Tài liệu Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ bacillus subtilis có trong natto nhật bản hướng tới thực phẩm chức năng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Bùi Thị Nhung NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Bùi Thị Nhung NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HỮU PHÚC Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu được trình bầy trong phần kết quả của luận văn này là do chính tôi thực hiện và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào. Tác giả luận văn Bùi Thị Nhung 1 LỜI CẢM ƠN Sau hai năm học tập và nghiên cứu, nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Sinh học. Để đạt được thành quả như ngày hôm nay Tôi xin chân thành cảm ơn:  Toàn thể quý Thầy, Cô khoa sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp. HCM đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong thời gian tôi theo học tại trường.  TS. Nguyễn Hữu Phúc – giáo viên hướng dẫn của tôi, một người thầy nhưng cũng rất gần gũi và luôn tận tâm đối với học trò của mình. Người đã hết lòng hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong những lúc khó khăn. Thầy đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này .  Sở Giáo Dục - Đào Tạo tỉnh Bình Dương, Trường THPT An Mỹ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian đi học.  Ths. Dương Nhật Linh và Ths. Nguyễn Văn Minh (Đại Học Mở) đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi làm thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài.  Em Trang, Quỳnh, Phi (sinh viên Đại Học Mở) và toàn thể các bạn học viên cao học khóa 22 đã luôn giúp đỡ, quan tâm và hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.  Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân yêu trong gia đình đã luôn bên cạnh, ủng hộ tôi, là nguồn động viên lớn lao nhất và hy sinh nhiều nhất để tôi có được ngày hôm nay. Xin chân thành cảm ơn Bùi Thị Nhung 2 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 1 LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 2 MỤC LỤC .................................................................................................................... 3 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ 6 MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 7 1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................................. 7 2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................................... 8 3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................... 8 4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 9 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 10 1.1. Khái quát chung về protease .................................................................................... 10 1.1.1. Khái niệm và phân loại ......................................................................................... 10 1.1.2. Cơ chế phản ứng và ứng dụng của protease ......................................................... 13 1.1.3. Enzyme protease kiềm .......................................................................................... 19 1.1.4. Enzyme Nattokinase ............................................................................................. 26 1.2. Phương pháp nuôi cấy và thu nhận enzyme từ canh trường lên men bán rắn ....... 30 1.2.1. Những vấn đề cơ bản trong lên men bán rắn ........................................................ 30 1.2.2 Những ưu điểm của lên men bán rắn tạo enzyme.................................................. 30 1.2.3 Các giai đoạn của quá trình lên men bán rắn ......................................................... 31 1.3. Đại cương về Bacillus subtilis ................................................................................... 31 1.3.1. Lịch sử phát triển .................................................................................................. 31 1.3.2. Vị trí phân loại ...................................................................................................... 32 1.3.3. Đặc điểm phân bố ................................................................................................. 32 1.3.4. Đặc điểm hình thái và sinh hóa ............................................................................. 32 1.4. Giới thiệu bệnh huyết khối ....................................................................................... 34 1.4.1. Khái niệm về huyết khối ....................................................................................... 34 1.4.2. Nguyên nhân hình thành huyết khối ..................................................................... 34 1.4.3. Biến chứng của bệnh huyết khối ........................................................................... 35 1.4.4. Tình hình bệnh huyết khối trên thế giới và ở Việt Nam ....................................... 36 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 37 2.1. Vật liệu ....................................................................................................................... 37 2.1.1. Nguyên vật liệu ..................................................................................................... 37 3 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................... 37 2.1.3. Hóa chất ................................................................................................................ 37 2.2. Môi trường nghiên cứu ............................................................................................. 37 2.3. Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí thí ngiệm tổng quát) ................ 39 2.3.1. Phương pháp phân lập VK Bacillus trong Natto .................................................. 40 2.3.2. Phương pháp cấy truyền VSV .............................................................................. 41 2.3.3. Phương pháp giữ giống dưới lớp dầu khoáng ...................................................... 41 2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc ........................................................... 42 2.3.5. Phương pháp nhuộm Gram ................................................................................... 42 2.3.6. Phương pháp nhuộm bào tử theo M.A. Peskop .................................................... 43 2.3.7. Phương pháp xác định khả năng sinh catalase ..................................................... 43 2.3.8. Phương pháp xử lí tế bào và bào tử để chụp trên KHV điện tử quét SEM .......... 44 2.3.9. Chụp ảnh tế bào, bào tử bằng kính hiển vi điện tử quét ....................................... 44 2.3.10. Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử .......................................... 44 2.3.11. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ............................... 45 2.3.12. Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân ............. 46 2.3.13. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến .......................... 47 2.3.14. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry...................................... 49 2.3.15. Phương pháp xác định hoạt độ nattokinase ........................................................ 50 2.3.16. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease của chủng B. subtilis N18 ................................................................................. 51 2.3.17. Phương pháp làm natto ....................................................................................... 54 2.3.18. Phương pháp xác định độ ẩm của sản phẩm sau lên men................................... 55 2.3.19. Phương pháp tách chiết enzyme ......................................................................... 56 2.3.20. Phương pháp thu nhận enzyme ........................................................................... 56 2.3.21. Khảo sát một số đặc tính của chế phẩm enzyme protease thu nhận bằng ethanol58 2.3.22. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................... 58 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 60 3.1. Phân lập và tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao ........................... 60 3.1.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto của Nhật Bản............................................... 60 3.1.2. Tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao.............................................. 61 3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai mẫu N18 và N441, định danh đến chi.... 66 3.2.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................................ 66 3.2.2. Định danh đến chi theo hình thái .......................................................................... 68 4 3.3. Định danh hai mẫu N18 và N441 đến loài bằng sinh học phân tử ....................... 68 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên sự tổng hợp protease của chủng B. subtilis N18 ................................................................................................. 69 3.4.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành ....................................................... 69 3.4.2. Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường ...................................................................... 71 3.4.3. Ảnh hưởng cuả nồng độ nấm men ........................................................................ 72 3.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu .................................................................................. 73 3.4.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống .................................................................................... 75 3.4.6. Ảnh hưởng của Zn2+ và K+ ................................................................................... 76 3.4.7. Ảnh hưởng thời gian lên men đến phát triển sinh khối và hoạt tính protease ...... 77 3.4.8. Tối ưu hóa nồng độ tween 80 và glucose bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao, cấu trúc có tâm................................................................................... 78 3.5. Nghiên cứu tạo chế phẩm protease giàu nattokinase ............................................ 82 3.5.1. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase theo phương pháp sản xuất natto của Nhật Bản ......................................................................................................................... 82 3.5.2. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase trên MT lên men bán rắn ..................... 86 3.5.3. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase và sinh khối Bacillus subtilis ............... 91 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 96 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 103 5 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ACE Angiotensin BT Bào tử CPE Chế phẩm enzyme ĐN & GL Đậu nành và gạo lức ĐN Đậu nành G(-) Gram âm G(+) Gram dương GL Gạo lức KHV Kính hiển vi KL Khuẩn lạc MT Môi trường NXB Nhà xuất bản OD Mật độ quang PP Phương pháp STT Số thứ tự TB Tế bào TCA Axit tricloacetic TN Thí nghiệm VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật 6 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid (-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thủy phân này có thể là các acid amin, các polypeptide chuỗi ngắn, nhiều enzyme protease còn có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc acid amin. Protease là các enzyme công nghiệp quan trọng hàng đầu, chiếm ít nhất một phần hai tổng sản lượng thị trường enzyme trên toàn thế giới (Rao et al.,1998). Các enzyme protease chiếm vị trí quan trọng do được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau: Chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc, gia cầm, trong ngành công nghiệp dược phẩm, công nghiệp thuộc da, sản xuất các chất tẩy rửa, công nghiệp dệt và thu hồi bạc từ phim ảnh… Vi sinh vật là nguồn quan trọng nhất trong sản xuất enzyme. Trừ một số ít protease được sản xuất từ động vật, thực vật như trypsin, chymotrypsin, papain, bromelain, ficin, còn lại hầu hết đựợc sản xuất từ vi sinh vật [2], trong đó vi khuẩn là nguồn đóng góp chủ yếu, thứ đến là nấm mốc. Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 17 triệu người chết do các bệnh tim mạch (nhồi máu cơ tim và đột quy), mà nguyên nhân là hậu quả của chứng huyết khối. Theo ước tính thị trường toàn cầu về các thuốc làm tan huyết khối là gần 14 tỷ USD (Cong et al., 2009) [26]. Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 200.000 người được chẩn đoán đột quỵ có liên quan đến huyết khối. Huyết khối xuất hiện khi sợi protein có tên là Fibrin tích lũy trong lòng mạch. Huyết khối là nguyên nhân gây tắc nghẽn các dòng mạch máu tới nuôi mô và cơ tim. Nếu dòng mạch máu bị chẹn, oxy cung cấp cho các cơ đó bị giảm hoặc không còn. Điều này dẫn đến chứng đau thắt ngực và cơn đau tim. Huyết khối trong các tâm thất của tim có thể di chuyển lên não gây tắc nghẽn các mạch máu não và gây ra các biến chứng như tai biến mạch máu não, suy não, suy giảm trí nhớ, đột quỵ. Các chất làm tiêu sợi fibrin đường tĩnh mạch như streptokinase, urokinase và hoạt hóa plasminogen mô ( t-PA ) đã được sử dụng điều trị làm tan huyết khối từ những năm 1960, 1970, 1980. Tuy nhiên hiệu lực hoạt động sinh học của các chất này tồn tại không lâu nên có trường hợp huyết khối lại xuất hiện trở lại và nguy cơ biến chứng gây xuất huyết (Kumar A.,(2010) [40]. Năm 1980 đã có một phát minh vô cùng lý thú đó là enzyme Nattokinase 7 (NK). NK là một enzyme hoạt huyết mạnh có nguồn gốc từ món ăn truyền thống của Nhật Bản có tên là Natto. Nó là một loại gia vị dân gian và là một phương thuốc cổ truyền chữa bệnh tim mạch. Natto được sản xuất bằng lên men đậu nành với vi khuẩn Bacillus subtilis – một loại vi khuẩn có ích, khi ủ ấm với hạt đậu nành sản sinh ra enzyme NK. Bác sỹ Hyroyuki Sumi là tác giả đầu tiên phát hiện Natto làm tan huyết khối năm 1980. Dựa trên nguồn gốc thực phẩm và hoạt tính làm tan huyết khối tương đối mạnh, NK có lợi thế về y tế và thương mại hóa nhờ tác dụng phòng ngừa và hiệu quả kéo dài, uống thuận tiện và sự ổn định trong đường tiêu hóa (Sumi et al., 1990). NK tăng cường hoạt hóa plasminogen và bất hoạt plasminogen activator inhibitor (Sumi et al, 1987, Urano et al. 2001)[52]. Các sản phẩm NK ngày nay đang được bán rộng rãi trên thế giới và sử dụng như một thực phẩm chức năng, hầu như không có phản ứng phụ. Nguyên liệu để sản xuất NK chủ yếu là đậu nành, ngoài ra có thể sử dụng các sản phẩm phụ của công nghiệp chế biến thực phẩm như cám mì, cám gạo, trấu, các loại vỏ đậu (đậu xanh, đậu đỏ..), vỏ tôm. Công đoạn lên men có thể thực hiện bằng lên men bán rắn hoặc lên men chìm, nhiệt độ lên men từ 30-40oC...Ngoài các chủng Bacillus subtilis phân lập từ Natto, chúng ta có thể tìm kiếm ở Việt nam nhiều chủng Bacillus sp khác từ các sản phẩm lên men truyền thống hoặc trong đất, nước của Việt nam. Tất cả những điều kiện như vậy đều có thể đáp ứng ở Việt nam. Với những lý do như trên chúng tôi thực hiện đề tài : “Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis có trong Natto Nhật Bản hướng tới thực phẩm chức năng”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ Natto Nhật Bản và xác định một số điều kiện tạo chế phẩm protease giàu nattokinase 3. Nội dung nghiên cứu 1) Phân lập các mẫu B.subtilis từ Natto của Nhật Bản 2) Chọn lọc khả năng sản xuất protease của một số mẫu phân lập 3) Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của mẫu chọn lọc 4) Phân loại đến loài hai mẫuh Bacillus đã chọn 5) Xác định một số điều kiện lên men sản xuất protease của chủng chọn lọc 6) Nghiên cứu một số đặc tính của protease đã tinh sạch sơ bộ 8 7) Đề xuất quy trình tạo chế phẩm protease giàu nattokinase dạng bột khô 4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: Từ tháng 12/2012 đến tháng 09/2013 - Địa điểm: Viện Sinh Học Nhiệt Đới Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Đại Học Mở Tp. HCM 9 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát chung về protease 1.1.1. Khái niệm và phân loại 1.1.1.1. Khái niệm protease Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid (-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thủy phân này có thể là các acid amin, các polypeptide chuỗi ngắn. Nhiều enzyme protease còn có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc acid amin. Phản ứng theo sơ đồ sau: 1.1.1.2. Phân loại protease 1.1.1.2.1. Dựa vào cơ chế xúc tác Theo IUBMB đã chia peptidase thành 2 nhóm [11]: Nhóm 1: Exo-peptidase còn gọi là peptidase hay enzyme phân cắt đầu mạch. Thủy phân đầu tận cùng của chuỗi polypeptide. Nếu xúc tác ở đầu gốc carboxyl tự do thì gọi là enzyme carboxypeptidase. Nếu xúc tác ở đầu có gốc amin tự do thì gọi là enzyme aminopeptidase Dựa trên cơ chất enzyme sử dụng thì protease được chia thành hai nhóm: protease và peptidase. Nhóm 2: Endo-peptidase còn gọi là protease hay enzyme phân cắt nội mạch. Xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide bên trong chuỗi polipeptidase. Cả hai enzyme endo-peptidase và exo-peptidase kết hợp với nhau một cách hiệu quả trong việc thủy phân phân tử protein, có thể nói rằng chức năng chính của endo-peptidase là tạo một lượng lớn những peptid có đầu tận cùng là nhóm carboxyl tự do và nhóm amin tự do để tạo điều kiện cho exo-peptidase hoạt động. 10 Hình 1.1. Cơ chế xúc tác của enzyme protease 1.1.1.2.2. Dựa vào hoạt động của pH Dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị số pH khác nhau mà enzyme protease được chia thành 3 loại. - Loại 1: Protease acid: pHopt trong khoảng 2 – 5. Nhóm enzyme này xúc tác cho sự thủy phân các peptid và protein ở vùng pH acid. Ngoài ra chúng còn có khả năng thủy phân một số đi – tri peptid do có sự hiện diện của enzyme carboxylpeptidase. Loại protease này thường được thu nhận từ các loại nấm sợi như: A. niger, A. awmori, A.saitoi. - Loại 2: Protease trung tính: pHopt trong khoảng hẹp, từ 6 – 7,5, không bền với nhiệt độ và mất hoạt tính khi có mặt của protease kiềm, có trung tâm hoạt động là kim loại, chứa nhiều Zn2+. Được thu nhận chủ yếu từ các loại nấm sợi như: A. oryzae, A. flavus, A. fumigatus, A. tericola. - Loại 3: Protease kiềm: pHopt trong khoảng 8 – 11, thường được tổng hợp nhiều bởi vi khuẩn và nấm men. Những protease kiềm tính là nhóm được quan tâm khá nhiều trong những năm gần đây vì có thể sử dụng chúng như chất phụ gia trong việc giặt tẩy, trong quá trình thuộc da, xử lý chất thải môi trường. Đa số chúng được thu nhận từ chủng Bac.subtilis hay những vi khuẩn khác. 1.1.1.2.3. Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động Đây là cách phân loại chi tiết nhất, cách phân loại này dựa trên đặc điểm cấu tạo trung tâm hoạt động của enzyme nên phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme đó. Theo cách phân loại này protease được chia thành 4 nhóm. Nhóm I: Cystein - protease ( EC.3.4.22) 11 - Còn được gọi là thinol protease hoặc sulfhydryl protease. - Đặc trưng cho nhóm này là papain, bromelin, ficin và một số protease từ vi sinh vật. - Trung tâm hoạt động bao gồm 2 acid amin là cysteine và histidine - Hoạt động trong vùng pH rộng trong khoảng 4,5 – 10, tuy nhiên vùng pHopt là 6 – 7,5, phụ thuộc vào cơ chất - Có khả năng bền với nhiệt độ từ 60 – 800C ở pH tự nhiên - Nhóm enzyme này rất nhạy với các phản ứng oxy hóa, vì vậy người ta thường dùng chúng kèm theo tác nhân khử (ví dụ cystein), hoặc dùng các chất có cấu trúc không gian phức tạp như EDTA. - Bị ức chế hoạt động bởi chất sulfhydryl. - Nhóm II: Aspartic protease (EC 3.4.23) - Còn được gọi là acid protease - Đại diện cho nhóm các enzyme như rennin, pepsin. - Aspartic protease có nguồn gốc từ VSV, được chia làm hai nhóm là pepsin-like và rennin-like. Nhóm pepsin-like thu nhận từ Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Asp. awamon, Penicilium spp và Trametes sanguinea…Nhóm rennin-like thu nhận từ Asp.usami, Mucor pusillus… - Phân tử aspartic protease có hai nhóm carbocyl, 1 ở miền tiếp xúc và một ở tâm hoạt động. Tâm hoạt động gồm: 2 aspartic acid và 1 tyrosine - pH hoạt động trong khoảng 2 – 4 và còn gọi là protease-acid, riêng cathepsin D có pHopt trong khoảng 6 – 7, cắt liên kết k – casein làm đông tụ sữa với tính đặc hiệu rất cao. - Hoạt tính enzyme bi ức chế bởi peptatin - Nhóm III: Metallo - protease (EC 3.4.24) - Các enzyme nhóm này gồm exopeptidase, dipeptidase, amino peptidase, carboxylpeptidase A & B, prolidase và một số protease thu nhận từ VSV như Bac. cereus, Bac. megaterium, Bac. subtilis, Streptomyces griseus, Aspergillus oryzae - Hầu hết protease đều chứa các ion kim loại trong phân tử enzyme. Phần lớn chúng chứa 1 mol Zn2+ trên 1 mol protein, nhưng với prolidase và prolinase thì thay bằng 1 mol Mn2+. Trong đó kim loại đóng vai trò chất nhận điện tử trong enzyme carboxylpeptidase A, nó thiết lập liên kết với carboxyl trong liên kết peptid và sẽ phân tách liên kết này. - Hoạt động trong vùng pH 6 – 9 - Các tác nhân vô hoạt là các chất có cấu trúc không gian phức tạp như EDTA hay natri dodecylsulfate. 12 - Nhóm IV: Serine protease ( EC.3.4.21) - Đại diện cho nhóm này là các enyme có nguồn gốc từ động vật như trypsin, chymotrypsin, plasmin và thrombin. Một số khác được tổng hợp từ VSV mà đặc biệt là từ VK và nấm mốc như B.cereus, B.firmus, B.subtilis, Asp.flavus, Asp. oryzae. - Hai acid amin hình thành trung tâm hoạt động là serine và histidine. - Khoảng pHopt là 7 – 11 - Các tác nhân làm mất hoạt tính của enzyme thuộc nhóm này là đi – isopropyl phosphoroflouridate (DFP) hay phenylmethenesulphosphate ( PMSF), coumarin và một số chất ức chế thuận nghịch như antitrypsin ở đậu nành, aprotinin, chymostatin. - Trong các nhóm protease được phân loại, ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực nhất là nhóm serine protease do chúng có khả năng thích ứng trong khoảng pH khá rộng từ trung tính đến kiềm đã làm tăng khả năng ứng dụng của nhóm enzyme này so với các nhóm protease khác. 1.1.2. Cơ chế phản ứng và ứng dụng của protease 1.1.2.1. Cơ chế phản ứng của protease Việc thủy phân protease là một tiến trình vật lý khá đa dạng. Hoạt động của chúng được chia ra làm 2 loại như sau: - Thủy phân giới hạn: Enzyme thủy phân có giới hạn đối với một hay một số các liên kết peptide có trong phân tử protein và tạo thành các peptid phân tử nhỏ. - Thủy phân không giới hạn: Protein bị thủy phân thành những acid amin Dưới tác dụng của protease, liên kết peptide -CO-NH- sẽ bị thủy phân tạo thành sản phẩm là aminoacid và một ít peptide có phân tử nhỏ. Với 4 nhóm protease được chia theo đặc điểm cấu tạo của trung tâm hoạt động sẽ có 4 cơ chế xúc tác khác nhau như sau: 13 Hình 1.2. Cơ chế xúc tác của Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của Serine - protease [62] Cystein – protease[63] 14 Hình 1.4. Cơ chế xúc tác của Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của Aspartic – protease[64] Metallo – protease[65] * Cơ chế phản ứng của nhóm serine protease Serine protease có chung nhóm phân loại (EC 3.4.21), là một trong số các enzyme được nghiên cứu khá rộng rãi. Ngoài khả năng thủy phân protein trong quá trình tiêu hóa của động vật, serine protease còn tham gia vào nhiều hiện tượng sinh lý trong cơ thể như làm tan huyết khối và hoạt hóa các bổ thể. Trung tâm hoạt động của nhóm này có chứa amino acid aspartic, histidin và serine, trong đó serine giữ vai trò trực tiếp gắn với cơ chất theo cơ chế được trình bày trong hình 1.7 15 Hình 1.6. Các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease Cơ chế theo hình 1.7 gồm 3 phản ứng: - Phản ứng 1: Nhóm -OH của serine trong trung tâm hoạt động enzyme kết hợp với nhóm C=O của liên kết peptide trong chuỗi polypeptide tạo phức hợp chuyển tiếp tứ diện (tetrahedral complex). - Phản ứng 2: Ở trạng thái chuyển tiếp tứ diện thường kém bền nên chuyển điện tích lên O tạo nhóm C=O mới làm đứt liên kết peptide giải phóng mạch polypeptide đầu N và hình thành hợp chất trung gian acyl-enzyme mới. - Phản ứng 3: Với sự có mặt của nước sẽ giải phóng mạch polypeptide đầu C còn lại và khôi phục trung tâm hoạt động của serine protease. 1.1.2.2. Ứng dụng của enzyme protease[1][11][16] Ngày nay việc khai thác và sử dụng enzyme đã phát triển thành một nghành công nghiệp với kỹ thuật hoàn chỉnh đã đem lại nguồn lợi không nhỏ. Người ta đã tìm ra trên 2000 enzyme khác nhau, nhưng chỉ có 140 enzyme có thể thương mại được. Năm 1997, thị trường về enzyme đã đạt 150 triệu USD. 16 Trong đó các enzyme thuộc nhóm protease hiện đang được ứng dụng nhiều nhất, chiếm 59% lượng enzyme được ứng dụng. Đặc biệt là enzyme protease kiềm được ứng dụng trong chất tẩy rửa với số lượng lớn so với các loại enzyme khác. Ngoài ra protease còn được ứng dụng trong các lĩnh vực: * Trong công nghiệp thịt Có thể sử dụng các chế phẩm protease để làm mềm thịt. Ngoài papain có thể dùng chế phẩm protease của VSV thủy phân một phần nào đó các protein tham gia trong thành phần của thịt. Kết quả là chất lượng của các loại thịt được tăng cao. Để làm mềm thịt có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: - Ngâm thịt vào dung dịch có chứa hỗn hợp protease, giữ ở pH và nhiệt độ thích hợp. Hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến và thuận lợi hơn cả. - Tẩm bột làm mềm thịt (có chứa protease, muối, mì chính) trên bề mặt thịt. - Tiêm dung dịch enzyme vào mô thịt - Tiêm enzyme vào máu động vật trước khi giết mổ. Thịt sau khi làm mềm có thể biến thành các thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. * Trong công nghiệp sữa Protease không những có khả năng phân giải protein mà còn có khả năng làm đông tụ sữa. Protease của nấm mốc và vi khuẩn cũng thể hiện khả năng đó. Tuy nhiên, tất cả các protease của VSV đều khác với rennin động vật ở chỗ chúng không những làm đông tụ được sữa mà còn có thể thủy phân sâu casein, do đó ảnh hưởng xấu đến chất lượng phomat. Trong sản xuất phomat người ta cố gắng tìm những chủng VSV tạo ra được protease có tính chất giống rennin hoặc thay thế một phần rennin (25 – 50%) bằng protease của VSV. Ở Nhật, từ canh trường bề mặt Mucor, người ta có thể thu được chế phẩm protease dùng trong sản xuất phomat. Ở một số nước khác, người ta cũng thu được chế phẩm tương tự nấm mốc Asp.candidus 11 hoặc từ Bacillus mesentericus * Trong công nghiệp thuộc da Trong công nghiệp thuộc da, protease của VSV cũng góp phần quan trọng trong hai quá trình: Làm mềm da và tách lông [60]. Về mặt này, chế phẩm protease như là một phương tiện có hiệu quả để hoàn thiện kỹ thuật chế biến da. 17 Protein là một phần cơ bản của da và lông nên protease đã được sử dụng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin trong quá trình thuộc da rất có hiệu quả (Christner, 1996; Varela et al., 1997) * Trong hương phẩm và mỹ phẩm Protease sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm, kem bôi mặt, kem đánh răng… Do nó có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da đã chết, làm cho da mịn. Thuốc đánh răng có chứa protease có tác dụng chữa viêm lợi và diệt khuẩn. Các loại xà phòng chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như vết máu ở áo quần, drap ở bênh viện… khá tốt. * Trong công nghiệp y dược Trong công nghiệp y dược, các chế phẩm protease được sử dụng để sản xuất các MT dinh dưỡng hỗn hợp có proten dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các VSV khác. Ngoài ra người ta còn thường dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc tố để chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch) Chế phẩm protease thuần khiết được sử dụng trong y học để loại bỏ các tổ chức hoại tử, hỗ trợ tiêu hóa, loại trừ cholesterol bám trên thành mạch máu và để chữa bệnh viêm tắc động mạch. Tác giả Phạm Thị Trân Châu đã kết hợp cùng với bệnh viện quân y 108 nghiên cứu sử dụng chế phẩm protease có tên gọi Prozumabo để điều trị bỏng, kết quả cho thấy dả mạc rụng nhanh, vết thương nhanh khỏi [11]. * Trong kỹ nghệ phim ảnh Protease vi khuẩn được sử dụng để tái sinh các nguyên liệu ảnh quang khác nhau như điện ảnh, giấy ảnh, phim rơnghen…Các protease sẽ phân giải và hòa tan lớp nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý. * Ứng dụng protease để sản xuất các sản phẩm lên men giàu đạm - Tương: Nguyên liệu trong sản xuất tương là gạo nếp, đậu tương. Nấm mốc từ ngoài không khí rơi vào xôi (được nấu lên từ gạo nếp) và phát triển thành phức hệ enzyme amylase – protease tham gia vào hai quá trình sinh hóa quan trọng là thủy phân protein của đậu nành thành các acid amin và thủy phân tinh bột thành đường. Do vậy tương có vị ngọt của đường, vị đậm đà của chất đạm, vị mặn của muối ăn. 18