Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Nghiên cứu tạo màng và xử lý màng bc có kích thước và tính chất phù hợ với việc ...

Tài liệu Nghiên cứu tạo màng và xử lý màng bc có kích thước và tính chất phù hợ với việc hấp thu thuốc phục vụ việc sử dụng trên da

.PDF
76
259
69

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 ----------------------------------- ĐOÀN THỊ YẾN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THU VÀ GIẢI PHÓNG THUỐC NEOMYCIN CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE ĐỂ PHỤC VỤ VIỆC SỬ DỤNG QUA DA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Thành HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: TS. Nguyễn Xuân Thành, người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy, cô giáo của Trung tâm Hỗ trợ NCKH&CGCN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn bộ các thầy, cô giáo và cán bộ nhân viên Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 - những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 2 năm học tại đây. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới cha mẹ, chồng, người thân, bạn bè, những người luôn bên tôi, chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi những lúc gặp nhiều khó khăn nhất. Hà Nội, tháng 11 năm 2016 Học viên Đoàn Thị Yến LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lí thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã công bố. Trong tài liệu này tôi có sử dụng một số tài liệu của một số tác giả, tôi xin phép các tác giả này để bổ sung cho luận văn của mình. Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, tháng 11 năm 2016 Học viên Đoàn Thị Yến MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 3 3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 3 4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu .................................................................... 3 5. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 4 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 4 7. Đóng góp mới của luận văn .......................................................................... 4 NỘI DUNG ....................................................................................................... 5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5 1.1. Tổng quan về BC ....................................................................................... 5 1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra BC .......................................................................... 5 1.1.2. Đặc điểm cấu trúc của BC ...................................................................... 6 1.1.3. Tính chất lí hóa của BC........................................................................... 7 1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC................................. 9 1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da ......................................................................................... 11 1.2.1. Trên thế giới .......................................................................................... 11 1.2.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 14 1.3. Tổng quan về neomycin ........................................................................... 15 1.3.1. Công thức .............................................................................................. 15 1.3.2. Tính chất lí hóa...................................................................................... 16 1.3.3. Dược lí và dược động học ..................................................................... 16 1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định ................................................................... 17 1.4. Tình hình nghiên cứu về neomycin.......................................................... 17 1.4.1. Trên thế giới .......................................................................................... 17 1.4.2. Tại Việt Nam .......................................................................................... 18 1.5. Sinh lý hấp thu các chất qua da ................................................................ 18 1.5.1.Cấu trúc và chức năng sinh lý của da .................................................... 18 1.5.2. Cơ chế hấp thu các chất qua da ............................................................ 25 CHƯƠNG 2 . VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 25 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 25 2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 25 2.2.1. Chuẩn bị màng BC ................................................................................ 25 2.2.1.1. Lên men thu màng BC thô .................................................................. 25 2.2.1.2. Tạo màng BC tinh chế ........................................................................ 26 2.2.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết màng BC tinh chế........................................... 27 2.2.1.4. Xác định các tiêu chuẩn của màng BC tinh chế sử dụng chế tạo màng hấp thu thuốc ......................................................................................... 28 2.2.2. Chế tạo màng BC hấp thu neomycin ..................................................... 30 2.2.2.1. Chuẩn bị bộ đệm ................................................................................ 30 2.2.2.2. Xây dựng đường chuẩn neomycin ...................................................... 30 2.2.2.3. Chuẩn bị môi trường cho BC hấp thu thuốc ...................................... 31 2.2.2.4. Xác định lượng neomycin hấp thu vào màng BC .............................. 31 2.2.3. Xác định tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin thông qua hệ thống được thiết kế ............................................................................................................. 32 2.2.4. Phương pháp xử lí thống kê .................................................................. 35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 36 3.1. Thu màng BC và tinh chế màng............................................................... 36 3.1.1. Thu màng BC từ các môi trường lên men ............................................. 36 3.1.2. Tinh chế màng BC ................................................................................. 37 3.2. Kiểm tra một số tiêu chuẩn của màng BC tinh chế.................................. 38 3.2.1. Kết quả thử độ tinh khiết của màng BC tinh chế .................................. 38 3.2.2. Kết quả đo pH của màng BC tinh chế................................................... 39 3.2.3. Kết quả khảo sát khả năng cản vi khuẩn của màng BC ....................... 40 3.3. Phương trình đường chuẩn neomycin trong dung dịch đệm PBS .......... 43 3.4. Tỉ lệ neomycin hấp thu vào màng BC...................................................... 44 3.5. Tỉ lệ neomycin giải phóng từ các hệ thống màng BC mang thuốc đã thiết kế ..................................................................................................................... 48 3.6. Đánh giá động học giải phóng neomycin từ màng BC mang thuốc ........ 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 57 1. Kết luận ....................................................................................................... 57 2. Kiến nghị ..................................................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 58 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A - BC Agitade – Bacterial cellulose BC Bacterial celullose CNM Cao nấm men cs Cộng sự ĐHSP Đại học Sư phạm Đk Đường kính KTNN Kỹ thuật nông nghiệp PBS Phosphate buffered saline NCKH&CGCN Nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ Nxb Nhà xuất bản mht Khối lượng thuốc hấp thu MT1 Môi trường 1 MT2 Môi trường 2 MT3 Môi trường 3 S – BC Static – Bacterial celllulose DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần của các môi trường lên men thu màng BC ................. 26 Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS ...................................................................... 30 Bảng 2.3. Môi trường thử nghiệm cho màng BC hấp thu thuốc..................... 31 Bảng 3.1. Kết quả thu màng BC tươi. ............................................................. 37 Bảng 3.2. Kết quả đo pH ở các lô màng thí nghiệm ....................................... 40 Bảng 3.3. Tốc độ mất nước của màng BC …………………………………..38 Bảng 3.4. Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin vào màng BC dày 0,5cm ................ 44 Bảng 3.5. Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin vào màng BC dày 0,3cm ................ 44 Bảng 3.6. Tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin (%) từ màng BC lên men từ môi trường cao nấm men (màng CNM) .......................................................... 49 Bảng 3.7. Tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin (%) từ màng BC lên men từ môi trường nước dừa (màng dừa) .................................................................. 50 Bảng 3.8. Tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin (%) từ màng BC lên men từ môi trường nước gạo (màng gạo).................................................................... 51 Bảng 3.9. Tỉ lệ giải phóng thuốc từ dung dịch neomycin đối chứng nồng độ 2mg/ml ....................................................................................................... 51 Bảng 3.10. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng CNM (trong môi trường pH = 7,4) theo mô hình động học ..................................... 54 Bảng 3.11. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng dừa (trong môi trường pH = 7,4) theo mô hình động học ............................................... 50 Bảng 3.12. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng gạo (trong môi trường pH = 7,4) theo mô hình động học ................................................50 DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ Hình 1.1. Cellulose vi khuẩn ............................................................................ 6 Hình 1.2. Cellulose thực vật ............................................................................. 6 Hình 1.3. Cấu trúc A – BC (a) và S – BC (b) ................................................... 7 Hình 1.4. Thí nghiệm cấy BC dưới da động vật thí nghiệm. ............................ 8 Hình 1.5. Ứng dụng BC bọc vết thương cho vùng da bị bỏng ....................... 12 Hình 1.6. Màng BC – lidocaine hydrochloride ứng dụng trên da .................. 13 Hình 1.7. Sử dụng màng BC hấp thu thuốc điều trị nhiễm khuẩn .................. 13 Hình 1.8. Công thức cấu tạo của neomycin .................................................... 15 Hình 1.9. Cấu trúc siêu hiển vi của da ……….…………………………….. 20 Hình 1.10. Cấu tạo của biểu bì da người …………………………………... 20 Hình 2.1. Quy trình tinh chế màng BC ........................................................... 27 Hình 2.2. Mô hình thí nghiệm khuếch tán thuốc qua da Franz....................... 33 Hình 3.1. Nuôi cấy màng BC tại phòng thí nghiệm Trung tâm Hỗ trợ NCKH&CGCN trường ĐHSP Hà Nội 2 ........................................................ 36 Hình 3.2. Môi trường dinh dưỡng lên men thu màng ..................................... 36 Hình 3.3. Màng BC tạo ra từ vi khuẩn A. xylinum.......................................... 38 Hình 3.4. Kết quả tìm sự hiện diện của glucose trong dịch chiết màng BC.................................................................................................................... 39 Hình 3.5. Kết quả tìm sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng BC .... 39 Hình 3.6. Khả năng cản khuẩn của màng BC trong thử nghiệm 1 .................. 40 Hình 3.7. Khả năng cản khuẩn của màng BC trong thử nghiệm 2. ................. 41 Hình 3.8. Khả năng cản khuẩn của vải gạc vô trùng ...................................... 42 Hình 3.9. Phương trình đường chuẩn của neomycin trong môi trường đệm .................................................................................................................. 44 Hình 3.10. Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin của các loại màng có độ dày 0,5cm ............................................................................................................... 46 Hình 3.11. Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin của các loại màng có độ dày 0,3 cm .................................................................................................................... 47 1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Trong những năm gần đây, khoa học đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử dụng các vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo, tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng. Một trong những vật liệu sinh học có những đặc tính trên được chú ý là cellulose. Vật liệu này vượt trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [32]. Trong đó, Bacterial Cellulose (BC) là đối tượng của nhiều nghiên cứu ứng dụng của các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài. Đây là một loại vật liệu mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học, mỹ phẩm,... Theo một số kết quả nghiên cứu cho thấy màng BC được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Về mặt tính chất, BC có độ tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác. BC có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, BC còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước. BC còn là một mạng polyme sinh học có khả năng giữ nước rất lớn, giải phóng nước kéo dài. Đồng thời BC còn có tính xốp, độ ẩm cao, có lực bền cơ học cao. Vì vậy, BC có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ thống giải phóng thuốc qua da, qua đường miệng và mô – kĩ thuật, và một số ứng dụng y sinh học khác [6], [9], [14], [19], [20], [22], [24],… Xét về tiềm năng làm hệ thống giải phóng thuốc qua da, ngoài những đặc điểm lợi thế trên, màng BC còn là hàng rào cản oxi và các vi sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và sự tác động của tia cực tím. Đồng thời BC cũng là vật liệu không gây kích ứng da (do có bản chất là saccharide) [24]. Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da với một số loại thuốc có hiệu quả 2 rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường. Việc sử dụng màng BC cho việc thẩm thấu qua da của nhiều thuốc, cụ thể là lidocaine [53], [54], ibuprophen [54], caffeine [49], diclofenac [50], amoxicillin [45], benzalconium chloride [19] và sulfadiazine bạc [37] cho kết quả tích cực. Các kết quả nghiên cứu này đã chứng minh rằng các tính chất cơ học của BC có độ bền và trương nở tương tự như da người; hỗ trợ sự phát triển, lây lan, và di chuyển của tế bào da người [14], [18], [19]. Lợi thế lớn nhất từ việc sử dụng màng BC hấp thu thuốc là khả năng chữa lành vết thương, đặc tính bảo vệ, không dị ứng với da và khả năng hấp thu dịch tiết với việc giải phóng các loại thuốc trị liệu có liên quan. Hầu hết các chế phẩm đắp qua da được sản xuất bởi các vật liệu khác nhau. Do đó, một hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc kéo dài có ít lớp, hoặc thậm chí một lớp duy nhất có thể đơn giản hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí [11], [53]. Trong điều trị nhiễm khuẩn trên da không có triệu chứng toàn thân, được y học khuyến cáo tránh sử dụng các chế phẩm kháng sinh thường được dùng rộng rãi toàn thân như penicilin, sulfonamid, streptomycin, gentamicin,... do có khả năng gây mẫn cảm và tạo thuận lợi cho phát triển vi khuẩn kháng thuốc. Để giảm thiểu phát triển vi khuẩn kháng thuốc, chỉ dùng các chế phẩm chứa các loại kháng sinh bôi trên da. Neomycin là một tác nhân kháng khuẩn hữu ích để điều trị vết thương do tụ cầu và liên cầu gây ra. Tuy nhiên, neomycin cũng như một số chế phẩm kháng sinh khác được khuyến cáo tránh sử dụng toàn thân do có khả năng gây mẫn cảm và tạo thuận lợi cho phát triển vi khuẩn kháng thuốc. Để giảm thiểu phát triển vi khuẩn kháng thuốc, chỉ dùng các chế phẩm chứa các loại kháng sinh trên dạng bôi trên da. Tuy nhiên, những phát hiện gần đây cho thấy rằng neomycin ở dạng chế phẩm dung dịch có bán trên thị trường thì khả năng hấp 3 thu vào da quá nhanh (trong vòng 4 giờ đầu có thể hấp thụ 85,01% ở vùng da tổn thương) dễ gây độc trên tai, suy giảm thần kinh và thận, có thể gây mẫn cảm khi điều trị lâu dài [17]. Điều này không thích hợp với việc điều trị một số bệnh viêm da mủ trên da cần điều trị kéo dài. Bên cạnh đó, chế phẩm dạng dung dịch thường nhanh khô và không có khả năng cản vi khuẩn bên ngoài xâm nhập. Vì vậy, giải pháp cần đặt ra cho vấn đề này là dùng một loại vật liệu có khả năng giải phóng kéo dài thuốc, có khả năng giữ ẩm vết thương và cản khuẩn,... Từ các nghiên cứu về màng BC và một số hạn chế của neomycin trong điều trị kháng khuẩn trên da, xét thấy đây là hướng nghiên cứu mới và triển vọng. Đó là lí do chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thu và giải phóng thuốc neomycin của màng bacterial cellulose để phục vụ việc sử dụng qua da”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu tiềm năng của màng BC trong việc hấp thu và giải phóng thuốc định hướng sử dụng qua da. - Thiết kế, chế tạo màng BC hấp thu thuốc neomycin nhiều nhất. Đánh giá khả năng giải phóng neomycin kéo dài từ hệ thống màng BC mang thuốc. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Nghiên cứu tạo màng và xử lí màng BC có kích thước và tính chất phù hợp với việc hấp thu thuốc phục vụ việc sử dụng trên da. - Đánh giá khả năng hấp thu và giải phóng thuốc neomycin của màng BC in vitro. 4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu - Vật liệu nghiên cứu: Màng BC làm từ sự lên men của vi khuẩn A. xylinum; thuốc neomycin tinh khiết 98% và một số chất khác. - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng hấp thu và giải phóng thuốc 4 neomycin của màng BC định hướng sử dụng qua da. 5. Phương pháp nghiên cứu - Lên men thu màng BC từ một số môi trường. - Tinh chế màng BC thô. - Đánh giá độ tinh khiết của màng BC. - Chế tạo màng BC hấp thu thuốc, xác định lượng thuốc hấp thu vào màng. - Xác định lượng thuốc giải phóng từ màng BC mang thuốc. - Xử lí thống kê. 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu tiềm năng của màng BC trong việc hấp thu và giải phóng thuốc định hướng sử dụng trên da. Từ kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về khả năng hấp thu cũng như kiểm soát thuốc của màng BC trên nhiều loại thuốc khác nhau nhằm tăng hiệu quả điều trị của các loại thuốc đó. Ý nghĩa thực tiễn: Việc sử dụng màng BC làm vật liệu để hấp thu và giải phóng thuốc kéo dài này có thể làm tăng sinh khả dụng của thuốc và khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường. 7. Đóng góp mới của luận văn Đây là đề tài đầu tiên tại Việt Nam sử dụng màng BC làm hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc neomycin trong điều trị nhiễm khuẩn trên da. Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể định hướng tạo hệ thống giải phóng thuốc kéo dài từ đó có thể áp dụng trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn trên da. 5 NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về BC Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, là thành phần chính của sinh khối thực vật cũng như đại diện cho các polymer ngoại bào của vi sinh vật. Cellulose vi khuẩn (becterial cellulose – BC) là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ [55]. 1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra BC BC là một polysaccharide được tổng hợp bởi các loài vi khuẩn khác nhau, chẳng hạn như Aerobacter, Acetobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Alacaligenes, Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobium và Sarcina [39]. Cho đến nay, A. xylinum được đánh giá là loài vi khuẩn có khả năng sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên. A. xylinum là loài vi khuẩn Gram âm sống hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử và là một trong những loài tiến hóa nhất của nhóm vi khuẩn tía. Mỗi tế bào A. xylinum có thể chuyển hóa tới 108 phân tử glucose và phân tử cellulose trong 1 giờ nên khả năng tổng hợp cellulose là rất lớn [3], [6], [8], [10], [27]. A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc không và không sinh bào tử (hình 1.1). Chúng là vi khuẩn Gram âm nhưng trọng lượng của chúng có thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường nuôi cấy. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì thế chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí và có khả năng tạo màng cellulose trên môi trường nuôi cấy [11]. Trên môi trường rắn sau khoảng 3 – 7 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc A. xylinum có dạng nhỏ, nhày, có màu kem, hơi trong nhưng sau 1 tuần thì khuẩn lạc to, đục, màu cà phê sữa, khô dần [11]. Trên môi trường lỏng sau 24 giờ nuôi cấy thì xuất hiện một lớp màng đục dày, sau 36 – 48 giờ hình thành một lớp màng trong và ngày càng dày. 6 1.1.2. Đặc điểm cấu trúc của BC Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer β – 1,4 – glucopyranose không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của BC giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [14], [18]. Theo Brown (1999) [21], BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ cellulose, đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 – 8nm. Hình 1.2 cho thấy rõ cấu trúc này. Hình 1.1. Cellulose vi khuẩn Hình 1.2. Cellulose thực vật (× 20 000 lần) [18] (×200 lần) [18] Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh, vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt nuôi cấy tĩnh, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy. Màng BC thu được dẻo dai, dày, có màu trắng trong hơi ngả màu vàng. BC được tạo ra từ môi trường nuôi cấy tĩnh gọi là Static – Bacterial cellulose (S – BC) còn BC tạo ra trong môi trường nuôi cấy động là Agitade – Bacterial cellulose (A – BC). Cấu trúc siêu hiển vi của BC được mô tả trong hình 1.3. 7 (a) (b) Hình 1.3. Cấu trúc A – BC (a) và S – BC (b) [36] BC được tạo ra từ phương pháp nuôi cấy tĩnh (S – B) có các bó xellulose chuỗi xếp song song quanh trục. Các sợi cellulose liên tục được tạo ra từ những lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết lại thành các vi sợi và bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song, sợi S – BC kéo dài và chồng lên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau không có tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào A. xylinum. Khi nuôi cấy động, một lượng nhỏ cellulose được hình thành dưới dạng huyền phù phân tán trong đó chuỗi β – 1,4 glucan xếp một cách ngẫu nhiên. BC được tạo ra bằng phương pháp động (A – BC) dưới dạng các hạt nhỏ, các sợi rối rắm, cong và không trật tự do sự dao động của môi trường nuôi cấy, hoặc các hạt bông hình sao phân tán trong môi trường, tuy nhiên bề mặt cắt ngang của sợi A – BC nhỏ hơn sợi S – BC. Có các nghiên cứu cho rằng, sự khác nhau giữa hai loại này ở mức độ kết tinh của nó và kích cỡ kết tinh của A – BC nhỏ hơn S – BC. 1.1.3. Tính chất lí hóa của BC Khả năng tương thích sinh học cao Cấu trúc sợi nano trong BC mang một số đặc điểm tương đồng với các thành phần ngoại bào, đặc biệt với collagen. Các sợi collagen và BC có kích thước tương tự nhau khoảng 100nm [20]. Một số nhà nghiên cứu đã chỉ ra BC 8 như một vật liệu collagen [31]. Trong y sinh ứng dụng, BC đang được tìm hiểu về vai trò sử dụng như collagen. Tuy nhiên, BC có thể có lợi thế so với collagen ở đặc điểm không gây dị ứng với hệ miễn dịch. Vì collagen có bản chất protein nên dễ bị nhận biết với hệ thống miễn dịch và dễ bị kích hoạt phản ứng miễn dịch, trong khi đó BC có lợi thế riêng biệt như một polysaccharide là ít miễn dịch kích thích. Khả năng tương thích sinh học của BC đã được nghiên cứu và chứng minh thành công trong các nghiên cứu trước đây [39]. Khả năng tương thích sinh học của BC được nghiên cứu cho đến nay vẫn cho kết quả tương tự. Helenius và cộng sự (cs) (2006) [28] trong một nghiên cứu in vivo cấy cellulose vi khuẩn dưới da ở chuột. Kết quả cho thấy sau 12 tuần, phát hiện bằng kính hiển vi cho thấy không có viên nang hoặc các tế bào xơ cho thấy cơ thể không phản ứng với BC (Hình 1.4). Hơn nữa, quanh vết cấy không có hiện tượng bị đỏ, sưng, hoặc tiết dịch. a. Một tuần sau khi cấy, BC cho thấy không có dấu hiệu phản ứng tại vị trí cấy. b. Độ phóng đại cấu trúc xốp của BC cho thấy xâm nhập của nguyên bào sợi thành các mạng lưới BC sau 12 tuần cấy. Đầu mũi tên là dấu hiệu của collagen được tổng hợp bởi các nguyên bào sợi. Hình 1.4. Thí nghiệm cấy BC dưới da động vật thí nghiệm [28] Độ bền cơ học lớn: BC có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng lượng nhẹ, độ bền đáng kể [10]. 9 Độ tinh khiết cao: BC là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp không có chứa lignin hay hemicellulose. Do đó BC có thể bị vi khuẩn phân hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh [49], [55]. Khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm: BC có cấu trúc dạng xốp nên có khả năng giữ nước đáng kể. Màng BC có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút khoảng 200 lần trọng lượng của nó. Bên cạnh đó BC còn có khả năng giải phóng nước kéo dài. Đây cũng là đặc tính của BC mà các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng BC trong lĩnh vực giải phóng thuốc [10], [14], [19], [55]. Tính chất của BC có thể thay đổi ở mỗi quá trình tổng hợp trong những môi trường khác nhau [38]. Các nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay là một nỗ lực để tìm kiếm các ứng dụng sáng tạo BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc điều trị nhiễm khuẩn trên da. 1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC Nguồn cacbon: Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzim, axit nucleic, và các sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy, các nguồn hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống vi sinh vật. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất BC được thể hiện ở bảng 1.1. Bảng 1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC Nguồn cacbon Năng suất Nguồn cacbon Năng suất tổng monosaccharide tổng hợp BC disaccharide hợp BC D – Glucose 100 Lactose 16 D – Fructose 92 Maltose 7 D – Galactose 15 Surcrose 33 D – Xylose 11 Cellobiose D – Arabinose 14 D – Sorbose 11 7 – 11 10 Nguồn nitơ: ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp nguyên liệu cho cơ thể sinh vật để hình thành nhóm amin (-NH2 và -NH-) trong các phân tử aminoaxit, nucleotit, các bazơ dị vòng [46]. Nguồn nitơ dễ hấp thu nhất với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4, NH4NO3, nguồn nitơ hữu cơ là pepton, cao nấm men [46]. Nguồn dinh dưỡng khoáng: Photpho bao giờ cũng chiếm tỉ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật. Photpho có mặt trong hầu hết các thành phần của tế bào. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng photpho, người ta sử dụng các nguồn dinh dưỡng photpho vô cơ như K2HPO4, KH2PO4, KNO3,... Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC như Mg, Fe, S, Na, Ca, Mn, Cl,... Một trong số nguyên liệu chủ yếu ngày nay được sử dụng để tạo màng BC là nước dừa già, nước vo gạo, dịch hoa quả, rỉ đường,... nên khi nuôi cấy không cần phải bổ sung nguyên tố vi lượng nữa [46]. Các chất kích thích sinh trưởng: các vitamin như pyridoxin, axit nicotinic, biotin được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp cellulose, trong khi pantothenate và riboflavin cho kết quả ngược lại [46]. Nước dừa già là nguồn nguyên liệu chủ yếu được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn thu màng BC. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành phần hóa học trong nước dừa có khác nhau. Lượng đường khử tổng và protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín. Đường ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sirbitol. Ngoài ra, nước dừa còn nhiều khoáng chất, vitamin, axit amin,... phù hợp cho quá trình hình thành màng BC [10]. Nước gạo cũng là một trong những thành phần thích hợp để tạo màng BC vì trong 11 nước gạo chứa nhiều cacbonhydrat, các vitamin nhóm B, các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn,... và axit amin. Ngoài ra các điều kiện nuôi cấy như độ pH, nhiệt độ, độ thông khí, thời gian nuôi cấy,... cũng ảnh hưởng đến quá trình hình thành màng BC. Vi khuẩn A. xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp. Do đó môi trường nuôi cấy thu màng BC cần được bổ sung thêm axit acetic nhằm axit hóa môi trường, đồng thời nó có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại [6], [46]. Nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy vi sinh vật tạo màng BC là từ khoảng 250C đến 300C. Ở nhiệt độ thấp quá, quá trình lên men xảy ra chậm. Nếu nhiệt độ quá cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [3], [6], [8], [10]. Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên điều kiện tiên quyết, quyết định đến năng suất tạo màng BC là độ thông khí. Tùy vào thời gian nuôi cấy để người ta thu được màng với độ dày mong muốn. Thường 24 giờ sau khi nuôi cấy sẽ xuất hiện lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36 – 48 giờ sẽ hình thành lớp màng mỏng và ngày càng dày lên. 1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da 1.2.1. Trên thế giới BC là vật liệu hấp dẫn cho các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực dùng BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da. Một số nghiên cứu trên thế giới về khả năng hấp thu và giải phóng thuốc của màng BC định hướng sử dụng qua da với một số loại thuốc đã cho thấy
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan