Tài liệu Nghiên cứu tạo dòng, biểu hiện và thu nhận higf-1 (human insulin-like growth factor 1) từ escherichia coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN DƢƠNG LONG DUY NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN hIGF-1 (HUMAN INSULIN LIKE GROWTH FACTOR 1) TÁI TỔ HỢP TỪ E. coli Chuyên ngành: DI TRUYỀN Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐẶNG THỊ PHƢƠNG THẢO Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2012 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến GS.TS. Trần Linh Thước, người thầy đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em học tập và hoàn thành luận văn này. Em chân thành cảm ơn TS. Đặng Thị Phương Thảo, cô là người đã luôn động viên, quan tâm giúp đỡ và định hướng cho em trong suốt quá trình nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Chân thành cảm ơn chị Phương Hiếu và anh Văn Đức đã dìu dắt em trong những ngày đầu bước chân vào lab A. Xin cảm ơn chị Kim Hằng và chị Mỹ Trinh đã chỉ bảo và giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian vừa qua. Cảm ơn tất cả các anh chị và các bạn ở BM CNSH Phân tử & Môi trường, PTN CNSH Phân Tử A đã luôn bên mình, cùng chia sẻ những niềm vui, nỗi buồn trong những ngày tháng làm việc tại Lab A. Và trên hết, con xin cảm ơn mẹ và anh chị đã luôn quan tâm, chăm sóc và tạo mọi điều kiện cho việc học của con. Gia đình sẽ mãi là niềm tự hào, là động lực để con vươn tới thành công. Một lần nữa, xin cảm ơn tất cả mọi người! Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9/2012 Dương Long Duy Luận văn Thạc sĩ Sinh học Mục lục MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... i DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ................................................................... ii LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1 Nhân tố tăng trƣởng hIGF-1 .......................................................................... 4 1.1.1. Giới thiệu .................................................................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm gene mã hóa và cấu trúc phân tử protein hIGF-1 ......................... 4 1.1.3. Đặc điểm hoạt động của hIGF-1 ................................................................. 5 1.1.4. Chức năng của hIGF-1 trong cơ thể sống ..................................................... 7 1.1.5. Các hướng ứng dụng hIGF-1 ....................................................................... 8 1.1.5.1. Điều trị bệnh IGFD ............................................................................... 8 1.1.5.2. Điều trị một số bệnh khác...................................................................... 9 1.1.5.3. Ứng dụng khác của hIGF-1 ..................................................................10 1.1.6. Tình hình nghiên cứu sản xuất hIGF-1 trên thế giới và ở Việt Nam ............11 1.2. Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp trên Escherichia coli .......................13 1.3. Tái gấp cuộn in vitro protein thu nhận từ thể vùi biểu hiện trong tế bào E. coli .........................................................................................................................14 1.4. Tinh chế thu nhận protein tái tổ hợp ............................................................17 1.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học hIGF-1 in vitro ............................................18 PHẦN II: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP...........................................................21 2.1. Vật liệu ..........................................................................................................22 2.1.1. Dụng cụ và thiết bị .....................................................................................22 2.1.2. Hóa chất và môi trường..............................................................................23 2.1.3. Nguyên vật liệu ..........................................................................................28 2.2. Phƣơng pháp .................................................................................................30 2.2.1. Thu nhận gene higf-1 từ phIGF1 bằng phản ứng PCR .................................32 2.2.2. Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b ................................................34 2.2.3. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET22b-higf1 ..........37 2.2.4. Tạo dòng tế bào E. coli Origami(DE3) mang vector pET22b-higf1 .............40 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Mục lục 2.2.5. Cảm ứng biểu hiện protein hIGF-1 ở E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 .40 2.2.6. Tinh chế thu nhận hIGF-1 ...........................................................................44 2.2.7. Kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1 thu nhận được ........................................45 PHẦN III: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN ..................................................................43 3.1. Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b .................................................48 3.1.1. Thu nhận gene higf-1 và chuẩn bị vector pET-22b ......................................49 3.1.2. Tạo dòng E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET22b-higf1.....................50 3.2. Tạo dòng tế bào E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 .................................55 3.3. Cảm ứng biểu hiện protein hIGF-1...............................................................57 3.3.1. Phân tích sự biểu hiện protein hIGF-1 trong tế bào chất E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 bằng Tricine SDS-PAGE ............................57 3.3.2. Khẳng định sự biểu hiện hIGF-1 bằng Western blot. ...................................58 3.4. Tinh chế thu nhận và kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1. ...........................59 PHẦN IV: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ....................................................................64 1. Kết luận ............................................................................................................65 2. Đề nghị .............................................................................................................65 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................66 PHỤ LỤC ..............................................................................................................70 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Danh mục các chữ viết tắt DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALS Acid Labile Subunit Amp Ampicillin Ampr Ampicillin resistance bp base pair DNA Deoxyribose Nucleic Acid dH2O distilled water (nước cất) dNTP deoxyNucleotide TriPhosphate DTT DiThioThreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine TetraAcetic acid EMEA European Medicines Agency FDA Food and Drug Administration FPLC Fast Performance Liquid Chromatography GH Growth Hormone HRP HorseRadish Peroxidase IPTG IsoPropyl-β-D-Thio-Galactoside hIGF-1 human Insulin-like Growth Factor IGF1R IGF-1 Receptor IGFBP Insulin-Like Growth Factor Binding Protein kDa kilo Dalton LB Môi trường Luria-Bertani MCS Multiple Cloning Site PBST Phosphate Buffered Saline Tween PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribose Nucleic Acid RNase Enzyme thuỷ giải RNA SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel Electrophoresis -i- Luận văn Thạc sĩ Sinh học Danh mục các bảng và hình DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ plasmid pET-22b ....................................................50 Bảng 3.2. Lượng hIGF-1 trong các phân đoạn tinh chế .........................................62 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của hIGF-1 .................................................................. 5 Hình 1.2. Các con đường truyền tín hiệu trong tế bào được kích hoạt bởi hIGF-1 .. 6 Hình 1.3. Một số sản phẩm rhIGF-1 trên thị trường ..............................................12 Hình 1.4. Các phương pháp sắc ký được sử dụng để tinh chế protein ....................17 Hình 1.5. Nguyên tắc chung của phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro ..........18 Hình 2.1. Cấu trúc plasmid pET-22b .....................................................................28 Hình 2.2. Thang chuẩn protein và DNA .................................................................29 Hình 2.3. Chương trình PCR..................................................................................33 Hình 3.1. Quy trình tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b.............................48 Hình 3.2. Thu nhận gene higf-1..............................................................................49 Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α ........................51 Hình 3.4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 .................................52 Hình 3.5. Sơ đồ vị trí chèn gene higf-1 và vị trí bắt cặp của các mồi trên vector pET22b-higf1 .........................................................................................................53 Hình 3.6. Kết quả kiểm tra plasmid pET22b-higf1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi T7 pro/T7 ter và cặp mồi 5’-NdeI-higf1 /T7 ter.......................................................54 Hình 3.7. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 vào tế bào E. coli Origami(DE3) ........................................................................................................56 Hình 3.8. Kết quả PCR khuẩn lạc E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 với cặp mồi T7 pro/T7 ter ..........................................................................................................56 Hình 3.9. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện protein hIGF-1 bằng điện di Tricine-SDSPAGE .....................................................................................................................58 Hình 3.10. Chứng minh sự biểu hiện protein hIGF-1 bằng lai Western ..................59 -ii- Luận văn Thạc sĩ Sinh học Danh mục các bảng và hình Hình 3.11. Sắc ký đồ tinh chế thu nhận hIGF-1 bằng sắc ký trao đổi cation ..........60 Hình 3.12. Kết quả phân tích Tricine SDS-PAGE các phân đoạn protein thu nhận từ quá trình tinh chế sắc ký trao đổi cation .............................................................61 Hình 3.13. Kết quả phân tích độ tinh sạch của mẫu trước và sau tinh chế bằng phần mềm Quantity One (Biorad, Hoa Kỳ) .............................................................62 Hình 3.14. Ảnh hưởng của hIGF-1 sau tinh chế lên khả năng tăng sinh của dòng tế bào MCF-7 .............................................................................................................63 -iii- Luận văn Thạc sĩ Sinh học Lời mở đầu LỜI MỞ ĐẦU hIGF-1 hay còn gọi là somatomedin C là một protein hormone được tạo ra chủ yếu ở gan nhờ sự kích thích của hormone tăng trưởng GH (Growth Hormone). hIGF-1 có vai trò kích thích sự tăng trưởng và phát triển của hầu hết các loại tế bào trong cơ thể đặc biệt là các tế bào cơ - xương, tế bào gan, tế bào thần kinh, tế bào da, tế bào tạo máu … Bên cạnh đó hIGF-1 còn giúp cân bằng các chu trình chuyển hoá protein, lipid, carbohydrate cùng nhiều loại hormone và các hợp chất sinh học khác. Sự thiếu hụt hIGF-1 ở trẻ gây ra bệnh IGFD (Insulin-like growth factor 1 deficiency). Trẻ bị mắc bệnh IGFD bị lùn hơn so với trẻ bình thường và phát triển không cân đối trong khi lượng GH bình thường. Nguyên nhân có thể là do đột biến gene mã hóa cho hIGF-1 hoặc thụ thể của GH không đáp ứng được với GH…Do đó để đảm bảo cho trẻ thiếu hụt hIGF-1 có khả năng phát triển bình thường thì việc phục hồi lượng hIGF-1 trong máu về mức bình thường là hết sức cần thiết. Hiện nay không có phương thuốc chữa trị hiệu quả cho những bệnh nhân mắc bệnh IGFD ở giai đoạn muộn, cách tốt nhất để chữa trị IGFD là phát hiện sớm bệnh nhân mắc bệnh và tiêm bổ sung đủ lượng hIGF-1 cần thiết bằng cách sử dụng rhIGF-1. Vào năm 2005 các sản phẩm hIGF-1 tái tổ hợp gồm Increlex (Tercia) và Iplex (Insmed) đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm, Hoa Kỳ) chấp nhận sử dụng là thuốc để điều trị trẻ bị lùn do thiếu hụt hIGF1. Trong những năm qua các cơ quan có chức năng đã cho phép trẻ em có tầm vóc nhỏ, lùn được điều trị với rhIGF-1 ngày càng tăng lên. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy hIGF-1 có tác dụng tích cực trong việc điều trị một số bệnh thần kinh, suy tim, tổn thương do bỏng, bệnh xơ cứng cột bên teo cơ, đái tháo đường loại 1, 2 và làm giảm lượng mỡ trong cơ thể. hIGF-1 còn được sử dụng trong công nghệ mỹ phẩm làm đẹp da và sử dụng cho các vận động viên thể dục thể thao để tăng lượng cơ bắp cũng như tăng cường các quá trình đồng hóa giúp tăng cường thể lực. Ngoài ra, đang có rất nhiều nghiên cứu đang được tiến hành để làm rõ hơn vai trò và khả năng ứng dụng của hIGF-1. Trang 1 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Lời mở đầu Tại Việt Nam các sản phẩm hIGF-1 chủ yếu được nhập về từ nước ngoài với giá thành cao. Việc nghiên cứu tìm ra một quy trình sản xuất protein với hiệu suất cao, đơn giản và rẻ tiền nhằm sản xuất sản lượng lớn hIGF-1 giá rẻ phục vụ cho việc điều trị bệnh cũng như phục vụ các nghiên cứu ứng dụng trong nước là hết sức cần thiết. Do đó, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử và Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành nghiên cứu sản xuất protein hIGF-1 bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. Trong khuôn khổ chương trình nghiên cứu, luận văn này được thực hiện nhằm: “Nghiên cứu tạo dòng, biểu hiện và thu nhận hIGF-1 (human insulin-like growth factor 1) từ Escherichia coli”. Luận văn bao gồm các nội dung chính như sau: 1. Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b. 2. Tạo chủng E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1. 3. Tạo chủng tế bào E. coli Origami(DE3) mang vector tái tổ hợp pET22bhigf1. 4. Cảm ứng biểu hiện và thu nhận thể vùi có chứa hIGF-1 từ chủng E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1. 5. Hòa tan thể vùi và tái gấp cuộn hIGF-1. 6. Tinh chế thu nhận hIGF-1 sau khi tái gấp cuộn. 7. Kiểm tra hoạt tính hIGF-1 thu nhận được. Trang 2 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 3 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu 1.1. Nhân tố tăng trƣởng hIGF-1 (human Insulin-like growth factor 1) 1.1.1. Giới thiệu Trong quá trình tăng trưởng và phát triển của cơ thể từ giai đoạn thai nhi đến lúc trưởng thành luôn chịu sự chi phối của nhiều loại hormone khác nhau. Trong đó đóng vai trò quan trọng nhất là nhóm các hormone điều hòa tăng trưởng bao gồm GHRH, GH, IGF-1,…Các hormone điều hòa tăng trưởng có vai trò quan trọng và quyết định đối với giai đoạn phát triển từ trẻ nhỏ sang giai đoạn trưởng thành thông qua việc kích thích thúc đẩy quá trình trao đổi chất, tăng cường các quá trình tổng hợp đặc biệt là tổng hợp hệ cơ-xương; đồng thời kiểm soát quá trình tăng trưởng ở một giới hạn nhất định để tạo ra một cơ thể phát triển cân đối hài hòa. Một trong những nhóm hormone điều hòa tăng trưởng quan trọng đó là nhóm hormone tăng trưởng insulin-like growth factors (IGFs). IGFs là họ protein hormone có trình tự amino acid tương đồng với proinsulin khoảng 50% bao gồm IGF-1 và IGF-2 (hay còn gọi là somatomedin C và somatomedin A) [9]. Trình tự amino acid của IGF-1 và IGF-2 có độ tương đồng khoảng 70% và có độ bảo tồn cao giữa các loài [16]. IGFs có vai trò kích thích tăng sinh hầu hết các loại tế bào, tham gia vào các quá trình trao đổi chất quan trọng của cơ thể [2, 16-17]. IGF-2 có vai trò kích thích tăng sinh và phát triển cơ thể chủ yếu ở giai đoạn thai nhi trong khi đó IGF-1 lại có vai trò kích thích thúc đẩy sự tăng trưởng ở trẻ mới lớn và tham gia vào các quá trình biến dưỡng ở người trưởng thành [16]. Vì IGF-2 có vai trò chủ yếu trong giai đoạn thai nhi và ít có vai trò quan trọng trong giai đoạn trưởng thành nên nhiều nghiên cứu chỉ tập trung chủ yếu vào IGF-1. Cho đến nay, vai trò và chức năng IGF-1 ngày càng được làm sáng tỏ, nhiều nghiên cứu ứng dụng IGF-1 đã và đang mang lại hiệu quả trong trị liệu và nhiều ứng dụng quan trọng khác [1, 15]. 1.1.2. Đặc điểm gene mã hóa và cấu trúc phân tử protein hIGF-1 Protein hIGF-1 được mã hóa bởi gene dài 90kb, gồm 6 đoạn exon nằm trên cánh dài của NST số 12 [13]. Gene này được biểu hiện ở nhiều mô trưởng thành, nhưng chủ yếu ở gan. Sự biểu hiện hIGF-1 được điều hòa bởi hormone tăng trưởng GH, insulin và điều kiện dinh dưỡng [2, 7]. Trang 4 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu Phân tử hIGF-1 chỉ có một chuỗi polypeptide dài 70 amino acid với 3 cầu nối disulfide nội phân tử ở các vị trí Cys6-Cys48, Cys18-Cys61 và Cys47-Cys52. Trọng lượng phân tử 7649 Da, với bốn vùng chức năng A, B, C và D. Trong đó vùng A, B và C tương đồng với vùng A, B và C trên phân tử proinsulin [9]. Không giống như phân tử insulin, vùng C của hIGF-1 không được loại bỏ mà còn tham gia một phần vào vùng cấu trúc hoạt động [9]. Cấu trúc hIGF-1 có 3 xoắn alpha, trong đó xoắn alpha Gly8-Cys18 thuộc vùng chức năng B, xoắn alpha Ile43-Cys47 và Leu54-Glu58 đều thuộc trong vùng chức năng A. Hai vùng chức năng A và B liên kết với nhau bởi ba cầu nối disulfide, có vai trò nhận diện thụ thể IGF1R (insulin-like growth factor 1 receptor) [9]. Hình 1.1. (A): Cấu trúc phân tử hIGF-1. (B): Cấu trúc không gian ba chiều của hIGF1, các vùng chức năng được phân biệt bằng màu sắc; Đỏ: vùng B; xanh: vùng C; cam: vùng A; vàng: vùng D [2, 9]. 1.1.3. Đặc điểm hoạt động của hIGF-1 Trong quá trình phát triển bình thường của cơ thể, tuyến yên được kích thích sản xuất GH, GH tác động lên các tế bào gan tổng hợp hIGF-1 và đi vào máu đến các mô đích để thực hiện chức năng [2]. hIGF-1 được sản xuất mạnh ở giai đoạn trẻ mới lớn và dậy thì, giảm dần khi về già. Trong máu, hIGF-1 chủ yếu tồn tại dưới dạng liên kết với 6 loại protein chuyên biệt IGFBPs (insulin-like growth factor binding protein) (IGFBP1-6), trong đó IGFBP-3 chiếm tỉ lệ cao nhất. Có đến trên 90% hIGF1 tạo thành phức hợp với IGFBP-3 và tiểu đơn vị ALS (acid labile subunit), một peptide với trọng lượng phân tử 85 kDa, được sản xuất ở gan [16]. Sự Trang 5 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu liên kết của 3 thành phần trên tạo thành một cấu trúc ổn định giúp kéo dài thời gian tồn tại hIGF-1 trong cơ thể đồng thời bất hoạt chức năng của hIGF-1 nhằm ngăn chặn tác dụng hạ đường huyết không mong muốn [16]. hIGF-1 chỉ hoạt động khi tồn tại dưới dạng tự do, khi đến cơ quan đích, dưới tác động của một số nhân tố, quá trình ly giải phức hợp IGFBP-ALS-hIGF-1 xảy ra và phóng thích hIGF-1 để liên kết với thụ thể IGF1R trên bề mặt tế bào đích và thực hiện chức năng [7, 10]. Giống như hIGF-1, IGFBPs cũng được tổng hợp phần lớn ở gan và ở một số mô, cơ quan khác. Trong một số trường hợp nhất định, các IGFBPs còn có khả năng tác động hỗ trợ hIGF-1 gắn lên thụ thể IGF1R [9]. Hình 1.2. Các con đường truyền tín hiệu trong tế bào được kích hoạt bởi hIGF-1. IGF1R là thụ thể của hIGF-1 thuộc họ Tyrosine kinase, có cấu trúc tương đồng với thụ thể insulin. IGF1R gồm 2 tiểu đơn vị α nằm ngoài tế bào và 2 tiểu đơn vị β xuyên màng tế bào. IGF1R hoạt động ở dạng dimer hóa tạo thành phức hợp α2β2 [9, 16]. Khi hIGF-1 gắn vào tiểu phần α sẽ kích hoạt quá trình phosphoryl hóa gốc tyrosine nằm trên tiểu đơn vị β ở bên trong tế bào. Sự phosphoryl hóa tyrosine dẫn đến kích hoạt một loạt các con đường truyền tín hiệu tiếp theo bao gồm sự tăng cường biểu hiện các gene liên quan đến chu trình tế bào như cyclin D1 và D2 làm cho tế bào bước sang giai đoạn phân bào và tăng sinh; đồng thời kích hoạt các con Trang 6 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu đường tín hiệu AKT/protein kinase B, MAPK làm ngăn chặn quá trình apoptosis của tế bào; ngoài ra còn hoạt hóa một loạt các quá trình khác nhau tùy thuộc vào loại tế bào đích tác động như tăng tăng cường biểu hiện các protein liên quan đến quá trình tạo cơ ở tế bào cơ, kích thích quá trình tạo xương ở các tế bào xương, điều hòa quá trình tạo cytokine ở các tế bào thuộc hệ miễn dịch,…[17]. Cho đến nay, vai trò của hIGF-1 vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ và nhiều nghiên cứu đang được tiến hành để làm sáng tỏ thêm. Dựa trên sự hiểu biết và vai trò của hIGF-1 đối với từng loại tế bào từ đó có thể đưa ra những ứng dụng có ý nghĩa to lớn trong việc điều trị một số bệnh quan trọng. 1.1.4. Chức năng hIGF-1 trong cơ thể sống hIGF-1 có vai trò kích thích tăng sinh hầu hết các loại tế bào thông qua việc thúc đẩy sự phát triển tế bào từ phase G2 đến phase M đưa tế bào đến giai đoạn phân bào trong chu trình tế bào. Bên cạnh đó, hIGF-1 còn kích thích tổng hợp DNA, ức chế quá trình apoptosis, tham gia vào các quá trình trao đổi chất của cơ thể, làm tăng hấp thu amino acid, giảm phân hủy protein, kích thích hấp thu glucose và tổng hợp glycogen góp phần giúp hạ đường huyết. Ngoài ra hIGF-1 còn thúc đẩy quá trình phân giải acid béo thành năng lượng cần thiết cho cơ thể, làm giảm acid béo dư thừa, chất béo trung tính, và lượng cholesterol trong máu [17, 22]. Trong giai đoạn phát triển bình thường của trẻ, khi bước sang giai đoạn dậy thì, hàng loạt các biến đổi xảy ra trong đó có quá trình phát triển của hệ cơ xương thúc đẩy sự gia tăng kích thước và tầm vóc của cơ thể [7]. Tuy nhiên để kích thích hệ cơ xương phát triển cần phải có sự tham gia của các hormone quan trọng trong đó có hIGF-1. Nếu cơ thể không sản xuất đủ lượng hIGF-1 trong giai đoạn này thì trẻ phát triển không bình thường và bị lùn. Hội chứng này được gọi là IGFD (insulin-like growth factor 1 deficiency) [4]. Những nghiên cứu trên chuột đột biến trên gene mã hóa cho IGF-1 cho thấy trọng lượng nặng hơn 30% so với bình thường. Đối với các động vật thiếu gene mã hóa cho IGF-1, trọng lượng cũng giảm rõ rệt, một số trường hợp đã chết ngay sau khi sinh. Những trường hợp sống sót vẫn tiếp tục thể hiện sự tăng trưởng chậm, ốm yếu [19]. Trang 7 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi tác nhân lạ xâm nhập có liên quan đến tương tác của các tế bào hệ miễn dịch với hIGF-1. hIGF1 làm tăng cường sản xuất nhanh các đại thực bào, nội độc tố để bảo vệ vật chủ chống lại tác nhân lạ một cách nhanh nhất, hiệu quả nhất. Năm 1992, Timsit đã chứng minh hIGF-1 có tác dụng kích thích tổng hợp DNA và tăng sinh các tế bào biểu mô tuyến ức, cơ quan quan trọng của hệ miễn dịch [28]. hIGF-1 giúp hồi phục và phát triển chức năng tuyến ức, đồng thời tạo nhiều tế bào T, đẩy nhanh quá trình tạo kháng thể trong cơ thể [12, 28]. Bên cạnh đó hIGF-1 còn có vai trò cân bằng hormone cho cơ thể, sự hiện diện hIGF-1 kiểm soát quá trình sản xuất GH. Tùy vào nồng độ mà hIGF-1 sẽ cho tín hiệu ức chế hay kích thích tiết GH từ tuyến yên [2]. 1.1.5. Các hƣớng ứng dụng hIGF-1 1.1.5.1. Điều trị bệnh IGFD Bệnh IGFD (insulin-like growth factor 1 deficiency) là tình trạng cơ thể sản xuất không đủ lượng protein hIGF-1 để đáp ứng nhu cầu cần thiết cho quá trình tăng trưởng và phát triển của cơ thể. Nếu kết quả kiểm tra nồng độ hIGF-1 < 15μg/l hoặc nồng độ IGFBP-3 < 400μg/l thì cơ thể đang thiếu protein hIGF-1 và cần phải được xem xét để điều trị kịp thời [4]. Nguyên nhân thiếu hụt hIGF-1 có thể là do [7]: - Những yếu tố có liên quan tới sự suy giảm tín hiệu của thụ thể hormone GH, từ đó làm giảm sự tổng hợp hIGF-1. - Thiếu hụt GH nghiêm trọng do suy tuyến yên, hoặc các bệnh liên quan đến vùng dưới đồi. - Do đột biến của các nhân tố trong con đường truyền tín hiệu của GH. - Do gene mã hóa cho GH bị phá hủy hoặc kháng thể trung hòa GH. - Hoạt động bất thường của thụ thể GH. - Sự phá hủy hay đột biến trong cấu trúc gene mã hóa hIGF-1 cũng làm thiếu hụt hIGF-1. - Tình trạng tuổi tác, dinh dưỡng, các bệnh về gan cũng góp phần ảnh hưởng đến lượng hIGF-1 trong cơ thể. Trang 8 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu Triệu chứng của bệnh IGFD cho thấy cơ thể có biểu hiện tích tụ chất béo dư thừa, giảm độ vững chắc của xương, giảm quá trình tổng hợp amino acid, mất cân bằng nội tiết, tăng nguy cơ rối loạn chuyển hóa chất dinh dưỡng, thiếu chất dinh dưỡng dẫn đến tình trạng chậm tuổi dậy thì, cơ thể lùn bất thường, phát triển không cân đối. Ngoài ra thiếu hụt hIGF-1 có thể trở nên bị điếc, kém trí tuệ và chậm hiểu biết [4]. Trước đây người ta cho rằng sự thiếu hụt hIGF-1 là do thiếu hụt hormone GH. Do đó, trẻ em mắc bệnh IGFD đã được điều trị với hormone rhGH. Tuy nhiên, một số thử nghiệm khác đo lường sự hiện diện của hormone hGH và hIGF-1 của trẻ mắc bệnh chỉ cho thấy mức độ thấp bất thường của hIGF-1. Như vậy đối với trẻ thiếu hụt hIGF-1 do thiếu hụt GH thì có thể sử dụng GH tái tổ hợp để điều trị cho kết quả tốt. Nhưng trong một số trường hợp khi cung cấp hormone tăng trưởng cho cơ thể nhưng vẫn không chữa được bệnh và nồng độ hIGF-1 vẫn không được phục hồi. Để điều trị những trường hợp này chỉ có thể bổ sung vào cơ thể một lượng hIGF-1 đã thiếu để bù đắp cho lượng hIGF-1 thiếu hụt. Hiện tại không có phương thuốc hữu hiệu nào để chữa trị các bệnh nhân bị IGFD ở giai đoạn muộn. Do đó, phương thức hiệu quả nhất đó là chẩn đoán sớm bệnh IGFD và tiêm bổ sung cho đủ lượng hIGF1. Lượng hIGF-1 sử dụng cho điều trị chủ yếu là hIGF-1 tái tổ hợp [1]. 1.1.5.2. Điều trị một số bệnh khác Ngoài việc sử dụng hIGF-1 để điều trị bệnh IGFD thì hiện nay người ta còn hướng đến việc dùng hIGF-1 để chữa bệnh tiểu đường, bệnh tim, bệnh Alzheimer (AD), bệnh xơ cứng cột bên teo cơ (ALS - Amyotrophic Lateral Sclerosis), lão hóa…[6, 15]. Các tác dụng kích thích đáng kể của hIGF-1 trên sự hấp thụ glucose của tế bào có vai trò quan trọng trong chữa bệnh tiểu đường ở người. hIGF-1 liên kết với thụ thể insulin nhỏ hơn rất nhiều so với insulin nhưng trên thực tế nó vẫn có tác dụng hạ đường huyết. Với những hiểu biết về hIGF-1, các nhà khoa học đã tiến hành thử nghiệm sử dụng hIGF-1 trên bệnh nhân tiểu đường trong một thời gian xác định và đã đưa ra kết luận rằng hIGF-1 có thể kiểm soát làm giảm lượng glucose trong máu mà không có các tác dụng phụ. Như vậy hIGF-1 cho chúng ta thêm một loại thuốc Trang 9 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu có thể điều trị bệnh tiểu đường [6]. Tuy nhiên, hIGF-1 có tác dụng làm tăng sinh tế bào nếu sử dụng liều cao quá có thể dẫn đến nguy cơ gây ung thư. hIGF-1 còn được sử dụng trong điều trị bệnh mất trí nhớ. Khi cơ thể mắc bệnh AD thì lượng protein hIGF-1 và thụ thể IGFR giảm rõ rệt. Thử nghiệm trên chuột có gene mã hóa cho IGF-1 bị phá hủy cho thấy sự sớm tích lũy protein amyloid beta (Aβ) trong não. Amyloid beta là một chuỗi liên kết peptide của 36-43 amino acid, tạo thành màng bao phủ trong mạch máu não làm tổn thương mạch máu não và tế bào thần kinh. Điều đó nói lên rằng hIGF-1 có thể giảm mức độ tích tụ của protein amyloid beta trong não và hIGF-1 có nhiều tiềm năng trong chữa bệnh AD [6]. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy hIGF-1 có thể sử dụng trong điều trị bệnh suy tim. Suy tim là tình trạng cơ tim ngày càng yếu đi và không thể bơm đủ máu để đi nuôi các cơ quan trong cơ thể, không đưa được máu thiếu oxi về tim nên máu bị ứ lại gây tình trạng phù nề, mệt mỏi, khó thở. hGF-1 có thể kích thích tăng trưởng cơ tim bằng cách tăng sự hấp thu amino acid, tổng hợp protein, ngăn ngừa quá trình apoptosis của tế bào cơ tim. Điều khiển tăng lượng canxi trong tế bào để tăng hoạt động co bóp cơ tim. Mở rộng mạch máu, tăng lượng oxi và các chất dinh dưỡng đến từng phần của cơ thể bằng cách kích hoạt làm tăng oxide nitric (NO) [8]. hIGF-1 còn góp phần quan trọng trong quá trình tổng hợp, kích thích tăng sinh tế bào xương, tế bào cơ, nguyên bào sợi ở da, giúp tăng mật độ tế bào xương làm xương vững chắc, tăng khả năng phục hồi, mau chóng chữa lành vết thương ở các vùng da và tăng khối lượng cơ. Vì vậy hIGF-1 được đề xuất cho liệu pháp chữa bệnh loãng xương, bệnh teo cơ, điều trị các tổn thương ngoài da [6]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng hIGF-1 có vai trò làm chậm quá trình thoái hóa cơ ở bệnh xơ cứng cột bên theo cơ (ALS) và vai trò của hIGF-1 đối với bệnh này vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu [23]. 1.1.5.3. Ứng dụng khác của hIGF-1 Trong thể dục thể thao, các vận động viên trên thế giới thường hay sử dụng các sản phẩm rhIGF-1 để tăng khối lượng cơ, cải thiện hiệu quả luyện tập. hIGF-1 thúc đẩy sự tăng trưởng cơ bắp, kích thích sự giảm mỡ, giúp thân hình trở nên săn chắc, thể lực cường tráng, thúc đẩy chữa lành các vết thương. Trong quá trình luyện Trang 10 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu tập đòi hỏi cơ thể phải sử dụng năng lượng, sự hiện diện hIGF-1 làm tăng quá trình oxy hóa chất béo, glycogen để cung cấp nguồn năng lượng cần thiết cho cơ thể đồng thời tăng hiệu quả hấp thu glucose. hIGF-1 còn kích thích cơ tim hoạt động điều hòa lưu thông máu mang oxi đến các tế bào, giúp các vận động viên khỏe mạnh hơn, tăng hiệu quả tập luyện. hIGF-1 còn được sử dụng trong công nghệ thẫm mỹ và làm đẹp. Với sự tăng thêm của tuổi tác, lượng collagen giảm thiểu, khiến cho làn da xuất hiện nhiều vết nhăn và trở nên thô ráp. hIGF-1 làm tăng nhanh tốc độ tổng hợp các nguyên bào sợi, tổng hợp collagen giúp làn da hồng hào, mịn màng và mất dần vết nhăn. hIGF1 thúc đẩy quá trình phân giải chất béo không cần thiết cho cơ thể. Tác dụng này làm giảm đi phần lớn lượng mỡ thừa ở phần bụng, hông và bắp tay… hIGF-1 thường được bổ sung vào kem dưỡng da. 1.1.6. Tình hình nghiên cứu sản xuất hIGF-1 trên thế giới và ở Việt Nam. hIGF-1 đã được sản xuất từ lâu trên thế giới chủ yếu bằng công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp trên hệ thống tế bào chủ E. coli [3] và nấm men [29] là chủ yếu. Đáng chú ý là vào tháng 08 năm 2005, FDA đã chấp nhận cho các sản phẩm rhIGF1 thương mại là Increlex của hãng dược phẩm Tercia (Hoa Kỳ) sử dụng để điều trị IGFD trên người. Đến tháng 12 năm 2005, FDA cũng chấp thuận cho sản phẩm Iplex (phối trộn giữa rhIGF-1 và IGFBP-3) của hãng Insmed (Hoa Kỳ) sử dụng để điều trị IGFD [1]. Một hướng triển vọng mới đang mở ra cho thị trường hIGF-1 tái tổ hợp. Vào năm 2007, cơ quan kiểm tra sản phẩm y tế (EMEA) của châu âu cũng đã đồng ý cho phép sử dụng hIGF-1 tái tổ hợp để điều trị IGFD [32]. Đến năm 2009, FDA đã chấp nhận cho việc sử dụng IPLEX để nghiên cứu điều trị bệnh xơ cứng cột bên teo cơ [33]. Trong những năm qua các cơ quan có chức năng đã cho phép trẻ em có tầm vóc nhỏ, lùn được điều trị với rhIGF1 ngày càng tăng lên. Một số sản phẩm rhIGF-1 chủ yếu trên thế giới gồm: - Increlex (mecasermin) là sản phẩm hIGF-1 tái tổ hợp được sản xuất trên hệ thống tế bào E. coli bởi công ty Tercia (Hoa kỳ). Increlex là dạng thuốc tiêm được bán ở dạng lọ tiêm nhiều lần gồm 10mg và 40mg rhIGF-1. Giá bán Increlex lọ 40mg trên thị trường Hoa Kỳ là 562,5 USD [34]. Trang 11 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu - Iplex (mecasermin rinfabate) là sản phẩm gồm hIGF-1 tái tổ hợp và IGFBP3 tái tổ hợp với tỉ lệ phối trộn 1:1 được sản xuất trên hệ thống E. coli bởi công ty Insmed (Hoa Kỳ). Sản phẩm kết hợp này giúp tăng thời gian tồn tại hIGF-1 trong máu sau khi tiêm đồng thời làm giảm tác dụng phụ của hIGF-1. IPLEX được bán dưới dạng liều tiêm một lần 36mg/0,6ml. Giá bán Iplex trên thị trường Hoa Kỳ là 90 USD/liều [31]. - Hiện nay trên thị trường còn có loại sản phẩm hIGF-1 tái tổ hợp đã được biến đổi cấu trúc với tên gọi là IGF-1 Long R3. Trình tự hIGF-1 đã được thay thế glutamine ở vị trí thứ 3 thành arginine đồng thời dung hợp thêm chuỗi 13 amino acid ở đầu N. Kết quả của sự biến đổi này là phân tử hIGF-1 không thể gắn được vào các IGFBPs và do đó hoạt tính của hIGF-1 không bị kìm hãm và tăng lên một cách đáng kể. Sản phẩm này chủ yếu sử dụng cho nghiên cứu mà không được sự chấp thuận cho việc sử dụng điều trị vì lý do không kiểm soát được tác dụng của hIGF-1. IGF-1 Long R3 được bán trên thị trường thế giới với giá dao động từ 300500 USD/ 1mg [36]. - Ngoài ra còn một loạt các sản phẩm hIGF-1 không sử dụng cho điều trị nhưng được sử dụng cho nghiên cứu của các hãng hóa chất và công nghệ sinh học như Sigma, R&D system,… với giá thành khá cao. Hình 1.3. Một số sản phẩm rhIGF-1 trên thị trường Tại Việt Nam, hIGF-1 vẫn chưa được biết đến nhiều và tiềm năng ứng dụng của hIGF-1 là rất lớn. Hiện nay trên thị trường Việt Nam cũng đã xuất hiện một số sản phẩm rhIGF-1 dưới dạng thực phẩm chức năng. Sản phẩm kết hợp IGF-1 và Vigorex dạng dịch phun 30ml/lọ được sản xuất bởi công ty Megalife (Hoa Kỳ) có giá bán 4.600.000VNĐ tại Việt Nam [35]. Giá thành như vậy còn khá cao so với Trang 12 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu mặt bằng chung thu nhập của người dân Việt Nam. Do đó việc nghiên cứu quy trình sản xuất lượng lớn hIGF-1 với giá rẻ nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị và nghiên cứu trong nước là việc hết sức cần thiết. 1.2. Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp trên hệ thống E. coli Với nhu cầu ngày càng tăng cao đối với các protein sử dụng trong trị liệu và nghiên cứu, đặc biệt là các protein có nguồn gốc từ động vật hữu nhũ thì lượng tách chiết thu nhận từ cơ thể sinh vật rất thấp với giá thành rất cao. Do đó yêu cầu đặt ra làm thế nào để thu nhận một lượng lớn protein mục tiêu với giá thành rẻ. Để giải quyết vấn đề này, công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp ra đời và cho đến nay đã đem lại những thành tựu hết sức to lớn. Hàng loạt các sản phẩm protein tái tổ hợp đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp và đem lại doanh thu lên đến hàng tỉ USD/năm. Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp là sự vận dụng thành công kỹ thuật di truyền, thao tác gene và các hiểu biết về sinh học tế bào. Một trong những hệ thống tế bào chủ biểu hiện thành công protein tái tổ hợp và cho đến nay vẫn được sử dụng phổ biến đó là hệ thống tế bào chủ E. coli. Hệ thống tế bào chủ E. coli được sử dụng phổ biến tại vì nó có những ưu điểm sau [18]: - E. coli có hệ thống di truyền đơn giản và đã được biết rõ, thuận lợi cho việc biến đổi gen nhằm tạo ra các chủng tế bào đột biến phục vụ sản xuất protein tái tổ hợp được dễ dàng. - E. coli là hệ thống tế bào chủ an toàn khi sử dụng. Chúng được tìm thấy trong tự nhiên ở cả người và động vật. - E. coli có tốc độ tăng trưởng rất nhanh nếu so với các hệ thống tế bào chủ khác, với thời gian một thế hệ khoảng 20 phút. Tốc độ tăng trưởng nhanh cũng đồng nghĩa với tốc độ sản xuất tốt hơn khi đưa vào lên men. - Hệ thống E. coli có khả năng dung nạp gene ngoại lai thông qua plasmid tái tổ hợp, tồn tại khá ổn định. Việc nuôi cấy E. coli khá dễ dàng với môi trường đơn giản và rẻ tiền. Sản lượng protein tái tổ hợp tạo ra cao, có thể lên đến 50% lượng protein của tế bào. Các chủng E. coli thường sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp là BL21 và K12 cùng các dẫn xuất của chúng. Ưu điểm hơn so với chủng K12, các chủng BL21 Trang 13