Tài liệu Nghiên cứu tạo một số chế phẩm chức năng chứa tinh dầu nghệ vàng

LỜI CAM ĐOAN Luận án sử dụng một phần kết quả của đề tài cấp Nhà nƣớc: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm sinh học từ thực vật có chứa các hoạt chất: cacbua tecpenic, xeton sesquitecpenic và turmeron trong bảo quản quả tươi sau thu hoạch” mã số ĐTĐL. 2008T-16 do PGS. TS Nguyễn Thị Kim Cúc làm chủ nhiệm. Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chƣa từng đƣợc các tác giả khác công bố trong các luận văn, luận án nào và đã đƣợc chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án này. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành luận án đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Nghiên cứu sinh i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án Tiến sĩ này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận đƣợc sự động viên và giúp đỡ rất lớn của nhiều thầy, cô giáo và tập thể. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS – Nguyễn Thị Kim Cúc– Phòng Công nghệ sinh học – Viện Hóa sinh biển– Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và PGS.TS Trần Liên Hà bộ môn Vi sinh – Hóa sinh - Sinh học phân tử Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội, là những ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, định hƣớng, đào tạo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo, các cán bộ phòng Vi sinh – Hóa sinh - Sinh học phân tử, Trung tâm nghiên cứu & phát triển công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm và Viện Đào tạo Sau đại học – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ, công nhân viên phòng Công nghệ sinh học – Viện Hóa sinh biển và Phòng Hoá Sinh nông nghiệp và tinh dầu- Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp trong Khoa Công nghệ Thực phẩm - Trƣờng Đại học Kinh tế Kỹ thuật Công nghiệp nơi tôi đang công tác và giảng dạy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và làm Luận án. Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình và bạn bè – những ngƣời thân luôn là nguồn động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu những lời cảm ơn chân thành nhất. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Nghiên cứu sinh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................ ii MỤC LỤC ............................................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT ................................................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................. viii DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................................... x MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................................. 1 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu .................................................................................. 2 3. Ý nghĩa khoa học của đề tài........................................................................................... 2 4. Tính mới của đề tài ........................................................................................................ 3 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN ............................................................................................... 4 1.1 Giới thiệu về cây nghệ vàng ........................................................................................ 4 1.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu nghệ vàng ........................... 5 1.2.1 Thành phần hóa học của tinh dầu nghệ vàng........................................................ 5 1.2.2. Hoạt tính sinh học của dịch chiết và tinh dầu nghệ vàng .................................... 7 1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn của tinh dầu ......................................................................... 8 1.3 Các phƣơng pháp thu nhận tinh dầu .......................................................................... 10 hơi nƣớc (LCHN) .......................................... 10 1.3.2 Phƣơng pháp trich ly bằng dung môi dễ bay hơi ................................................ 11 1.3.3 Một số phƣơng pháp khai thác tinh dầu khác ..................................................... 11 1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam trong việc khai thác hoạt tính sinh học của Curcuma longa L........................................................................................... 12 1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới ..................................................................................... 12 1.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam ...................................................................................... 13 1.5 Các biện pháp bảo quản sau thu hoạch ...................................................................... 15 1.5.1 Vi sinh vật gây hỏng quả .................................................................................... 15 1.5.2 Các phƣơng pháp bảo quản sau thu hoạch ......................................................... 17 1.5.3 Cam và các phƣơng pháp bảo quản cam ............................................................ 20 1.6 Công nghệ bảo quản cam bằng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng ......................... 23 1.6.1. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp bảo quản cam bằng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng.................................................................................................................... 23 iii 1.6.2 Thành phần trong chế phẩm .............................................................................. 24 1.6.3 Phƣơng pháp sử dụng chế phẩm ......................................................................... 25 1.7 Nghiên cứu chế phẩm chăm sóc da ........................................................................... 25 1.7.1 Nấm da và bệnh nấm da ..................................................................................... 25 1.7.2 Đặc điểm của nấm Candida gây bệnh trên da .................................................... 28 1.7.3 Đặc điểm của nấm Trichophyton gây bệnh trên da ............................................ 29 1.7.4 Thành phần cơ bản trong chế phẩm chăm sóc da .............................................. 30 CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 34 2.1 Nguyên vật liệu .......................................................................................................... 34 2.1.1 Nguyên liệu ........................................................................................................ 34 2.1.2 Thiết bị, hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ........................................................... 35 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................... 36 2.2.1 Phƣơng pháp tách chiết tinh dầu nghệ vàng ....................................................... 36 2.2.2 Phƣơng pháp tách phân đoạn tinh dầu nghệ vàng ............................................. 38 2.2.3 Phƣơng pháp xác định chỉ số hóa lý và phân tích thành phần tinh dầu nghệ ..... 38 2.2.4 Phƣơng pháp kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng ...... 40 2.2.5 Xây dựng qui trình bảo quản cam Hà Giang ở quy mô phòng thí nghiệm........ 42 2.2.6 Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình bảo quản bằng chế phẩm tinh dầu nghệ vàng ............................................................................................ 43 2.2.7. Tối ƣu hóa quy trình sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng trong bảo quản cam Hà Giang bằng phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm. ....................................... 45 2.2.8 Phƣơng pháp đánh giá an toàn của chế phẩm bảo quản chứa tinh dầu nghệ .... 46 2.2.9 sinh trƣởng nấm da với tinh dầu nghệ vàng ............. 47 2.2.10 Phƣơng pháp đánh giá các chỉ tiêu cảm quan, hóa lí của chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu nghệ vàng ........................................................................................ 48 2.2.11 Phƣơng pháp đánh giá độ kích ứng da của chế phẩm chăm sóc da .................. 48 2.2.12 Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................................ 50 CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 51 3.1 Khảo sát phƣơng pháp thu nhận tinh dầu nghệ vàng................................................. 51 3.1.1 Hiệu quả thu nhận tinh dầu nghệ vàng bằng các phƣơng pháp khác nhau. ........ 51 3.1.2 Xác định các chỉ số hóa lý của tinh dầu nghệ vàng tách chiết bằng các phƣơng pháp khác nhau ........................................................................................................... 53 3.1.3 Phân tích vàng tách chiết bằng các phƣơng pháp khác nhau…… .................................................................................................................... 55 iv LCHN ....... 59 3.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng in vitro ...................... 62 3.3.1 Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng tách chiết bằng các phƣơng pháp khác nhau .............................................................................................. 62 3.3.2 Ảnh hƣởng của nồng độ tinh dầu nghệ vàng LCHN lên sinh trƣởng của một số chủng vi khuẩn ........................................................................................................... 64 3.3.3 Ảnh hƣởng của nồng độ tinh dầu nghệ vàng LCHN lên sinh trƣởng của một số chủng nấm men ........................................................................................................... 67 3.3.4 Ảnh hƣởng của nồng độ tinh dầu nghệ vàng LCHN lên sinh trƣởng của một số chủng nấm mốc ........................................................................................................... 70 3.3.5 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của các phân đoạn tinh dầu nghệ vàng LCHN…. .................................................................................................................... 71 3.4 Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng LCHN trên cam ........ 73 3.5. Nghiên cứu xây dựng quy trình bảo quản cam bằng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng ............................................................................................................................ 77 3.5.1 Xác định công thức chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng ................................... 77 3.5.1.1 Lựa chọn dung môi .......................................................................................... 77 3.5.1.2 Lựa chọn phụ gia tạo chế phẩm ...................................................................... 78 3.5.1.3 Xác định nồng độ tinh dầu nghệ vàng trong chế phẩm ................................... 79 3.5.2. Xây dựng mô hình bảo quản cam Hà Giang bằng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng qui mô phòng thí nghiệm ................................................................................... 80 3.5.3 Đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng đến cam sau thời gian bảo quản .............................................................................................................. 84 3.5.4 Đánh giá độ an toàn của chế phẩm bảo quản có chứa tinh dầu nghệ vàng ........ 91 3.5.5 Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quy trình sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng trong bảo quản cam Hà Giang .................................................................. 93 3.5.6 Tối ƣu hóa quy trình sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng trong bảo quản cam Hà giang .............................................................................................................. 95 3.5.7 Quy trình sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng bảo quản cam ............. 100 3.6 Nghiên cứu tạo chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu nghệ ............................... 102 3.6.1 Đánh giá khả năng ức chế sinh trƣởng nấm da của tinh dầu nghệ vàng .......... 102 ................................. 104 3.6.3 Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu nghệ vàng.................................................................................................................. 106 v 3.6.3.1 Lựa chọn các thành phần chính trong chế phẩm chăm sóc da ..................... 106 3.6.3.2 Quy trình tạo chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu nghệ vàng ............... 109 3.6.3.3 Kiểm tra đánh giá chất lượng chế phẩm chăm sóc da .................................. 110 KẾT LUẬN ....................................................................................................................... 112 KIẾN NGHỊ....................................................................................................................... 112 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 113 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 127 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT BSE: Bovine Spongiform Encephalopathy CA - Controlled Atmosphere (Kiểm soát khí quyển) COX: cycloxygenase d: Đƣờng kính lỗ đục D: Đƣờng kính vòng kháng khuẩn DMSO: dimethylsulfoxide EG: Ethylene glycol EMAP: equilibrium modified atmosphere packaging (bao gói bằng màng khí quyển điều chỉnh) EPA: Environmental Protection Agency (Cơ quan bảo vệ môi trƣờng) GC-MS: Gas Chromatography/ Mass Spectometry (Sắc ký khí ghép khối phổ) GO: Garlic Oil (Dầu tỏi) GRAS: Generally Recognized As Safe (đánh giá an toàn) HIV: Human Immuno-deficiency Virus (virus làm suy giảm miễn dịch ở ngƣời) IC: Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế) LCHN: Lôi cuốn hơi nƣớc LDL: Low Density Lipoprotein (lipoprotein tỉ trọng thấp) LOX: Liquid oxygen (oxy lỏng) MA: Modified atmosphere (Khí quyển điều chỉnh) MBC: Minimum Bactericidal Concentration (Nồng độ tối thiểu diệt vi khuẩn) MFC: nồng độ tối thiểu diệt nấm MIC: Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MKT: Minimum killing time (Thời gian diệt thấp nhất) MMP: Matrix metallopeptidase MPA: Meat-Pepton-Agar NĐTD: Nồng độ tinh dầu PG: Propylene Glycol ROS: Reactive oxygen species TBZ: Thiabendazole TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam VSV: Vi sinh vật vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1: Một số chất diệt nấm đƣợc sử dụng trong bảo quản quả sau thu hoạch [8] ....... 18 Bảng 1. 2: Phân loại các bệnh nấm da [49]. ........................................................................ 26 Bảng 1. 3: Các thành phần thƣờng có trong chế phẩm chăm sóc da [113] ......................... 30 Bảng 2. 1: Các chủng vi sinh vật đƣợc sử dụng của phòng CNSH ..................................... 34 Bảng 2. 2: Môi trƣờng Czapek- dox .................................................................................... 35 Bảng 2. 3: Môi trƣờng Hansen ............................................................................................ 35 Bảng 2. 4: Môi trƣờng MPA................................................................................................ 35 Bảng 2. 5: Môi trƣờng Sabouraud ....................................................................................... 36 Bảng 2. 6: Phiếu đánh giá cảm quan bằng phép thử cho điểm thị hiếu ............................... 45 Bảng 2. 7: Bố trí thí nghiệm sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng .......................... 45 Bảng 2. 8: Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp của các mẫu BQC ....................................... 47 Bảng 2. 9: Mức độ phản ứng trên da thỏ ............................................................................ 49 Bảng 2. 10: Phân loại các phản ứng trên da thỏ .................................................................. 50 ................... 51 háp LCHN .............. 52 Bảng 3. 3: Chỉ số hóa lý của tinh dầu nghệ tách chiết bằng các phƣơng pháp khác nhau .. 54 Bảng 3. 4: Thành phần của tinh dầu nghệ vàng khi ............................................................ 56 Bảng 3. 5: Kết quả tách phân đoạn tinh dầu nghệ vàng LCHN ở áp suất 20mmHg ......... 60 Bảng 3. 6: Thành phần hóa học của các phân đoạn tinh dầu nghệ vàng ............................. 61 Bảng 3. 7: Khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng .......................................... 62 Bảng 3. 8: Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ vàng LCHN ..................................... 64 Bảng 3. 9: Khả năng kháng nấm men của tinh dầu nghệ vàng LCHN ................................ 67 Bảng 3. 10: Khả năng ức chế nấm mốc của tinh dầu nghệ vàng LCHN ............................. 70 Bảng 3. 11: Khả năng ức chế vi sinh vật của các phân đoạn tinh dầu nghệ vàng ............... 72 Bảng 3. 12: Ảnh hƣởng của nồng độ và khả năng ức chế .................................................. 74 Bảng 3. 13: Khả năng ức chế sinh trƣởng vi sinh vật của tinh dầu nghệ ............................ 77 Bảng 3. 14: Khả năng ức chế vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng ....................................... 78 Bảng 3. 15: Thành phần phụ gia của chế phẩm BQC ......................................................... 79 Bảng 3. 16: Tỉ lệ cam bị hỏng theo thời gian và nhiệt độ bảo quản (%) ............................. 80 Bảng 3. 17: Kết quả bảo quản cam bằng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng ................... 81 Bảng 3. 18: Chất lƣợng cam trƣớc bảo quản ....................................................................... 84 Bảng 3. 19: Chất lƣợng cảm quan của cam sau thời gian bảo quản .................................... 89 viii Bảng 3. 20: Khả năng chấp nhận mùi quả cam sau khi xử lý bằng chế phẩm .................... 90 Bảng 3. 21: Trọng lƣợng chuột trƣớc và sau thử nghiệm 7 ngày với mẫu BQC (g) ........... 92 Bảng 3. 22: Tỉ lệ tổn thất khối lƣợng theo nồng độ chế phẩm BQCTD khác nhau ............ 94 Bảng 3. 23: Tỉ lệ tổn thất khối lƣợng theo thời gian tiếp xúc BQC khác nhau ................... 94 Bảng 3. 24: Tỉ lệ tổn thất khối lƣợng theo số lần nhúng chế phẩm BQC khác nhau .......... 95 Bảng 3. 25: Mức và khoảng biến thiên của các thông số thí nghiệm .................................. 96 Bảng 3. 26: Mô hình thí nghiệm đa yếu tố ảnh hƣởng đến tỉ lệ tổn thất của chế phẩm ...... 96 Bảng 3. 27: Kết quả phân tích hồi quy ................................................................................ 97 Bảng 3. 28: Hoạt tính kháng nấm da của tinh dầu nghệ vàng ........................................... 103 Bảng 3. 29: Ảnh hƣởng nồng độ tinh dầu nghệ vàng lên sinh trƣởng............................... 103 Bảng 3. 30: Ảnh hƣởng của thời gian phơi nhiễm lên khả năng ....................................... 104 Bảng 3. 31: Thành phần chế phẩm chăm sóc da ............................................................... 108 Bảng 3. 32: Đánh giá một số chỉ tiêu chất lƣợng của chế phẩm chăm sóc da ................... 110 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. 1: Cây và dịch chiết nghệ vàng................................................................................. 4 Hình 1. 2: Cấu trúc của một số hợp chất đƣợc nhận dạng trong tinh dầu nghệ [38]. ........... 5 Hình 1. 3: Cơ chế kháng khuẩn của tinh dầu lên màng tế bào vi sinh vật [43]. .................... 9 Hình 2. 1: Quy trình đánh giá khả năng kháng vi sinh của tinh dầu nghệ vàng trên cam ... 42 Hình 3. 1: Quy trình tách chiết tinh dầu nghệ vàng bằng phƣơng pháp LCHN. ................. 53 Hình 3. 2: Tinh dầu nghệ vàng tách chiết bằng lôi cuốn hơi nƣớc ...................................... 55 Hình 3. 3: Sắc ký đồ thành phần tinh dầu nghệ tách bằng lôi cuốn hơi nƣớc ..................... 57 Hình 3. 4: Sắc ký đồ thành phần tinh dầu nghệ tách bằng n-hexane ................................... 57 Hình 3. 5: Sắc ký đồ thành phần tinh dầu nghệ tách bằng chloroform ............................... 58 Hình 3. 6: Các phân đoạn sau khi tách tinh dầu nghệ vàng LCHN ở 20mmHg ................. 60 Hình 3. 7: Biểu diễn khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng.......................... 63 Hình 3. 8: Khả năng phát triển của chủng Pseudomonas putida ......................................... 66 Hình 3. 9: Khả năng phát triển của chủng Listonella damsela ............................................ 66 Hình 3. 10: Khả năng phát triển của chủng Bacillus cereus ................................................ 66 Hình 3. 11: Khả năng phát triển của chủng Micrococcus luteus ......................................... 66 Hình 3. 12: Khả năng phát triển của chủng Rhodoturola sp. trên môi trƣờng có tinh dầu .. 68 Hình 3. 13: Khả năng phát triển của chủng Candida sp. trên môi trƣờng có tinh dầu ........ 69 Hình 3. 14: Khả năng phát triển của chủng Torulopsis sp.trên môi trƣờng có tinh dầu .... 69 Hình 3. 15: Khả năng phát triển của chủng Hansenulla sp. trên môi trƣờng có tinh dầu... 69 Hình 3. 16: Khả năng ức chế một số chủng nấm mốc của tinh dầu nghệ vàng ................... 71 Hình 3. 17: Cam bị nhiễm nấm men, nấm mốc sau thời gian bảo quản 10 ngày ................ 75 Hình 3. 18: Ảnh hƣởng của nồng độ và khả năng ức chế nấm men, nấm mốc của tinh dầu nghệ vàng trên cam sau 30 ngày bảo quản .......................................................................... 76 Hình 3. 19: Cam bảo quản ở nhiệt độ phòng ngày đầu tiên ............................................... 82 Hình 3. 20: Cam bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 5 ngày ..................................................... 82 Hình 3. 21: Cam bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 20 ngày .................................................. 83 Hình 3. 22: Cam bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 30 ngày .................................................. 83 Hình 3. 23: Cam bảo quản ở điều kiện lạnh ngày đầu tiên .................................................. 83 Hình 3. 24: Cam bảo quản trong điều kiện lạnh sau 15 ngày bảo quản .............................. 83 Hình 3. 25: Biểu diễn tỉ lệ tổn thất khối lƣợng trong quá trình bảo quản .......................... 85 Hình 3. 26: Biểu diễn sự biến đổi màu sắc của cam trong quá trình bảo quản. .................. 86 Hình 3. 27: Biểu diễn sự biến đổi hàm lƣợng đƣờng trong quá trình bảo quản .................. 86 x Hình 3. 28: Biển diễn sự biến đổi hàm lƣợng axit tổng số .................................................. 87 Hình 3. 29: Biểu diễn sự biến đổi hàm lƣợng vitaminC ...................................................... 88 Hình 3. 30: Ảnh hƣởng của các yếu tố đến tỉ lệ tổn thất khối lƣợng................................... 98 Hình 3. 311: Ảnh hƣởng của nồng độ chế phẩm và số lần nhúng tới tỉ lệ tổn thất ............. 98 Hình 3. 322: Ảnh hƣởng của nồng độ chế phẩm, thời gian tiếp xúc tới tỉ lệ tổn thất ......... 98 Hình 3. 33: Mức độ đáp ứng sự mong đợi giảm tỉ lệ tổn thất khối lƣợng khi sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng BQC bảo quản cam.......................................................... 99 Hình 3. 34: Độ bám dính của chế phẩm BQC trên cam theo thời gian nhúng .................... 99 Hình 3. 35: Quy trình sử dụng chế phẩm BQC bảo quản cam .......................................... 101 Hình 3. 36: Sự phát triển của nấm men trên môi trƣờng chứa tinh dầu ............................ 105 Hình 3. 37: Sự phát triển của nấm mốc trên môi trƣờng chứa tinh dầu ............................ 105 Hình 3. 38: Quy trình tạo chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu nghệ vàng ................ 109 xi MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trên thế giới hiện nay rất nhiều chất khác nhau có hoạt tính sinh học nguồn gốc từ thực vật đã đƣợc đƣa vào sản xuất ở quy mô công nghiệp hoặc bán công nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công – nông nghiệp và cho y học. Ở nƣớc ta, việc nghiên cứu, thu nhận và ứng dụng các chất hoạt tính sinh học từ thực vật đã và đang đƣợc quan tâm, phát triển. Trong các loại thực vật đƣợc nghiên cứu ứng dụng, củ nghệ đang đƣợc sử dụng rộng rãi để sản xuất các chế phẩm sinh học và các chế phẩm này đƣợc dùng trong các ngành sản xuất thực phẩm, y học, mỹ phẩm… Theo phân loại thực vật, chi nghệ có nhiều loài khác nhau phân bố ở Ấn Độ, Thái Lan, Việt Nam và bắc Australia. Loài nghệ còn có tên gọi khác là Uất kim, Khƣơng hoàng... tên khoa học là Curcuma longa L., thuộc họ gừng (Zingiberaceae), là một họ thực vật phân bố rộng khắp các vùng nhiệt đới, đặc biệt là vùng Đông Nam Á [26]. Trong những năm gần đây, một số báo cáo đã công bố thành phần và các đặc tính sinh học (kháng khuẩn, chống oxy hóa, kháng u và kích thích hệ miễn dịch) của dịch chiết họ Zingiberaceae [41, 118]. Các hợp chất của tinh dầu nghệ vàng thuộc nhóm sesquiterpenoids (ar-turmerone, -turmerone, -turmerone…). Hoạt tính sinh học của tinh dầu đƣợc biết bao gồm kháng vi sinh vật, diệt muỗi, cảm ứng apoptosis, ức chế sinh nitrogen oxide và prostagladin và tăng cƣờng chức năng gan [73, 74, 82, 95]. Chất màu vàng sáng đƣợc tách từ củ nghệ rất đƣợc ƣa chuộng sử dụng trên thế giới nhƣ một loại gia vị, không độc, đáp ứng tiêu chuẩn y tế trong nhuộm màu thực phẩm, có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khoẻ ngƣời tiêu dùng. Việc nghiên cứu tách chiết tinh dầu nghệ và các hợp chất có trong tinh dầu, đồng thời xác định hoạt tính sinh học của chúng là việc làm cần thiết, khả thi góp phần đƣa các hợp chất thiên nhiên ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, dƣợc phẩm và mỹ phẩm. Do đó, chúng tôi đã tiến hành với đề tài: “Nghiên cứu tạo một số chế phẩm chức năng chứa tinh dầu nghệ vàng” là hƣớng đi nhằm sử dụng các chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, để tạo ra các chế phẩm có tiềm năng sử dụng trong thực tế, an toàn cho sức khoẻ con ngƣời, thay thế cho hóa chất tổng hợp hiện đang đƣợc dùng. 1 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1 Mục tiêu nghiên cứu: Sử dụng tinh dầu nghệ vàng kết hợp với một số phụ gia nhằm mục tiêu: - Tạo chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng có tiềm năng sử dụng trong bảo quản quả tƣơi sau thu hoạch, an toàn cho ngƣời sử dụng và thân thiện với môi trƣờng - Tạo chế phẩm chăm sóc da chứa tinh dầu nghệ vàng có khả năng phòng chống các bệnh nấm ngoài da và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. 2.2 Nội dung nghiên cứu:  Khảo sát phƣơng pháp thu nhận tinh dầu nghệ vàng  Xác định chỉ số hóa lý và phân tích thành phần của tinh dầu nghệ vàng  Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng in vitro  Nghiên cứu xây dựng quy trình bảo quản cam bằng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng - Xác định nồng độ tinh dầu và công thức chế phẩm bảo quản quả sau thu hoạch đạt hiệu quả cao. - Đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm đến quả sau thời gian bảo quản. - Xây dựng quy trình sử dụng chế phẩm bảo quản quy mô phòng thí nghiệm. - Đánh giá độ an toàn của chế phẩm.  Nghiên cứu tạo chế phẩm chăm sóc da chứa tinh dầu nghệ vàng - Đánh giá khả năng ức chế sinh trƣởng nấm da của tinh dầu nghệ vàng - Xác định nồng độ tinh dầu và công thức chế phẩm chăm sóc da - Đánh giá độ kích ứng da của chế phẩm. 3. Ý nghĩa khoa học của đề tài 3.1 Ý nghĩa lý thuyết Luận án bổ sung nguồn tƣ liệu và khả năng khai thác ứng dụng tinh dầu nghệ ở Việt Nam. Ngoài ra kết quả của luận án khẳng định xu hƣớng sử dụng các chất tự nhiên có hoạt tính sinh học trong việc phát triển các sản phẩm mới ứng dụng trong công nghệ sau thu hoạch cũng nhƣ trong y dƣợc là khả thi và có ý nghĩa thực tế cao. Luận án cũng là tƣ liệu giúp cho sinh viên và những nhà khoa học quan tâm đến lĩnh vực này tham khảo. 3.2 Ý nghĩa thực tế Chế phẩm có chứa tinh dầu nghệ vàng dùng trong bảo quản sau thu hoạch có tiềm năng áp dụng cho bảo quản quả có giá trị xuất khẩu, đáp ứng yêu cầu cao của các nhà nhập 2 khẩu. Chế phẩm chăm sóc da là tiền đề để phát triển các loại thuốc chống nấm da tự nhiên, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng 4. Tính mới của đề tài Luận án là công trình nghiên cứu khoa học và đã xác định đƣợc các hợp chất có trong tinh dầu nghệ vàng Hƣng Yên chủ yếu thuộc nhóm sesquitecpen, đồng thời xác định hoạt tính kháng một số loại vi sinh vật gây hỏng quả và 2 chủng nấm da, là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu phát triển các sản phẩm mới làm phong phú thêm tính ứng dụng của tinh dầu nghệ trong lĩnh vực công nghệ sau thu hoạch và y dƣợc. Xây dựng quy trình bảo quản cam bằng chế phẩm sinh học có chứa tinh dầu nghệ ở nhiệt độ thƣờng an toàn, hiệu quả, góp phần đa dạng hóa các biện pháp bảo quản sau thu hoạch ở Việt Nam an toàn, thân thiện môi trƣờng. Bƣớc đầu nghiên cứu đƣa ra công thức chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu nghệ vàng thay thế các chất bảo quản tổng hợp trong mỹ phẩm và chất kháng nấm trong phòng và điều trị bệnh nấm da, bảo vệ sức khỏe cộng đồng. 3 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cây nghệ vàng Cây nghệ (Curcuma sp.), một thảo dƣợc lƣu niên, là thành viên của họ gừng (Zingiberaceae). Cây mọc cao từ 0,60 đến 1m, lá nhọn, hình chữ nhật và hoa vàng hình phễu đƣợc trồng rộng rãi ở Châu Á, Ấn Độ, Trung Quốc và các nƣớc có khí hậu nhiệt đới. Thân rễ của cây là bộ phận đƣợc dùng làm thuốc, thƣờng đƣợc đun sôi, rửa sạch và sấy khô, nghiền thành bột màu vàng [1]. Nghệ vàng (Curcuma longa L.) còn có tên gọi là Uất kim, Khƣơng hoàng. Nghệ đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm làm phụ gia tạo hƣơng vị và chất màu E100 để nhuộm màu thực phẩm, dƣợc phẩm thay thế những chất màu tổng hợp. Nghệ cũng đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền của Trung Quốc, Ấn Độ, dùng uống chữa bệnh dạ dày, thuốc bổ, dùng ngoài để bảo vệ và chữa các bệnh ngoài da. Y học cổ truyền Ấn Độ khẳng định việc sử dụng bột nghệ có thể chống các rối loạn về mật, chứng chán ăn, chứng sổ mũi, ho, các vết thƣơng, các bệnh về gan, thấp khớp và viêm xoang [1, 26]. Mối quan tâm mới về nghệ bắt đầu từ những năm 1970 khi các nhà nghiên cứu tìm đƣợc bằng chứng cho thấy nghệ có đặc tính kháng viêm. Rễ nghệ đƣợc biết có mùi thơm và có tính khử trùng. Thử nghiệm lâm sàng chứng minh đặc tính diệt khuẩn của nghệ và hiện nay nghệ đƣợc dùng cho nhiều mục đích hơn là chỉ trong thực phẩm. Tầm quan trọng của nghệ trong y học thay đổi đáng kể vì đã phát hiện ra đặc tính chống oxy hóa của các hợp chất phenol tự nhiên trong nghệ [74, 83]. Nghiên cứu gần đây tập trung vào tác dụng kháng khuẩn, chống ung thƣ, chống viêm, bảo vệ gan và chống oxy hoá, ngoài ra còn sử dụng nghệ trong chữa rối loạn dạ dày và bệnh tim mạch [5, 14]. Hình 1. 1: Cây và dịch chiết nghệ vàng 4 1.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu nghệ vàng 1.2.1 Thành phần hóa học của tinh dầu nghệ vàng Thành phần hóa học của củ (thân rễ) cây nghệ chứa ít nhất 7% các loại dầu dễ bay hơi có sắc tố màu vàng. Tinh dầu nghệ vàng ở dạng lỏng, có mùi thơm đặc trƣng của nghệ với thành phần dễ bay hơi nhƣ α-pinen, β-pinen, limonene, tecpinen, caryophyllen, curcumen, linalool, camphen, turmerone, ar-turmerone, curlone, cymene, sesquiphellandrene… Các hợp chất này thuộc nhóm sesquiterpenes và monoterpenes là những hợp chất đã đƣợc chứng minh có hoạt tính kháng khuẩn [38, 87]. Hình 1. 2: Cấu trúc của một số hợp chất được nhận dạng trong tinh dầu nghệ [38]. Tinh dầu nghệ nhận đƣợc từ các bộ phận khác nhau của cây có thành phần khác nhau. Các thành phần dầu chính của hoa là p-cymen-8-ol (26,0%), terpinolene (7,4%) và 1,8-cineole (4,1%), 54 thành phần đƣợc phát hiện trong dầu lá, trong đó 30 phân tử (chiếm 91% dầu) đƣợc xác định. Các thành phần chính đƣợc tìm thấy là -phellandrene (32,6%), terpinolene (26,0%), 1,8-cineole (6,5%) và p-cymene (5,9%). Thành phần chính của dầu lá từ Nigeria, India, Bhutan và Vietnam là -phellandrene, mặc dù lƣợng có thay đổi. Dầu lá của Nigeria có lƣợng -phellandrene cao hơn (47,7%), trong khi của Vietnam và Bhutan có hàm lƣợng -phellandrene thấp hơn (15,9% và 14,6%, tƣơng ứng). Lƣợng terpinolene của tinh dầu Nigeria là 18,9%, của Vietnam 5,5% và Bhutan 11,6%. Dầu lá của Vietnam 5 và Bhutan có hàm lƣợng 1,8-cineole cao hơn (15,9% và 14,6%, tƣơng ứng), p-cymene (13,2% và 13,3%, tƣơng ứng) và -pinene (8,9% và 7,2%, tƣơng ứng). Trong thí nghiệm của Leela và cộng sự dầu lá chứa sesquiterpenes, ar-turmerone, turmerone và curlone, trong khi các chất này không có trong tinh dầu ở Nigeria [84]. Tinh dầu từ rễ có 43 chất, trong đó 24 hợp chất (68,8% dầu) đƣợc xác định, phần lớn là ar-turmerone (46,8%), ar-curcumene (7,0%) và dehydro-curcumene (4,3%). Tinh dầu từ thân củ gồm 47 chất và 24 chất (70% dầu) đƣợc xác định. Các thành phần chính bao gồm ar-turmerone (31,1%), turmerone (10,0%), curlone (10,6%) và ar-curcumene (6,3%). Turmerone, một trong những thành phần chính của dầu thân củ không có trong dầu rễ, trong khi curlone chỉ có vết, -3-carene, -terpinene, Z- -ocimene, E- -ocimene, - terpinene, 1,3,8-paramenthatriene và E-nerolidal không phát hiện đƣợc trong dầu rễ và dầu thân củ [84, 109]. Phụ thuộc vào cây trồng và phƣơng pháp thu nhận tinh dầu, lƣợng các thành phần chính trong tinh dầu thay đổi khá lớn [41, 84, 132]. Theo Zeng và cộng sự, tinh dầu thân rễ của Curcuma kwangsiensis có các thành phần chính là β-elemene, curzerenone, curcumol, curdione, germacrone, and β–elemenone [145]. Garg và cộng sự đã phân tích thành phần tinh dầu từ 27 giống nghệ vàng khác nhau ở miền bắc Ấn Độ nhận đƣợc bằng phƣơng pháp chƣng cất hơi nƣớc, lƣợng tinh dầu thay đổi từ 0,16% đến 1,94% trên trọng lƣợng tƣơi và xác định đƣợc 7 thành phần chính là β-pinene, p-cumene, α-curcumene, β-curcumene, arturmerone, α-turmerone và β-turmerone. Mặc dù có sự thay đổi đáng kể về lƣợng của các terpenes chính này, nhƣng có thể chia các giống nghệ thành 2 nhóm: nhóm 1 với tổng 7 thành phần trong khoảng 58-79% và nhóm 2 tổng này nằm trong khoảng 10-22% [58]. Khi chiết bằng dung môi hexan, tinh dầu của các loài nghệ khác nhau có thành phần chính thay đổi nhƣ sau: ar-turmerone (2,6–70,3%), α-turmerone (0- 46,2%) và zingiberene (0 36,8%). Tinh dầu nghệ của French Polynesia nhận đƣợc bằng phƣơng pháp CO2 siêu tới hạn có các thành phần chính là zingiberene (16,7%), ar-turmerone (15,5%) và - phellandrene (10,6%). Tinh dầu thân rễ C. longa của Ấn Độ chứa tới 59,7% ar-turmerone, cùng với vết của các chất khác: limonene, cineole, curcumene, zingiberene, bisabolene, β – phellandrene và turmerone. Tinh dầu thân rễ C. longa L. của Bhutan có các thành phần chính là ar-turmerol (16,7–25,7%), α -turmerone (30,1–32,0%) và β -turmerone (14,7– 18,4%), trong khi của lá là α- phellandrene (18,2%), 1,8-cineole (14,6%), p-cymene (13,3%) và terpinolene (11,6%). Phân tích thành phần tinh dầu thân rễ C. domestica của Malaysia phát hiện α -termerone (45,3%), β -turmerone (13,5%) và linalool (14,9%) là 6 những thành phần chính. Hàm lƣợng của các thành phần phụ thuộc vào tuổi cây nhƣ lƣợng sesquiterpene turmerone tăng, trong khi monoterpenes 1,8-cineole và α -phellandrene giảm cùng với sự trƣởng thành của cây [15, 44, 84]. 1.2.2. Hoạt tính sinh học của dịch chiết và tinh dầu nghệ vàng Hoạt tính chống viêm: Tinh dầu của Curcuma longa có hiệu quả chống viêm và ức chế enzyme hyaluronidase. Các tác giả cho rằng hiệu quả chống oxy hóa của tinh dầu đƣợc chứng minh bằng sự ức chế khả năng sự khuếch tán của hyaluronidase enzyme. Dầu từ lá Curcuma longa cũng cho thấy hoạt tính chống viêm ở chuột bạch thực nghiệm. Dịch chiết thân rễ làm giảm sự phát triển của u hạt và không độc đối với động vật [95]. Hoạt tính chống oxy hóa: Scatezzini và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của một số thực vật sử dụng trong y học cổ truyền ở Ấn Độ. Nghiên cứu này chỉ ra rằng cây nghệ đƣợc sử dụng nhiều trong liệu pháp ayurvedic cách đây hàng ngàn năm [120]. Lee và cộng sự phát hiện ra thành phần hủy tiểu cầu là ar-turmerone có nguồn gốc từ thân rễ của cây nghệ Curcuma longa L., ở nồng độ ức chế 50% (IC50) ar-turmerone ức chế sự lắng của tiểu huyết cầu do collagen cảm ứng (IC50, 14,4 μM) và arachidonic acid (IC50 43,6 μM) [82]. Xác định đƣợc hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ thân rễ tƣơi và khô tách chiết bằng methanol từ 4 dòng nghệ vàng (Curcuma longa L.) [44]. Tác dụng giảm mỡ: khi sử dụng 1mg dịch chiết nghệ trong 15 ngày, lƣợng lipid giảm rõ rệt, lƣợng cholesterol tổng, triglycerides và LDL giảm từ 55-40% ở động vật thí nghiệm. Ngoài ra, dịch chiết này còn làm giảm nguy cơ xơ cứng động mạch. Các tác giả cho rằng uống dịch chiết nghệ ức chế oxy hóa LDL và có hiệu quả giảm cholesterol ở thỏ thí nghiệm [73]. Hoạt tính kháng vi sinh vật: Một số tác giả đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của dầu nghệ, Jayaprakasha và cộng sự đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dầu nghệ đƣợc tách từ dịch chiết sau khi tách lấy curcumin. Tinh dầu nghệ đƣợc thử với các chủng Staphylococcus albus, Staphylococcus aureus và Bacillus typhosus, kết quả cho thấy đã ức chế sinh trƣởng của Staphylococcus albus, Staphylococcus aureus ở các nồng độ khác nhau. Đối với vi khuẩn đƣờng ruột, sinh trƣởng của Lactobacilus bị ức chế bởi tinh dầu nghệ ở nồng độ 4,5-90μl/100ml. Dịch chiết nghệ bằng alcohol cũng có hiệu quả ức chế (10–200mg/ml) nhƣng không mạnh bằng tinh dầu [74]. Một số tác giả chƣng cất dầu nghệ ở áp suất thấp (20mmHg) thu đƣợc 2 phân đoạn, các phân đoạn này đƣợc thử hoạt tính sinh học với một số chủng nấm nhƣ Aspergillus flavus, A. parasiticus, Fusarium moniliforme và Penicillium digitatum. Bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc cho thấy phân đoạn nhận đƣợc ở 7 110-120oC có hiệu quả ức chế sinh trƣởng của các loại nấm tốt hơn. Kết quả phân tích GC/MS cho thấy trong phân đoạn này chủ yếu là turmerone và curlone cùng với các hợp chất oxy hóa khác [38, 54]. Theo Dhingra và cộng sự, tinh dầu nghệ (Curcuma longa L, ) độc đối với 7 loại nấm hại nông sản trong quá trình bảo quản. Phụ thuộc vào loại nấm, sự ức chế của chúng dao động từ 36-77%, Aspergillus flavus, Fusarium semitectum, Colletotrichum gloeosporioides và Cylindrocarpon musae là những loại mẫn cảm nhất bị ức chế trên 70%, trong đó ar-turmerone chiếm 87% và ar-turmerone tinh sạch có hoạt tính kháng nấm tƣơng tự nhƣ tinh dầu thô [51]. Behura và cộng sự thấy trong 5 nguồn bệnh nấm lúa đƣợc xử lý với tinh dầu nghệ, Rhizotonia solani mẫn cảm nhất với sự ức chế là 81% [40]. Tƣơng tự, Saju và cộng sự đã xác nhận tinh dầu nghệ ở nồng độ 1%-5% thì ức chế hoàn toàn sự phát triển của C. gloeosporioides, Sphaceloma caradmomi và Pestdlotiopsis palmarum, trong khi đó Fusarium solani chỉ bị ức chế 79% [118]. Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn đã tách nhóm sesquiterpenoids bằng dung môi n-hexan từ củ nghệ Curcuma cochinchinensis Gagnep đƣợc 4 hợp chất: curdione (A), curcumol (B), isocurcumenol (C) và curcumenol (D). Các tác giả đã nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật của các sesquiterpenoids này. Các hợp chất A, B và C trộn với nhau theo tỉ lệ 2 : 1 : 4 có khả năng ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum khác nhau. Nồng độ ức chế tối thiểu của hợp chất A lớn hơn 300 μg/ml đối với Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida albicans, Aspergillus niger. Candida albicans mẫn cảm với hợp chất B, C và D với nồng độ ức chế tối thiểu là 50 μg/ml [19]. 1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn của tinh dầu Cơ chế kháng khuẩn của tinh dầu đến tế bào vi khuẩn vẫn chƣa thực sự đƣợc sáng tỏ. Do tinh dầu có rất nhiều nhóm các hợp chất hóa học khác nhau, nên có lẽ hoạt tính kháng khuẩn của chúng không do một cơ chế đặc biệt nào mà có thể coi nhƣ là kết quả của việc liên hợp của nhiều cơ chế khác nhau. 8 Hình 1. 3: Cơ chế kháng khuẩn của tinh dầu lên màng tế bào vi sinh vật [43]. Đặc trƣng quan trọng nhất của những phân tử có mặt trong tinh dầu là tính kỵ nƣớc. Nhờ hoạt tính này mà nó tan tốt trong màng tế bào, điều này dẫn đến sự mất ổn định cấu trúc và làm tăng tính thấm của màng tế bào. Những thay đổi này gây ra sự rò rỉ của các ion và các chất nội bào. Nếu nhƣ mất quá nhiều cơ chất hoặc tế bào chất bị rò rỉ quá nhiều sẽ ảnh hƣởng đến sự sống của tế bào, làm cho tế bào bị chết [43]. Nhìn chung, tinh dầu chứa các hợp chất phenol nhƣ carvacrol, eugenol và thymol, có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất do nhóm thế có tính axit. Cơ chế của chúng tƣơng tự nhƣ các phenolics là làm thay đổi màng tế bào chất, gián đoạn lực đẩy proton và làm kết tủa các chất trong tế bào. Tầm quan trọng của sự có mặt nhóm hydroxyl trong các hợp chất phenolic đã đƣợc chứng minh. Các thành phần của tinh dầu cũng tác động lên các enzymes nhƣ ATPases nằm trong màng tế bào chất và đƣợc bao quanh bởi các phân tử lipid. Các phân tử lipophilic hydrocacbon có thể tích tụ trong lớp lipid kép và làm ảnh hƣởng đến tƣơng tác lipid-protein; ngoài ra có thể có sự tƣơng tác trực tiếp của các hợp chất lipophilic với phần kỵ nƣớc của protein. Một vài tinh dầu kích thích sinh trƣởng của pseudomycelia (một loại tế bào gắn với nhau do sự phân tách không hoàn thiện của các tế bào mới tạo thành) ở một số nấm men. Điều đó có thể thấy tác động của tinh dầu lên enzyme tham gia vào quá trình điều hòa năng lƣợng hoặc tổng hợp các thành phần cấu trúc quan trọng. Gần đây các nghiên cứu cho thấy điểm hoạt tính của các hydrocacbon vòng, gồm cả terpene hydrocacbons là màng tế bào nhƣ β-pinene làm rò rỉ K+, H+ và ảnh hƣởng đến hô hấp của nấm men. Tƣơng tự, cyclohexane, limonene và β-pinene cũng ức chế hô hấp và các quá trình trao đổi chất liên quan đến màng tế bào nhƣ S. cerevisiae. Các hydrocacbon terpenes nhƣ α-pinene, β -pinene, γ-terpinene và limonene đƣợc tìm thấy ảnh hƣởng tới 9