vật liệu mới quý, không chỉ vì từ chitin có thể tạo ra được nhiều sản phẩm có giá trị gia tăng cao để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội, mà quan trọng hơn nữa là nguồn nguyên liệu này có thể được coi là vô tận, vì được tái sinh trong tự nhiên. Polysaccharide này là một trong các thành phần quan trọng của khung xương ngoài ở nhiều động vật không xương sống, nấm và cả ở một số loài tảo, có chức năng sinh học chính là chức năng cấu trúc (nâng đỡ và xác định hình dạng cơ thể) và bảo vệ. Từ chitin dễ dàng nhận được chitosan – một polymer sinh học là dẫn xuất trực tiếp của chitin và cũng có mặt trong tự nhiên trong thành phần thành tế bào của một số loại nấm. Chitosan là dẫn xuất quan trọng nhất của chitin, hiện nay polysaccharide này đã được coi là polymer dược phẩm. Cả chitin và chitosan đều không độc, dễ phân hủy và có tính dung nạp sinh học. Các polysaccharide có các tính chất hấp phụ rất quí với phổ hấp phụ rất rộng: từ kim loại đế các chất hữu cơ. Chitin là biosorbent rất tốt đối với các kim loại, có thể hấp phụ tất cả các kim loại, đặc biệt là các kim loại nặng, chỉ ngoại trừ các kim loại kiềm và kiềm thổ được sử dụng trong làm sạch nước thải chứa phóng xạ và các kim loại nặng [80]. Các thử nghiệm invitro cho thấy chitin liên kết trên bề mặt của nó các phân đoạn có khối lượng phân tử trung bình, các oligopeptide, creatin, ure, cholesterin và triglyceride, nhưng không hấp phụ các protein có kích thước phân tử lớn, các ion Na và hấp phụ ít K. Các thí nghiệm trên động vật cho thấy trên nền phát triển của các trạng thái bệnh lí khác nhau, sử dụng chitin làm giảm lượng các oligopeptide độc và các chất khác trong máu có tác động âm tính đối với cơ thể, làm giảm 2 lần tỉ lệ chết của động vật so với nhóm động vật không được nhận biosorbent. Hơn nữa, phân tích các kết quả thí nghiệm lâm sàng cho phép đưa ra giả định về sự tham gia của chitin trong hấp phụ các thành phần của huyết tương như cholesterin, triglyceride, ure, creatinin, serotonin, histamin và các chất khác, điều này có ý nghĩa rất lớn trong -7- 8 điều trị một loạt các trạng thái bệnh lí liên quan tới các rối loạn kinh niên hoạt động của các cơ quan và hệ cơ quan tương ứng. Các kết quả này mở ra triển vọng ứng dụng chitin trong y học thông qua cái gọi là thẩm tích ruột để chữa các bệnh nhiễm trùng kinh niên và cấp đường dạ dày-ruột, các tổn thương hệ thống gan-mật, các rối loạn kinh niên và cấp tính đồng hành với sự phát triển ngộ độc (viêm phổi, các biến chứng tính chất nhiễm trung mủ sau phẫu thuật, suy thận mãn và cấp…), các rối loạn dị ứng và trao đổi. Ngoài ra chitin có thể được sử dụng để chữa bệnh trong thú y, chăn nuôi… [82] Trở ngại lớn nhất trong ứng dụng chitin là tính chất khó hòa tan của chúng trong nhiều dung môi, kể cả các dung môi hữu cơ. Từ chitin và chitosan đã nhận được nhiều dẫn xuất khác nhau bằng các phương pháp hóa học để làm tăng tính tan của chúng, nhằm phát huy được các tiềm năng ứng dụng của các polysaccharide này. Một trong các phương thức đơn giản và rẻ tiền nhất làm tăng tính phân tán của chitin và chitosan trong thể tích, về mặt nào đó cũng đồng nghĩa với làm tăng tính tan của chúng, là phương pháp thủy phân acid nhờ sử dụng các acid vô cơ làm tác nhân thủy phân. Bằng phương pháp này có thể thu nhận nhiều loại sản phẩm có các tác dụng khác nhau từ chitin để phục vụ cho các mục đích ứng dụng khác nhau, bao gồm: (i) chitin và chitosan mạch ngắn (so với các phân tử ban đầu) và nanochitin; (ii) các chito-oligosaccharide (cả mạch ngắn và mạch dài, hay tan và không tan), và (iii) chito-monosaccharide (chủ yếu là glucosamine). Các sản phẩm thủy phân nhóm 1 ngoài các ứng dụng trong y học như nêu trên, trong vai trò biosorbent còn có thể sử dụng để tạo ra thực phẩm chức năng phòng chống béo phì, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, tiểu đường, chống ngộ độc thực phẩm… Nhóm sản phẩm chitooligosaccharide có triển vọng rất lớn trong vai trò các elicitor – các chất làm tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể và có tác dụng chống béo phì. Glucosamine là thuốc chống viêm khớp tốt. Chúng tôi quan tâm hơn cả tới 2 nhóm sản phẩm đầu, vì vậy đề tài luận văn thạc sĩ của tôi có tên là: “Nghiên cứu tạo một số chế phẩm sinh học từ chitin tách chiết từ vỏ tôm bằng phương pháp thủy phân acid” -8- 9 Đề tài được tiến hành dựa trên cơ sở phương pháp hóa học nhằm tạo ra một số chế phẩm có giá trị gia tăng cao từ nguồn phụ phẩm dồi dào của ngành công nghiệp chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu là vỏ tôm, phục vụ cho các ứng dụng khác nhau. Tôi tin tưởng sự thành công của đề tài không chỉ có ý nghĩa thực tiễn về mặt kinh tế- xã hội, mà còn có ý nghĩa khoa học cơ bản sâu sắc. 2. Mục đích nghiên cứu Tạo một số chế phẩm sinh học từ vỏ tôm bằng phương pháp thủy phân acid 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Đề tài có các nội dung chính sau đây: 1) Thu nhận chế phẩm chitin từ vỏ tôm; 2) Chuyển hóa chitin thành chitosan và xác định kích thước phân tử của chitin thông qua đo độ nhớt của chế phẩm chitosan nhận được; 3) Nghiên cứu động học của quá trình thủy phân chitin bằng các axit vô cơ khác nhau để tìm điều kiện tối ưu cho việc tạo ra một số chế phẩm sinh học từ chitin: nhóm sản phẩm SP1(bao gồm chitin mạch ngắn, nanochitin và các chitooligosaccharide mạch dài không tan), nhóm sản phẩm SP2 (gồm các oligosaccharide mạch ngắn, tan trong acid) và nhóm sản phẩm SP3 (các chitomonosaccharide, chủ yếu là glucosamine) 4) Xác định độ độc cấp tính của chế phẩm SP2 (OLIGOMER) trên chuột nhắt trắng. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: - Chitin, chitin mạch ngắn, nanochitin, chitooligosaccaride và glucosamine. * Phạm vi nghiên cứu: - Nghiên cứu quá trình thủy phân chitin/chitosan bằng các acid khác nhau: HCl, H2SO4, H3PO4, HNO3 ở các nồng độ, nhiệt độ và thời gian khác nhau. 5. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tách chiết chitin. -9- 10 - Phương pháp chuyển chitin thành chitosan - Xác định trọng lượng phân tử trung bình của chitin bằng phương pháp đo độ nhớt - Phương pháp thuỷ phân chitin bằng acid - Các phương pháp xác định đường khử - Phương pháp phân tách, thu hồi và làm sạch sản phẩm - Phương pháp xác định sản phẩm phụ của phản ứng thuỷ phân acid - Phương pháp xác định độ độc cấp tính của chế phẩm SP2 6. Dự kiến đóng góp mới Chỉ ra bằng phương pháp thủy phân acid sẽ tạo ra được một số chế phẩm sinh học có giá trị giá tăng cao từ chitin. -10- 11 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về chitin/chitosan Chitin có công thức phân tử: (C 8H13O5N)n (n thay đổi tùy thuộc từng loại nguyên liệu, chẳng hạn như tôm hùm: n = 700800 và ở cua n = 500600). Công thức cấu tạo của chitin xem hình 1. Phân tử lượng của chitin không dưới 1 000 000 Da. CH2OH CH2OH CH2OH O OH O O O O OH NHAc NHAc NHAc n Chitin CH2OH CH 2OH CH2OH O O O O OH O OH O OH n O OH NH2 NH2 NH2 n Chitosan CH2OH CH2OH CH2OH O OH OH O O O O OH OH OH Cellulose O OH n Hình 1. Sơ đồ cơ cấu trúc hóa học của chitin, chitosan và cellulose Trên hình 1 là sơ đồ cấu trúc hóa học của chitin, chitosan và cellulose. Từ sơ đồ này ta thấy về mặt hóa học chitin có thể được coi là dẫn xuất của cellulose, nhưng điều này chỉ đúng về mặt hình thức, còn nếu xét về bản chất của quá trình sinh tổng hợp chitin và cellulose, thì 2 polysaccharide này được tạo thành trong cơ thể sống theo các đường trao đổi chất hoàn toàn khác nhau. Hơn nữa, phân bố của 2 loại polysaccharide này trong tự nhiên cũng khác nhau hoàn toàn: nếu như cellulose là biopolymer đặc trưng cho giới thực vật, thì chitin lại chỉ có ở các động vật không -11- 12 có xương sống, nấm và một số loài tảo [29, 33, 74]. Nói đúng hơn, đơn vị cấu trúc của chitin (N-acetylglucosamine) là dẫn xuất của glucose - đơn vị cấu trúc của cellulose. Với chitosan vấn đề lại hoàn toàn khác: Chitosan thực sự là dẫn xuất của chitin, từ chitin có thể nhận được chitosan bằng các phương pháp khác nhau (xem phần sau). Tính chất vật lý của chitin: Khi dùng kính hiểm vi điện tử quét để khảo sát chitin cho thấy cấu trúc bề mặt của chitin khá chặt chẽ, phẳng lì. Ở điều kiện thường chitin tồn tại ở thể rắn, vô định hình, không tan trong nước, acid loãng, kiềm loãng, không tan trong các dung môi hữu cơ thông thường. Chitin tan trong HCl đậm đặc, acid sulfuric đậm đặc, sự hòa tan này dẫn đến biến đổi khối lượng phân tử, độ deacetyl và năng suất quay cực của chitin [27]. Chitin có thể phân tán trong dung dịch các muối trung tính có khả năng hydrat hóa ở nồng độ cao Tính chất hóa học của chitin: - Phản ứng deacetyl hóa chitin xảy ra trong môi trường kiềm đặc. - Chitin bị thủy phân trong môi trường acid clohydric đặc ở nhiệt độ cao gây cắt mạch thu được glucosamine. Hình 2. Sơ đồ chuyển hóa chitin thành chitosan và glucosamine - Phản ứng este hóa: + Chitin tác dụng với acid nitric đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat. -12- 13 + Chitin tác dụng với acid sulfuric đậm đặc trong pyridin, dioxan và N, Ndimethylamin cho sản phẩm chitin sulfate. + Chitin tác dụng với acid cloacetic cho sản phẩm cacboxylmetylchitin [26]. Nhìn chung các phản ứng hóa học của chitin là không đa dạng, điều này dễ dàng giải thích được do cấu tạo chitin có các nhóm chức tương đối trơ, hơn nữa cấu trúc bề mặt của chitin phẳng lì và rất chặt chẽ đã gây khó khăn cho sự tiếp xúc của nó với các tác nhân phản ứng. Tính không tan trong nước và các dung môi hữu cơ thông thường nên chitin khó tham gia các phản ứng hóa học thông thường, vì điều này mà khả năng ứng dụng của chitin bị hạn chế rất nhiều. Các nhà khoa học đã cố gắng nghiên cứu biến đổi hóa học tạo ra các dẫn xuất khác nhau của chitin để có thể hòa tan trong các dung môi thông thường tiện lợi hơn trong quá trình sử dụng. Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan, một dẫn xuất thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin biến đổi nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2 [2], được coi là dẫn xuất quan trọng nhất. Hiện nay người ta đã biết được chitosan có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng đa dạng trong thực tế. Về mặt cấu tạo chitosan là một polymer hữu cơ được cấu tạo bởi các đơn vị D-Glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-1→4-glycoside [27]. Công thức lý thuyết của chitosan được biểu diễn trên hình 1, còn công thức phân tử là (C6H11O4N)n. Tính chất vật lý của chitosan: Chitosan ở điều kiện thường là thể rắn tinh thể và rắn vô định hình có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi, không vị, không tan trong nước, kiềm đặc và loãng, không tan trong aceton và các dung môi hữu cơ thông thường khác. Chitosan tan trong dung dịch acid loãng (pH = 6) tạo dung dịch keo trong suốt, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309 – 311o C. Độ nhớt của dung dịch chitosan trong dung dịch acid loãng có liên quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polymer) [81]. -13- 14 Do chitosan có –NH2 còn cặp electron tự do linh động trên nguyên tử (N), nên có khả năng tạo phức với ion kim loại, tạo liên kết với các acid hữu cơ, anhydrit hữu cơ. Tính chất hóa học của chitosan: - Phản ứng Van-Wisselingh [28]: Chitosan tác dụng với dung dịch Ingol cho màu nâu, màu này chuyển sang màu tím khi có mặt acid sulfuric. - Chitosan tác dụng với dung dịch acid sulfuric tạo tinh thể hình cầu chitosan sulfate, chất này làm mất màu dung dịch Fucsin 1% hay dung dịch acid picric 1%. - Sự khử amine có thể gây ra bởi một số tác nhân oxy hóa như Ba(BrO)2; AgNO3; N2O3; HNO2… - Chitosan có thể bị cắt mạch bởi acid, enzyme [2] hoặc bằng bức xạ để tạo oligomer . 1.2.Các phương pháp tách chiết chitin. Như chúng ta đã biết rằng chitin được khoa học biết đến từ năm 1811, chitin và chitosan và các sản phẩm nhận được từ chitin và chitosan (các chitoologosaccharide dạng [GlcNAc]n và [GlcN]n) được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như nông nghiệp, y-dược, môi trường…, cho nên chitin đã được tách chiết từ rất nhiều nguồn tự nhiên như vỏ tôm, cua, mai mực… Trong vòng hơn một thế kỉ qua chitin được tách chiết đều bằng các phương pháp hóa học và cho đến nay có rất nhiều phương pháp hóa học khác nhau được sử dụng trong các phòng thí nghiệm trên thế giới cũng như ở nước ta để tách chiết và làm sạch chitin, phục vụ cho các mục đích ứng dụng khác nhau [29, 31, 85, 95]. Từ năm 2002 ở nước ta có dự án “Hoàn thiện công nghệ sản xuất một số sản phẩm chitin và chitosan nguồn gốc thiên nhiên từ phụ phẩm của ngành thuỷ, hải sản với quy mô công nghiệp”, với mục tiêu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất được 100 tấn chitin/1 năm. do trường Đại học Thuỷ sản Nha Trang chủ trì, phương pháp được sử dụng để thu nhận chitin cũng là phương pháp hóa học. Trong thời gian gần đây do các bức xúc về vấn đề ô nhiễm môi trường, nên các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu áp dụng các phương pháp chế biến sinh học -14- 15 (bioprocessing methods) trong sản xuất chitin để thay thế cho các phương pháp hóa học tiêu tốn nhiều hóa chất và gây ô nhiễm môi trường. Phương pháp sinh học đầu tiên và cũng là duy nhất cho đến nay được áp dụng trong sản xuất chitin là phương pháp lên men lactic [29, 51, 52, 82, 71, 100,], tuy còn ở quy mô rất nhỏ so với phương pháp hóa học. Phương pháp này cũng đã được một số tác giả của nước ta áp dụng để thu nhận chitin từ vỏ tôm [41]. Như vậy, hiện nay có hai nhóm phương pháp sản xuất chitin từ vỏ giáp xác đó là các phương pháp hóa học và các phương pháp sinh học, trong đó phương pháp hóa học tách chiết chitin là phương pháp đã có từ rất lâu và ngày nay vẫn là phương pháp chính được áp dụng trong sản xuất polymer sinh học này, còn phương pháp sinh học mới được nghiên cứu áp dụng trong thời gian gần đây với mục đích thay thế phương pháp hóa học truyền thống tiêu hao nhiều hóa chất và gây ô nhiễm môi trường. 1.2.1. Thuỷ phân chitin và chitosan bằng acid Thuỷ phân acid các polysaccharide, mà chủ yếu là thuỷ phân tinh bột và các nguyên liệu chứa tinh bột, là một phương pháp đã được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất rượu bia và nước giải khát và trong công nghiệp thực phẩn để sản xuất mạch nha, cũng như trong lĩnh vực sản xuất ethanol (cồn) nhiên liệu. Điều này rất dễ hiểu vì tinh bột và một số polysaccharide khác trong nguyên liệu ban đầu đều là các polysaccharide với các liên kết glucoside ở cấu hình  rất dễ bị thuỷ phân bằng acid. Với chitin và chitosan thì vấn đề thuỷ phân bởi acid lại hoàn toàn khác, bởi các liên kết glucoside trong 2 polysaccharide lại có cấu hình , do vậy chitin và chitosan cũng giống như cellulose, rất bền với thuỷ phân acid trong các điều kiện “mềm”, tức là ở nồng độ acid thấp và nhiệt độ thấp. Tuy nhiên ở điều kiện nhiệt độ là 100oC các polysaccharide này được thuỷ phân dễ dàng bằng acid [71]. Về mặt lí thuyết, polysaccharide nói chung, chitin và chitosan nói riêng, có thể bị thuỷ phân hoàn toàn bằng acid. Về nguyên tắc có thể sử dụng các acid vô cơ khác nhau như HCl, HNO3, H2SO4, H3PO4… để thuỷ phân, nhưng trên thực tế H2SO4 thường được sử dụng để thuỷ phân polysaccharide vì dư lượng của nó dễ bị loại -15- 16 khỏi hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc thuỷ phân ở dạng bari sulfate, và H2SO4 cũng gây phá huỷ monosaccharide ít nhất (tạo thành dẫn xuất của furfurol) so với các acid vô cơ khác. Ví dụ, để thuỷ phân cellulose, đầu tiên polysaccharide này được hoà trong H2SO4 72%, sau đó pha loãng bằng nước và đun sôi trường diễn ở 100oC. Các điều kiện trung bình cho thuỷ phân polysaccharide là: Đun polysaccharide trong dung dịch H2SO4 2N ở 100oC trong 2-4h thì đa số các polysaccharide bị thuỷ phân [71]. Ở nước ta quá trình thuỷ phân chitin và chitosan bằng acid cũng đã được một số tác giả quan tâm nghiên cứu với mục đích tạo chế phẩm GlcN để chữa bệnh viêm khớp [102]. Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu này đều chỉ dừng lại ở trong phòng thí nghiệm. Phản ứng thuỷ phân polysaccharide nói chung và chitin, chitosan nói riêng trong acid có rất nhiều hạn chế, do tạo thành các sản phẩm phụ từ sản phẩm chính của phản ứng (monosaccharide hay đường khử) dưới tác động của acid, đặc biệt là ở các nồng độ acid cao và nhiệt độ cao (xem phần sau). 1.2.2. Các biến đổi hóa học của monosaccharide dưới tác động của acid Các monosaccharide (đường khử) có thể bị biến đổi thành rất nhiều chất khác nhau trong các phản ứng hóa học dưới tác động xúc tác của kiềm và acid. Nhìn chung các monosaccharide bền hơn nhiều với tác động của acid so với tác động của kiềm [71, 69,]. Chẳng hạn trong các điều kiện thuỷ phân các polysaccharide trong dung dịch acid vô cơ 2 M thì glucose bị biến đổi rất chậm. Tuy vậy, phụ thuộc vào một số điều kiện (trước tiên là nồng độ acid và thời gian mà monosaccharide bị tác động bởi acid) mà có thể xảy ra một loạt phản ứng [71]. Cả acid và kiềm đều xúc tác (kiềm mạnh hơn) phản ứng Lobrri de Bruin Alberd van Ekenstein [71]. Dưới tác dụng của kiềm và acid phản ứng enol hóa aldose thành endiol xảy ra theo các sơ đồ trên hình 6. Enol tạo thành có thể biến đổi theo nhiều hướng khác nhau. Phản ứng này là cơ sở của hầu như tất cả các biến đổi hóa học của các monosaccharide dưới tác động của kiềm và acid. Tuy nhiên trong -16- 17 khuôn khổ đề tài này chúng tôi chỉ quan tâm tới các biến đổi hóa học của các monosaccharide dưới tác động của acid. HC H HO O +OH-,-H2O OH H H HO R H H H O H O C HO O OH H R + H+ OH HO H R C OH C +H2O + OH- H (A) R 1,2-endiol H H C HO OH+ OH H R H C OH OH HO H (B) R 1,2-endiol Hình 6. Sơ đồ phản ứng tạo thành dạng enol (1,2-endiol) dưới tác dụng của kiềm (A) và acid (B). Dưới tác động của acid xảy ra nhiều biến đổi hóa học của các monosaccharide, trong đó có aminosaccharide nói chung và GlcN nói riêng. Trong số các biến đổi hóa học đó đáng kể nhất là:1) Các phản ứng isomer hóa và epimer hóa (ví dụ, từ glucose trong môi trường acid sẽ tạo thành fructose và mannose, và có thể cả psicose; 2) Đứt liên kết C–C hay phản ứng ngược với phản ứng trùng hợp aldol; 3) Di chuyển liên kết đôi dọc mạch C; 4) Tách nước khỏi enol - phản ứng loại trừ  với sự tạo thành hợp chất dicarbonyl 3-deoxyhexosulese. Trên thực tế cả 4 loại phản ứng trên có thể xảy ra cùng một lúc. Ngoài ra, dưới tác động của acid còn xảy ra phản ứng ngược với phản ứng thuỷ phân, tức là biến đổi các monosaccharide thành các oligosacchride khi tách nước. Phản ứng này xảy ra trong các điều kiện khá mềm. Chẳng hạn D-Glc trong dung dịch 0,15 M H2SO4 bị biến đổi một phần thành isomaltose (6-O--D-glucopyranosyl-D-glucose) do tác động của nhóm OH rượu bậc I của một phân tử lên tâm anomer của phân tử thứ hai. Cùng với chất này còn nhận được một lượng nhất định các oligosacchride khác, cấu trúc và tỉ lệ tương quan của chúng phụ thuộc vào bản chất của các monosaccharide ban đầu. Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi quan tâm hơn cả tới các biến đổi hóa học của monosaccharide dẫn tới tạo thành các hợp chất dicarbonyl. Trong cả môi -17- 18 trường kiềm và acid trong trường hợp glucose hợp chất hợp chất dicarbonyl được tạo thành từ endiol tương ứng là 3-deoxyglucosulese: H C HO OH C O OH C OH H CH HCH R R 3-deoxyhexosulese H R 1,2-endiol H C O C O Hình 7. Sơ đồ phản ứng tạo thành hợp chất dicarbonyl từ glucose. Các 3-deoxyhexosulese là những chất không bền, các biến đổi tiếp theo của chúng trong môi trường kiềm và môi trường acid là khác nhau. Trong môi trường acid xảy ra biến đổi các hợp chất dicarbonyl thành các dẫn xuất của furan: 3deoxypentosulese (hay pentose) tạo thành furfurol, còn 3-deoxyhexosulose (hay hexose) - tạo thành 5-hydroxy-methylfurfurol (xem phần dưới) [71]. 1.2.3. Tạo thành furfurol và các chất họ hàng Trong số các sản phẩm phụ của phản ứng thuỷ phân acid chitin và chitosan thì chúng tôi quan tâm nhất là furfurol và các chất họ hàng, bởi vì sự tạo thành các chất này ảnh hưởng rất nhiều lên hiệu suất của quá trình thuỷ phân. Các chất này được tạo thành khi tác động lên monosaccharide các acid vô cơ mạnh. Trong môi trường acid xảy ra sự biến đổi của các hợp chất dicarbonyl thành các dẫn xuất của furan: các pentose cho furfurol, còn các hexose - cho hydroxymethylfurfurol: H C C O H C C O H C H H C OH H C OH CH2OH 3-Deoxyhexosulese - H2O H H O O + H+ C O C OH CH CH CH CH C OH CH2OH C HOH2C O C H O Hydroxymethylfurfurol OH CH2OH 3,4-Dideoxyhexusolene-3 Hình 8. Sơ đồ tạo thành các sản phẩm phụ là dẫn xuất của furan khi thuỷ phân chitin và chitosan trong môi trường acid. Trong một chuỗi biến đổi hóa học từ 1 phân tử monosaccharide tách ra 3 phân tử H2O (theo 3 giai đoạn), sau đó là quá trình vòng hóa và cuối cùng là tạo thành -18- 19 hydroxymethylfurfurol. Điều kiện quan trọng để sự vòng hóa diễn ra là cấu hình trans của liên kết C2 - C3 của diendiol có hệ thống liên hợp dài với 3 liên kết đôi. Lượng sản phẩm phụ dạng các dẫn xuất của furan tạo thành trong quá trình thuỷ phân acid chitin và chitosan, có thể xác định bán định lượng được bằng đo hấp phụ của dịch thuỷ phân trong vùng bước sóng 270 - 300 nm (xem phần kết quả). 1.3. Các tính chất hấp phụ của chitin/chitosan. 1.3.1. Khả năng hấp phụ các kim loại nặng, các hợp chất hữu cơ. Chitin và chitosan chứa một số nhóm chức – các nhóm hydroxyl, carbinol, amino, acetylamid và các cầu oxy, cho nên cơ chế hấp phụ các ion kim loại nặng và các chất khác bởi các polymer này mang tính chất khá phức tạp. Phụ thuộc vào các điều kiện cơ chế này có thể bao gồm sự tạo phức, trao đổi ion và hấp phụ bề mặt, tuy nhiên trong thời gian cuối đa số các nhà nghiên cứu cho rằng sự tạo phức chelat (còng cua) chiếm ưu thế hơn cả, cơ chế này được nguyên nhân bởi khả năng cho electron cao của các nguyên tử N & O. Nhờ vậy mà các chất hấp phụ chitin có phổ hấp phụ đặc biệt rộng. Chúng có thể được sử dụng để làm sạch các dung dịch nước khỏi các chất bẩn rất khác nhau: thực tế là khỏi tất cả các kim loại nặng, nhiều nguyên tố phóng xạ (radionuclid), các vi khuẩn, nhiều tạp chất hữu cơ, các thuốc trừ sâu và nhiều chất khác [80]. Do đặc tính của nhóm amino tự do trong cấu trúc chitosan được tạo thành khi deacetyl hóa chitin, các tính chất tạo phức chelat của nó làm cho khả năng hấp phụ kim loại tăng gấp 5 đến 6 lần so với chitin. Khi ghép một số nhóm chức vào khung cấu trúc của chitosan sẽ làm tăng khả năng hấp phụ kim loại của chitosan lên nhiều lần. Để tạo điều kiện tốt cho quá trình chuyển khối, đồng thời tăng dung lượng hấp phụ kim loại của chitosan, một số nhà khoa học đã nghiên cứu biến tính chitosan, đồng thời đánh giá khả năng hấp phụ kim loại nặng trên mạng lưới liên kết mạch thẳng và chéo nhau của chitosan. Kết quả là đã tạo ra được nhiều loại chitosan biến tính có dung lượng hấp phụ kim loại cao. Bên cạnh khả năng hấp phụ các kim loại nặng chitin/chitosan còn có khẳ năng hấp phụ các chất hữu cơ. Người ta đã ứng dụng tính chất này để sản xuất thuốc -19- 20 giảm béo, do chitosan mang điện tích dương, khi vào đến ruột được dịch tiêu hóa hòa tan tạo thành dạng gel và sẽ tìm hút những chất mang điện tích âm như: chất béo, cholesterol, lipid… Đây là giải pháp giảm cân an toàn nhờ tác dụng như nam châm hút mỡ, nhanh chóng hút lấy các acid béo, dầu mỡ có trong thức ăn tại ruột và thải trừ chúng ra khỏi cơ thể. Sản phẩm này có khả năng hấp thu và thải trừ chất béo cao nhất mà ở chất xơ thực vật không có được. 1.3.2. Tính kháng khuẩn của chitosan Gần đây những nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan đã chỉ ra rằng chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Trong một nghiên cứu khá rộng về tính kháng khuẩn của chitosan từ tôm chống lại E.coli, đã phát hiện thấy nhiệt độ cao và pH acid của thức ăn làm tăng ảnh hưởng của chitosan đến vi khuẩn. Nó cũng chỉ ra cơ chế ức chế vi khuẩn của chitosan là do liên kết giữa chuỗi polymer của chitosan với các ion kim loại trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Khi bổ sung chitosan vào môi trường, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương. Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rằng chitosan không trực tiếp hoạt động ức chế vi khuẩn E.coli mà là do sự kết lại của các tế bào và sự tích điện dương ở màng của vi khuẩn. Chitosan N-carboxybutyl, một polycation tự nhiên, có thể tương tác và hình thành polyelectrolyte với polymer acid tính có trên bề mặt vi khuẩn, do đó làm dính kết một lượng vi khuẩn với nhau. Cũng từ thí nghiệm này người ta thấy rằng có rất nhiều ion kim loại có thể ảnh hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như K+, Na+,Mg2+ và Ca2+. Nồng độ cao các ion kim loại có thể làm mất tính chất này, ngoại trừ ảnh hưởng của Na+ đối với hoạt động kháng Staphylococcus aureus. Người ta cũng thấy rằng chitosan có thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào nhiều vi khuẩn. Khi sử dụng chitosan, thì một lượng lớn các ion K+ với ATP bị rò rỉ ở vi khuẩn Staphylococcus aureus và nấm Candida albicans. Cả chitosan phân tử lượng 50 kDa và 5 kDa đều kháng tốt hai loại trên nhưng chitosan phân tử lượng 50 kDa làm mất nhiều gấp 2-4 lần ion K+ và ATP so với chitosan 5 kDa. Điều này thể hiện cơ chế kháng khuẩn -20-
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan