Tài liệu Nghiên cứu tạo dung dịch keo bạc nano để phòng trừ bệnh rụng lá corynespora trên cây cao su do nấm corynespora cassiicola

LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dƣới bất kỳ hình thức nào. Tác giả luận án Lê Thị An Nhiên i TÓM TẮT LUẬN ÁN Đề tài “Nghiên cứu tạo dung dịch keo bạc nano để phòng trừ bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su do nấm Corynespora cassiicola” đƣợc thực hiện từ tháng 09/2011 đến tháng 01/2018 tại Bộ môn Công nghệ sinh học – Đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai và Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh. Mục tiêu của đề tài là tìm hiểu bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su do nấm Corynespora cassiicola gây ra và tìm phƣơng pháp tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rụng lá Corynespora có hiệu quả trong phòng thí nghiệm và trên cây cao su trong vƣờn ƣơm. Nội dung của đề tài bao gồm: Phân lập và khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng lên sự sinh trƣởng của nấm C. cassiicola, từ đó tìm biện pháp phòng chống chúng; Khảo sát khả năng ức chế nấm C. cassiicola của vi khuẩn Bacillus subtilis và Bacillus thuringiensis; Khảo sát khả năng tổng hợp bạc nano từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis; Chế tạo dung dịch keo bạc nano - chitosan bằng phƣơng pháp chiếu xạ; Khảo sát hiệu lực ức chế nấm C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano trong điều kiện in vitro; Khảo sát khả năng phòng và trị bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su trong vƣờn ƣơm bằng dung dịch keo bạc nano - chitosan với kích thƣớc hạt bạc nano 10 nm. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: Đã phân lập đƣợc chủng nấm C. cassiicola và xác định đƣợc một số đ c tính sinh trƣởng của nấm C. cassiicola nhƣ phát triển và sinh bào tử tốt nhất trên môi trƣờng thạch lá cao su ở pH 6,5, nhiệt độ 29°C. Đã tạo đƣợc 4 chế phẩm có khả năng ức chế và diệt nấm C. cassiicola gồm Huyền phù B. subtilis với mật độ vi khuẩn là 2,2  109 tế bào/ml; Huyền phù B. thuringiensis với mật độ vi khuẩn là 1,6  109 tế bào/ml; Dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis có kích thƣớc hạt trung bình từ 7 nm đến 12 nm, thời gian ổn định 20 ngày; Dung dịch keo bạc nano - chitosan đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp chiếu xạ có kích thƣớc hạt từ 5 nm đến 15 nm, thời gian ổn định là 12 tháng. Trong điều kiện in vitro, hiệu lực ức chế nấm C. cassiicola của huyền phù B. subtilis và B. thuringiensis lần lƣợt là 45,67 và 33,04 ii ; Dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ở nồng độ 90 ppm đạt 66,30 %, dung dịch keo bạc nano - chitosan ở nồng độ 50 ppm đạt từ 52,08 đến 100,00 khi kích thƣớc hạt bạc nano trung bình giảm từ 15 nm xuống 5 nm. Tại cùng nồng độ 90 ppm, dung dịch keo bạc nano - chitosan với kích thƣớc hạt 10 nm có hiệu lực ức chế nấm đạt 100,00 %, cao hơn dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis với kích thƣớc hạt bạc nano trung bình 7 nm (đạt 66,30 %). Trong điều kiện trong vƣờn ƣơm, dung dịch keo bạc nano - chitosan với kích thƣớc hạt trung bình 10 nm có hiệu lực phòng bệnh tốt nhất ở nồng độ 2,5 ppm với t lệ lá bị nhi m bệnh là 34,27 sau 28 ngày chủng bệnh và có hiệu lực trị bệnh tốt nhất tại nồng độ 12,5 ppm với t lệ lá cây cao su bị nhi m bệnh giảm từ 50,00 6,67 %; cây cao su bị nhi m bệnh giảm từ 50,00 xuống còn 6,75 giảm từ 22,13 % xuống còn 15,03 % sau 28 ngày xử lý dung dịch. iii xuống còn và ch số bệnh ABSTRACT The thesis title: “Study on synthesis of silver nanoparticles solution for controlling Corynespora leaf fall disease on rubber trees causing by Corynespora cassiicola” was carried out at the Department of Biotechnology, Dong Nai Biotechnology Application Center and Biotechnology Center of Ho Chi Minh City from September 2011 to January 2018. The objective of the thesis is studying Corynespora leaf fall disease on rubber trees causing by Corynespora cassiicola and finding a method to create a product to defence and eliminate Corynespora leaf fall disease effectively in the laboratory and on rubber trees in nurseries. The contents of this research including: Isolation and investigation of a number of factors affecting the growth of C. cassiicola, thereby finding ways to prevent them; Investigating the ability of Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis to inhibit C. cassiicola; Investigation of the ability to biosynthesize silver nanoparticles from B. subtilis intracellular fluid; Synthesis silver nanoparticles/chitosan by gamma ray irradiation method; Investigating the effective inhibition of C. cassiicola of silver nanoparticles solution in in vitro conditions; Survey of the ability to prevent and treat Corynespora leaf fall disease on rubber trees in nurseries with silver nanoparticles/chitosan with 10 nm silver nanoparticles size. The results showed that: C. cassiicola was isolated and some growth characteristics of C. cassiicola were identified as development and the best spore growth on rubber leaf agar media at pH 6.5, temperature of 29 ° C. Four types of biological product against C. cassiicola were created, including B. subtilis suspension with a bacterial density of 2.2  109 cells/ml; B. thuringiensis suspension with a bacterial density of 1.6  109 cells/ml; The silver nanoparticles solution systhesized from B. subtilis intracellular fluid had an average particle size from 7 to 12 nm, with the stabilization being about 20 days; The silver nanoparticles/chitosan solution had an average particle size from 5 to 15 nm, with the stabilization being about 12 months. iv In in vitro conditions, C. cassiicola resistance of B. subtilis and B. thuringiensis were 45.67 % and 33.04 %, respectively. The antifungal effect of silver nanoparticles solution systhesized from B. subtilis intracellular fluid was 66.30 % at 90 ppm. The antifungal effect of silver nano particles/chitosan solution reached from 52.08 % to 100.00 % when silver nanoparticle size decreased from 15 to 5 nm, at a concentration of 50 ppm. At the 90 ppm of concentration, the antifungal effect of silver nanoparticles/chitosan solution with an average particle size 10 nm (reached 100.00 %) was slightly higher than the silver nanoparticles solution systhesized from B. subtilis intracellular fluid with an average particle size 7 nm (reached 66.30 %). In in vivo conditions, the treatment of AgNPs /chitosan solution with an average particle size 10 nm was the best preventative effect at a concentration of 2.5 ppm with the infected leaves of 34.27 % after 28 days of C. cassiicola infection (defence effect). For the elimination effect, the treatment of AgNPs /chitosan solution at a concentration of 12.5 ppm was able to reduce from 50.00 % to 6.67 % of infected leaves; from 50,00 % to 6.75 % of infected trees and from 22.13 % to 15.03 % of infection index after 28 days of treatment. v LỜI CẢM ƠN Đầu tiên con muốn bày tỏ lòng biết ơn đến Cha, Mẹ, những ngƣời đã nuôi nấng, dạy dỗ con, tạo điều kiện và niềm tin để con có đủ nghị lực vƣợt qua khó khăn trong cuộc sống và trƣởng thành nhƣ ngày hôm nay. Con xin mãi mãi trân trọng khắc ghi công ơn của Cha, Mẹ. Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn Thầy PGS. TS. Nguy n Đức Lƣợng; Cô PGS. TS. Lê Thị Thủy Tiên; Thầy PGS. TS. Lê Quang Luân và Anh Trần Tây Sơn đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quý báu; đã giúp em vƣợt qua những khó khăn trong suốt quá trình làm Luận án. Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trƣờng, các thầy, cô Phòng Đào tạo Sau đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Kỹ thuật Hóa học, Bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện tốt nhất trong quá trình học tập, nghiên cứu và bảo vệ Luận án. Em xin chân thành cảm ơn Cô PGS. TS. Nguy n Thúy Hƣơng, TS. Huỳnh Ngọc Oanh đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu và giúp đỡ em trong khóa học. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Lãnh đạo Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh, Lãnh đạo Phòng cùng toàn thể các anh, chị, em Phòng Công nghệ sinh học Vật liệu và Nano - Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và hỗ trợ em trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Em xin cảm ơn Ban Lãnh đạo Sở Khoa học và Công nghệ t nh Đồng Nai, Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai đã tạo điều kiện cho em trong suốt khóa học. Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội đồng đánh giá Luận án các cấp, đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu để Luận án đƣợc hoàn ch nh. Xin chân thành biết ơn! Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2019 Nghiên cứu sinh Lê Thị An Nhiên vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i TÓM TẮT LUẬN ÁN .................................................................................................... ii ABSTRACT ...................................................................................................................iv LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................vi MỤC LỤC .................................................................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................ xii DANH MỤC BẢNG .....................................................................................................xv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................xvi MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................5 Tổng quan về cây cao su ....................................................................................5 1.1.1 Đ c điểm sinh học của cây cao su ............................................................... 5 1.1.2 Tình hình phát triển của cây cao su ............................................................. 5 1.1.3 Một số bệnh hại của cây cao su ...................................................................6 1.2 Tổng quan về bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola gây ra trên cây cao su .........................................................................................................7 1.2.1 Sơ lƣợc về bệnh rụng lá Corynespora ......................................................... 7 1.2.2 Đ c điểm nhận diện của bệnh rụng lá Corynespora....................................9 1.2.3 Một số nghiên cứu về bệnh rụng lá Corynespora của cây cao su .............12 1.3 Tổng quan về nấm Corynespora cassiicola ..................................................... 14 1.3.1 Đ c điểm phân loại của nấm C. cassiicola ...............................................14 1.3.2 Lịch sử phát hiện nấm C. cassiicola ......................................................... 14 1.3.3 Hình thái học và đ c điểm sinh học của nấm C. cassiicola ...................... 15 1.4 Tổng quan về công nghệ nano .........................................................................16 1.4.1 Khái niệm về khoa học, công nghệ và vật liệu nano.................................16 1.4.2 Cơ sở khoa học của công nghệ nano ......................................................... 17 1.4.2.1 Hiệu ứng bề mặt ................................................................................. 17 1.4.2.2 Kích thước tới hạn .............................................................................. 17 1.4.2.3 Chuyển tiếp từ tính chất cổ điển đến tính chất lượng tử .................... 17 1.4.3 Các phƣơng pháp chế tạo vật liệu nano ....................................................17 vii 1.4.3.1 Phương pháp từ trên xuống ................................................................ 17 1.4.3.2 Phương pháp từ dưới lên.................................................................... 18 1.4.4 Hạt nano kim loại và các phƣơng pháp chế tạo hạt nano kim loại ...........18 1.4.4.1 Hạt nano kim loại ............................................................................... 18 1.4.4.2 Các phương pháp chế tạo hạt nano kim loại ..................................... 18 1.4.5 Tổng quan về bạc nano .............................................................................19 1.4.5.1 Bạc nano ............................................................................................. 19 1.4.5.2 Tính chất kháng khuẩn của bạc nano................................................. 21 1.5 Tổng hợp nano bạc bằng phƣơng pháp sinh học .............................................23 1.5.1 Tổng quan về tổng hợp nano bạc bằng phƣơng pháp sinh học .................23 1.5.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................................25 1.5.2.1 Đặc điểm phân loại học của vi khuẩn B. subtilis ............................... 25 1.5.2.2 Khả năng kháng vi sinh vật củ vi khuẩn 1.5.3 subtilis.......................... 26 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis ..........................................27 1.5.3.1 Đặc điểm phân loại học của vi khuẩn B. thuringiensis ...................... 27 1.5.3.2 Khả năng kháng vi sinh vật của vi khuẩn B. thuringiensis ................ 28 1.5.4 Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về tổng hợp bạc nano nhờ vi khuẩn ...................................................................................................................28 1.6 Chế tạo dung dịch keo bạc nano bằng phƣơng pháp chiếu xạ ......................... 30 1.6.1 Giới thiệu về công nghệ bức xạ ................................................................ 30 1.6.2 Chế tạo bạc nano bằng phƣơng pháp chiếu xạ ..........................................30 1.6.3 Vai trò của chất ổn định trong dung dịch keo bạc nano ............................ 32 1.6.4 Một số nghiên cứu về tính ức chế nấm của dung dịch keo bạc nano đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp chiếu xạ ......................................................................34 CHƢƠNG 2 2.1 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................................... 37 Vật liệu, hóa chất thí nghiệm ...........................................................................37 2.1.1 Vật liệu thí nghiệm ....................................................................................37 2.1.2 Hóa chất thí nghiệm ..................................................................................37 2.2 Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................. 38 2.2.1 Phân lập và khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm C. cassiicola gây bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su ................................ 38 viii 2.2.1.1 Thu mẫu lá cây cao su bị bệnh r ng lá Corynespora, phân lập nấm C. cassiicola ..................................................................................................... 38 2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng củ môi trường nuôi cấ khác nh u l n khả năng sinh trưởng của nấm C. cassiicola và sự hình thành bào tử củ nấm C. cassiicola .................................................................................................... 39 2.2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ l n khả năng sinh trưởng của nấm C. cassiicola ..................................................................................................... 39 2.2.1.4 Khảo sát ảnh hưởng củ p l n khả năng sinh trưởng của nấm C. cassiicola ..................................................................................................... 39 2.2.2 Khảo sát khả năng ức chế nấm C. cassiicola của vi khuẩn B. subtilis và B. thuringiensis ......................................................................................................40 2.2.3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp bạc nano nhờ vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................................................... 42 2.2.3.1 Khảo sát khả năng tổng hợp bạc nano từ dịch nội bào và xác tế bào vi khuẩn B. subtilis ........................................................................................... 42 2.2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng củ p đến quá trình tổng hợp bạc nano từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis .............................................................................. 43 2.2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tổng hợp bạc nano từ dịch nội o vi khuẩn su tilis ...................................................................... 43 2.2.3.4 Khảo sát độ ổn định của dung dịch keo bạc nano tổng hợp từ dịch nội o vi khuẩn su tilis theo thời gi n ............................................................. 44 2.2.4 Chế tạo dung dịch keo bạc nano-chitosan bằng phƣơng pháp chiếu xạ ...44 2.2.4.1 Xác định liều xạ bão hòa của dung dịch ở các nồng độ bạc nitrate khác nhau.......................................................................................................... 44 2.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitos n l n kích thước hạt bạc nano ............................................................................................................ 45 2.2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitos n l n kích thước hạt bạc nano ..................................................................................................... 46 2.2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng củ độ deacetyl củ chitos n l n kích thước hạt bạc nano ........................................................................................................... 46 2.2.4.5 Khảo sát độ ổn định của dung dịch keo bạc nano - chitosan theo thời gian .......................................................................................................... 47 2.2.5 Khảo sát hiệu lực ức chế nấm C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano trong điều kiện in vitro .......................................................................................... 47 2.2.6 Khảo sát khả năng phòng và trị bệnh rụng lá Corynespora của cây cao su trong vƣờn ƣơm của dung dịch keo bạc nano - chitosan .......................................49 ix 2.2.6.1 Khảo sát khả năng ph ng bệnh r ng lá Corynespora của cây cao su trong vườn ươm của dung dịch keo bạc nano - chitosan. .......................... 49 2.2.6.2 Khảo sát khả năng trị bệnh r ng lá Corynespora của cây cao su trong vườn ươm của dung dịch keo bạc nano - chitosan. ................................ 51 2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu ...............................................................................52 2.4 Nơi thực hiện thí nghiệm .................................................................................53 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................ 54 3.1 Phân lập và khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm C. cassiicola gây bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su .........................................54 3.1.1 Thu mẫu lá cây cao su bị bệnh rụng lá Corynespora, phân lập nấm C. cassiicola...........................................................................................................54 3.1.2 Ảnh hƣởng của các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau lên sự sinh trƣởng và hình thành bào tử của nấm C. cassiicola .......................................................... 57 3.1.3 Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự sinh trƣởng của nấm C. cassiicola ..........60 3.1.4 Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy lên sự sinh trƣởng của nấm C. cassiicola...........................................................................................................63 3.2 Khảo sát khả năng ức chế nấm C. cassiicola của vi khuẩn B. subtilis và B. thuringiensis ..........................................................................................................65 3.3 Một số yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình tổng hợp bạc nano từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis. .......................................................................................................67 3.3.1 Quá trình tổng hợp bạc nano từ dịch nội bào và xác tế bào vi khuẩn B. subtilis ...............................................................................................................67 3.3.2 Ảnh hƣởng của pH đến quá trình tổng hợp bạc nano từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ....................................................................................................69 3.3.3 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình tổng hợp bạc nano từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ................................................................................................ 72 3.3.4 Thời gian ổn định của dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ......................................................................................... 76 3.4 Chế tạo dung dịch keo bạc nano - chitosan bằng phƣơng pháp chiếu xạ ........77 3.4.1 Liều xạ bão hòa của dung dịch bạc có nồng độ bạc nitrate khác nhau .....77 3.4.2 Ảnh hƣởng của nồng độ chitosan lên kích thƣớc hạt bạc nano ................81 3.4.3 nano Ảnh hƣởng của khối lƣợng phân tử (Mw) chitosan lên kích thƣớc hạt bạc ...................................................................................................................82 x 3.4.4 Ảnh hƣởng của chitosan có độ deacetyl hóa (DD) khác nhau lên kích thƣớc hạt bạc nano .................................................................................................84 3.4.5 Thời gian ổn định của dung dịch keo bạc nano - chitosan theo thời gian lƣu trữ ...................................................................................................................85 3.5 Hiệu lực ức chế nấm C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano trong điều kiện in vitro........................................................................................................................ 87 3.5.1 Hiệu lực ức chế nấm C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ở các nồng độ khác nhau ....................... 87 3.5.2 Hiệu lực ức chế nấm C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano - chitosan với các kích thƣớc hạt bạc nano khác nhau ........................................................... 89 3.5.3 Hiệu lực ức chế nấm C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano - chitosan với với các nồng độ bạc nano khác nhau ............................................................... 91 3.5.4 So sánh hiệu lực ức chế nấm C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis với dung dịch keo bạc nanochitosan ..................................................................................................................94 3.5.5 Ảnh hƣởng của nồng độ và kích thƣớc hạt bạc nano của dung dịch keo bạc nano - chitosan đến hình thái sợi nấm Corynespora cassicola ....................... 98 3.6 Hiệu lực phòng bệnh và trị bệnh rụng lá Corynespora của cây cao su trong vƣờn ƣơm của dung dịch keo bạc nano - chitosan ..................................................100 3.6.1 Hiệu lực phòng bệnh rụng lá Corynespora của cây cao su trong vƣờn ƣơm của dung dịch keo bạc nano - chitosan ...............................................................100 3.6.2 Hiệu lực trị bệnh rụng lá Corynespora của cây cao su trong vƣờn ƣơm của dung dịch keo bạc nano - chitosan .....................................................................106 CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..........................................................118 4.1 Kết luận ..........................................................................................................118 4.2 Kiến nghị ........................................................................................................118 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................................119 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................120 PHỤ LỤC ...................................................................................................................128 xi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Các dạng triệu chứng bệnh Corynespora do nấm C. cassiicola gây ra trên lá cây cao su [9] .............................................................................................................10 Hình 1.2 Các dạng triệu chứng bệnh Corynespora do nấm C. cassiicola gây ra trên gân lá cây cao su [9] ......................................................................................................10 Hình 1.3 Các dạng triệu chứng bệnh Corynespora do nấm C. cassiicola gây ra trên cuống lá cây cao su [9] ..................................................................................................11 Hình 1.4 Các dạng triệu chứng bệnh Corynespora do nấm C. cassiicola gây ra trên chồi cây cao su [9] .........................................................................................................11 Hình 1.5 Các dạng triệu chứng bệnh Corynespora do nấm C. cassiicola gây ra trên tán lá, chồi cây cao su [9] .............................................................................................. 11 Hình 1.6 Hình thái khuẩn ty nấm C. cassiicola [9] ....................................................... 15 Hình 1.7 Bào tử nấm C. cassiicola dƣới kính hiển vi điện tử [9] .................................15 Hình 1.8 Cơ chế diệt vi khuẩn của bạc nano thông qua các tƣơng tác với protein và nucleic acid [33] ............................................................................................................21 Hình 1.9 Cơ chế diệt nấm của bạc nano thông qua tác động của các gốc oxy hóa tự do (ROS) đến ty thể và DNA [33] .................................................................................22 Hình 1.10 Các cơ chế tác động của bạc nano đến vi sinh vật [32] ................................ 23 Hình 1.11 Cơ chế giả thuyết của quá trình tổng hợp bạc nano [40].............................. 25 Hình 1.12 Vi khuẩn B. subtilis dƣới kính hiển vi [42] ..................................................26 Hình 1.13 Vi khuẩn B. thuringiensis dƣới kính hiển vi [42] .........................................27 Hình 1.14 Cấu trúc phân tử của chitosan [62] ............................................................... 33 Hình 2.1 Sơ đồ quá trình khảo sát khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn B. subtilis và B. thuringiensis ..............................................................................................................41 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tổng hợp bạc nano từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis .......43 Hình 2.3 Sơ đồ quá trình chế tạo dung dịch keo bạc nano - chitosan bằng phƣơng pháp chiếu xạ .................................................................................................................44 Hình 2.4 Cây cao su đƣợc trồng ổn định trong vƣờn ƣơm ............................................49 Hình 2.5 Gây vết thƣơng trên lá cây cao su trong vƣờn ƣơm .......................................50 Hình 2.6 Phun huyền phù bào tử nấm lên lá cây cao su để chủng bệnh ....................... 51 Hình 2.7 Sơ đồ tổng quát các nội dung nghiên cứu ………………………………….53 Hình 3.1 Tản nấm C. cassiicola sau 6 ngày nuôi cấy ...................................................54 Hình 3.2 Bào tử của nấm C. cassiicola sau 10 ngày nuôi cấy (vật kính x40) ...............55 Hình 3.3 Kết quả so sánh với các trình tự có trong ngân hàng gen bằng công cụ BLAST........................................................................................................................... 56 Hình 3.4 Tốc độ phát triển của hệ sợi nấm C. cassiicola trên các môi trƣờng .............58 Hình 3.5 Sự gia tăng đƣờng kính của tản nấm C. cassiicola theo thời gian trên môi trƣờng PDA, thạch malt và thạch lá cao su ...................................................................58 xii Hình 3.6 Tản nấm C. cassiicola trên môi trƣờng PDA, thạch malt và thạch lá cao su sau 5 ngày nuôi cấy (Hình a), sau 10 ngày nuôi cấy (Hình b) ......................................59 Hình 3.7 Bào tử của nấm C. cassiicola (vật kính 40)....................................................60 Hình 3.8 Sự gia tăng đƣờng kính của tản nấm C. cassiicola theo thời gian ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau .................................................................................................61 Hình 3.9 Tốc độ phát triển của hệ sợi nấm C. cassiicola ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau ............................................................................................................................... 62 Hình 3.10 Tản nấm sau 10 ngày nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau ............62 Hình 3.11 Sự gia tăng đƣờng kính của tản nấm C. cassiicola theo thời gian ở các pH khác nhau ....................................................................................................................... 64 Hình 3.12 Tốc độ tăng trƣởng của hệ sợi nấm C. cassiicola ở các pH khác nhau ........64 Hình 3.13 Tản nấm ở các pH khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy ....................................65 Hình 3.14 Hiệu lực ức chế nấm C. cassiicola của vi khuẩn B. subtilis và B. thuringiensis sau 10 ngày nuôi cấy ...........................................................................66 Hình 3.15 Tản nấm C. cassiicola sau 10 ngày nuôi cấy trên các môi trƣờng có huyền phù vi khuẩn B. subtilis và B. thuringiensis ..................................................................67 Hình 3.16 Quang phổ hấp thụ của dịch nội bào và xác tế bào vi khuẩn B. subtilis sau quá trình tổng hợp bạc nano ....................................................................................68 Hình 3.17 Màu sắc của dung dịch nội bào và xác tế bào vi khuẩn trƣớc và sau khi tổng hợp bạc nano ..................................................................................................................69 Hình 3.18 Quang phổ hấp thụ của dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ở các pH khác nhau .................................................................70 Hình 3.19 Dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ở các pH khác nhau ...................................................................................... 70 Hình 3.20 Sự phân bố kích thƣớc của các hạt bạc nano trong dung dịch keo nano bạc đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ở các pH khác nhau ...................... 72 Hình 3.21 Quang phổ hấp thụ của dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ở các nhiệt độ khác nhau......................................................... 73 Hình 3.22 Dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ở các nhiệt độ khác nhau ..............................................................................74 Hình 3.23 Sự phân bố kích thƣớc của các hạt bạc nano trong dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ở các nhiệt độ khác nhau ..............75 Hình 3.24 Quang phổ hấp thụ của dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis theo thời gian ..........................................................................77 Hình 3.25 Dung dịch bạc nitrate - chitosan trƣớc khi chiếu xạ .....................................78 Hình 3.26 Dung dịch keo bạc nano - chitosan 1 sau khi chiếu xạ ở các điều kiện khác nhau ....................................................................................................................... 78 Hình 3.27 Quang phổ hấp thụ của dung dịch keo bạc nano - chitosan ở các liều xạ khác nhau ....................................................................................................................... 79 Hình 3.28 Ảnh TEM của các mẫu dung dịch keo bạc nano - chitosan với nồng độ bạc nitrate khác nhau sau khi chiếu xạ .................................................................................80 xiii Hình 3.29 Ảnh TEM của các mẫu dung dịch keo bạc nano - chitosan 10 mM bạc nitrate với nồng độ chitosan khác nhau sau khi chiếu xạ ..............................................82 Hình 3.30 Ảnh TEM của mẫu dung dịch keo bạc nano - chitosan gồm 10 mM bạc nitrate, 1 chitosan có khối lƣợng phân tử khác nhau sau khi chiếu xạ ..................... 83 Hình 3.31 Ảnh TEM của dung dịch keo bạc nano - chitosan đƣợc ổn định bằng chitosan có độ deacetyl hóa khác nhau..........................................................................85 Hình 3.32 Quang phổ hấp thụ của dung dịch keo bạc nano - chitosan theo thời gian lƣu trữ ............................................................................................................................ 86 Hình 3.33 Sự tăng trƣởng của tản nấm C. cassiicola khi bổ sung dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ở các nồng độ khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy .....................................................................................................88 Hình 3.34 Tản nấm C. cassiicola khi bổ sung dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ở các nồng độ khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy ..................................................................................................................................88 Hình 3.35 Tản nấm C. cassiicola sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng thạch lá cao su có bổ sung dung dịch keo bạc nano - chitosan ở các kích thƣớc khác nhau .................90 Hình 3.36 Tản nấm C. cassiicola sau 9 ngày nuôi cấy khi bổ sung dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm) ở các nồng độ khác nhau ........................................................ 93 Hình 3.37 Sự tăng trƣởng của tản nấm C. cassiicola khi bổ sung dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm) với các nồng độ khác nhau sau 9 ngày nuôi cấy ....................94 Hình 3.38 Tản nấm C. cassiicola trong môi trƣờng có bổ sung dung dịch keo bạc nano với các nồng độ khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy. ........................................................ 97 Hình 3.39 Ảnh SEM của hệ sợi nấm C. cassiicola sau khi phun dung dịch keo bạc nano - chitosan với nồng độ và kích thƣớc hạt bạc trung bình khác nhau ………… 99 Hình 3.40 Biểu hiện do nấm C. cassiicola gây ra trên lá của cây cao su ....................101 Hình 3.41 Cây cao su trong vƣờn ƣơm đƣợc xử lý dung dịch keo bạc nano (10 nm) ở các nồng độ khác nhau sau 28 ngày chủng bệnh .........................................................105 Hình 3.42 Vết bệnh trƣớc và sau khi xử lý dung dịch keo bạc nano - chitosan …….107 Hình 3.43 Cây cao su trong vƣờn ƣơm sau 28 ngày xử lý bằng dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm) ở các nồng độ khác nhau ……………………………………113 Hình 3.44 Quy trình tạo huyền phù B. subtilis ……………………………………114 Hình 3.45 Quy trình tạo huyền phù B. thuringiensis ……………………………….115 Hình 3.46 Quy trình tạo dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ..........................................................................................................115 Hình 3.47 Quy trình chế tạo dung dịch keo bạc nano - chitosan bằng phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma Co-60 …………………………………………………………. 116 xiv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Chiều dài trung bình của bào tử nấm C. cassiicola trên môi trƣờng PDA, thạch malt và thạch lá cao su ......................................................................................... 60 Bảng 3.2 So sánh hiệu quả ức chế nấm C. cassiicola của vi khuẩn B. subtilis và B. thuringiensis sau 10 ngày nuôi cấy ...........................................................................66 Bảng 3.3 Đ c điểm của dung dịch keo bạc nano-chitosan theo nồng độ bạc nitrate ...80 Bảng 3.4 Đ c điểm của mẫu dung dịch keo bạc nano - chitosan theo nồng độ chitosan .......................................................................................................................... 81 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng của khối lƣợng phân tử chitosan lên kích thƣớc hạt bạc nano ....83 Bảng 3.6 Đ c điểm của mẫu dung dịch keo bạc nano - chitosan theo độ deacetyl hóa của chitosan ...................................................................................................................84 Bảng 3.7 Khả năng ức chế nấm C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano đƣợc tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis ở các nồng độ khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy ..................................................................................................................................87 Bảng 3.8 Khả năng ức chế nấm C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano – chitosan ở các kích thƣớc khác nhau sau 8 ngày nuôi cấy.............................................................. 90 Bảng 3.9 Khả năng ức chế nấm C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano – chitosan (10 nm) ở các nồng độ khác nhau sau 9 ngày nuôi cấy .................................................92 Bảng 3.10 So sánh hiệu lực ức chế nấm của 2 dung dịch keo bạc nano ....................... 96 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng của các nồng độ dung dịch keo bạc nano-chitosan (10nm) đến tỷ lệ cây cao su bị nhi m bệnh.....................................................................................102 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng của các nồng độ dung dịch keo bạc nano-chitosan (10nm) đến tỷ lệ lá cây cao su bị nhi m bệnh .................................................................................102 Bảng 3.13 Chiều cao của cây cao su sau chủng bệnh đã đƣợc xử lý trƣớc bằng dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm) ở các nồng độ khác nhau. ...............................103 Bảng 3.14 Chiều cao tăng trƣởng của cây cao su sau chủng bệnh đã đƣợc xử lý trƣớc bằng dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm) ở các nồng độ khác nhau. .............104 Bảng 3.15 Ảnh hƣởng của các nồng độ dung dịch keo bạc nano-chitosan (10nm) đến tỷ lệ cây cao su bị nhi m bệnh.....................................................................................108 Bảng 3.16 Ảnh hƣởng của các nồng độ dung dịch keo bạc nano-chitosan (10nm) đến tỷ lệ lá cây cao su bị nhi m bệnh .................................................................................109 Bảng 3.17 Ch số bệnh Corynespora của cây cao su sau khi phun dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm) ở các nồng độ khác nhau ......................................................110 Bảng 3.18 Chiều cao của cây cao su sau khi xử lý bằng dung dịch keo bạc nano chitosan (10 nm) ở các nồng độ khác nhau. ................................................................111 Bảng 3.19 Chiều cao tăng trƣởng của cây cao su sau khi xử lý bằng dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm) ở các nồng độ khác nhau. ....................................................112 Bảng 3.20 Tóm tắt đ c điểm của 4 chế phẩm .............................................................117 xv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTS ĐC DD EPA FDA Mw NSC SEM SIAA TEM TSA TSB UV-Vis w/v w/w Chitosan Đối chứng Độ deacetyl hóa Environmental Protection Agency - Cơ quan bảo vệ môi trƣờng Hoa Kỳ Food and Drug Administration - Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ Molecular weight - Khối lƣợng phân tử Ngày sau cấy Scanning electron microscope - Kính hiển vi điện tử quét Society of Industrial technology for Antimicrobial Articles - Hiệp hội kỹ thuật công nghiệp về thuốc chống vi khuẩn Nhật Bản Transmission electron microscopy - Kính hiển vi điện tử truyền qua Trypto - casein soy agar Trypto - casein soy broth Ultraviolet-visible - Phổ tử ngoại và khả kiến Khối lƣợng/thể tích Khối lƣợng/khối lƣợng xvi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây cao su (Hevea brasiliensis) là cây công nghiệp dài ngày có giá trị kinh tế cao, cung cấp mủ và gỗ cho nhiều ngành công nghiệp. Trong những năm gần đây, sản lƣợng mủ không ngừng đƣợc nâng cao nhờ những cải tiến về giống, kỹ thuật nông nghiệp, quy trình khai thác… Tính sơ bộ năm 2017, diện tích cao su cả nƣớc đạt gần 971.600 ha với sản lƣợng 1.086.700 tấn. Toàn ngành cao su xuất khẩu 1.380.257 tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu hơn 2,2 tỷ USD, là một trong những m t hàng xuất khẩu chính của Việt Nam [1]. Để đáp ứng nhu cầu kinh tế, các dòng cao su đƣợc lựa chọn theo hƣớng sinh trƣởng mạnh. Cùng với sự sinh trƣởng mạnh của cây cao su thì những thiệt hại do bệnh gây ra cũng gia tăng. M t khác, tình hình thời tiết - khí hậu có nhiều thay đổi và di n biến phức tạp, việc phát triển và chuyên canh cây trồng trên diện rộng trong vùng khí hậu nóng ẩm, mƣa nhiều đã dẫn đến sự phát sinh - phát triển mạnh cả về chủng loại cũng nhƣ mức độ bệnh, gây ảnh hƣởng không nhỏ đến vấn đề canh tác và hiệu quả kinh tế, làm giảm sản lƣợng và gia tăng chi phí sản xuất. Hiện nay, cây cao su đƣợc phát triển mạnh dƣới dạng tiểu điền nên thiệt hại do bệnh gây ra đã ảnh hƣởng trực tiếp đến đời sống của những ngƣời trồng cao su. Bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. gây ra đã gây thiệt hại rất nghiêm trọng đối với ngành cao su không ch ở Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia, lãnh thổ trên thế giới. Ở Việt Nam, bệnh rụng lá Corynespora xuất hiện từ năm 1999; đến năm 2010 bệnh đã bùng phát mạnh thành dịch và ngày càng trở nên nghiêm trọng, khoảng 15.000 ha cao su trên địa bàn 10 t nh bị nhi m bệnh; Tính đến năm 2017 tình hình dịch bệnh di n biến cực kỳ phức tạp, gia tăng về cả diện tích nhi m và mức độ gây hại. Với hiện trạng dịch bệnh bùng phát thì thuốc hoá học trƣớc mắt vẫn giữ vai trò chủ lực trong công tác trị bệnh. Cũng nhƣ nhiều loại hoá chất khác, thuốc trừ nấm 1 C. cassiicola gây bệnh rụng lá Corynespora có thể gián tiếp làm hại sức khỏe con ngƣời, là mối đe dọa cho các hệ sinh thái, đồng thời làm giảm chất lƣợng sản phẩm. Gần đây, công nghệ nano phát triển và đƣợc định hƣớng trong việc nâng cao chất lƣợng và năng suất cây trồng, trong đó bạc nano đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp sinh học và phƣơng pháp chiếu xạ đƣợc coi là một sản phẩm an toàn, góp phần trong công tác phòng và trị bệnh trên cây trồng. Từ các vấn đề nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu tạo dung dịch keo bạc nano để phòng trừ bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su do nấm Corynespora cassiicola” đƣợc thực hiện. Mục tiêu đề t i Tìm hiểu bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su do nấm Corynespora cassiicola gây ra và tìm phƣơng pháp tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rụng lá Corynespora có hiệu quả trong phòng thí nghiệm và trên cây cao su trong vƣờn ƣơm. Đối tƣợng nghiên cứu Nấm C. cassiicola đƣợc phân lập từ lá của cây cao su bị bệnh Corynespora trồng tại Đồng Nai. N i ung nghiên cứu - Phân lập và khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng lên sự sinh trƣởng của nấm C. cassiicola gây bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su, từ đó đ t kế hoạch tạo chế phẩm phòng chống chúng. - Khảo sát khả năng đối kháng nấm C. cassiicola của B. subtilis và B. thuringiensis. - Khảo sát khả năng tổng hợp bạc nano từ dịch nội bào của vi khuẩn B. subtilis có khả năng kháng nấm C. cassiicola. - Chế tạo dung dịch keo bạc nano - chitosan có khả năng ức chế nấm C. cassiicola bằng phƣơng pháp chiếu xạ. - Khảo sát khả năng ức chế nấm C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano trong điều kiện in vitro. 2 - Khảo sát khả năng phòng và trị bệnh rụng lá Corynespora do nấm C. cassiicola gây ra trên cây cao su 9 tháng tuổi trong vƣờn ƣơm của dung dịch keo bạc nano chitosan có kích thƣớc hạt bạc 10 nm. Ý nghĩa khoa học Luận án xác định đƣợc các điều kiện thích hợp cho quá trình tạo ra 4 chế phẩm gồm huyền phù vi khuẩn B. subtilis, B. thuringiensis, dung dịch keo bạc nano từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis và dung dịch keo bạc nano - chitosan bằng phƣơng pháp chiếu xạ. Xác định đƣợc khả năng ức chế nấm C. cassiicola gây bệnh rụng lá Corynepora trên cây cao su của các dung dịch trong điều kiện in vitro, khả năng phòng và trị bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su 9 tháng tuổi trong vƣờn ƣơm bằng dung dịch keo bạc nano - chitosan. Ý nghĩa thực tiễn Luận án góp phần tìm ra giải pháp phòng và trị bệnh rụng lá Corynespora do nấm C. cassiicola gây ra trên cây cao su. Bƣớc đầu thành công trên cây cao su 9 tháng tuổi trong vƣờn ƣơm. Việc ứng dụng bạc nano để phòng và trị bệnh rụng lá Corynespora của cây cao su là một phƣơng pháp mới, có hiệu quả, đáp ứng một số vấn đề sau: - Áp dụng công nghệ cao phục vụ sản xuất nông nghiệp. - Việc giảm sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học sẽ góp phần bảo vệ sức khỏe của nông dân. Tính mới của luận án 1. Xác định đƣợc ảnh hƣởng của khối lƣợng phân tử và độ deacetyl hóa chitosan lên kích thƣớc hạt bạc nano. 2. Bƣớc đầu xác định đƣợc ảnh hƣởng của bạc nano lên hệ sợi nấm C. cassiicola bằng ảnh SEM . 3. Xây dựng đƣợc quy trình và chế tạo đƣợc dung dịch keo bạc nano có kích thƣớc hạt khác nhau sử dụng chitosan làm chất ổn định bằng phƣơng pháp chiếu xạ. 3 4. Chứng minh đƣợc hiệu quả của dung dịch keo bạc nano - chitosan chế tạo đƣợc đối với bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su trong vƣờn ƣơm. 4